CN102604973B

CN102604973B - 一种重金属镉抗性相关的基因LakeGST1及其应用

Info

Publication number: CN102604973B
Application number: CN201110428450.7A
Authority: CN
Inventors: 俞陆军; 胡敏; 陈亮; 谢丽娟; 廖斌; 束文圣
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2031-12-19
Also published as: CN102604973A

Abstract

本发明公开了一种重金属镉抗性相关的基因LakeGST1及其编码的蛋白质和应用。该重金属镉抗性相关的基因LakeGST1序列如SEQIDNO:1所示，编码的蛋白质序列如SEQIDNO:2所示。转化大肠杆菌实验证明该基因在大肠杆菌中的表达可以提高其对重金属镉的抗性。本发明可用于提高微生物和植物对重金属镉的抗性，进一步用于清除环境重金属污染，为生物修复提供性能优良的生物资源。

Description

一种重金属镉抗性相关的基因LakeGST1及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域和生物修复领域，具体涉及一种重金属镉抗性相关的基因LakeGST1及其应用。

背景技术

随着矿产资源的开发利用以及工业的发展，重金属对环境造成的污染日趋严重，土壤重金属污染已经成为一个危害全球环境质量的问题。土壤重金属会影响植物的生长发育，降低农作物的产量和质量，带来了严重的经济损失。此外，受土壤重金属污染的作物在植物体中积累，并通过食物链富集到人体和动物体中，危害人畜健康，引发癌症和其他疾病。治理重金属污染刻不容缓，各种修复技术和措施正在研究和应用中。各国政府和科学家着力通过两个途径解决这一问题：一为利用物理的、化学的方法试图清除土壤或水体的重金属污染：二为利用现代生物技术清除污染。自从20世纪80年代以来，生物修复技术因其具有处理费用低、对环境影响小、效率高等优点，越来越受到广大科技人员的广泛关注。生物修复一般分为植物修复、动物修复和微生物修复三种类型，其中植物修复和微生物修复是研究的热点。微生物修复就是利用微生物将环境中的污染物降解或转化为其他无害物质的过程。近年来，基于微生物对重金属的作用机理，以修复有毒有害金属污染或回收有经济价值重金属为目的的生物处理技术日趋成熟。植物修复指利用植物去治理水体、土壤和底泥等介质中的污染的技术。然而用于重金属污染修复的生物往往会受到重金属的毒害，生长缓慢、生物量小，甚至不能生存，所以重金属对植物和微生物的毒害作用是生物修复的主要限制因素。

解决生物修复中重金属对生物的毒害作用的根本途径在于研究耐受重金属的分子生物学机制，克隆对重金属耐受的关键基因，通过基因工程手段获得用于生物修复中性能优良的转基因工程生物。

由于技术上的原因，直到最近，对微生物基因资源的利用主要局限于可培养微生物。然而，已培养微生物仅占自然界中微生物的不到1%，因此各种生境中的微生物宏基因组是一个巨大而未发掘的基因资源库。极端环境具有丰富的微生物资源，当中许多与逆境和关键生命过程相关的基因在长期的适应进化中获得了更强的耐性潜能，发掘这些抗性基因已成为国际重要的研究热点。酸性矿山废水(AMD)是极端生境微生物学研究的重要系统。AMD来源于采矿活动使含硫矿物(主要为黄铁矿, FeS₂)暴露于空气和水中，在微生物催化作用下迅速氧化产酸所致，其pH值一般在1- 4左右，而且富含硫酸盐以及Pb、Zn、Cu、Cd和Ni等重金属，是采矿业面临的最严重环境问题之一。在AMD中生存的原核微生物在长期的进化过程中逐渐形成了一些独特机制，以应对低pH值、高盐度以及高重金属等多种极端环境协迫。因此，AMD生境成为极具特色和丰富的抗逆基因库。

谷胱甘肽S转移酶（GSTs，EC 2.5.1.18）是一个多功能蛋白家族，它在细胞对许多的外源和內源的毒性物质的解毒作用中起着重要作用。1970年，Frear和Swanson等人首次从玉米中发现了GST，随后研究者又从许多其他植物和高等生物中分离到了GST。GST家族由许多细胞质GST，线粒体GST和MAPEG组成。GST广泛分布在真核生物和原核生物中，在不同生物内GSTs的类型也不同：α, μ, π, θ,σ, ζ 和 ω 存在于哺乳动物中, φ和τ 在植物体内存在, δ分布在昆虫中，β存在于细菌中。哺乳动物的细胞质GSTs都由二聚体组成，每个GST亚基大小在22-30kDa之间，由氨基端的α/β结构域和羧基端的α螺旋结构域组成。每个亚基上都有一个独立的配体结合位点：一个谷胱甘肽结合位点（G位点），一个疏水底物结合位点（H位点）。

