CN102595886A - 包含4，5-二羟基茚-1-酮的农药组合物 - Google Patents

包含4，5-二羟基茚-1-酮的农药组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了包含4，5-二羟基茚-1-酮或其衍生物的农药组合物，所述组合物用于保护重要作物免受螨虫、真菌和细菌的侵害。所述组合物可以通过对真菌提取物进行分级来制备。

Description

包含4,5-二羟基茚-1-酮的农药组合物
技术领域
本发明涉及包含基于二羟基茚的真菌代谢物的农药组合物，特别是用于抑制对重要作物造成伤害的螨虫、真菌或细菌的组合物。
背景技术
由螨虫、细菌和真菌造成的植物病害对全球重要作物的生产具有很大的负面影响。最重要的螨虫包括叶螨，其对多种水果、蔬菜和花卉造成伤害。实例包括棉叶螨和柑橘锈螨。化学抑制已经遇到越来越多的困难，尤其是耐农药性的发展及监管问题。真菌分泌多种二次代谢物，其中有多种对其他生物体和微生物体有毒性，并且可用于农业系统的生物抑制。因此本发明的一个目的是提供采用真菌代谢物抑制作物虫害的方法。
本发明的另一个目的是提供用于保护重要作物免受螨虫、细菌和真菌伤害的农药。
本发明的再一个目的是提供源自真菌的杀螨剂。
本发明的又一个目的是提供用于保护易感染螨虫、细菌和真菌的植物(包括其果实)的杀螨剂组合物。
本发明的再一个目的是提供抑制和预防受螨虫并最终受其他虫害(包括细菌和真菌)感染的方法，该方法包括施加真菌源(fungus-derived)组分。
本发明的又一个目的是提供制备用于保护易感染螨虫、细菌和真菌的植物(如柑桔类水果)的农药制剂的方法。
本发明的其他目的和优点将随着说明书展开而明显。
发明内容
本发明提供一种农药组合物，所述组合物包含式I所示的化合物作为活性成分：
Figure BDA0000156114620000021
其中，R1和R2独立地选自H、C1～18烷基和C1～18酰基。由于本发明证实了4，5-二羟基茚-1-酮的农药活性，因此本领域技术人员将领会到，在虫害体内容易代谢为4，5-二羟基茚-1-酮的衍生物对所述虫害也有毒性。此类衍生物的一个实例是一个或两个羟基经羧酸而酯化的4，5-二羟基茚-1-酮。在优选的实施方式中，所述农药组合物包含来自真菌的提取物。优选的真菌是Meira argovae。优选的是，本发明的农药组合物显示出杀螨剂和杀真菌活性。所述农药组合物还优选显示出杀细菌剂活性，例如抗根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)活性。
本发明涉及用于抑制或预防经济植物(如重要作物，例如包括果树、蔬菜、观赏花卉等)的螨虫、真菌或细菌感染的组合物。
螨虫可以例如是叶螨。所述组合物还可以包含选自由农业可接受载体、稀释剂、乳化剂、分散剂组成的组中的至少一种组分，以及选自除草剂、杀虫剂、生长促进剂和肥料中的另外的活性成分。
在本发明的另一方面中，本发明涉及抗细菌组合物，所述组合物包含来自真菌Meira argovae、Meira geulakonigae、Acaromyces ingoldii或保持抗细菌活性的其后代、突变体或变异体中的至少一种的提取物，或者源自所述提取物的生物制品。
本发明还涉及用于抑制植物被细菌感染的方法，所述方法包括将下述抗细菌组合物施加到植物上或施加到植物附近，所述组合物包含来自真菌Meira argovae、Meirageulakonigae、Acaromyces ingoldii或保持抗细菌活性的其后代、突变体或变异体中的至少一种的提取物，或者源自所述提取物的生物制品。
优选的是，所述提取物来自真菌Meira argovae。
优选的是，真菌Meira argovae是CBS登记号第110053号命名的真菌，或保持抗细菌活性的其后代、突变体或变异体。
优选的是，Meira geulakonigae是CBS登记号第110052号命名的真菌，或保持抗细菌活性的其后代、突变体或变异体。
优选的是，Acaromyces ingoldii是CBS登记号第110050号命名的真菌，或保持抗细菌活性的其后代、突变体或变异体。
优选的是，所述组合物包含来自真菌Meira argovae的提取物，并且除了抗细菌活性外其还显示出杀螨和抗真菌活性。在一个重要的实施方式中，本发明的组合物包含式II的化合物：
Figure BDA0000156114620000031
本发明提供了抑制易感染植物中螨虫、真菌或细菌感染的方法，所述方法包括将下述组合物施加到所述植物上或施加到所述植物附近，所述组合物包含式I的化合物(如上所述)，该式I的化合物例如为式II的化合物。在本发明的方法中，所述组合物优选具有杀螨、抗真菌和抗细菌活性；所述植物通常包括水果、蔬菜或观赏花卉。要抑制的螨虫的实例可以包括但不限于棉叶螨和柑橘锈螨。
本发明涉及包含式I化合物的组合物的制备方法：
Figure BDA0000156114620000032
其中，R1和R2独立地选自H、C1～18烷基和C1～18酰基；所述方法包括培养真菌、提取培养基和色谱分离所述真菌的释放进入所述培养基的代谢物，以及可选地对所述代谢物进行衍生化。在本发明的一个优选实施方式中，所述农药组合物的制备方法包括生产式II的代谢物：
其中，通过调节培养基的pH来增加所述生产。
附图说明
通过下述实例并参考附图，本发明的上述和其他特征以及优点将变得更加显而易见，附图中：
图1显示了活性真菌剂的分离；图1A是来自Meira argovae的经提取代谢物的HPLC色谱图；图1B是与第二主峰相关的UV谱图，其中洗脱于8.46分钟开始；图1C显示了将所述第二主峰中洗脱出的材料用作抑制根癌土壤杆菌生长的生物活性毒素；
图2显示了本文中称为argovin(即4，5-二羟基茚-1-酮，分子式C9H7O3)的活性剂的草拟结构，该argovin为Meira argovae分泌的抗螨虫化合物；
图3是显示了生长于磷酸盐缓冲培养基上的Meira argovae菌落的菌落面积的图，所述培养基的初始pH为5、6或7；不同的字母表示处理物之间的显著性差异(p＜0.05)；
图4是显示了在非缓冲培养基中Meira argovae菌落诱发的pH变化的图；培养基的初始pH分别为4.0(◆)、4.5(■)、5.0(▲)或6.0(●)；pH变化通过在距菌落边界等距离处读数而进行监测；
图5是显示了通过HPLC检测的Meira argovae的pH依赖性毒素生产的图；真菌在初始pH值为5、6或7的液体磷酸盐缓冲培养基中或在对照物(Con)中生长，对照物为非缓冲培养基(初始pH为5.0)；不同的字母表示处理物之间的显著性差异(p＜0.05)；
图6显示了柑橘锈螨对Meira argovae的RPLC纯化毒素(argovin)的剂量响应；
图7是显示了与未经处理的未成熟果实(对照)(●)相比，在成熟葡萄柚(◆)、未经处理的成熟葡萄柚(对照)(▲)和经真菌处理的未成熟果实(■)上施加Meira argovae分生孢子(108ml-1)所响应的柑橘锈螨死亡率的图；在成熟果实和未成熟果实中均测量葡萄柚皮的pH值；
