CN102575225A - 用于将生物分子转染进细胞的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新组合物，所述组合物被描述用于同时、控制剂量地递送多种生物分子进入吞噬细胞。所述组合物为生物活性组合物，其包含：(1)至少一种以下生物活性组分：(a)核酸或其衍生物；(b)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物；(c)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物；(d)脂多糖或其衍生物；(e)肽聚糖或其衍生物；(f)糖或其衍生物；(g)脂质或其衍生物；(h)脂肽或其衍生物；(i)金属离子；(j)硫醇；(k)抗生素或其衍生物；(l)维生素或其衍生物；(m)生物类黄酮或其衍生物；(n)抗氧化剂或其衍生物；(o)免疫应答调节剂；(p)抗体；(q)生物活性非金属；(r)组胺或抗组胺剂；和(s)激酶抑制剂；以及(2)至少一种载体，其将所述组合物有效递送至吞噬细胞，以使所述生物活性组分被所述吞噬细胞摄取并影响其生物活性。

Description

用于将生物分子转染进细胞的组合物
交叉引用
本PCT申请要求Grandics等人于2009年4月20日提交的美国临时申请序列号61/170,945(题目为“Compositions for Transfection of Biomoleculesinto Cells”)的优先权，其内容通过援引整体并入本文。
背景技术
本发明提供可将生物活性分子引入(转染)到哺乳动物细胞中的组合物。核酸的转染是分子生物学中已充分开发的领域，其应用多种方法，例如试剂(例如，DEAE-葡聚糖、磷酸钙、脂转染剂(lipofectin)、病毒载体)、电穿孔、基因枪或显微注射。蛋白递送方法也包括阳离子脂质、脂质体和载体肽。糖类的转染以及控制剂量地引入特定金属则未被充分开发。此外，开发这样的转染方法是很重要的：允许控制剂量、同时将多种生物活性组分(核酸和衍生物、脂肽、脂多糖、肽聚糖、脂质、蛋白质和肽、离子、硫醇化合物、抗生素、维生素、生物类黄酮、抗氧化剂等)递送进特定的细胞亚群，例如吞噬细胞(包括树突细胞、巨噬细胞和B细胞)。这些分子的差异很大的理化特征可干扰将其整合进入现有的递送载体中，所述载体在体内非特异性地靶向多种细胞类型。因此，需要在体外和体内都工作的新的细胞递送系统来同时将可能的最广泛范围的生物分子转染进入吞噬细胞中。
发明内容
根据本发明，描述了用于同时、控制剂量地将多种生物分子递送进入吞噬细胞的新组合物。
因此，本发明的一个方面是生物活性组合物，其包含：
(1)至少一种以下生物活性组分：
(a)核酸或其衍生物；
(b)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物；
(c)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物；
(d)脂多糖或其衍生物；
(e)肽聚糖或其衍生物；
(f)糖或其衍生物；
(g)脂质或其衍生物；
(h)脂肽或其衍生物；
(i)金属离子；
(j)硫醇；
(k)抗生素或其衍生物；
(l)维生素或其衍生物；
(m)生物类黄酮或其衍生物；
(n)抗氧化剂或其衍生物；
(o)免疫应答调节剂；
(p)抗体；
(q)生物活性非金属；
(r)组胺或抗组胺剂；和
(s)激酶抑制剂；以及
(b)至少一种载体，其将所述组合物有效递送至吞噬细胞，以使所述生物活性组分被所述吞噬细胞摄取并影响其生物活性。
在所述组合物中，所述分子可作为混合物存在。或者，所述分子可化学连接在一起。所述载体通常为微粒(microparticle)。优选地，所述微粒具有窄的粒度分布范围。所述微粒可为多孔的或非多孔的。通常情况下，所述微粒的直径小于10μm；更通常地，所述微粒的直径小于约5μm。通常地，所述微粒由生物聚合物制成。在一个备选方案中，所述组分非共价附着至所述微粒。在另一个备选方案中，所述组分共价附着至所述微粒。
本发明的另一个方面是在细胞培养物或细胞亚群中或在多细胞生物(例如，植物、动物或人类受试者)中诱导生物学应答的方法，所述方法包括施用有效量的组合物的步骤，所述组合物包含与微粒相连的选定的生物活性组分，其中所述微粒小于病原体的粒度范围，或与其范围相同。
根据本发明，所述组合物的施用可在细胞培养物中进行，或通过粘膜途径、肠胃外途径或皮肤途径施用到宿主中。也可以替代性地使用其他施用途径。
本发明的另一方面是用于研究急性感染的作用的方法，慢性炎性疾病选自变态反应、哮喘、自身免疫病和癌症，或肿瘤转移，所述方法包括步骤：
(1)提供对病症易感的动物模型，所述病症选自变态反应、哮喘、自身免疫病、癌症和肿瘤转移；
(2)向所述动物模型施用本发明的组合物，以通过由施用所述组合物所引发的免疫应答来治疗或预防该动物模型中的感染，其中，在所述组合物中，微粒具有与病原体相同的粒度范围，其中所述组合物包含免疫活性抗原或抗原性表位，并且其中所述免疫活性抗原或抗原性表位是肽、蛋白质、重组肽或多重肽(multi-peptide)或重组蛋白；和
(3)测定步骤(2)中所施用的组合物对所述病症的影响，所述病症选自变态反应、哮喘、自身免疫病、癌症和肿瘤转移。
具体实施方式
本发明描述了组合物以及将所述组合物靶向某些细胞群和在动物模型中诱导免疫应答的方法。
需要生产药剂和递送载体，以用于控制剂量地递送具有互斥的理化特性的多种生物活性分子。例如，核酸或脂多糖在多胺分子、碱性肽和/或过渡金属(例如，锌离子)存在下沉淀出来，这种现象使其无法与其他生物活性分子混合并同时施用(尽管其控制剂量施用至细胞可能是引起特定的生理应答(例如，保护性免疫)所必需的)。阳离子脂质/脂质体递送载体无法有效递送阳离子分子。我们的结论是，病原体大小的微粒会提供递送理化性质截然不同的生物分子(本文中也描述为生物活性组分)的最佳方法，因为可以选择性地连续附着配体。因此，通过本发明，可将生物活性分子靶向给药至大量吞噬细胞。
我们研究了通过包含脂多糖的载体(例如，天然琼脂糖或其他可生物降解的载体)将生物活性分子靶向至特定细胞。琼脂糖的优势是其为天然多糖，是可生物降解的D-半乳糖聚合物，并已证明与哺乳动物细胞相容。肠胃外施用的琼脂糖微粒已被证明显示出弱的巨噬细胞活化能力以及与氢氧化铝相当的佐剂特性(Gronlund H.等，Carbohydrate-based particles：a newadjuvant for allergen-specific immunotherapy.Immunology，2002；107，523-529)。
从终端使用者的角度来看，所述组合物不需要冷藏但却仍然具有很长的保质期是很重要的。琼脂糖颗粒满足这些要求。此外，所述组合物的施用尽可能简单是很重要的。因此，可粘膜施用的组合物比肠胃外施用更有优势。然而，因为消化系统的分解代谢作用，粘膜应用受到稳定性问题的困扰。
我们的结论是，连接到多孔琼脂糖基质的生物分子可免受GI道中的降解。此外，琼脂糖微粒的大小(＜5μm)可使其适于允许所述颗粒进入派伊尔氏斑(PP，Peyer′s patch)。
我们在动物模型系统中确定，当在支原体攻击之前向动物施用本发明的组合物时，可实现针对(鸡败血支原体，Mycoplasma gallisepticum)感染性菌株的显著程度的免疫保护。此外，还在预先感染的动物中观察到了特征性病理症状的逆转，表明该微粒有效地治疗已感染的动物。由于各种微生物株的广泛抗生素抗性，这是有重大意义的。此外，我们发现，与文献中所述使用整合有抗原的微粒时超过100μg相比，通过本方法，每只动物仅需要极少量的抗原(1～10μg)就可引起保护性应答。(Brayden，D.2001 EuropeanJournal of Pharmaceutical Sciences 14：183-189)。这提示，所述免疫调节剂颗粒在穿过动物肠道时并不降解，并且其以高效的方式递送至所靶向的粘膜免疫细胞。