GSTs 能催化GSH 的巯基与多种亲电底物的结合，生成水溶性的产物，从而降低底物的毒性。另外，GSTs还能充当过氧化物酶，异构酶和硫醇转移酶的作用。Yang等在2001年发现GSTs有助于细胞抵抗脂质过氧化作用。Cancado等人也发现玉米中GST27.2对于抵抗铝毒害发挥着重要作用。Adamis等人发现酵母在镉胁迫下，GTT1和GTT2（酵母中GTT1和GTT2编码有功能的GST）在镉解毒机制中起着不同的作用：相比野生型酵母，gtt2Δ表现出对镉较高的抗性，而gtt1Δ则表现出较低的抗性。Won最近发现沙蚕GSTs的表达量和活性随着镉浓度的升高而升高，这意味着GSTs可能在细胞抵抗镉毒害过程中起着重要作用。

然而，迄今为止GST基因在微生物中对重金属镉抗性究竟起什么作用仍不清楚，也没有从AMD微生物中克隆到GST基因的报道。AMD中重金属含量极高，那么AMD微生物中哪些基因对重金属抗性起着关键作用？GST基因是否对AMD微生物的生长和生存起着重要的作用？这些问题仍然尚待解决。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种重金属镉抗性相关的基因LakeGST1，本发明的另一个目的是提供上述基因编码的蛋白质即谷胱甘肽S转移酶，本发明的进一步目的是提供上述基因及其编码的蛋白质的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明从酸性矿山废水（AMD）微生物中克隆了一个新的谷胱甘肽S转移酶基因，命名为LakeGST1，并对其对重金属镉的抗性进行了功能分析。

本发明提供的一种重金属镉抗性相关的基因LakeGST1，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供的一种上述重金属镉抗性相关的基因LakeGST1编码的蛋白质，为如下蛋白质(i)或(ii)：

(i)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(ii)在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸衍生与蛋白质(i)具有相同的功能的蛋白质。

具体地，上述蛋白质为谷胱甘肽S转移酶。

本发明还提供了上述重金属镉抗性相关的基因LakeGST1以及其编码的蛋白质在治理环境镉污染中的应用，具体来说可用于培育高生物量的重金属超富集植物或微生物，用于重金属污染土壤和水体的生态修复。

含有上述重金属镉抗性相关的基因LakeGST1的表达载体，所述表达载体优选的出发载体为pET28a，即载体pET28a中插入重金属镉抗性相关的基因LakeGST1的编码序列。

一种基因工程菌，含有上述的表达载体，具体是由该表达载体转染大肠杆菌得到的。该基因工程菌在治理环境镉污染中的应用，如可以用于制备具有镉离子抗性的转基因植物或直接投放到环境镉污染中。尤其是对于镉离子浓度在200μM以下的环境治理效果最好。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的基因及所编码的蛋白质通过大肠杆菌转化实验证明可以提高大肠杆菌中对镉的抗性，在200μM Cd²⁺浓度下，表达LakeGST1基因的大肠杆菌在培养过程中都可以生长。本发明可用于提高微生物和植物对重金属镉的抗性，进一步用于清除环境重金属污染，为生物修复提供性能优良的生物资源，在提高微生物和植物对重金属镉的抗性方面有着重大的应用价值。

附图说明

图1为LakeGST1在大肠杆菌中的表达时相， M为蛋白分子量标准；

1为携带空载体pET28a的BL21(DE3)菌株；2-9为携带pET28a-LakeGST1的BL21(DE3)菌株诱导表达0-7小时后的电泳结果；

图2为表达LakeGST1的大肠杆菌在不同镉浓度下培养12小时后的生长情况；

图3为表达LakeGST1的大肠杆菌在150μM镉胁迫下的生长曲线。

具体实施方式

实施例1

LakeGST1基因全序列的克隆

(一) 野外微生物样品采集

在云浮铅/锌矿选取不同酸化阶段（pH值为2,4,6）的AMD，使用0.22 μm的滤膜收集20L AMD里面的细胞。为了保持核酸的完整保存，保存样品冻于液氮中，24小时内带回实验室，并放于-70℃冰箱长期保存。