图8显示了由其上培育有Acaromyces ingoldii(Ai)、Meira argovae(Ma)和Meirageulakonigii(Mg)的培养皿制得的提取物对以下七种植物病原性真菌的菌落生长的作用：1.水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)；2.白绢病菌(Sclerotium rolfsii)；3.核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)；4.胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；5.指状青霉(Pencillium digitatum)；6.镰刀菌(Fusarium mangiferae)和7.柑桔褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)。除了M.geulakonigii对镰刀菌(F.mangiferae(6))的效果外，全部处理物均与对照物有显著性差异(p＜0.05)；
图9显示了由其上培育有Acaromyces ingoldii(Ai)、Meira argovae(Ma)和Meirageulakonigii(Mg)(符号与图8中相同)的培养皿制得的提取物对自核盘菌(图9A)和白绢病菌(图9B)菌核的菌丝发育的作用；竖直线表示SE；
图10表示核盘菌受喷洒Acaromyces ingoldii(Ai)、Meira argovae(Ma)和Meirageulakonigii(Mg)的芽生分生孢子在去离子水中的1-5×108ml-1悬浮液影响而覆盖番茄小叶的程度；对照叶片仅以去离子水处理；对照小叶的覆盖程度与全部FBA的效果有显著性差异；竖直线表示SE并且星号表示与对照物有显著性差异(p＜0.05)；
图11表示指状青霉对经喷洒Acaromyces ingoldii(Ai)、Meira argovae(Ma)和Meira geulakonigii(Mg)的芽生分生孢子在去离子水中的1-5×108ml-1悬浮液而预处理过的甜橙造成的绿霉菌感染的程度；对照甜橙仅以去离子水处理；对照甜橙的感染程度与全部FBA的效果有显著性差异；竖直线表示SE；
图12表示渗入甜橙(纽荷尔脐橙(Citrus sinensis cv.New Hall))表皮的FBA菌丝的SEM显微照片；图12A显示了Acaromyces ingoldii，图12B显示了Meira argovae，图Fig.12C显示了Meira geulakonigii；显微照片中间的大洞是气孔；箭头指向FBA菌丝的H点；左上角的线条表示10μm；和
图13显示了在沸水中加热之前(图13A和13B)和加热之后(图13C和13D)，FBA对指状青霉(图13A和13C)和菌核病菌(图13B和13D)的抑制效果；全部处理物均与对照物有显著性差异(p＜0.05)；竖直线显示SE。
具体实施方式
现在已发现来自真菌Meira argovae的粗提取物的HPLC级分显示出出乎意料的强杀螨剂活性。而且，当对重要作物病虫害根癌土壤杆菌进行检验时，同一级分还显示出抗细菌活性。如此预料不到的有利的生物活性组合形成了制备新型农药制剂的优良基础。
真菌Meira argovae的代谢物经检验为螨虫和细菌的拮抗剂。通过反相液相色谱法(RPLC)分离经提取的真菌代谢物，然后测试所得级分，使得本发明人能够分离出包含一种主要组分的单一抗螨级分。该活性化合物(本文中命名为“argovin”)经分析其光谱特征而确认为4，5-二羟基茚-1-酮。该化合物之前仅被报道为化学反应的产物或中间体；本文中，该化合物作为天然产生的材料而从代谢混合物中分离出。真菌在中性pH的生长率高于酸性pH 。Meira argovae将其培养基的pH调节为对于其菌落生长和毒性分泌最适宜的值。0.2mg/ml经RPLC精炼的argovin杀死100％的柑橘锈螨(Phyllocoptruta oleivora)种群。与施加在受感染的不成熟葡萄柚上的螨虫死亡率相比，当施加在螨虫感染的成熟葡萄柚时，M.argovae的分生孢子导致较高的螨虫死亡率。这可能是由于果皮的pH值差异：成熟果实为6.7，不成熟果实为5.6。本发明人推测：该真菌利用葡萄柚上变化的pH条件来达到最大毒素分泌，从而导致更高的螨虫死亡率。可利用或控制这一特性来抑制田间的柑橘锈螨，以及进行毒素生产以用于工业和药学用途。因此，argovin是一种拮抗螨虫的新型天然产物，由真菌Meira argovae生产，该真菌的分泌受到周围pH的影响。出乎意料且有利的是，当在根癌土壤杆菌上(许多重要农作物肿瘤形成的细菌性致病病原，属于经济上最重要的作物致病菌)进行检验时，同一材料还显示出具有杀细菌剂活性。
本发明因此涉及一种农药制剂，所述制剂包含源自真菌提取物的组分。特别是，采用了Meira argovae真菌；然后对粗制真菌提取物进行色谱分离和生物检验。收集通过RPLC分析(图1A)检测到的三个主峰，并与其他由RPLC洗脱出的非UV检测级分一起用于生物检验。仅有一个在8.46分钟洗脱出的峰(其UV光谱特征为λmax＝205nm、235nm和285nm(图1B))对根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)具有活性(图1C)。收集特征为λmax＝205nm、235nm和285nm的级分，冻干，通过MS和MS/MS并通过NMR光谱法的不同模式(modification)进行分析。所述化合物的M-H质量为163.0401(分子式C9H7O3)。根据MS/MS光谱，M-H峰的主要损失是H2、H2O、CO和CH2＝C＝O。所述化合物在CD3OD溶液中的1H-NMR光谱显示出四组质子：多重态δ＝2.66(2H)，多重态δ＝3.04(2H)，双重态δ＝6.86(1H，J＝8Hz)和双重态δ＝7.17(1H，J＝8Hz)。13C-NMR光谱显示9个不同的信号：δ：23.18(CH2，根据DEPT光谱)，37.45(CH2，根据DEPT光谱)，116.76(CH，根据DEPT光谱)，117.09(CH，根据DEPT光谱)，130.69，142.92，144.58，152.89，208.99。HQMC光谱使得发明人能够将δ＝2.66的质子分配给δ＝37.45的碳原子，将δ＝3.04的质子分配给δ＝23.18的碳原子，将δ＝6.86的质子分配给δ＝116.76的碳原子，将δ＝7.17的质子分配给δ＝117.09的碳原子。显然，δ＝208.99的碳原子属于羰基。根据COSY光谱，两个CH2基团彼此连接，并且两个CH基团也彼此连接。上述全部数据教导发明人所分析的化合物具有茚-1-酮骨架，该骨架包含两个连接于芳族部分的羟基。HMBC光谱：i)发现H(2.66)与C(23.18，强)、C(130.69，弱)、C(144.58，强)、C(208.99，强)有相互作用；ii)发现H(3.04)与C(37.45，强)、C(130.69，强)、C(142.92，强)、C(144.58，强)、C(152.89，强)、C(208.99，强)有相互作用；iii)发现H(6.86)与C(130.69，强)、C(142.92，强)、C(152.89，弱)有相互作用；iv)发现H(7.17)与C(144.58，强)、C(152.89，弱)、C(208.99，强)有相互作用。对NMR信号进行了下述分配：23.18(23.54)-C(2)，37.45(37.20)-(C3)，116.76(115.07)-(C6)，117.09(119.01)-(C7)，130.69(128.89)-(C7a)，142.92(142.23)-(C4)，144.58(142.93)-(C3a)，152.89(152.29)-(C5)，208.99-(C1)。该分配通过13C化学位移的测量值和计算值(括号内所示)之间的良好吻合而得到了支持，所述计算是第二作者于Prof.G.Gescheidt实验室，Graz(University of Technology，Graz，奥地利)拜访期间采用ACD(版本10.0)13C-Predictor进行的。额外的数据表明所分析的化合物结构是4，5-二羟基茚-1-酮(也记作，4，5-二羟基-1-茚酮；4，5-二羟基-2，3-二氢-1H-茚-1-酮)，并因此命名为argovin(图2)。由此确认了毒性级分的主要代谢物。
