CN102617737A - 金表面一步固定蛋白质分子的方法 - Google Patents

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靳刚
安娜·维亚纳
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Abstract

本发明公开了一种金表面一步固定蛋白质分子的方法，该方法是：将清洗后的金基底置于二硫化碳和蛋白质分子的混合液中，静置两个小时，使蛋白质分子的氨基、二硫化碳和金表面发生反应，形成二硫代氨基甲酸盐结构，一步实现金表面有机自组装单分子膜层的改性和含氨基分子的固定，从而实现蛋白质分子的固定。本发明可以快速高效地实现金表面上蛋白质分子的固定，能够简化表面改性与配基装配步骤，缩短蛋白质分子固定的时间；同时，由于省去了传统方法中用到的活化试剂，降低了操作成本，具有良好的应用前景。

Description

金表面一步固定蛋白质分子的方法
技术领域
本发明涉及一种利用二硫化碳改性金表面从而固定蛋白质分子的方法，属于表面化学和蛋白质固定技术领域。
背景技术
玻璃上的镀金表面是一种常用的传感器基底材料，它除了具有良好的光学、电学性质和生物相容性之外，还易于进行表面改性处理。改性修饰操作能够在金表面构建不同功能用途的膜层，赋予天然金材料所不具备的诸多特性。
在众多金表面改性方法中，烷硫醇自组装单分子膜层改性一直是研究热点，也是发展得最为成熟的改性方法之一。作为一种灵活的表面化学修饰方法，烷硫醇改性后，原位自发形成的单分子膜层具有热力学稳定和高度有序的特点。这不但保证了改性分子与表面的稳定联接，也使得构建高密度、均匀一致和低缺陷的覆盖层变得相对容易。此外，还可以根据需求，人为地通过有机合成来设计改性分子结构和进行分子剪裁，以在金表面形成可控的、预先设定的改性膜层。
目前，在以固定蛋白质分子为目的的金表面改性中，常使用末端为羧基基团的烷硫醇。这种烷硫醇能够通过键能较强的Au-S键与金表面发生共价结合，从而固定在金表面，暴露出羧基基团，形成羧基化表面。在需要固定蛋白质时，先通过N-羟基琥珀酸亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺活化羧基基团，使其形成能够捕获氨基的中间态化合物。这样，在加入蛋白质分子后，这种中间态化合物就可与蛋白质分子中的氨基形成稳定的酰胺键，实现蛋白质分子在金表面上的固定。
虽然烷硫醇改性方法是一种成熟的金表面修饰方法，但是该方法在操作中存在着一些不便。
首先，该方法前期处理时间过长。改性时，需要将金基底浸泡在烷硫醇的乙醇溶液中过夜，才能够使得改性所形成的单分子层基本覆盖金表面。这使得金表面改性和蛋白质分子固定无法在同一天内完成，减少了后续流程的灵活性。
其次，在进行蛋白质分子固定时，需要加入N-羟基琥珀酸亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺的混合液，对羧基基团进行活化，而NHS和EDC的混合液由于无法长期保存，必须现用现配。这显然增加操作环节的步骤和难度。
发明内容
本发明的目的是克服在固定蛋白质分子应用时现有烷硫醇改性方法操作时间长和过程复杂的不足，提供一种新型的金表面修饰方法，在实现金表面改性和蛋白质分子固定的同时，缩短操作时间，简化操作流程。
本发明提供的一种金表面一步固定蛋白质分子的方法是：将清洗后的金基底置于二硫化碳和蛋白质分子的混合液中，静置两个小时，使蛋白质分子的氨基、二硫化碳和金表面发生反应，形成二硫代氨基甲酸盐结构，从而实现蛋白质分子的固定。
本发明利用二硫化碳分子能够在金表面上与氨基基团形成二硫代氨基甲酸盐这一原理，一步实现金表面有机自组装单分子膜层的改性和含氨基分子的固定。与传统的烷硫醇改性相比，二硫化碳改性方法形成的改性膜层结构更加有序、性质特别稳定，同时操作简单，仅需要将金基底浸置于二硫化碳分子和含氨基分子的混合溶液中，就能够一步实现金表面改性和含氨基分子固定的功能，省去了烷硫醇改性方法中需要引入和活化功能基团的步骤，具有良好的应用前景。
本发明方法能够一步实现金表面的改性修饰和蛋白质分子的固定，不仅简化了操作流程，还节约了改性操作的时间。本发明省去了传统的烷硫醇方法中必须添加的羧基基团活化试剂，在降低了表面改性和蛋白质固定的操作难度的同时还节省了相应试剂的费用。与烷硫醇相比，二硫化碳是一种十分廉价的化学试剂，这使得进一步控制操作成本成为可能。此外，本发明虽然以蛋白质分子作为应用对象，但是对于其它含氨基基团的分子，改性原理仍然适用，具有良好的可移植性。
附图说明
图1为本发明反应流程示意图；
图2为应用本发明固定蛋白A分子的原子力显微镜图。
具体实施方式
如图1所示，本发明具体的工艺步骤是：将清洗后的金基底置于二硫化碳和蛋白质分子的混合液中，静置两个小时，使蛋白质分子的氨基、二硫化碳和金表面发生反应，形成二硫代氨基甲酸盐结构，从而实现蛋白质分子的固定。
本发明的金基底可以是在玻璃、硅片等表面上镀的金薄膜，厚度没有特别的要求。此外，蛋白质分子也没有特定限制。另外，溶液一般采用水即可，如需要控制混合液体系的pH值，也可以使用低盐缓冲溶液。在反应时间上，上述实施例列举了两小时，但也可以依据蛋白质分子固定的效果进行相应的调整。
具体实施例：蛋白A分子在金表面上的固定
首先用浓硫酸、过氧化氢的混合液(体积比3∶1)清洗玻璃上的镀金薄膜5至10分钟，去离子水和乙醇交替冲洗后备用。用pH等于4.1的磷酸缓冲液配置0.1摩尔/升的二硫化碳和10毫克/毫升的蛋白A分子混合液，随后将清洗后的金基底浸入混合液两个小时，使蛋白质分子的氨基、二硫化碳和金表面发生反应，反应过程如图1所示，形成二硫代氨基甲酸盐结构，从而实现蛋白质分子的固定。最后再用磷酸缓冲液和去离子水清洗即可。
用原子力显微镜检测到蛋白A在金表面固定效果良好，密度适中，如图2所示。

Claims (5)

1.一种金表面一步固定蛋白质分子的方法，该方法是：将清洗后的金基底置于二硫化碳和蛋白质分子的混合液中，静置两个小时，使蛋白质分子的氨基、二硫化碳和金表面发生反应，形成二硫代氨基甲酸盐结构，从而实现蛋白质分子的固定。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金基底可以是玻璃片、硅片或其它天然材料表面上的镀金薄膜。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二硫化碳的浓度为0.1摩尔/升。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二硫化碳和所述蛋白质分子的混合液为水或生理缓冲液等水溶液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述金基底置于混合液的时间为两个小时。
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