CN102533926A - 一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒主要包括：Y1肾上腺皮质细胞，抗霍乱毒素中和抗体，多聚赖氨酸，96-E-plate，以及用于Y1肾上腺皮质细胞的细胞培养基。本发明提供了一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒及其检测方法，针对霍乱毒素的特异性细胞学反应，建立了一种能够实时动态、高灵敏度的霍乱毒素检测体系，可高特异性、快速、准确地鉴定霍乱毒素，能有效地将产毒株与非产毒株进行甄别，加强了产毒株的监测和控制，可极大地提高防治的效果和效益，对于霍乱的预防控制具有重要的意义。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒，以及利用该试剂盒检测霍乱毒素的方法。
(二)背景技术
在霍乱弧菌疫情的防控工作中，菌体是否产生CT是一个极为重要的检测指标。霍乱弧菌流行株几乎均为产CT的菌株，而非流行株均不产生CT。CT由ctxAB基因编码，是霍乱弧菌分泌的一种具有ADP-核糖基转移酶活性的毒蛋白，该基因位于染色体CTX遗传单元上，其415kb的核心区域包含至少5个基因(cep，orfU，ace，zot，ctxAB)，是由溶原性噬菌体CTXΦ携带，可在霍乱弧菌间水平转移。CT毒素由5个B亚单位和1个A亚单位组成，B亚单位作用于肠黏膜上皮细胞特异性受体GM1(Gangliosidoses，神经节苷脂类分子)，使得A亚单位能够进入肠细胞，A亚基作用于腺苷酸环化酶，使其活化，从而使环磷酸腺苷(cAMP)含量增高，cAMP在小肠上皮细胞内起水、电解质代谢调节作用，其浓度的增高导致肠液分泌功能增强，打开细胞膜离子通道，引起大量的水和电解质流入肠腔，进而导致细胞大量失水引起腹泻。因此，有效地将产毒株与非产毒株进行甄别，加强产毒株的监测和控制，可极大地提高防治的效果和效益，对于霍乱的预防控制具有重要的意义。
目前，传统的CT检测方法主要依靠动物实验，传统细胞学、免疫学、分子生物学和生物传感器等技术，但是这些方法检测周期长，灵敏度低，而且无法针对霍乱毒素的活性进行有效甄别。因此，有必要建立一种能够实时动态、高灵敏度的霍乱毒素检测方法。
(三)发明内容
本发明目的是一种能够高特异性、快速、准确地鉴定霍乱毒素的细胞学检测试剂盒及其检测方法。
本发明采用的技术方案是：
一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒，主要包括：Y1肾上腺皮质细胞(本发明中为市购，ATCC：CCL-79)，抗霍乱毒素中和抗体，多聚赖氨酸，96-E-plate，以及用于Y1肾上腺皮质细胞的细胞培养基。
所述细胞培养基可为常规适用于Y1肾上腺皮质细胞的培养基，本发明中所述细胞培养基组成如下：马血清15％(v/v)，胎牛血清2.5％(v/v)，溶剂为F-12K培养基。
本试剂盒也可含有霍乱毒素标准品，检测时同时以梯度浓度的标准品于同等条件下进行检测，以加入已知霍乱毒素的时间点至达到20％细胞病变的时间点所需时间与霍乱毒素的浓度关系绘制标准曲线，根据待测阳性样本加入的时间点至达到20％病变时间点所需的时间，对照标准曲线，即可获知待测样本中的霍乱毒素浓度。
本发明还涉及一种利用所述试剂盒检测霍乱毒素的方法，所述方法包括：
(1)多聚赖氨酸用磷酸盐缓冲液稀释后包被96-E-plate；具体方法如下：将多聚赖氨酸(0.1g/L)用磷酸盐缓冲液(PBS)按照1∶4(体积比)稀释后，每孔100μl体积包被96-E-plate，室温10分钟，除去后用磷酸盐缓冲液清洗2次，待用；多聚赖氨酸由25～30赖氨酸残基聚合而成，具有强烈的抑菌能力和增强细胞黏附性，用于孔板的包被，可使细胞保持良好的生长状态；
(2)将Y1肾上腺皮质细胞以1～2×104细胞/孔的密度铺板，细胞培养基体积为100～200μl/孔，在实时细胞分析系统上于37℃、5％CO2条件下培养；
(3)细胞培养18～20小时后，取待测样本(菌体培养上清液或者粪便等样本上清液)，加入细胞生长孔中，同时另取一份待测样本和抗霍乱毒素中和抗体混合、孵育后，加入细胞生长孔中，在实时细胞分析系统上于37℃、5％CO2条件下培养；
(4)以不加样品的细胞生长孔作为阴性对照，观察加入待测样本后的细胞生长曲线，若加入待检样本后细胞生长曲线值出现20％细胞病变、同时与抗霍乱毒素中和抗体混合后无细胞病变，则判断为阳性(一般来说，如果是阳性，在加入样本后2小时内会达到20％病变)。
所述细胞培养基组成如下：马血清15％，胎牛血清2.5％，溶剂为F-12K培养基。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒及其检测方法，针对霍乱毒素的特异性细胞学反应，建立了一种能够实时动态、高灵敏度的霍乱毒素检测体系，可高特异性、快速、准确地鉴定霍乱毒素，能有效地将产毒株与非产毒株进行甄别，加强了产毒株的监测和控制，可极大地提高防治的效果和效益，对于霍乱的预防控制具有重要的意义。
(四)附图说明
图1为标准品检测结果；1～8分别为：0.9ng/ml、0.45ng/ml、0.22ng/ml、0.11ng/ml、55pg/ml、27.5pg/ml、14pg/ml和阴性对照；
图2为非线形标准曲线；
图3为17例阳性模拟样本检测结果；
图4为例阴性样本检测结果。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1、材料：