检查了不同pH值对真菌生长的作用。与pH 5.0下的222mm2相比，在缓冲至pH 6.0和pH 7.0的培养基中发生最快的真菌生长(分别达到平均311mm2和327mm2)(图3)。测量生长培养基中的pH值变化(InLab
Figure BDA0000156114620000071
427微电极)表明，与其他位点相比，菌落边缘附近处的值更大。培养基的初始pH接近4.0，21天后升至6.0(在距菌落边缘20mm处测量)。当初始pH值为4.5、5.0或6.0时，其分别升至7.2、7.3和7.3(图4)。而且，pH值对argovin分泌数量的影响也有特征。与真菌在pH 6.0(3.1mg/mg)或pH 5.0(0.98mg/ml)生长时获得的毒素分泌量相比，在pH 7.0缓冲培养基内生长的菌落中测量到最高的毒素分泌量(5.2mg/ml)。非缓冲对照物中的分泌量与在pH 6.0获得的值相比并无统计差异(1.99mg/ml)。在从5.0到6.0的实验过程中，非缓冲对照物中的pH上升(图5)。
检验了葡萄柚果皮的变化pH对M.argovae的柑橘锈螨拮抗作用的影响。不成熟的葡萄柚果皮的pH值接近5.5，成熟果实果皮的pH值接近6.5。在施加真菌分生孢子后，与不成熟果实的78％死亡率(显著性差异0.05)相比，在成熟果实中发现最高的螨虫死亡率(85％)。在成熟或不成熟果实上包含CRM的对照处理物(仅有水)中，死亡率分别仅达到11％和9％。这些数据表明果皮pH水平与螨虫死亡率之间的关联(R2＝0.81)(图7)。
测量了柑橘锈螨对argovin浓度的剂量响应。活性级分(0.01mg/ml)导致39％的死亡率(与对照物的6％对比)，在0.2mg/ml时达到100％的死亡率(图6)。
因此，本发明提供了通过采用由Meira argovae分泌的化合物抵抗如根癌土壤杆菌和柑橘锈螨(CRM)等虫害的方法。提供了RPLC方法来检测和分离真菌分泌物中的生物活性级分，特别是，其中所述真菌包括M.argovae。所提供的生物检验非常实用，因为根癌土壤杆菌的应用能够实现结果的过夜读取。能够进行真菌物质4，5-二羟基茚-1-酮(本文称为argovin)的确认和表征，并且该物质对根癌土壤杆菌和CRM均有毒性。
本发明人发现尚没有关于用任何生物体分泌化合物argovin的报道，更没有关于其生物活性的报道。Singh等(1989)在旨在理解这些化合物的立体化学分配的研究中将该化合物描述为4，5-二甲氧基茚-1-酮和4，5-二苄氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-酮之间的中间体，没有涉及生物活性。还报道了一种类似的化合物5，6-二羟基茚-1-酮，其作为5，6-二甲氧基茚-1-酮溴化中的中间体，没有涉及任何生物活性(Choi和Ma，2007)。已报道了1-茚酮的不同衍生物在体外对人类细胞中的乳腺癌生长具有副作用(Somers-Edgar和Rosengren，2009)。根据另一研究，1-茚酮的衍生物对阿尔茨海默症有药学用途(da Silva等，2006)。
用作生物抑制剂(或潜在的生物抑制剂)的多种真菌都分泌毒性二次代谢物，该二次代谢物为拮抗活性的主要或唯一模式(Vey等，2001)。例如，Meira argovae相关物种即类酵母真菌Pseudozyma flocculosa是分泌毒性脂肪酸(Avis和Bélanger，2001)和纤维二糖脂质(Cheng等，2003)的潜在生物抑制剂，其已证实为对抗黄瓜白粉病和拟茎点霉(Phomopsis sp.)的主要作用模式(Avis和Belanger，2001；Cheng等，2003)。
在其他真菌系统中，pH值的变化也影响生长率。例如，核盘菌属(Sclerotinia spp.)的真菌寄生物盾壳霉(Coniothyrium minitans)在酸性条件下比在中性-碱性条件下生长得更好，并产生更多的毒素(Yang等，2008)。昆虫病原真菌金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)调节周围pH，这将激活其表皮降解酶并增强渗透后的毒素分泌(St Leger等，1999)。在本申请中，看起来葡萄柚果皮在成熟时的pH变化有助于真菌培育并使得argovin分泌能够在较高的速率下进行。在本研究中，证实了当在人造培养基中生长时，M.argovae将其环境的pH改变至中性，结果与偏酸性的条件相比分泌更多量的argovin。Argovin直接导致螨虫死亡，如螨虫死亡率随所施加的毒素量增大而增加所示。Argovin能够抑制根癌土壤杆菌和螨虫(例如，原核生物体和真核生物体)的事实表明其可能具有药学用途和农业用途。仅能获得关于真菌霉菌毒素，特别是包括M.argovae的黑粉菌亚纲(Ustilaginomycetidae)中的那些霉菌毒素(Vey等，2001)的极少信息。该真菌显示出具有很大潜力成为对抗食草螨虫和其他植物致病菌(包括真菌和细菌)的生物抑制剂。在利用该真菌对抗柑桔螨时，可以控制葡萄柚果皮pH与真菌对抗活性之间的联系。施加在碱性培养基/制剂中的真菌可导致更高的虫害死亡率，而不管其环境pH如何。当为了工业目的和药学目的而生产argovin时，为了获得更多的argovin，也可以利用该生物特性。本研究确认并表征了M.argovae的毒素分泌及其对周围pH的依赖性。除了证实argovin在减少虫害-螨虫种群中的效果外，本文还首次将argovin描述为活生物体代谢物(真菌)。
在本发明的优选实施方式中，采用下述制剂来保护作物免受螨虫、真菌和/或细菌侵害，所述制剂包含真菌提取物(特别是来自M.argovae的提取物)或从所述提取物中分离出的组分。在一个实施方式中，所述分离出的组分通过已知的化学方法进行衍生化。优选的是，将该真菌提取物或其组分施加于待保护的植物上或其附近，所述提取物包含4，5-二羟基茚-1-酮或其衍生物。所述衍生物可以包括酯或醚。特别是，优选在虫害体内容易水解以提供游离态4，5-二羟基茚-1-酮的衍生物。
本发明提供了一种农药制剂，所述制剂包含4，5-二羟基茚-1-酮和农业可接受载体、助剂或稀释剂(如溶剂)、乳化剂和分散剂或表面活性剂。在一些实施方式中，本发明的制剂可包含另一农药剂，所述另一农药剂提供对抗螨虫、真菌和/或细菌的协同效应或者提供对抗其他虫害的活性。一些应用中，所述制剂还可以包含诸如除草剂、杀虫剂、生长促进剂和肥料等活性成分。
在本发明的又一方面中，提供了抑制和/或预防重要农作物受螨虫、真菌和细菌感染的方法。在本发明的一个实施方式中，提供了抑制和/或预防重要农作物受螨虫、真菌和/或细菌感染的方法。
为了实施本发明，可以以农药应用和农业保护领域已知的任何方式施加该杀螨、杀真菌和杀细菌用悬浮液或溶液。
下述实施例中将进一步描述和阐明本发明。
实施例
真菌和细菌菌株、生长条件和真菌代谢物粗提取