生物活性分子可非共价或共价地附着至微粒。共价附着的方法是本领域中已知的，并描述于例如P.Tijssen，″Practice and Theory of EnzymeImmunoassays″(Elsevier，Amsterdam，1985，283-289页)，S.S.Wong，″Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking″(CRC Press，BocaRaton，Florida，1993)，T.E.Creighton编辑，″Protein Function：A PracticalApproach″(IRL Press，Oxford，1989)和G.T.Hermanson，″BioconjugateTechniques″(Academic Press，San Diego，1996)中，其均以援引方式并入本文。通常情况下，当所述微粒为可生物降解的天然多糖(例如，琼脂糖)时，所述生物活性分子附着至可生物降解的天然多糖的聚合物链中的羟基。一般来说，形成含有良好离去基团(用于后续的亲核取代)的中间反应性衍生物的某些化合物可活化多糖的羟基残基。这些活化羟基与亲核试剂例如胺(例如，蛋白质或肽中的赖氨酸基团)的反应导致稳定的共价键，所述共价键将生物活性分子交联至可生物降解的天然多糖的聚合物链。合适的试剂包括羰二咪唑、氯甲酸酯/盐衍生物、三氟乙磺酰氯(tresyl chloride)、甲苯磺酰氯(tosyl chloride)、溴化氰、二乙烯基砜、氰尿酰氯和双环氧化物(bis-epoxide)。或者，可用氯乙酸修饰糖类聚合物(例如，琼脂糖)的羟基以产生羧酸酯官能团。再或者，可在多糖上产生胺官能团；糖分子或所产生的醛的还原末端可与低链长度(即，所述链通常少于约6个碳原子)的二胺化合物反应，获得可用于后续缀合反应的短烷基胺间隔物(spacer)。可类似地用双酰肼化合物产生酰肼基团。随后，可以使用各种反应将所产生的官能团偶联至生物活性分子。例如，如果产生羧基，则可通过混合酸酐法、碳二亚胺法、使用二环己基碳二亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺酯法，将其缀合至蛋白质或多肽。可通过多种方法包括碳二亚胺、甲苯基-2，4-二异氰酸酯或马来酰亚胺化合物(尤其是马来酰亚胺衍生物的N-羟基琥珀酰亚胺酯)将脂肪胺缀合至蛋白质或肽。这种化合物的一个例子为4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己基-1-羧酸。另一个例子是间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯。还可使用的另一种试剂是N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶联硫基)丙酸酯。此外，可使用双官能团酯类(例如，庚二亚氨酸二甲酯(dimethylpimelimidate)、己二亚氨酸二甲酯(dimethyladipimidate)或辛二亚氨酸二甲酯(dimethylsuberimidate))将含有氨基的部分偶联至蛋白质。用于将化合物(包括肽、蛋白质和糖类，以及其他化合物)共价连接到固体支持物上的其他方法是本领域中已知的。用于非共价附着的方法依赖于多种非共价相互作用(例如，氢键、疏水键、金属螯合)以及可稳定所述相互作用的盐键。
通常情况下，要递送的生物分子(本文中也描述为生物活性组分)为以下至少一种：
(1)核酸或其衍生物；
(2)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物；
(3)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物；
(4)脂多糖或其衍生物；
(5)肽聚糖或其衍生物；
(6)糖或其衍生物；
(7)脂质或其衍生物；
(8)脂肽或其衍生物；
(9)金属离子；
(10)硫醇；
(11)抗生素或其衍生物；
(12)维生素或其衍生物；
(13)生物类黄酮或其衍生物；
(14)抗氧化剂或其衍生物；
(15)免疫应答调节剂；
(16)抗体；
(17)生物活性非金属；
(18)组胺或抗组胺剂；和
(19)激酶抑制剂。
本文中使用的术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的寡核苷酸或多核苷酸，包括单链或双链形式，以及编码或非编码(例如，“反义”)形式。该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸。该术语还包括含有修饰或替换的碱基的核酸，只要所述修饰或替换的碱基即不干扰互补核苷酸的Watson-Crick结合也不干扰与特异性结合的蛋白质(例如，锌指蛋白)与核苷酸序列的结合。该术语还包括具有合成骨架的核酸样结构。本发明提供的DNA骨架类似物包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3’-硫缩醛、亚甲基(甲基亚氨基)、3’-N-氨基甲酸酯、吗啉代氨基甲酸酯和肽核酸(PNA，peptidenucleic acid)；参见Oligonucleotides and Analogues，a Practical Approach，F.Eckstein编辑，IRL Press at Oxford University Press(1991)；AntisenseStrategies，Annals of the New York Academy of Sciences，Volume 600，Baserga和Denhardt编辑(NYAS 1992)；Milligan(1993)J.Med.Chem.36：1923-1937；Antisense Research and Applications(1993，CRC Press)。PNA含有非离子骨架，例如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元。硫代磷酸酯连接描述于例如U.S.Pat.No.6,031,092；6,001,982；5,684,148；还见于WO 97/03211；WO 96/39154；Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144：189-197。该术语所涵盖的其他合成骨架包括甲基磷酸酯连接或交替的甲基磷酸酯和磷酸二酯连接(见例如U.S.Pat.No.5,962,674；Strauss-Soukup(1997)Biochemistry 36：8692-8698)，以及苄基磷酸酯连接(见例如，U.S.Pat.No.5,532,226；Samstag(1996)Antisense Nucleic Acid Drug(Dev 6：153-156)。
本文中使用的术语“核酸”还包括DNA和RNA，以及天然和合成形式的DNA和RNA，以及RNA-DNA杂交体。对于DNA，该术语“核酸”包括单链和双链DNA，以及部分双链的DNA，其还包括线性和环状DNA，以及信使RNA(mRNA)逆转录制备的cDNA。对于RNA，该术语“核酸”包括例如核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)和信使RNA(mRNA)的RNA形式，以及RNA分子例如小干扰RNA(siRNA，small interfering RNA)和小发卡RNA，所述小干扰RNA为20～25个核苷酸长度的短双链RNA分子，其在两个末端具有2个核苷酸的3’突出端，其在RNA干扰途径中有活性，干扰特定基因的表达。可并入本发明的另一类核酸的例子是小RNA(microRNA)。它们是非编码的寡核苷酸，是基因表达的强调节剂，在多种组织中在成形细胞发育和分化中发挥关键作用。小RNA水平的失调与多种恶性疾病有关。可并入本发明的另一种类型的核酸为聚I:C(poly I:C)(实施例4)，其为已知的与Toll样受体(TLR)3相互作用的免疫刺激剂，所述受体表达于B细胞和树突状细胞的胞内区室中。聚I:C在结构上类似于双链RNA，其存在于一些病毒中，并且是TLR3的“天然”刺激剂。因此，聚I:C可被认为是双链RNA的合成类似物。Toll样受体7、8和9都涉及对病原体来源的核酸或寡核苷酸的感受。
已知很多核苷酸和核苷是有生物活性的。其例子包括但不限于腺苷三磷酸(ATP)、鸟苷三磷酸(GTP)和环AMP(cAMP)。ATP和GTP是能量来源，而cAMP在很多信号转导系统中作为信号调节子或第二信使发挥作用。其他生物活性核苷酸和核苷是本领域已知的。