Y1肾上腺皮质细胞(ATCC：CCL-79)、F-12K培养基、马血清购自ATCC公司；胎牛血清购自Hyclone公司；霍乱毒素购自List biologicallaboratories公司；多聚赖氨酸、牛血清白蛋白和抗霍乱毒素中和抗体购自Sigma公司；96-E-plate购自瑞士Roche公司。实时细胞分析系统购自瑞士Roche公司。
2、检测方法：
2.1 96-E-plate的包被和细胞铺板
将多聚赖氨酸用磷酸盐缓冲液(pH7.2)按照1∶4(v/v)稀释配成包被液，每孔加100μl体积包被液包被96-E-plate，室温静置10分钟，除去包被液后用磷酸盐缓冲液清洗2次，待用。
将F-12K培养基按照15％和2.5％分别加入马血清和胎牛血清，混合均匀。将试剂盒中的Y1肾上腺皮质细胞按照终浓度1.5×104细胞/孔铺板，细胞培养基体积为150μl/孔，在实时细胞分析系统上37℃、5％CO2(另95％为空气)条件下培养，细胞的生长曲线值随着培养时间的延长而不断地增加。
2.2霍乱毒素检测
待细胞培养至18～20小时，加入毒素或菌体培养上清液。针对每一个产霍乱毒素的菌株和非产霍乱毒素的菌株培养上清液，分别取两份15μl，一份直接加入到有细胞生长孔，一份与等体积的抗霍乱毒素中和抗体混合，37℃孵育30分钟，然后加入细胞生长孔，用的霍乱纯毒素作为阳性对照。观察细胞生长曲线的变化情况。
2.3定量检测方法的建立
阴性粪便样本上清液(将固体粪便样本按照1∶5(g∶mL)稀释后，800～100g离心5～10分钟，取上清待用；如为腹泻样本，则800～100g离心5～10分钟，取上清待用)，采用含有0.1％(w/w)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液按照1∶10体积比稀释，取15μl，一份直接加入到细胞生长孔，一份先与等体积的抗霍乱毒素中和抗体混合，37℃孵育30分钟后再加入至不同的细胞生长孔。
将霍乱毒素标准品用上述溶液以2倍体积系列梯度稀释成0.9ng/ml～14pg/ml，共7个梯度，结果见图1。
3、结论：
阳性结果的判定标准为：加入待检样本后细胞生长曲线值出现20％细胞病变，同时与抗霍乱毒素中和抗体混合后无细胞病变；并以加入已知霍乱毒素的时间点至达到20％细胞病变的时间点所需时间与霍乱毒素的浓度绘制标准曲线，(见图2，标准方程为y＝0.8387x-0.3045)。(一般来说，如果是阳性，在加入样本后2小时内会达到20％病变)。
以阳性模拟样本(霍乱毒素标准品溶液掺入阴性样本中制备)进行检测，结果见图3，均呈阳性结果。
以非产毒性霍乱弧菌、副溶血性弧菌、志贺菌、艰难梭菌、沙门菌等进行检测，结果见图4，均无阳性结果出现。
由以上实验可知，本发明试剂盒可实时动态、高灵敏度地对霍乱毒素进行甄别，能有效地将产毒株与非产毒株进行甄别，对于霍乱的预防控制具有重要的意义。
Claims (5)
1.一种甄别霍乱毒素的细胞学检测试剂盒，主要包括：Y1肾上腺皮质细胞，抗霍乱毒素中和抗体，多聚赖氨酸，96-E-plate，以及用于Y1肾上腺皮质细胞的细胞培养基。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述细胞培养基组成如下：马血清15％，胎牛血清2.5％，溶剂为F-12K培养基。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还含有霍乱毒素标准品。
4.一种利用权利要求1所述试剂盒检测霍乱毒素的方法，所述方法包括：
(1)多聚赖氨酸用磷酸盐缓冲液稀释后包被96-E-plate；
(2)将Y1肾上腺皮质细胞以1～2×104细胞/孔的密度铺板，细胞培养基体积为100～200μl/孔，在实时细胞分析系统上于37℃、5％CO2条件下培养；
(3)细胞培养18～20小时后，取待测样本，加入细胞生长孔中，同时另取一份待测样本和抗霍乱毒素中和抗体混合、37℃孵育30分钟后，加入细胞生长孔中，在实时细胞分析系统上于37℃、5％CO2条件下培养；
(4)以不加样品的细胞生长孔作为阴性对照，观察加入待测样本后的细胞生长曲线，若加入待检样本后细胞生长曲线值出现20％细胞病变、同时与抗霍乱毒素中和抗体混合后无细胞病变，则判断为阳性。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述细胞培养基组成如下：马血清15％，胎牛血清2.5％，溶剂为F-12K培养基。
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2012
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 《中国病理生理杂志》 20071231 刘海鸥等 "SSeCKS对牛肺动脉内皮细胞黏附和迁移的影响" 第1758-1763页 1-5 第23卷, 第9期 * |
| 《家畜传染病》 19851231 唐红娣等 "Y-1细胞检测大肠菌LT及CT毒素" 第28-30页 1-5 , 第3期 * |
| 刘海鸥等: ""SSeCKS对牛肺动脉内皮细胞黏附和迁移的影响"", 《中国病理生理杂志》 * |
| 唐红娣等: ""Y-1细胞检测大肠菌LT及CT毒素"", 《家畜传染病》 * |
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