采用了Meira argovae(菌株AS005，Boekhout等，2003)。25℃在马铃薯右旋糖琼脂(PDA，Difco，Detroit)上常规地生长真菌，并保持在4℃直至使用。为了进行代谢物提取，在持续搅拌(150rpm)下，使真菌于黑暗中在30ml酵母麦芽胨右旋糖(YMPD)肉汤中(Cheng等，2003)生长28天。根据Duffy和Defago(1999)的方法(如前所述稍有改变(Paz等，2007b))提取代谢物。用于生物检验的根癌土壤杆菌(菌株ID1)培养物由耶路撒冷希伯来大学(Hebrew University)的Leonid Chernin教授友情提供。
柑橘锈螨的来源
由以色列海岸平原上的Tzrifin农场中的Mineola橘柚(葡萄柚(C.paradisi)×芦柑(C.reticulata))果实获得CRM菌群。该农场没有使用杀螨剂，使得该区域成为符合本发明目的的适合场所。在实验室中，虫害在酸橙(Citrus aurantium)的幼苗(6～8周)上进行培养。
粗提取物的色谱分离
进行反相液相色谱法(RPLC)分离以从粗制真菌提取物中检测出生物活性级分。HPLC系统(Thermo Separation Products，Riviera Beach，FL)由自动取样器(AS3000)、注射器(100μl)、柱温箱(35℃)、泵(P3000)和二极管阵列检测器(UV6000)构成。采用了反相C18柱(250mm×4.6mm，“Luna”5μPhenomenex，Torrance，CA)。使用由双蒸水(ddH2O)和乙腈构成的线性梯度进行洗脱，首先在85％水下采用3分钟的等度洗脱步骤，然后在1ml/分钟的流速下适度增加乙腈以在14分钟达到17％。在λmax＝210nm、232nm和285nm检测粗提取物。收集各个检测出的级分并进行生物检验(见下文)。
抗细菌活性检验以及粗提取物对柑橘锈螨的作用
因为初步结果已表明根癌土壤杆菌对提取物敏感并因而适合本发明的生物检验，因此首先检验粗提取物在体外对抗根癌土壤杆菌的作用。所述细菌在容有5mlLennox肉汤(LB，Difco)的玻璃管中生长过夜。将50μl过夜生长的细菌悬浮液添加至5ml含0.6％琼脂的LB中，并置于皮氏培养皿(直径55mm)中。各个洗脱出的色谱级分采用旋转蒸发器干燥，溶解在10μl甲醇中，移取至皮氏表面皿中并在28℃温育。24小时后检查各培养皿的抑制光环，使用单独的10μl甲醇作为对照。将该过程重复四次以确认该级分的毒性。同时检验了对根癌土壤杆菌具有拮抗作用的RPLC精炼部分对抗柑橘锈螨的作用(见下文)。
毒性级分的MS和NMR分析
在配有ESI离子源的Bruker Daltonik micrOTOF-Q质谱仪上进行MS分析。采用下述MS参数进行分析：毛细管电压4000V，喷雾器压力0.6巴，干气流量5l/分钟，干气温度180℃，ISCID能1eV/z，离子能3eV/z，碰撞能量10eV/z～40eV/z，质量范围100～2500道尔顿。用正负两种模式分析样品；后者获得更好的结果。采用在1H为500MHz、13C为125MHz下运行的Bruker″Avance″DRX-500 NMR光谱仪进行NMR实验；化学位移以δ(百万分率)表示，参照CD3OD的溶剂峰δH 3.34和δX 49.0；耦合常数J的单位为Hz。采用文献中所述的常规脉冲序列进行DEPT、1H-1H COSY、1H-13C HSQC和HMBC NMR实验。
不同pH值对真菌生长的影响
为了评价菌落生长是否受周围pH的影响，将真菌菌落(PDA上)边缘的6mm菌斑置于90mm皮氏培养皿中心，所述培养皿容有含2％琼脂的缓冲YMPD(缓冲溶液(柠檬酸盐/磷酸盐)包含0.1M柠檬酸，并且必要时通过添加一定量的0.2M Na2HPO4将其pH调节至5.0、6.0或7.0的水平)。将这些皮氏培养皿(5份)在黑暗中于25℃温育21天。为了获得其生长面积，测量各菌落的直径。在菌落测量前，将茜素(Alizarin)S红色染料(Sigma)(0.2％)添加至各培养皿上；已知该染料是酸度变化的信号：当pH升至5.8以上时其形成红色光环。在距菌落边界的等距离(5mm)处设置InLab
Figure BDA0000156114620000111
427微电极，通过pH计测量实际的pH值。该真菌还在pH值调节至4.0、4.5、5.0或6.0的非缓冲YMPD(2％琼脂)培养基中于25℃生长21天。记录距菌落边界渐增距离(0.5cm、1.0cm、1.5cm和2.0cm)处的pH值。
pH值对毒性分泌物数量的影响
本实验的目的是确定培养基的pH对毒素分泌的影响，并确立分泌最优的pH条件。在锥形瓶中，将3ml在ddH2O中的悬浮液(1×108孢子/ml)添加至的30ml缓冲(磷酸盐/柠檬酸盐，如上)YMPD中。将该烧瓶在黑暗中持续搅拌(150rpm)5天。非缓冲YMPD培养基用作对照。用RPLC系统测量各pH处理所得的经提取的毒性代谢物的量。
柑橘锈螨对纯化毒素浓度的剂量响应
为了确定CRM对毒素的剂量响应，将溶解在2ml体积ddH2O中的0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml和0.4mg/ml经RPLC精炼的毒素喷洒至CRM(30CRM/叶，4份)上。经感染的幼苗在25℃温育(12L∶12D)。24小时后记录螨虫死亡率。
葡萄柚果皮的变化pH对M.argovae的柑橘锈螨拮抗作用的影响
为了探索葡萄柚果皮的pH对真菌的CRM拮抗作用的影响而进行本实验。在上述Tzrifin农场收集10个成熟红葡萄柚和10个不成熟红葡萄柚，并如所上所述，从幼苗起培育螨虫。如上所述，采用InLab
Figure BDA0000156114620000121
427微电极(Mettler Toledo，Schwerzenbach，瑞士)测量果实外皮层的pH。各葡萄柚感染了约30个螨虫。处理物包括对5个成熟的和5个不成熟的感染果实喷洒真菌悬浮液(1×108)，用水处理的对照物也包括5个成熟的和5个不成熟的果实。处理(25℃，12L∶12D；光照∶黑暗)5天后，记录CRM死亡率。
统计分析
各实验分3～5份进行两次。采用JMP 8.0软件(SAS Institute，Cary，NC)通过ANOVA Tukey检验(P＝0.05)分析所获得的数据。为了进行感染螨虫的红葡萄柚实验，进行回归分析。
三种担子菌亚门(Basidiomycotine)真菌对土壤传播的、叶子和果实损伤型植物病 原体的作用
在实验室中检验了三种担子菌亚门真菌Meira geulakonigii、Meira argovae和Acaromyces ingoldii对七种植物病原性真菌，即胶胞炭疽菌、镰刀菌、指状青霉、柑桔褐腐疫霉、水稻纹枯病菌、核盘菌和白绢病菌的作用。将植物病原体真菌置于覆盖培养基的透析膜上，该培养基上之前已经培养了担子菌亚门真菌，由此使植物病原体真菌暴露给担子菌亚门真菌的提取物。Acaromyces ingoldii抑制全部植物病原性真菌的生长，而Meira spp.不同程度地阻止了这些真菌。在移回到不含提取物的培养基中后，全部植物病原性真菌继续生长，这表明担子菌亚门真菌的抑制作用是抑真菌性的。上述三种担子菌亚门真菌能在数天内抑制番茄叶上的核盘菌(S.sclerotiorum)生长，并且Meira spp.完全阻止了甜橙受指状青霉(P.digitatum)的感染，而A.ingoldii效用较低。初步检验的结果表明担子菌亚门真菌的抑制活性既不是因为碳氢化合物竞争，也不是因为分泌蛋白酶，而是小分子可能起到一定作用。