蛋白质包括酶、膜蛋白、分泌蛋白、转运蛋白、受体蛋白、结构蛋白、抗体、抗体片段和其他生物活性蛋白。本文中使用的术语“蛋白质”包括包含单个多肽链的蛋白质和包含多个多肽链(有时称为“亚基”)的蛋白质，当蛋白质包含亚基时，所述亚基可通过共价或非共价相互作用连接在一起。本文中提及的“蛋白质”包括提及多亚基蛋白的单个亚基。肽为少于约50个氨基酸长度的聚-α-氨基酸链；更长链的聚-α-氨基酸一般归类为蛋白质或蛋白质亚基。很多肽是有生物活性的，例子包括但不限于胸腺九肽、速激肽例如P物质和神经激肽A和B、血管活性肠肽、脑啡肽、抗菌碱性肽、血管紧张素、富含脯氨酸的肽、降钙素、糊精(amylin)、胰高血糖素和分泌素。可并入本发明组合物的其他具有生物学活性的肽包括但不限于多碱性肽(polybasic peptide)，例如聚赖氨酸和抗菌碱性肽，以及肽表位和肽表位的混合物，例如MHC I和MHC II肽表位混合物(G1/9+G2/4)(实施例4)或肽B3(实施例8～10)。其他的很多肽是本领域已知的。此外，可包括在本发明组合物中的生物活性蛋白质或肽的范围之内的还有重组蛋白、重组肽和多重肽。此外，可包括在本发明组合物中的生物活性蛋白质或肽的范围之内的还有发挥蛋白激酶抑制剂作用的单克隆抗体，例如(但不限于)靶向VEGF磷酸化的贝伐单抗(bevacizumab)、靶向Erb1磷酸化的西妥昔单抗(cetuximab)、靶向Erb2磷酸化的曲妥珠单抗(trastuzumab)、靶向VEGF磷酸化的兰尼单抗(ranibzumab)和靶向EGFR磷酸化的帕尼单抗(panitumumab)。mTOR的抑制剂也可包含于所述组合物中，以调节细胞增殖、代谢和血管发生。mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶标，mammalian targetof rapamycin)蛋白也称为FK506结合蛋白12-雷帕霉素结合蛋白1(FRAP1，FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1)。其为调节细胞生长、细胞增殖、细胞运动、细胞存活、蛋白合成和转录的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。mTOR的抑制剂包括雷帕霉素、FK506(他克莫司)及其类似物和衍生物。
脂多糖(也称为脂聚糖)是由脂质和多糖通过共价键连接所组成的大分子。其位于革兰氏阴性菌的外膜中；其发挥内毒素作用并引发强免疫应答。脂多糖包含三个组分：(1)多糖(O)侧链；(2)核心多糖(一些物种中为核心寡糖)；和(3)脂质A。脂多糖可被修饰以表现出特定结构。
肽聚糖是由糖和氨基酸组成的聚合物，其在细菌原生质膜的外侧形成网状层(mesh-like layer)，形成细胞壁。糖组分是由β-(1，4)连接的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸的交替残基构成的。N-乙酰胞壁酸上附着有三至五个氨基酸的肽链。所述肽链可交联至形成3D网状层的另一链中的肽链。细菌细胞壁的肽聚糖层是由两个交替的氨基糖的线性链所形成的晶格结构，所述氨基糖即N-乙酰葡糖胺(GlcNAc或NAG)和N-乙酰磷壁酸(MurNAc或NAM)。所述交替的糖是由β-(1，4)糖苷键连接的。每个MurNAc附着有短的(4至5个残基)氨基酸链，如果是大肠杆菌(Escherichia coli)(革兰氏阴性)，其含有D-丙氨酸、D-谷氨酸和内消旋二氨基庚二酸，或者如果是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(革兰氏阳性菌)，则含有L-丙氨酸、D-谷氨酰胺、L-赖氨酸和D-丙氨酸。这些氨基酸(除了L-氨基酸以外)不存在于蛋白质中，并且被认为帮助针对多数肽酶的攻击提供保护。不同的线性氨基糖链中的氨基酸之间通过被称为转肽酶的酶而交联，导致强且刚性的三维结构。具体的氨基酸序列和分子结构随细菌种类而不同。
糖包括单糖、寡糖和多糖。多糖可包括杂多糖和同多糖，支链和线性聚合物均包括在内。很多糖类是受体或其他参与免疫应答及信号转导的分子中的重要组分。
脂质包括脂肪酸、三酰甘油、甘油磷酸脂(例如，磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和二磷脂酰甘油)、神经酰胺、鞘脂(例如，鞘磷脂和脑苷脂)和类固醇(例如，胆固醇)。脂质是细胞膜的重要组分，在维持细胞膜的结构和调节其对溶质的通透性中发挥关键作用。其还参与免疫应答的诱导和调节。
脂肽是由与肽共价结合的脂组成的分子。其被细菌所表达并特异性地结合TLR 1和其他Toll样受体。例子包括但不限于表面活性素和达托霉素。脂肽描述于Hill等的美国专利6,911,525，其以援引形式整体并入本文。
金属离子(例如Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+和Mn2+)经常作为辅因子参与酶反应。此外，带正电荷的金属离子可作为锌指蛋白的一部分与带负电荷的核酸结合，并且，带正电荷的金属例子(尤其是Fe2+)也是氧转运蛋白(例如，肌红蛋白和血红蛋白)的一部分。
硫醇是生物还原剂，并且参与很多生物学上重要的氧化还原过程，例如还原蛋白质中的二硫键以将氧化型半胱氨酸残基转化为其还原形式。生物活性硫醇分子的例子为谷胱甘肽和N乙酰半胱氨酸，二者在免疫应答中发挥重要作用。
抗生素是通常产生自或来源于细菌或真菌的分子，所述分子杀死不良微生物或阻止其生长。很多抗生素是本领域中已知的；例如，抗生素可以是(但不限于)氧氟沙星，硫姆林(tiamulin)，四环素，红霉素，青霉素，甲氧西林，萘夫西林，苯唑青霉素，邻氯青霉素，双氯青霉素，氨苄青霉素，阿莫西林，巴氨西林，羧苄青霉素，替卡西林，美洛西林，哌拉西林，头孢菌素，庆大霉素，妥布霉素，阿米卡星，奈替米星，卡那霉素，新霉素，克拉霉素，阿奇霉素，克林霉素，大观霉素，万古霉素，利福霉素。也可以使用其他抗生素。这些和其他抗生素的结构和用途已在J.G.Hardman&L.G.Limbird编辑，Goodman&Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics(第9版，McGraw-Hill，New York，1996)，1073-1153页中公开，其以援引形式并入本文。此外，某些蛋白质或蛋白质衍生物具有抗菌活性，并包括在本文中使用的“抗生素”的定义中。它们包括乳铁蛋白(lactoferrin)和乳铁蛋白肽(lactoferricin)。除了其抗菌作用之外，抗生素还影响先天及适应性免疫应答。
维生素通常在生化反应中发挥辅酶或辅因子的作用。维生素包括维生素A(类视黄醇，retinoid)、维生素B1(硫胺)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸或烟酰胺)、维生素B6(磷酸吡哆醛、吡哆胺)、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸)、维生素B12(氰钴胺)、维生素C(抗坏血酸)、维生素D(麦角钙化醇或胆钙化醇)、维生素E(生育酚和生育三烯酚)和维生素K(叶绿醌和甲萘醌)。维生素还可直接影响免疫应答。
除了其他功能之外，生物类黄酮是生物抗氧化剂，阻止或延缓自由基在生物系统中引起的损伤。例如，生物类黄酮可为(但不限于)槲皮素、栎素、山奈酚、山奈酚3-芦丁糖苷、3’-甲氧基山奈酚3-芦丁糖苷、5，8，4′-三羟基-6，7-二甲氧基黄酮、儿茶酸、表儿茶素(epicachetin)、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocachetin gallate)、橘皮苷、柚苷(naringin)、芦丁(rutin)、vixetin、原花色素(proanthocyanidin)、芹菜配基(apigenin)、杨梅黄酮(myricetin)、五羟黄酮(tricetin)、槲皮素、柚苷、山奈酚、毛地黄黄酮、双黄酮(biflavonyl)、水飞蓟素、水飞蓟宁和次水飞蓟素，或这些化合物的衍生物和糖苷。生物类黄酮描述于例如Nair等的美国专利No.6,576,271，其以援引形式并入本文。
生物抗氧化剂具有抑制、减慢、延迟或阻止生物氧化反应的特性，所述氧化反应可使蛋白质、核酸、糖或脂质氧化，从而导致细胞损伤。这些生物抗氧化剂通常通过阻止活性氧簇(reactive oxygen species)(例如包括过氧化氢(H2O2)、次氯酸(HOCl))和自由基(例如，羟自由基(·OH)和超氧化物阴离子(O2 -))所引起的损伤而发挥作用。所述生物抗氧化剂包括上文所述硫醇例如谷胱甘肽，维生素(例如维生素A、维生素C和维生素E)，以及姜黄素、尿酸、硫辛酸、胡萝卜素和泛醇(辅酶Q)。其他生物抗氧化剂是本领域中已知的。
免疫应答调节剂活化免疫系统。一个例子是咪喹莫特(imiquimod)。咪喹莫特通过细胞表面的toll样受体7(TLR7)活化免疫细胞，TLR7通常参与病原体识别。通过TLR-7被咪喹莫特活化的细胞分泌细胞因子(主要是干扰素-α(IFN-α)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α))。有证据表明，当应用至皮肤时，咪喹莫特可导致朗格汉斯细胞(Langerhans cell)的激活，其随后迁移至局部淋巴结以活化适应性免疫系统。被咪喹莫特活化的其他细胞类型包括自然杀伤细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞。新的研究已经证明，咪喹莫特的抗增殖作用是通过提高阿片生长因子受体(OGFr，opioidgrowth factor receptor)的水平而发挥的。用siRNA技术阻断OGFr功能导致咪喹莫特丧失任何抗增殖作用。