(二) 核酸的提取

DNA提取采用SET方法，过程如下：向SET buffer中加入溶菌酶及蛋白酶K，消化30 min后，15000rpm离心15 min后用氯仿抽提2次，用异丙醇沉淀过夜后，用75 %乙醇清洗2次，最后溶于灭菌水中。用Qiagen tip-100柱纯化回收基因组DNA，用核酸蛋白分析仪检测DNA质量及浓度。

(三) 基因组测序

用Roche公司的GS FLX Titanium General Library Preparation Kit制备上机样品。使用Roche 454 Genome Seqencer FLX测序仪，通过进行测序，用Pyrobayer软件获取碱基序列。

(四) 基因组序列分析

去除低质量的测序结果后，对基因组进行如下分析：

序列拼接：使用Euler-SR及454公司的GS De Novo Assembler Software进行序列拼接。用N50指数评价拼接的效果。

基因组注释：将拼接好的微生物的全基因组序列用IMG和SEED系统进行基因组的注释，发现新的基因。

(五) LakeGST1基因片段的克隆

通过PCR方法，以从AMD中提取的DNA为模板，根据基因组测序并拼接得到的基因序列设计一对引物：

LAKE111: ATGAAGTTATATTATAGCCCCGGC（SEQ ID NO:3）

LAKE111: TTAAGAACTCTGGATGAGCCCTT（SEQ ID NO:4）

PCR获得一条600bp大小的条带，并克隆到PCR2.1（购自invitrogen 公司）载体中，序列委托invitrogen 公司测定。

(六) LakeGST1基因序列分析

测序结果表明GST基因大小为615bp（见图1），编码204个氨基酸（见图2）

实施例2

LakeGST1基因的功能分析

本实施例中利用大肠杆菌转化实验分析LakeGST1基因的功能。

(一) 构建重组表达载体

设计以下一对引物，在LakeGST1基因5’引入BamHI酶切位点，3’引入XhoI酶切位点。

LakeGST1-F: 5’CGCGGATCCATGGACACGGTATGTTCAGAAGG3’ （SEQ ID NO:5）；

LakeGST1-R: 5’CCGCTCGAGTGATCCCTGCATCAACCATTGT3’ （SEQ ID NO:6）。

以PCR2.1-LakeGST1载体为模板进行PCR。分别将PCR产物和酵母穿梭表达载体pET28a用BamHI和XhoI进行酶切，将酶切产物回收、连接、并转化大肠杆菌DH5α。经测序并酶切鉴定，得到了pET28a-LakeGST1重组子。

(二) 蛋白表达

将重组子pET28a-LakeGST1转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），通过PCR验证筛选阳性克隆。挑取含重组质粒的菌体单斑至10ml LB（含Kan 50μg/ml）中37℃过夜培养。将1ml菌液加入到含100ml LB培养基（含Kan 50μg/ml）, 37℃震荡培养至OD600约为0.4-1.0（最好0.6，大约需2小时）。

加入IPTG至终浓度为1mM进行诱导，每隔1小时收集1ml菌液，离心12000g×60s收获沉淀，用80μl ddH2O重悬，加入20μl 5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀, 沸水浴10min。取上清作为样品做SDS-PAGE分析（见图1）。

(三) 转化子对重金属镉抗性的测定

挑取含重组质粒的菌体单斑至10ml LB（含Kan 50 μg/ml）中37℃过夜培养。将100ul菌加入到10ml Cd²⁺浓度分别为0μM、50μM、100μM、150μM、200μM 的LB培养基（含Kan 50μg/ml、IPTG1mM）中，37℃、200rpm震荡培养12小时，分别测定OD600值。

根据实验结果，选取Cd²⁺浓度为150μM作为胁迫条件，进行了生长曲线的测定。挑取含重组质粒的菌体单斑至10ml LB（含Kan 50μg/ml）中37℃过夜培养。将100ul菌加入到10ml Cd²⁺浓度为150μM的LB培养基（含Kan 50μg/ml、IPTG1mM）中，37℃、200rpm震荡培养，每隔2小时测定OD600值。