用微生物(包括真菌)进行植物病原性真菌的生物抑制近年来日益受关注。本发明人近来发现了几种土着真菌，该真菌归属于黑粉菌纲(担子菌门)的外担子菌亚纲，并被Boekhout、Theelen、Houbraken、Robert、Scorzetti、Gafni、Gerson和Sztejnberg(2003)描述为新分类群。虽然所述真菌由传播疾病的螨虫尸体获得，但本发明人检验了这些物种之一Meira geulakonigii Boekhout、Gerson、Scorzetti & Sztejnberg对抗白粉病的作用。该检验的基本原理是Meira属与Pseudozyma(Bandoni emend)属的相近亲缘关系。Boekhout的物种之一Pseudozyma flocculosa(Traquair、L.A.Shaw和Jarvis)Boekhout & Traquair已知为白粉病的拮抗剂。目标疾病是由棕丝单囊壳(Sphaerothecafusca(Fr.)Blumer)引起的影响黄瓜的黄瓜白粉病。本发明人发现用M.geulakonigii(Sztejnberg、Paz、Boekhout、Gafni和Gerson 2004)的芽生分生孢子进行处理后，白粉病的叶面覆盖率显著下降并且黄瓜果实产率显著增加。后来，本发明人报道了M.geulakonigii和其他新物种Meira argovae Boekhout、Gerson，Scorzetti & Sztejnberg和Acaromyces ingoldii Boekhout、Gerson、Scorzetti & Sztejnberg也可以抑制两种土壤传播的植物病原性真菌核盘菌(Lib.)de Bary和白绢病菌(Sacc.)(Gerson、Paz、Kushnir和Sztejnberg 2005)。本发明人之前假定Meira spp.和A.ingoldii均不是寄生型(Sztejnberg、Paz、Boekhout、Gafni和Gerson 2004)，其对螨虫和真菌的拮抗作用是由于分泌的毒素。该假设通过下述事实得以证实：使核盘菌和白绢病菌的菌核暴露给全部三种真菌的粗提取物(例如，没有真菌物质)，获得了对新兴菌丝生长的显著抑制(Gerson Paz、Kushnir和Sztejnberg 2005)。在后来的研究中(Paz、Burdman、Gerson和Sztejnberg 2007b)，本发明人发现，M.geulakonigii分泌物的粗提取物导致螨虫虫害100％的死亡率。本文中，本发明人提供了关于这三种真菌生物抑制剂(FBA)对植物病原性土壤传播真菌的影响的数据；本发明人还增加了关于来自FBA的分泌物粗提取物对于核盘菌和白绢病菌的作用以及对于水稻纹枯病菌(Kuehn)(烂根病的致病剂)的作用的数据。本发明人还描述了FBA对传播疾病的叶子和果实损伤型真菌的作用。这些真菌是：胶胞炭疽菌(Penz.)Penz.& Sacc.；镰刀菌Britz、Wingfield &Marasas；指状青霉Sacc.和柑桔褐腐疫霉(Sm.& Sm.)Leonian。
有益真菌的来源和培养
FBA来源地的细节见于Boekhout、Theelen、Houbraken、Robert、Scorzetti、Gafni、Gerson和Sztejnberg(2003)中。足以注意的是，M.argovae(分离菌AS005)得自棉叶螨(Tetranychus urticae Koch)的尸体，M.geulakonigii(分离菌AS004)来自死亡的柑橘锈螨(Phyllocoptruta oleivora Ashmead)，而且A.ingoldii(分离菌AS001)来自另一地点的同一螨虫。全部分离菌按常规方法在25℃黑暗中、在皮氏培养皿(直径9cm)中于3.9％重量/体积的马铃薯右旋糖琼脂(以250ppm氯霉素(PDAC)改良)上生长。
Meira argovae和M.geulakonigii也在锥形烧瓶中于液体培养基马铃薯右旋糖肉汤(PDB)上生长，但A.ingoldii(其在液体培养基中不形成芽生分生孢子)保持在PDAC上。对烧瓶内容物进行离心分离(4,000RPM)，倒出上清液并用50cc去离子水(dH2O)使含芽生分生孢子的残余物再次水合，由此获得芽生分生孢子悬浮液。然后通过用血细胞计进行计数而确定芽生分生孢子的浓度。通过将5cc dH2O添加至培育有真菌的皮氏培养皿中并重复相同步骤，来获得相似量的A.ingoldii芽生分生孢子。
植物病原性真菌和色藻菌的来源和培养
感染多种经济作物的核盘菌的培养物由发明人所在大学的O.Yarden教授处获得，来自以色列耶路撒冷希伯来大学的植物病理学和微生物学系(Department of PlantPathology and Microbiology)的培养物保藏。该真菌分泌伤害植物的草酸并形成可能在土壤中长期存活的菌核(Agrios 2005)。也感染多种作物的白绢病菌和水稻纹枯病菌(R.solani)的培养物由发明人所在大学的Y.Katan教授处获得；这些真菌也形成菌核。这些真菌保持在PDAC上。在将其暴露于各种粗提取物之前，这些真菌在其优选的温度(核盘菌在19℃，白绢病菌和水稻纹枯病菌在29℃)下于DWA(去离子水琼脂)上生长。该真菌的菌核通过使它们的培养物干燥然后收集干燥的菌核而获得。胶胞炭疽菌(C.gloeosporioides)和镰刀菌的培养物得自以色列Bet Dagan的Volcani研究所的S.Freeman博士。指状青霉的培养物接收自同一研究所的S.Droby博士，并且柑桔褐腐疫霉(P.citrophthora)的培养物得自本发明人实验室的培养物保藏。胶胞炭疽菌伤害多种大田作物以及柑桔和鳄梨，而镰刀菌是芒果畸形症的致病剂。指状青霉导致绿霉病，其伤害采摘的柑桔果实(例如，收获后疾病)，并且柑桔褐腐疫霉通过导致食物腐烂、流胶病和果实褐腐病而影响柑桔。全部真菌如FBA一样培养。在将其暴露给各种提取物之前，将其由PDA转移至DWA(为了避免可能干扰提取物作用的营养物的残余作用)并在25℃温育。
也对两种另外的病原性真菌即链格孢菌(Alternaria alternata(Fr.)Keissl，得自发明人所在大学)和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea(De Bary)Whetzel，来自以色列BetDagan的Volcani研究所的Y.Elad博士)进行了短期的非重复性观察。前者导致多种经济植物的叶斑病，而后者导致葡萄、草莓和多种蔬菜作物的灰霉病。这两种真菌如上进行培养。
实验设置
为了消除FBA和病原体之间的任何意外接触，将取自一周龄菌落的各FBA的盘(直径18mm)转移至置于皮氏培养皿中的PDAC上、切除自12-kDa截留分子量(12kDacutoff)的透析袋(Visking透析膜，12kDa，Medicell International LTD，伦敦，英国)的膜上。为了避免培养基与真菌之间的任何接触，膜的面积大于培养皿的面积，膜覆盖培养基以及培养皿的内壁。已知这些膜允许小分子的扩散而不允许大分子或酶的扩散。培养皿在25℃温育10天，然后除去含FBA的膜，留下培养基，该培养基含各FBA的提取物而不含其菌丝或芽生分生孢子等任何残余物(下文中称为“提取物培养皿”)。然后将已保存在DWA上的病原体培养物(包括两种“短期”真菌)的盘(直径8mm)置于提取物培养皿的中心。