抗体的结构和活性是本领域中公知的。抗体通过互补的非共价相互作用特异性地结合其对应的抗原。抗体属于被称为免疫球蛋白的一大类血清糖蛋白，其在所有脊椎动物中作为对抗原攻击的免疫应答的一部分而被制造，所述抗原攻击是通过被免疫系统识别为外源性的物质所引起的。天然抗体是由两个相同的重(H)链(各具有约50kDa的分子量)和两个相同的轻(L)链(各具有约25kDa的分子量)通过二硫键连接在一起而组成的Y形蛋白。每个天然抗体具有两个抗原结合位点，由重链和轻链中的特定部分(称为可变区，更特别地称为可变区中的高变区)形成。抗原与抗体分子的特异性结合通过重链和轻链中的部分(称为恒定区，与可变区不同)激活许多生物功能。这些生物功能包括补体的活化、病原体的调理作用和许多细胞类型的活化。
这些抗体的制备是本领域中公知的，无需在本文中进一步描述。一般来说，本发明的抗体可为任何类型，例如IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或IgY，但通常优选IgG。抗体可以是任何哺乳动物或禽类来源的，包括人、鼠(小鼠或大鼠)、驴、绵羊、山羊、兔、骆驼、马或鸡。在一些备选方案中，所述抗体可为双特异性的。可通过将任何类型的分子共价连接至抗体来修饰所述抗体。例如(但不限于)，抗体衍生物包括经修饰的抗体，例如，通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护基/封闭基衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白，或本领域中已知的其他修饰。可使用本领域中已知的各种各样的技术(包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合)来制备单克隆抗体。例如，可使用杂交瘤技术来生产单克隆抗体，包括本领域中已知的那些技术，例如在Harlow等，″Antibodies：A Laboratory Manual″，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling，等，Monoclonal Antibodies and T-CeII Hybridomas563-681(Elsevier，N.Y.，1981)中教导的技术，或通过本领域中的其他标准方法。本文中使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”是指源自单个克隆的抗体，所述克隆包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是指其生产方法。例如，可通过噬菌体展示或其他技术来生产合适的抗体。此外，不作为限制地，可通过多种技术制造人抗体，包括使用来自人免疫球蛋白序列的抗体文库进行噬菌体展示法，和通过使用不能表达有功能的内源性免疫球蛋白但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。例如，可通过同源重组将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机引入到小鼠胚胎干细胞中。所述抗体还可通过表达编码这些抗体的多核苷酸来生产。此外，本发明的抗体可与标记序列融合，例如便于纯化的肽标签；适合的标签为六组氨酸标签。所述抗体还可通过本领域中已知的方法与诊断剂或治疗剂缀合。用于制备这种缀合物的技术是本领域中公知的。
制备这些单克隆抗体以及嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体的其他方法是本领域中已知的。在一些情况下，人单克隆抗体适合用于组合物中，并且可通过本领域中已知的许多方法制备，包括噬菌体展示技术和改造成产生人抗体的转基因小鼠。
除非另有特别限定，否则本文中使用的术语“抗体”包括本文中描述的所有类型的抗体，包括但不限于天然抗体、单克隆抗体、转基因抗体、单链抗体、衍生化抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和其他类型的抗体。
生物活性非金属包括硒，其为必需的微量营养素，并且是不常见氨基酸硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸的组分。在人中，硒是微量元素养分，其在抗氧化物酶(例如，谷胱甘肽过氧化酶和在动物和某些植物中发现的某些形式的硫氧还原蛋白还原酶)的还原中发挥辅因子的作用。
组胺是组氨酸脱羧的产物。组胺作用于至少四种不同受体：H1受体、H2受体、H3受体和H4受体。其提高血管通透性，并且通过这一作用和其他作用作为炎性反应的介质。抗组胺剂广泛地用于治疗多种炎性病症，包括变态反应。抗组胺剂包括但不限于盐酸多塞平、马来酸卡比沙明、富马酸氯马斯汀、盐酸苯海拉明、茶苯海明(dimenhydrinate)、柠檬酸吡拉明、盐酸曲吡那敏、柠檬酸曲吡那敏、马来酸氯苯那敏、马来酸溴苯那敏、盐酸羟嗪、双羟萘酸羟嗪(hydroxyzine pamoate)、盐酸赛克利嗪、乳酸赛克利嗪、盐酸美克洛嗪、盐酸异丙嗪、盐酸赛庚啶、酒石酸苯茚胺、阿伐斯汀、盐酸西替利嗪盐、盐酸氮卓斯汀、盐酸左卡巴斯汀、氯雷他定、地氯雷他定、依巴斯汀、咪唑斯汀和非索非那定，及其盐、溶剂化物、类似物、同源物(congener)、生物电子等排体、水解产物、代谢物、前体和前药。
激酶抑制剂抑制蛋白质中丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或在某些情况下组氨酸残基的磷酸化。激酶抑制剂包括小分子激酶抑制剂。这种小分子激酶抑制剂的例子包括但不限于：BIBW 2992，其抑制EGFR和Her2/neu，并且其化学结构为N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧]-6-喹唑啉基]-4(二甲基氨基)-2-布屈嗪；伊马替尼(imatinib)(格列卫，Gleevec)，其抑制酪氨酸激酶，并且其化学结构为4-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-N-[4-甲基-3-[(4-吡啶-3-基嘧啶-2-基)氨基]苯基]苯甲酰胺；吉非替尼，其抑制EGFR的酪氨酸激酶结构域，并且其化学结构为N-(3-氯-4-氟-苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺；哌加他尼(pegaptanib)，其抑制VEGF；索拉非尼(sorafenib)，其抑制多种蛋白激酶，并且其化学结构为4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基氨基]苯氧基]-N-甲基-吡啶-2-羧胺；达沙替尼(dasatinib)，其也抑制多种蛋白激酶，并且其化学结构为N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑羧胺一水合物；舒尼替尼(sunitinib)，其抑制多种受体蛋白激酶，并且其化学结构为N-[2-(二乙胺基)乙基]-5-[(Z)-(5-氟-1，2-二氢-2-氧-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧胺；厄洛替尼(erlotinib)，其抑制EGFR酪氨酸激酶，并且其化学结构为N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺；尼罗替尼(nilotinib)，其为酪氨酸激酶抑制剂，并且其化学结构为4-甲基-N-[3-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-5-(三氟甲基)苯基]-3-[(4-吡啶-3-基嘧啶-2-基)氨基]苯甲酰胺；和拉帕替尼(lapatinib)，其抑制与癌基因EGFR和Her2/neu相关的酪氨酸激酶活性，并且其化学结构为N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[(2-甲基磺酰基乙基氨基)甲基]-2-呋喃基]喹唑啉-4-胺。其他小分子激酶抑制剂是本领域中已知的，例如(但不限于)mTOR抑制剂，包括雷帕霉素、FK506(他克莫司)，及其类似物和衍生物。