实验结果表明，表达LakeGST1基因的BL21(DE3)在0-200μM Cd²⁺浓度下都可以正常生长，而空载体对照在Cd²⁺浓度超过150μM时便不能生长（见图2）。在150μMCd²⁺浓度下，表达LakeGST1基因的BL21(DE3)在培养过程中都可以生长，而空载体对照的生长一直受到抑制（见图3）。实验结果说明，LakeGST1对重金属镉的防御起着重要作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种重金属镉抗性相关的基因LakeGST1及其应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaagttat attatagccc cggcgcctgc tccctttctc cccatatcat cctgaacgaa 60

ggcggattca acttcgacaa ggaagcggtc gatttagcca gcaaaaaaac agcgactggt 120

accgactata acgccgtgaa catcaacggc tatgtcccgg cactggtgct tgacgatggc 180

accatactga ccgaaggacc cgctattatc caatatctgg ctgatcgtgt accggaaaaa 240

aagctcgcac ctccggccgg cacgatagaa cgctaccagc tcatgcaatg gctcaatttt 300

atttccaccg aactgcacaa gggcttttca cccttgttta acccacaggc accggcagaa 360

tggaagacgc tggtcaccgc tcaactcggg cgccgcttga agaccgtcag ccaacaactg 420

gagggcagag attggttgct gggcaaggac ttcacagtgg ccgatgccta tctctttacg 480

gtattgggct ggtgcccgca tgtaggcatt gaattggagc agtggcccgt actcaaagca 540

taccatagcc gagtatctat gcggccagca gtacaagcca gcctgaaaga agaagggctc 600

atccagagtt cttaa 615

<210> 2

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Lys Leu Tyr Tyr Ser Pro Gly Ala Cys Ser Leu Ser Pro His Ile

1 5 10 15

Ile Leu Asn Glu Gly Gly Phe Asn Phe Asp Lys Glu Ala Val Asp Leu

20 25 30

Ala Ser Lys Lys Thr Ala Thr Gly Thr Asp Tyr Asn Ala Val Asn Ile

35 40 45

Asn Gly Tyr Val Pro Ala Leu Val Leu Asp Asp Gly Thr Ile Leu Thr

50 55 60

Glu Gly Pro Ala Ile Ile Gln Tyr Leu Ala Asp Arg Val Pro Glu Lys

65 70 75 80

Lys Leu Ala Pro Pro Ala Gly Thr Ile Glu Arg Tyr Gln Leu Met Gln

85 90 95

Trp Leu Asn Phe Ile Ser Thr Glu Leu His Lys Gly Phe Ser Pro Leu

100 105 110

Phe Asn Pro Gln Ala Pro Ala Glu Trp Lys Thr Leu Val Thr Ala Gln

115 120 125

Leu Gly Arg Arg Leu Lys Thr Val Ser Gln Gln Leu Glu Gly Arg Asp

130 135 140

Trp Leu Leu Gly Lys Asp Phe Thr Val Ala Asp Ala Tyr Leu Phe Thr

145 150 155 160

Val Leu Gly Trp Cys Pro His Val Gly Ile Glu Leu Glu Gln Trp Pro

165 170 175

Val Leu Lys Ala Tyr His Ser Arg Val Ser Met Arg Pro Ala Val Gln

180 185 190

Ala Ser Leu Lys Glu Glu Gly Leu Ile Gln Ser Ser

195 200

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaagttat attatagccc cggc 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttaagaactc tggatgagcc ctt 23

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcggatcca tggacacggt atgttcagaa gg 32

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgctcgagt gatccctgca tcaaccattg t 31

Claims

1.一种重金属镉抗性相关的基因LakeGST1，其特征在于其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种权利要求1所述重金属镉抗性相关的基因LakeGST1编码的蛋白质，其特征在于为由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.权利要求1所述重金属镉抗性相关的基因LakeGST1在治理环境镉污染中的应用。

4.权利要求2所述重金属镉抗性相关的基因LakeGST1编码的蛋白质在治理环境镉污染中的应用。

5.含有权利要求1所述重金属镉抗性相关的基因LakeGST1的表达载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于出发载体为pET28a。

7.一种基因工程菌，其特征在于含有权利要求6所述的表达载体。

8.权利要求7所述基因工程菌在治理环境镉污染中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于环境镉污染中的镉离子浓度为150μM~200μM。