大多数培养物保存在25℃(除了核盘菌保存在19℃，白绢病菌和水稻纹枯病菌保存在29℃)，并且每24小时测量其菌丝的生长；所得数据用于评估菌落生长。各个病原体-FBA组合分两组重复八次。对照培养皿(仅含PDAC)用相同的病原体接种并进行相似的检查。在记录提取物的作用后，将全部带病原体的盘放置在不含任何FBA提取物的PDAC片上。这样做是为了观察任何进一步的真菌生长并由此确定提取物作用是杀真菌性的还是抑真菌性的。
将5cc的dH2O添加至各个片上，将所获得的悬浮物倒入Eppendorf管中，然后用血细胞计进行计数，由此评估各病原体所产生的分生孢子或菌核的量(除了柑桔褐腐疫霉，其为产生游动孢子的物种，不能通过该方法检验)。重复次数如上。
病原体菌核和分生孢子的萌发和生产
将20个白绢病菌的菌核和20个核盘菌的菌核置于由各FBA获得的提取物培养皿上(水稻纹枯病菌在本培养物中不形成菌核)，并如上所述测量菌落生长，由此检验FBA对干燥菌核的萌发和菌丝生长的作用。含白绢病菌的培养皿保存在29℃，含核盘菌的培养皿保存在19℃，两天后评价萌发程度。分别在15天和10天后监测保存在提取物培养皿上的病原体培养物中白绢病菌和核盘菌的菌核生产。由于核盘菌不生产菌核(见下)，仅通过将白绢病菌的菌核置于用溴甲酚蓝(随着菌核萌发，其颜色将变为暗黄色)浸透的滤纸上来测试白绢病菌菌核的存活能力(Gamliel、Grinstein、Klein、Cohen和Katan 1998)。
将胶胞炭疽菌、镰刀菌和指状青霉的分生孢子在dH2O中的悬浮液(108ml-1)置于FBA的提取物培养皿上并在25℃温育，前两种真菌温育一周，指状青霉仅温育4天。温育期结束时，在每个培养皿的四个显微场中对萌发的分生孢子(其萌发管超过相关分生孢子的长度)数进行计数，取平均值并计算萌发百分比。各病原体-FBA组合分两组重复四次。如上所述制备并检查对照培养皿。
此外，将含指状青霉分生孢子(其根本不萌发，见下文)的盘转移至不含任何真菌提取物的PDAC培养皿上，从而如上所述确定抑制作用的持续时间。
有益真菌在番茄叶片上对核盘菌的抑制
将番茄幼苗小叶置于皮氏培养皿中的湿润滤纸上，并喷洒各FBA的芽生分生孢子在dH2O中的1-5×108ml-1悬浮液；对照叶仅以水处理。将封闭的培养皿在19℃保存10天，然后将从核盘菌培养物中间取出的盘(直径2mm)置于各小叶上。将培养皿恢复至19℃。每24小时测量叶片上的菌丝生长(直到对照叶被病原体覆盖为止)，并使用所获得的数据评估FBA抑制程度。各FBA检测两次，每次5～8片小叶，分为5份。
如前文描述(Paz、Burdman、Gerson和Sztejnberg 2007b)，通过扫描电子显微镜(SEM)检查用FBA处理然后用核盘菌处理的番茄叶片。简言之，将样品浸泡在戊二醛(5％)中2小时，用缓冲磷酸盐(pH 7.2)彻底清洗，干燥并镀金。然后通过JSM 5410扫描电子显微镜(Jeol Ltd，日本东京)以高真空模式检查样品，从而检查叶片上FBA与病原体之间的实际相互作用。
有益真菌对甜橙的柑桔绿霉病的抑制
用90％的乙醇对采摘自Rehovot附近的有机果园的甜橙(Citrus sinensis cv.NewHall)进行表面杀菌。如上所述获得FBA芽生分生孢子，并将各悬浮液(108ml-1)喷洒在甜橙上，然后将甜橙保存在25℃的无菌湿度箱中10天。保存期间，使用无菌器械在其表皮上划出小伤口(2mm长和深)，并将50ml的指状青霉分生孢子悬浮液(5×103ml-1)涂抹在各伤口上。将各FBA施加到10个甜橙(分两组，每组5个)上，并将所述甜橙与合适的对照物(有伤口但不用FBA处理)一起保存在25℃以用于观察。当对照甜橙完全被霉菌覆盖时，评估受损程度。从显示绿霉病抑制作用的甜橙上取样并制备薄切片以如上所述用于SEM检查。
检查FBA的作用模式
为了获得关于FBA作用的抑制模式的初步数据而进行了若干测试。所述测试包括确定FBA的碳氢化合物消耗率、评价小分子(已知与大分子和酶相比可穿过透析膜的分子)的作用和确定FBA源的水解蛋白酶是否抑制病原体。
碳氢化合物(糖)的利用
该测试用于确定FBA的抑制活性是否源于碳水化合物竞争。使用Poola，Bhuiyan、Ortiz、Savant、Sidhom、Taft、Kirschenbaum和Kalis(2002)的稍有改进的步骤进行该测试。将70ml浓硫酸添加至30ml的dH2O中，然后添加200mg蒽酮(Sigma)，由此配制蒽酮试剂。将0.0mg、0.005mg、0.01mg、0.05mg和0.1mg葡萄糖放入玻璃管中的1ml dH2O中，并在各玻璃管中添加5ml蒽酮，由此绘制标准(或稀释)曲线。然后将玻璃管在100℃水浴中煮沸5分钟，并从各玻璃管中取出1ml葡萄糖浓缩物，然后通过分光光度计在620nm读数，从而获得标准曲线。10天后测试被透析膜覆盖的培养基，所述透析膜上生长有FBA。从各FBA(来自三个不同的提取物培养皿)中取出盘(直径13mm)并将盘置于塑料密封管(13ml)中。使密封管中的培养基在沸水中液化，并将各个从密封管中取出的0.1ml样品稀释在0.001、0.005和0.01dH2O中。将各1ml经稀释物转移至玻璃管中，向其中添加5ml的蒽酮试剂，并在100℃水浴中保持5分钟。将1ml的各样品转移至比色皿中并用分光光度计在620nm读数。各个稀释液进行四次独立读数，各个FBA进行两次独立实验。通过比较所获得的结果与来自稀释曲线的数据来计算FBA的糖利用率。
FBA分泌的蛋白酶的作用
这些测试用来确定FBA的抑制活性是否源于其分泌的蛋白酶(Elad和Kapat1999)。实验步骤是对Kanemitsu、Nishini、Kunishima、Okamura、Takemura、Yamamoto和Kaku(2001)的方法略加改进而进行，从而确定FBA源的水解蛋白酶(无论是在提取物培养皿中还是源自FBA芽生分生孢子)是否参与了病原体抑制。该实验在含5ml明胶(作为底物)的皮氏培养皿中进行。将来自10天龄FBA培养物(已被透析膜覆盖)的盘(直径8mm)置于培养皿中的明胶中央，并在25℃温育7天。通过在各培养皿中添加0.1ml的15％三氯乙酸(TCA)溶液来确定蛋白酶活性。TCA使得明胶变得混浊，而分解的底物变得透明；由此在培养皿的中间形成清晰的光环。如上所述测量了来自原始PDA(不含FBA)的盘和添加了来自0.1gr/ml dH2O浓缩物的0.02ml蛋白酶K(Sigma)的类似盘(作为对照)，以及蛋白酶活性。
在含5ml明胶(作为底物)的皮氏培养皿中进行M.argovae和M.geulakonigii的芽生分生孢子的蛋白酶分泌测试。在各培养皿中的明胶中间挖出小槽(深3.0mm，直径8.0)。将其上培育有M.argovae和M.geulakonigii的PDB培养基(如上所注，A.ingoldii在液体培养基中不形成芽生分生孢子)于25℃在4,000rpm进行离心分离10分钟。然后将来自(各FBA的)上清液的且含未沉淀的芽生分生孢子的小样品(0.2ml)放入小槽中。另一样品用筛网(0.45微米孔，Schleicher & Schull，伦敦)过滤，由此获得不含芽生分生孢子的液体，也将该样品置于明胶小槽中。有两组对照：在一组小槽中放入原始PDB，而在另一组小槽中放入蛋白酶K(0.02ml)。全部培养皿在25℃温育三天并进行评价；各FBA分两组进行测试，每组4份。
FBA生产的小分子的作用