因此，本发明的组合物可以以任何合适的组合包含一种或多种上文描述的生物活性组分。可引入本发明组合物的组合的例子包括但不限于：(1)核酸或其衍生物加肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物；(2)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物加肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物；(3)糖或其衍生物加脂质或其衍生物；(4)糖或其衍生物加脂肽或其衍生物；(5)核酸或其衍生物加金属离子；(6)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物加金属离子；(7)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物加金属离子；(8)核酸或其衍生物加硫醇；(9)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物加硫醇；(10)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物加硫醇；(11)核酸或其衍生物加抗生素或其衍生物；(12)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物加抗生素或其衍生物；(13)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物加抗生素或其衍生物；(14)核酸或其衍生物加维生素或其衍生物；(15)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物加维生素或其衍生物；(16)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物加维生素或其衍生物；(17)核酸或其衍生物加生物类黄酮或其衍生物；(18)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物加生物类黄酮或其衍生物；(19)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物加生物类黄酮或其衍生物；(20)核酸或其衍生物加抗氧化剂或其衍生物；(21)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物加抗氧化剂或其衍生物；(22)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物加抗氧化剂或其衍生物。也可以为其他组合，例如包含3、4、5、6或直至16种生物活性组分。在下文中的实施例6～10中描述了包含多种生物活性组分的多种组合。根据组分的确切组合，多种组分可在单个反应中被添加至载体；或者可使用多轮反应，在每轮反应中添加单个组分或多个组分。下文中的实施例6～10中描述了这些组合的例子，其中在一轮反应中添加多种组分，或是用多轮反应。在实施例6中，生物活性组分为氧氟沙星、姜黄素、芦丁、G1/9肽(CKRNIFKSY)(SEQ ID NO：1)、G2/4肽(CQIDKNKPKYYILDMFPYPSG)(SEQ ID  NO：2)和B3肽(CKPKDMVDNYPSTWRERRRKKR)(SEQ ID NO：3)。在第一轮反应中添加前三种组分(氧氟沙星、姜黄素和芦丁)。在第二轮反应中添加后三种组分(G1/9肽、G2/4肽和B3肽)。在实施例7中，生物活性组分为视黄酸、芦丁、G1/9肽、G2/4肽和B3肽。在第一轮反应中添加前两种组分(视黄酸和芦丁)。在第二轮反应中添加后三种组分(G1/9肽、G2/4肽和B3肽)。在实施例8中，生物活性组分为LPS(脂多糖)、PG(肽聚糖)、DNA、咪喹莫特、G1/9肽、G2/4肽、B3肽、新生霉素、谷胱甘肽和硫姆林。在第一轮反应中添加前四种组分(LPS、PG、DNA和咪喹莫特)。在第二轮反应中添加随后三种组分(G1/9肽、G2/4肽和B3肽)。在第三轮次的反应中添加最后三种组分(新生霉素、谷胱甘肽和硫姆林)。在实施例9中，生物活性组分为LPS(脂多糖)、PG(肽聚糖)、DNA、咪喹莫特、G1/9肽、G2/4肽、B3肽、视黄酸和硫姆林。在第一轮反应中添加前四种组分(LPS、PG、DNA和咪喹莫特)。在第二轮反应中添加随后三种组分(G1/9肽、G2/4肽和B3肽)。在第三轮反应中添加最后两种组分(视黄酸和硫姆林)。在实施例10中，生物活性组分为LPS(脂多糖)、PG(肽聚糖)、DNA、咪喹莫特、G1/9肽、G2/4肽、B3肽、乳铁蛋白肽和胸腺九肽。在第一轮反应中添加前四种组分(LPS、PG、DNA和咪喹莫特)。在第二轮反应中添加随后三种组分(G1/9肽、G2/4肽和B3肽)。在第三轮反应中添加最后两种组分(乳铁蛋白肽和胸腺九肽)。在一些情况下，当在一轮反应中添加多种组分时，可优选以确定的先后顺序添加所述组分。例如，当在单个轮次的反应中添加G1/9肽、G2/4肽和B3肽时，优选以该顺序添加(先是G1/9肽，然后是G2/4肽，最后是B3肽)。
因此，一般地，本发明的生物活性组合物包含：
(1)至少一种以下生物活性组分：
(a)核酸或其衍生物；
(b)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物；
(c)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物；
(d)脂多糖或其衍生物；
(e)肽聚糖或其衍生物；
(f)糖或其衍生物；
(g)脂质或其衍生物；
(h)脂肽或其衍生物；
(i)金属离子；
(j)硫醇；
(k)抗生素或其衍生物；
(l)维生素或其衍生物；
(m)生物类黄酮或其衍生物；
(n)抗氧化剂或其衍生物；
(o)免疫应答调节剂；
(p)抗体；
(q)生物活性非金属；
(r)组胺或抗组胺剂；和
(s)激酶抑制剂；以及
(2)至少一种载体，其将所述组合物有效递送至吞噬细胞，以使所述生物活性组分被所述吞噬细胞摄取并影响其生物活性。
在一个备选方案中，所述组合物可以包含免疫活性抗原或抗原性表位。所述免疫活性抗原或抗原性表位可以是但不限于肽、蛋白质、重组肽或多重肽，或者重组蛋白。当组合物包含免疫活性抗原性表位时，所述组合物可以在体内引发保护性免疫。
在另一备选方案中，所述组合物可包含双链RNA、siRNA、pre-miRNA、miRNA、多聚U或富含GU的核苷酸序列。
在所述组合物中，分子可以作为混合物存在。或者，分子可以化学连接在一起；在该备选方案中，至少一种生物活性组分与所述载体连接。载体通常是微粒。优选地，微粒具有窄的粒度分布范围。微粒可以是多孔的或非多孔的。通常，微粒的直径小于约10μm；更通常地，微粒的直径小于约5μm。通常，微粒由生物聚合物制成。在一个备选方案中，组分与微粒非共价结合。在另一备选方案中，组分与微粒共价结合。通常，微粒与病原体的粒度范围相同。当微粒与病原体的粒度范围相同时，组合物可包含免疫活性抗原抗原性表位或免疫调节剂，并且所述免疫活性抗原或抗原性表位可以是肽、蛋白质、重组肽或多重肽、重组蛋白、脂质、糖类或它们的组合。组合物可同时包含免疫活性抗原或抗原性表位以及免疫调节剂。
在一个备选方案中，至少一种生物活性组分与载体可逆连接。至少一种生物活性组分可以通过二硫键与载体可逆连接。或者，至少一种生物活性组分可以通过包含固定化金属螯合物的键与载体可逆连接。固定化金属螯合物可以包括锌、铜、铁或其他金属的螯合物。在另一备选方案中，所述可逆连接可以是离子键或疏水键。
本发明的另一方面是在细胞培养物、细胞亚群或多细胞生物(如植物、动物或人)对象中引发生物学应答的方法，其包括施用一定量的组合物的步骤，所述组合物包含与微粒结合的选定的生物活性组分，其中所述微粒比病原体的大小范围更小或与其相同。所施用的量足以在细胞培养物、细胞亚群或多细胞生物对象中引发免疫应答。当该方法是在细胞亚群中引发生物学应答的方法时，组合物可施用于细胞培养物。
根据本发明，组合物的施用可以在细胞培养物中进行，或者通过粘膜途径、肠胃外途径或皮肤途径施用到多细胞宿主(如植物、动物或人)中。或者可以使用其他施用途径。
可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序测定本发明组合物的毒性和效力，用于例如测定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体有治疗效果的剂量)的那些。毒性和治疗作用的剂量比值是治疗指数，并且它可以表示为LD50/ED50比。优选显示大治疗指数的组合物。从这些细胞培养物测定和动物研究中获得的数据可用于制定用于人或其他动物的剂量范围。该组合物的剂量优选在包含ED50并且无毒或几乎无毒的循环浓度范围内。剂量可以根据所使用的剂型和所采用的施用途径在该范围内变化。