该测试的目的是确定FBA的抑制活性是源于所分泌的能穿过12kDa透析膜的小分子，还是源于暂时被称为毒素的其他化合物。这就需要两段式检验：首先将经加热的纯化活性材料施加在细菌菌落上，然后将提取物培养皿中经加热的内容物施加在病原体真菌上。
测试细菌是根癌土壤杆菌(菌株ID1)，其得自发明人所在大学的Leonid Chernin教授，并且已显示出对FBA敏感。根癌土壤杆菌在含5ml Lennox肉汤(LB)(Difco)的管中于28℃进行持续振动，由此生长过夜。将50-μl试样量的该细菌悬浮液添加至5ml含0.6％琼脂的LB中，并置于较小(直径5mm)皮氏培养皿中。采用HPLC步骤(Paz 2007)纯化得自10日龄FBA菌落的提取物培养皿的明显活性毒素，并加热至100℃保持15分钟。然后冷冻来自各FBA的10μl经加热的培养基并倒入根癌土壤杆菌培养皿中间。相似量的经纯化但未加热的毒素以及来自各FBA的提取物培养皿的未加热培养基一起用作对照。培养皿在28℃温育24小时并观察任何发展的抑制光环。
从10日龄FBA菌落中取出盘(13mm)，将其密封于无菌管(13ml)中，并立即将无菌管放入沸水中15分钟直到培养基完全煮沸，由此检验分泌进培养基中的FBA蛋白质(小分子)的作用。将煮沸的培养基倒入5ml皮氏培养皿中，固化后，将指状青霉或核盘菌的一周龄培养物的DWA盘放在培养皿的中间。来自FBA的非煮沸培养基用作对照。使指状青霉培养皿在25℃保持3天，将核盘菌培养皿在19℃保持3天。全部实验对各病原体均重复两次，每次四份(四个管)。
统计分析
通过Dunnett检验(p＝0.05)使用双向ANOVA并采用JMP 5.1.2.Software(SASInstitute，Cary，NC)来分析获得的全部生长和萌发抑制数据。分析前数据进行反正弦(arc-sin)转换。使用得自对照处理物的数据作为参照组。
结果——菌落生长和分生孢子生产的抑制作用
这些实验不得不在数天后结束(水稻纹枯病菌、白绢病菌和核盘菌为3～4天，其他真菌为约一周)，因为对照培养皿完全被病原体菌丝覆盖。FBA抑制了全部病原体的生长，但抑制的方式不同。在其上生长有A.ingoldii的提取物培养皿中获得了最强的抑制作用(图1)；其上仅有水稻纹枯病菌和镰刀菌产生菌丝。M.argovae和M.geulakonigii的提取物也抑制全部病原体，但抑制程度有差异。它们对指状青霉和柑桔褐腐疫霉有相似的抑制效果，以不同程度影响胶胞炭疽菌、镰刀菌(其完全不受M.geulakonigii提取物的影响)和水稻纹枯病菌，并对核盘菌具有相似效果；白绢病菌看起来受到最小的影响。
短期观察显示出FBA的提取物还抑制链格孢菌(A.alternata)和灰葡萄孢菌(B.cinerea)菌落的生长。对前者的作用相当温和，类似于胶胞炭疽菌，而后者则受到更为强烈的影响，类似于核盘菌。
当随后将含有迄今为止抑制的病原体培养物的盘置于不含任何FBA提取物的PDAC上时，所有的真菌继续生长并继续生产分生孢子。
菌核和分生孢子生产的抑制
生长在三种FBA的提取物培养皿上的核盘菌不产生菌核。相反，白绢病菌产生不同数量的菌核(A.ingoldii提取物上平均为39±9.0，M.argovae提取物上平均为87±9.3，M.geulakonigii提取物上平均为50±5.2，均明显小于对照培养皿中约343±19.3的平均值)。并且，其菌核仅在培养皿边缘生长并且明显小于对照组中的那些。已在FBA提取物上发育出的白绢病菌菌核的存活能力(用溴甲酚蓝测试)与对照组菌核的存活能力无差异，在全部情况中均达到近100％。
已在A.ingoldii的提取物培养皿上培养的指状青霉完全没有形成分生孢子，但在两种Meira spp.上产生了相似数量(约5×102)的分生孢子。由镰刀菌和胶胞炭疽菌形成的分生孢子数量与对照组中产生的数量无差异(数据未示出)。
对灰葡萄孢菌的非平行(non-replicated)观察显示出该病原体得到FBA抑制的程度与核盘菌相同。链格孢菌的发育受到较小程度的阻碍，其类似于胶胞炭疽菌中的所见。
菌核和病原体分生孢子的萌发
核盘菌和白绢病菌的菌核在多种FBA提取物上的萌发在这两种病原体之间有差异。M.argovae和M.geulakonigii的提取物对前一病原体的菌核萌发没有作用，而A.ingoldii的提取物完全抑制萌发。然而，白绢病菌菌核在后一病原体提取物上的萌发受到其在每个培养皿中的数量的影响。当每个培养皿仅放置一个菌核时，没有菌核萌发，但当5个或20个菌核放置在一起时，分别有70％和82％的萌发(表1)。
表1：白绢病菌菌核在其上培育有Acaromyces ingoldii(Ai)、Meira argovae(Ma)和Meira geulakonigii(Mg)的提取物培养皿上的萌发百分比
指状青霉的分生孢子萌发受到全部三种FBA的完全抑制，而M.argovae对胶胞炭疽菌和镰刀菌没有作用，M.geulakonigii仅影响后一病原体(表2)。当将指状青霉的分生孢子(迄今为止未能萌发)置于不含提取物的PDAC上时，其萌发并形成正常的菌丝。
表2：胶胞炭疽菌、镰刀菌和指状青霉的分生孢子在其上培育有Acaromycesingoldii(Ai)，Meira argovae(Ma)和Meira geulakonigii(Mg)的提取物培养皿上的萌发百分比。星号表示与对照物有显著性差异(P＜0.05)
Figure BDA0000156114620000202
自菌核的菌丝生长的抑制
生长有A.ingoldii的提取物培养皿再次引发最强的抑制作用，其上没有发育出核盘菌或白绢病菌的菌丝。前一病原体的生长也几乎受到M.argovae和M.geulakonigii提取物的完全抑制(图9A)。相反，白绢病菌的菌落生长虽然仍显著小于对照物(图9B)，但其在M.argovae和M.geulakonigii的提取物培养皿上还是可观的。白绢病菌在提取物上自其菌核的生长方式与其自菌丝的发育相似，但慢于后者(图1)。
FBA在番茄叶片上对核盘菌的抑制
全部FBA均显著抑制番茄小叶上核盘菌的生长，但是程度不同(图10)。然而，到第四天时，抑制程度下降。后来的观察表明全部小叶均随后被病原体覆盖(数据未示出)。
FBA对甜橙的绿霉病接种的抑制
Meira argovae和M.geulakonigii完全抑制经感染甜橙上绿霉病的发展，而A.ingoldii的作用远低于良性(50％感染)，但是损伤仍显著小于对照果实(80％感染)(图11)。
SEM显微照片显示全部三种FBA均存在于果皮上并经由气孔渗入果实(图12)。
碳水化合物(糖)的利用率
FBA的糖利用率相当低，因为10天后其被A.ingoldii消耗了近15.6％(与对照相比)，被Meira argovae消耗达14.5％，被M.geulakonigii消耗达到21.9％。这表明碳氢化合物竞争至多是影响FBA抑制病原体的次要因素。
FBA分泌的蛋白酶的作用
在含FBA菌丝的培养皿中温育一周～两周后发展出约1～2mm的弱光环，而在含PDB的培养皿中没有出现光环(数据未示出)。这表明所检验的两种FBA的菌丝均产生了外部蛋白酶。相反，在存在芽生分生孢子的检验中发现没有光环(意味着没有蛋白酶分泌)，表明后者不产生蛋白酶。
FBA产生的小分子的作用
与对照物相比，小分子的变性(由沸水浴导致)显著降低M.argovae和M.geulakonigii对核盘菌和指状青霉的抑制作用(图6)。不过，其仍保持了相当大的显著性抑制。相反，煮沸处理没有降低A.ingoldii提取物片的抑制活性，表明该真菌分泌了不同的二级化合物。
将M.argovae和M.geulakonigii产生的蛋白质小分子煮沸，对根癌土壤杆菌的生长率没有抑制作用，因为在暴露给经煮沸提取物和暴露给未经煮沸提取物的微生物菌落中发展出相似的抑制光环(数据未示出)。
植物病原体的生物抑制中所用的真菌采用多种拮抗方法，包括寄生、生存空间竞争和营养源竞争、改变化学环境、分泌毒性或抑制性二级化合物和诱发产生寄主植物抗性因子的化合物(Agrios 2005；Elad 2000)。置于原始PDAC上的全部病原体在暴露给FBA提取物后均恢复正常生长的事实强烈表明FBA的反作用可能是抑真菌性。该假设得到下述观察结果的支持：迄今为止在提取物培养皿上未能发育的指状青霉分生孢子在置于不含提取物的PDAC上时萌发并形成正常菌丝，并且FBA对核盘菌感染番茄叶片只有短期作用。此外，FBA提取物的抑制作用似乎是剂量依赖性的，如在培养皿中放置更多菌核时抑制的下降所示。
许多拮抗性真菌通过养分竞争来抑制病原体发育，例如，已知黑细基格孢(Ulocladium atrum(Preuss)Sacc.)利用可获得的食物源比核盘菌更快来抑制后者。本发明人的关于FBA的可能作用模式的初步数据表明糖竞争最有可能在病原体生长的抑制中不起作用。已知一些拮抗性真菌分泌蛋白酶以杀伤病原体；例如，哈茨木霉菌(Trichoderam harzianum Rifai)分泌能够降低病原体灰葡萄孢菌活性的蛋白酶。关于FBA，蛋白酶的分泌至多占有相当小的作用。关于大分子，煮沸测试表明其同样未参与抑制，但不能排除小分子，因为其降低两种Meira spp.的抑制作用(图13)。
本发明人之前注意到(Paz、Gerson和Sztejnberg 2007a)，三种FBA各自对几种传播疾病的螨虫(蜱螨亚纲)物种具有不同的作用，并且在本研究中也发现了类似现象。FBA各自对各病原体有不同影响，显示出不同的选择性，该选择性的不同可能是由于其毒素不同导致的。A.ingoldii的提取物对全部目标真菌具有最强的作用，而两种Meira spp.的影响则不同。不过有趣的是虽然A.ingoldii的提取物完全抑制指状青霉的菌落生长(图8)，但是该FBA提供给甜橙的对抗病原体的保护显著小于Meira spp.(图11)。在实验室或田地里施加FBA时，FBA有效性的这种差异是公知的。
甜橙气孔的渗入(图12)表明，就葡萄柚(Paz、Burdman、Gerson和Sztejnberg 2007b)而言，FBA可以在果实组织中存活(例如，是内寄生的)。这些内寄生FBA的长期影响(如上所注，其作用主要是抑真菌性的)可能是由于其连续分泌抑制性毒素。Backman和Sikora(2008)认为内生真菌是生物抑制的新兴手段，其与本发明人关于FBA(特别是Meira spp.)抑制甜橙绿霉病的发现(图11)相一致。这些微观照片(图12)表明全部三种FBA均可能对指状青霉的分生孢子和萌发管具有亲和力，导致其局部萎缩。随后的实验可能显示出用FBA接种柑桔果实是否可用作对抗真菌的防卫机制。
先前本发明人显示了三种FBA抑制几种植食性螨虫(Gerson、Paz、Kushnir和Sztejnberg 2005；Paz、Gerson和Sztejnberg 2007a)，现在本发明人将此类易敏感的目标虫害的谱带扩宽至植物病原性真菌。
最后，有趣的是，上述病原体被分配至不同的两界：真菌界和色藻界(Agrios2005)。前者包括不同的高等真菌组的类群(子囊菌亚门的胶胞炭疽菌、镰刀菌、指状青霉和核盘菌，担子菌亚门的水稻纹枯病菌和白绢病菌；相反，柑桔褐腐疫霉属于色藻界的卵菌门(Oomycotina))。因此，值得注意的是，上述病原体全部受A.ingoldii的相似影响(图8)，而两种Meira spp.对该七种病原体的作用则各异。此外，Meira spp.对担子菌亚门的白绢病菌的阻碍小于两种子囊菌亚门病原体(图8和图9B)，表明对FBA的不同敏感性。最后，对FBA敏感的病原性真菌的广谱范围表明FBA也可以抑制其他病原体(包括病原性细菌)。
虽然已采用一些具体实例描述了本发明，但可以对本发明进行多种改进和变型。因此应当理解，本发明可以在所附权利要求的范围内得到实现，而不限于上述具体描述。
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Claims (18)

1.一种农药组合物，所述组合物包含式I的化合物作为活性成分：
Figure FDA0000156114610000011
其中，R1和R2独立地选自H、C1～18烷基和C1～18酰基。
2.如权利要求1所述的农药组合物，所述组合物是杀螨剂组合物。
3.如权利要求1所述的农药组合物，所述组合物是杀细菌剂组合物。
4.如权利要求1所述的农药组合物，所述组合物是杀真菌剂组合物。
5.如权利要求1所述的组合物，所述组合物用于抑制或预防经济植物的螨虫感染。
6.如权利要求5所述的组合物，所述组合物显示抗细菌活性。
7.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含至少一种下述组分和另外的活性成分，所述组分选自由农业可接受载体、稀释剂、乳化剂和分散剂组成的组，所述活性成分选自除草剂、杀虫剂、生长促进剂和化肥。
8.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含来自真菌Meira argovae的提取物，所述提取物显示出杀螨剂活性和杀细菌剂活性。
9.一种抑制易感植物的螨虫性、真菌或细菌感染的方法，所述方法包括将权利要求1所述的组合物施加到所述植物上或施加到所述植物附近。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述组合物具有杀螨剂活性和杀细菌剂活性。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述植物包括水果、蔬菜或观赏花卉。
12.权利要求1所述的组合物的制备方法，所述方法包括培养真菌、提取培养基、和色谱分离所述真菌的释放进入所述培养基的代谢物。
13.如权利要求12所述的方法，所述方法包括生产式II的代谢物：
其中，通过调节所述培养基的pH来增加所述生产。
14.一种抑制植物被细菌感染的方法，所述方法包括将下述组合物施加到所述植物上或施加到所述植物附近，所述组合物包含选自Meira argovae、Meira geulakonigae和Acaromyces ingoldii.的真菌的提取物，或者源自所述提取物的生物活性制品。
15.一种抗细菌性农用组合物，所述组合物包含选自Meira argovae、Meirageulakonigae和Acaromyces ingoldii.的真菌的提取物或者源自所述提取物的生物活性制品作为活性成分。
16.生物活性制品，所述制品源自选自由M.geulakonigae、M.argovae和A.ingoldii组成的组中的真菌，其中，所述制品的生物活性是杀细菌活性。
17.生物活性制品，所述制品源自选自由M.geulakonigae、M.argovae和A.ingoldii组成的组中的真菌，其中，所述制品的生物活性是杀螨活性。
18.生物活性制品，所述制品源自选自由M.geulakonigae、M.argovae和A.ingoldii组成的组中的真菌，其中，所述制品的生物活性是杀真菌活性。
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