本发明的另一方面是用于研究急性感染对病症发病机制之影响用的方法，所述病症选自(i)慢性炎性疾病，其选自变态反应、哮喘和自身免疫病；和(ii)恶性病症，其选自癌症和肿瘤转移，所述方法包括以下步骤：
(1)提供对病症易感的动物模型，所述病症选自(i)慢性炎性疾病，其选自变态反应、哮喘和自身免疫病；和(ii)恶性病症，其选自癌症和肿瘤转移；
(2)对所述动物模型施用本发明组合物，以通过施用所述组合物所引发的免疫应答来治疗或预防动物模型中的感染，其中在所述组合物中，微粒与病原体有相同的大小范围，其中所述组合物包含免疫活性抗原或抗原性表位，并且其中免疫活性抗原或抗原性表位是肽、蛋白质、重组肽或多重肽，或者重组蛋白；和
(3)测定步骤(2)中施用的组合物对所述病症的作用，所述病症选自(i)慢性炎性疾病，其选自变态反应、哮喘和自身免疫病；和(ii)恶性病症，其选自癌症和肿瘤转移。
本发明通过以下实施例阐明。所包括的这些实施例仅用于说明目的，而不旨在限制本发明。
实施例1
微粒的选择
1-10μm范围的琼脂糖微粒由Sterogene Bioseparations，Inc.(Carlsbad，CA)生产并用Saturn DigiSizer 5200(Micromeritis Instrument Corp)测试。结果表明颗粒分布为75％在5μm以下，24％为5-10μm，1％大于10μm。
实施例2
活化的琼脂糖微粒
通过两种不同方法活化颗粒。活化方法由Sterogene Bioseparations，Inc.(Carlsbad，CA)利用硫醇-二硫化物配体交换化学进行。在这种提供了配体的可逆共价附着的连接化学中，微粒被高密度的硫醇基团功能化。肽和其他生物分子被2-硫吡啶基部分或环氧化物基团功能化。2-硫吡啶基功能化的肽在细胞内化后将由于细胞内的强还原环境而从微粒上释放。该化学的另一优势是配体的高效和可重复的固定。
固定的另一方法通过使用固定化的金属螯合(immobilized metalchelation，IMAC)化学来进行。根据标准方法将琼脂糖微粒用Zn2+离子功能化。肽和其他活性化合物的选择包含可容易地与固定化的Zn2+离子螯合的螯合部分(例如赖氨酸、半胱氨酸、色氨酸、杂环结构、酰胺键、含硫残基等)。
实施例3
病原体抗原性蛋白质的生物信息学分析也可以鉴定出具有高抗原性潜能的肽表位。这种分析已经对鸡败血支原体(M.gallisepticum)MGA蛋白实施。在线性抗原基序中进一步分析抗原性区域。
实施例4
制备硫醇功能化的微粒上的MG肽免疫调节剂。制备免疫调节组合物：向2.5ml硫醇功能化的微粒(Sterogene Bioseparations，Inc.，Carlsbad，CA)中加入环氧化的50μg LPS、50μg肽聚糖(PG)和250μg大肠杆菌DNA的混合物。搅拌4小时后，离心浆体并用LAL水清洗一次。然后加入125μg硫醇化的聚I:C，继续偶联4小时。然后离心，用LAL水清洗3次，加入0.125mg 2-cys-硫吡啶基B3肽并继续偶联4小时。然后，用LAL水清洗混合物1次，加入0.125mg含有N端的2-cys-硫吡啶部分的单MHC I和MHCII肽表位化合物(G1/9+G2/4)并继续偶联4小时。(这些肽包含用于偶联至硫醇颗粒的N端2-硫吡啶反应基团)。通过上清液的OD343测量偶联效率。用LAL水清洗后，在等体积的LAL水中重悬颗粒。
在另一偶联反应中，Zn螯合微粒如下用于相同的肽和激动剂浓度：向2ml的Zn螯合微粒(Sterogene Bioseparations，Inc.，Carlsbad，CA)中加入40μg LPS、40μg PG、100μg聚I:C和200μg DNA的混合物并轻柔振荡3小时。离心混合物，用6ml LAL水清洗2次。然后按照如下顺序加入60μgG 1/9、60μg G2/4和60μg B3肽(终体积2ml)，每次添加后进行轻柔的人工混合。轻柔振荡12小时后，离心悬液并用6ml LAL水清洗3次。将颗粒重悬于等体积的LAL水中。
实施例5
固定其他生物活性分子
我们向Zn螯合微粒固定了以下另外的激动剂：激酶抑制剂如姜黄素和芦丁、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽、谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸以提高细胞内的氧化还原电位、胸腺九肽、抗生素(如氧氟沙星和硫姆林)、硒、咪喹莫特、多聚碱性肽如聚赖氨酸、抗微生物碱性肽、富脯氨酸肽、抗氧化剂和维生素。
实施例6
首先向2ml的Zn螯合微粒中加入0.5mg氧氟沙星、0.5mg姜黄素和0.5mg芦丁，轻柔振荡1小时。离心，保留上清液，用6ml LAL水清洗1次并合并。再清洗一次并丢弃洗液。然后按照如下顺序加入20μg G 1/9、20μg G2/4和20μg B3肽(体积2ml)，每次添加后轻柔人工混合。轻柔振荡1小时后，离心并保留上清液。用6ml LAL水清洗1次并与上清液合并。每个再重复清洗2次。在等体积的LAL水中重悬，然后分配进两个等体积管中。测定上清液和第一次清洗混合物的偶联效率。
实施例7
首先向2ml的Zn螯合微粒中加入0.5mg视黄酸和0.5mg芦丁，轻柔振荡1小时。离心，保留上清液，用6ml LAL水清洗1次并合并。再清洗一次并丢弃洗液。然后按照如下顺序加入20μg G 1/9、20μg G2/4和20μg B3肽(体积2ml)，每次添加后轻柔人工混合。轻柔振荡1小时后，离心并保留上清液。用6ml LAL水清洗1次并与上清液合并。每个再重复清洗2次。在等体积的LAL水中重悬，然后分配进两个等体积管中。测定上清液和第一次清洗混合物的偶联效率。
实施例8
首先向2ml的Zn螯合微粒中加入40μg LPS、40μg PG、200μg DNA和10μg咪喹莫特的混合物，轻柔振荡1小时。然后按照如下顺序加入20μgG 1/9、20μg G2/4和20μg B3肽(体积2ml)，每次添加后轻柔人工混合。轻柔振荡1小时后，离心并保留上清液。用6ml LAL水清洗1次并与上清液合并。然后添加0.5mg新生霉素、0.5mg谷胱甘肽和0.5mg硫姆林。轻柔振荡3小时后，离心并保留上清液。用6ml LAL水清洗1次并与上清液合并。每个再重复清洗2次。在等体积的LAL水中重悬，然后分配进两个等体积管中。测定上清液和第一次清洗混合物的偶联效率。
实施例9
首先向2ml的Zn螯合微粒中加入40μg LPS、40μg PG、200μg DNA和10μg咪喹莫特的混合物，轻柔振荡1小时。然后按照如下顺序加入20μgG 1/9、20μg G2/4和20μg B3肽(体积2ml)，每次添加后轻柔人工混合。轻柔振荡1小时后，离心并保留上清液。用6ml LAL水清洗1次并与上清液合并。然后添加0.5mg视黄酸和0.5mg硫姆林。轻柔振荡3小时后，离心并保留上清液。用6ml LAL水清洗1次并与上清液合并。每个再重复清洗2次。在等体积的LAL水中重悬，然后分配进两个等体积管中。测定上清液和第一次清洗混合物的偶联效率。
实施例10
首先向2ml的Zn螯合微粒中加入40μg LPS、40μg PG、200μg DNA和10μg咪喹莫特的混合物，轻柔振荡1小时。然后按照如下顺序加入20μgG 1/9、20μg G2/4和20μg B3肽(体积2ml)，每次添加后轻柔人工混合。轻柔振荡1小时后，离心并保留上清液。用6ml LAL水清洗1次并与上清液合并。然后添加50μg乳铁蛋白肽和50μg硫姆林。轻柔振荡3小时后，离心并保留上清液。用6ml LAL水清洗1次并与上清液合并。每个再重复清洗2次。在等体积的LAL水中重悬，然后分配进两个等体积管中。测定上清液和第一次清洗混合物的偶联效率。
实施例11
动物实验
将免疫调节组合物经口施用给三日龄的鸡(无鸡败血支原体(MG)和滑液支原体(M.synoviae，MS)并且经ELISA检测无MG和MS亲本抗体)。每组有10只鸡。记录鸡个体体重。对鸡进行分配以使每组的平均体重没有统计学差异。每只禽通过根据处理涂色并编号的翅膀标签来标识，并在适当表格上记录体重。在实验的第14天，用鸡败血支原体Rlow株攻击。在第28天终止试验。
按照以下设定分组：G1和G2是阴性和阳性对照。G1为未攻击未处理的，G2为攻击而未处理的。G3为用基于硫醇的功能化微粒(0.2ml/鸡)经口处理并攻击的。G4为用基于Zn螯合物的功能化微粒(0.2ml/鸡)经口处理并攻击的。
时间线
第-1天：设定G1-G4组。处死10只鸡进行ELISA测定、PCR和鸡败血支原体和滑液支原体培养，以证实实验用鸡无亲本抗体并且不存在鸡败血支原体和滑液支原体。
第0天：口服接种G3-G4，然后用0.2ml微粒组合物攻击。
第14天：攻击组G2-G4。用滴度约8.0log10CFU/ml的毒性鸡败血支原体R株的新鲜液体培养物攻击动物。用喷雾技术对这些组的每个施用10ml该新鲜液体培养物。简言之，禽被置于隔离单元中。然后向隔离单元喷洒新鲜鸡败血支原体R株培养物(107个颗粒/ml)，鸡被暴露20分钟。
第14天和28天：对鸡取血，以获得血清用血清板凝集(SPA)测试和封闭ELISA来检测MG特异抗体。
第28天：G1-G4。安乐死、尸检并从特定器官、气管、气囊和肺中铺板分离鸡败血支原体(MG)。进行气管和肺的组织学检查。
安乐死和病理
在第28天，在实验研究结束时，所有组被安乐死。对每只禽进行尸检并对MG相关的总体病变进行评分。记录气管、左右胸气囊和腹膜中渗出物的存在情况。根据以下系统记录病变：在气管中：0＝无渗出物，1＝轻微红色和小量渗出物，2＝粘膜变红，有渗出物。左和右气囊：0＝无病变，1＝浆液状渗出物，2＝伴随小片纤维的浆液状渗出物，3＝浆液状、纤维化渗出物，气囊壁轻微加厚，4＝许多纤维状渗出物，气囊壁非常厚。腹膜：0＝无渗出物，1＝浆液状渗出物，2＝伴随小片纤维的浆液状渗出物，3＝浆液状-纤维状渗出物。
MG再分离
在尸检检查中，用拭子对气管、胸气囊、肝、肺、脾、肾和心脏进行无菌取样。然后将来自拭子的材料在支原体琼脂(MA)上铺板，于37℃在5％CO2的孵育箱中培养。在第2、4和7天观察板上支原体，之后以周为间隔进行观察直至最多三周。通过PCR测试阳性集落以鉴定鸡败血支原体和滑液支原体。
尸检
MG攻击后，在气囊和腹膜观察到显著的病理学病变。然而，与未处理而进行了攻击的对照组(G2)相比，用含有免疫活性肽加激动剂的颗粒处理的组(G3、G4p＜0.001)所记录的病变评分显著降低。
支原体的再分离
可以经常从未处理而进行了感染的对照鸡的内部器官中再分离出支原体。与未处理的对照(G2)组相比，用功能化微粒(G3、G4)处理的组中观察到支原体的完全消除(从呼吸系统和内部器官中)。在比较实验组的呼吸道(器官、肺、气囊)或内部器官(肝、脾、肾和心脏)的支原体再分离率时获得了类似的结果。
结果示于表1。
表1
Figure BDA0000122651950000211
Figure BDA0000122651950000221
血清学结果
实验结束时，各组的血清学应答不同。未处理而进行了攻击的组(G2)应答低。同时，在用颗粒加肽表位和激动剂处理的组中(G3、4)观察到显著更强的应答(p＜0.05)。
讨论
鸡败血支原体可以导致气囊的显著炎症，伴随在气管、气囊和肺的定殖。支原体也经常可以在内部器官中检测到。我们开发了一种新型“病原体模拟”免疫活性组合物，其由具有微生物大小范围(＜5μm)的微粒组成，该微粒具有与不同激动剂免疫调节分子一起固定化的抗原性表位肽或其他抗原。
我们的结果表明，当将抗原性分子加入包被有选定的免疫调节化合物的颗粒时，增强了支原体特异性的血清学应答。器官定殖被降低到不显著的水平，并且病理性病变的评分低。当在攻击前经粘膜引入微粒时观察到更强的这种作用。
在施用组合物后和攻击前，每天检查处理的鸡以评价组合物的安全性。发现鸡临床健康，并且未显示副作用。研究期间尸检的动物未显示炎症体征或器官体积/重量变化。组合物显示为安全的。除预防外，这些组合物可用于治疗临床上已建立的感染。由于慢性炎性病症(如感染、变态反应、自身免疫)与癌症之间存在联系，这是具有显著意义的。
本发明的优势
本发明提供用于剂量控制地将多种生物活性分子引入吞噬细胞中的改进的组合物和方法。这些组合物是稳定的，并且可以以宽浓度范围制备，以带来所期望的生物效应。这种作用的一个实例是免疫应答。它们适于通过多种途径在体内和体外施用。它们的结构防止了效应分子在体内的过早分解或释放。该颗粒具有固有的粘膜粘膜特性，这可以提高它们与粘膜的相互作用并促进摄取。
本发明的组合物具有工业实用性，用于将生物活性组分递送至细胞(尤其是吞噬细胞)，以通过它们与吞噬细胞的相互作用来影响其他细胞类型的功能。
本文说明性描述的本发明可以适合地在缺少任何本文未特别公开的要素、限定的情况下实施。因此，如术语“包含”、“包括”、“含有”等应理解为开放性的并且没有限制。此外，本文所用的术语和表达是用于描述性术语而非限制，不旨在用这样的术语和表达排除今后显示和描述的任何等同形式或其部分，认为在所要求的本发明范围内可以进行多种修改。因此，应理解，尽管本发明特别通过优选实施方案和任选特征进行了公开，本领域技术人员可以采用本文公开发明的修改和变化，并且认为这种修改和变化在本文公开发明的范围内。本文宽泛和一般性地描述了本发明。落入本类公开内容范围的每种更窄的种类和亚种类分类也是这些发明的一部分。这包括具有从种类中去除任何主题的附加或否定性限制的每个发明的一般描述，无论所删除的材料是否在其中特别存在。
此外，在发明的特征或方面根据马库什分类描述时，本领域技术人员应理解本发明还根据马库什分类的任何单个成员或成员的亚组描述。还应理解以上描述旨在说明而非限制。在阅读上述描述后许多实施方案对本领域技术人员显而易见。因此本发明的范围应不参照以上描述确定，而应参照所附权利要求以及该权利要求赋予的等同形式的全部范围确定。所有文章和参考文献(包括发明公开)通过引用并入本文。

Claims (73)

1.生物活性组合物，其包含：
(a)至少一种以下生物活性组分：
(i)核酸或其衍生物；
(ii)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物；
(iii)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物；
(iv)脂多糖或其衍生物；
(v)肽聚糖或其衍生物；
(vi)糖或其衍生物；
(vii)脂质或其衍生物；
(viii)脂肽或其衍生物；
(ix)金属离子；
(x)硫醇；
(xi)抗生素或其衍生物；
(xii)维生素或其衍生物；
(xiii)生物类黄酮或其衍生物；
(xiv)抗氧化剂或其衍生物；
(xv)免疫应答调节剂；
(xvi)抗体；
(xvii)生物活性非金属；
(vxiii)组胺或抗组胺剂；和
(xix)激酶抑制剂；以及
(b)至少一种载体，其将所述组合物有效递送至吞噬细胞以使所述生物活性组分被所述吞噬细胞摄取并影响其生物活性。
2.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含核酸或其衍生物。
3.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物。
4.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物。
5.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含脂多糖或其衍生物。
6.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含肽聚糖或其衍生物。
7.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含糖或其衍生物。
8.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含脂质或其衍生物。
9.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含脂肽或其衍生物。
10.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含金属离子。
11.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含硫醇。
12.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含抗生素或其衍生物。
13.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含维生素或其衍生物。
14.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含生物类黄酮或其衍生物。
15.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含抗氧化剂或其衍生物。
16.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含免疫应答调节剂。
17.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含抗体。
18.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含生物活性非金属。
19.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含组胺或抗组胺剂。
20.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含激酶抑制剂。
21.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)核酸或其衍生物；和
(2)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物。
22.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物；和
(2)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物。
23.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)糖或其衍生物；和
(2)脂质或其衍生物。
24.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)糖或其衍生物；和
(2)脂肽或其衍生物。
25.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)核酸或其衍生物；和
(2)金属离子。
26.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物；和
(2)金属离子。
27.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)核酸或其衍生物；和
(2)硫醇。
28.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物；和
(2)硫醇。
29.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物；和
(2)硫醇。
30.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)核酸或其衍生物；和
(2)抗生素或其衍生物。
31.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物；和
(2)抗生素或其衍生物。
32.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物；和
(2)抗生素或其衍生物。
33.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)核酸或其衍生物；和
(2)维生素或其衍生物。
34.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物；和
(2)维生素或其衍生物。
35.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物；和
(2)维生素或其衍生物。
36.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)核酸或其衍生物；和
(2)生物类黄酮或其衍生物。
37.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物；和
(2)生物类黄酮或其衍生物。
38.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物；和
(2)生物类黄酮或其衍生物。
39.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)核酸或其衍生物；和
(2)抗氧化剂或其衍生物。
40.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)核苷、核苷酸或者核苷或核苷酸的衍生物；和
(2)抗氧化剂或其衍生物。
41.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
(1)肽、蛋白质或者肽或蛋白质的衍生物；和
(2)抗氧化剂或其衍生物。
42.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含氧氟沙星、姜黄素、芦丁、G1/9肽、G2/4肽和B3肽。
43.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含视黄酸、芦丁、G1/9肽、G2/4肽和B3肽。
44.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含LPS(脂多糖)、PG(肽聚糖)、DNA、咪喹莫特、G1/9肽、G2/4肽、B3肽、新生霉素、谷胱甘肽和硫姆林。
45.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含LPS(脂多糖)、PG(肽聚糖)、DNA、咪喹莫特、G1/9肽、G2/4肽、B3肽、视黄酸和硫姆林。
46.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含LPS(脂多糖)、PG(肽聚糖)、DNA、咪喹莫特、G1/9肽、G2/4肽、B3肽、乳铁蛋白肽和胸腺九肽。
47.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含免疫活性抗原或抗原性表位。
48.权利要求47的组合物，其中所述免疫活性抗原或抗原性表位是肽、蛋白质、重组肽或多重肽，或者重组蛋白。
49.权利要求47的组合物，其中所述组合物在体内引发保护性免疫应答。
50.权利要求2的组合物，其中所述组合物包含双链RNA或siRNA。
51.权利要求1的组合物，其中所述至少一种生物活性组分与所述载体连接。
52.权利要求51的组合物，其中所述载体是微粒。
53.权利要求51的组合物，其中所述至少一种生物活性组分与所述载体可逆连接。
54.权利要求53的组合物，其中所述至少一种生物活性组分通过二硫键与所述载体可逆连接。
55.权利要求53的组合物，其中所述至少一种生物活性组分通过包含固定化金属螯合物的连接与所述载体可逆连接。
56.权利要求53的组合物，其中所述可逆连接是离子或疏水连接。
57.权利要求55的组合物，其中所述固定化金属螯合物包括锌、铜或铁的螯合物。
58.权利要求52的组合物，其中所述微粒具有窄的粒度分布范围。
59.权利要求52的组合物，其中所述微粒是多孔的。
60.权利要求52的组合物，其中所述微粒是非多孔的。
61.权利要求52的组合物，其中所述微粒中大部分的直径小于约10μm。
62.权利要求52的组合物，其中所述微粒中大部分的直径小于约5μm。
63.权利要求52的组合物，其中所述微粒由生物聚合物制成。
64.权利要求52的组合物，其中所述至少一种生物活性组分非共价附着至所述微粒。
65.权利要求52的组合物，其中所述至少一种生物活性组分共价附着至所述微粒。
66.权利要求1的组合物，其中所述至少一种生物活性组分作为混合物存在。
67.权利要求52的组合物，其中所述微粒与病原体的粒度范围相同。
68.权利要求67的组合物，其中所述组合物包含免疫活性抗原或抗原性表位，并且其中所述免疫活性抗原或抗原性表位是肽、蛋白质、重组肽或多重肽，或者重组蛋白。
69.在细胞亚群中引发免疫应答的方法，其包括以足以引发免疫应答的量向所述细胞亚群施用权利要求68所述组合物的步骤。
70.权利要求67的方法，其中所述组合物在细胞培养物中施用。
71.在动物对象中引发免疫应答的方法，其包括以足以引发免疫应答的量向所述动物对象施用权利要求68所述组合物的步骤。
72.权利要求71的方法，其中所述组合物通过选自以下的途径施用：粘膜途径、肠胃外途径和皮肤途径。
73.用于研究急性感染对病症发病机制之影响的方法，所述病症选自(i)慢性炎性疾病，其选自变态反应、哮喘和自身免疫病；和(ii)恶性病症，其选自癌症和肿瘤转移，所述方法包括以下步骤：
(a)提供对病症易感的动物模型，所述病症选自(i)慢性炎性疾病，其选自变态反应、哮喘和自身免疫病；和(ii)恶性病症，其选自癌症和肿瘤转移；
(b)对所述动物模型施用权利要求68的组合物，以通过由施用所述组合物所引发的免疫应答来治疗或预防该动物模型中的感染；和
(c)测定步骤(b)中所施用的组合物对所述病症的影响，所述病症选自(i)慢性炎性疾病，其选自变态反应、哮喘和自身免疫病；和(ii)恶性病症，其选自癌症和肿瘤转移。
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