CN102512694A - 抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂及其制备方法与应用。该生物制剂的活性部分为siRNA-VP1和siRNA-2B；siRNA-VP1的转录模板的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；siRNA-2B的转录模板的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明通过将siRNA-VP1的转录模板和siRNA-2B的转录模板分别与U6启动子连接，克隆入人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X，得到能分别转录、串联结构的质粒；接着通过包装细胞包装，得到该重组腺病毒Adeno-2B-VP1。通过实验证实，重组腺病毒Adeno-2B-VP1的防治效果优于重组腺病毒Adeno-2B和Adeno-VP1分别单独应用或联合应用的效果。该生物制剂能有抑制口蹄疫病毒复制和抗口蹄疫病感染。
Description
技术领域
本发明属于口蹄疫防治技术领域，特别涉及一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂及其制备方法与应用。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起偶蹄类动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病感染率高，感染后发病率最高可达100％，易感动物多达70余种，其中重要的经济畜种如猪、牛、羊等均易感。鉴于FMD不仅降低动物生产性能，造成巨大的直接经济损失，而且还影响动物及动物产品的国际贸易，因此所造成的间接损失更大，同时还会影响一个国家的国际形象，故素有“政治经济病”之称。
各国学者对FMDV进行了广泛而又深入的研究。FMDV属小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)成员。该病毒有7个血清型，分别为A型、O型、C型、Asia I型、SAT I型、SAT II型和SAT III型，且血清型间无血清交叉反应和交叉免疫现象。各血清型又根据抗原亲缘关系分为不同的亚型，其亚型间抗原也有很大的差异。
目前，FMD是严重威胁畜牧业发展的重要传染病，发达国家主要采取扑杀为主的防控措施，发展中国家主要采取疫苗接种和扑杀相结合的方法。但是疫苗接种后需要至少七天的时间才能产生保护作用，同时由于FMDV血清型多，各血清型之间几乎没有交叉保护性，所以现在应用的单血清型疫苗难以达到对不同血清型和亚型的变异毒株产生保护作用。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象的发现为疾病防控开启了希望之门。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由功能性双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的序列特异性转录后同源靶基因沉默现象，是近几年迅速发展起来的一项用于抑制病毒复制的新技术。科研人员将RNAi技术应用于多种病毒性疾病的治疗研究，如艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、禽流感病毒等；RNAi技术也为抗FMDV感染方面的研究提供了新的思路。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂。
本发明的另一目的在于提供所述抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述抗口蹄疫病毒复制与感染的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，活性成分为siRNA-VP1和siRNA-2B；
siRNA-VP1的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
GAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCC；
反义链为(5’-3’)：
GGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTC；
siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
CCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGC；
反义链为(5’-3’)：
GCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGG；
以上序列的小写部分为茎环结构，粗体部分和斜体部分互补，以以上序列为模板，转录得到的siRNA为具有loop结构的dsRNA；
所述的siRNA-VP1和siRNA-2B是将其转录模板分别与U6启动子连接，克隆入载体制备得到；
所述的载体优选为人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X；
所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，更优选为重组腺病毒rAdeno-2B-VP 1；
所述的重组腺病毒rAdeno-2B-VP1通过如下方法制备得到：是将siRNA-VP1的转录模板和siRNA-2B的转录模板分别与U6启动子连接，克隆入人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X，得到能分别转录、串联结构的质粒；接着通过包装细胞包装，得到该重组腺病毒Adeno-2B-VP1；
所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂的制备方法，优选包含以下步骤：
(1)将如下所示的siRNA-VP1的转录模板和siRNA-2B的转录模板分别克隆入PSIREN-shuttle穿梭载体，位于U6启动子的下游，得到重组质粒pShuttle-2B和pShuttle-VP1；
siRNA-VP1的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
GATCCGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCTTTTTTTCTAGAG；
反义链为(5’-3’)：
AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCG；
siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
GATCCGCCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGCTTTTTTTCTAGAG；
反义链为(5’-3’)：
AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGGCG；
正义链寡核苷酸的5’端突出部分是BamHI酶切位点粘性末端，反义链寡核苷酸的5’端突出部分是EcoRI酶切位点粘性末端，加粗部分为siRNA正义链，斜体部分为siRNA的反向互补链，小写字体为loop环序列，下划线部分为7个连续T终止信号及其互补序列；
(2)分别通过PI-Sce I/I-Ceu I双酶切重组质粒pShuttle-2B和pShuttle-VP1，得到目的片段；再通过体外连接法分别将目的片段与人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X连接，得到重组质粒pAdeno-2B和pAdeno-VP1；
(3)将重组质粒pAdeno-2B和pAdeno-VP1分别线性化后，通过包装细胞包装，得到重组腺病毒Adeno-2B和Adeno-VP1；该重组腺病毒Adeno-2B和Adeno-VP1即为抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，使用时将其接种到动物体身上即可；
所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂的制备方法，更优选包含以下步骤：
(1)以前述得到重组质粒pShuttle-2B和pShuttle-VP1为模板，通过PCR分别得到U6启动子+2B融合片段和U6启动子+VP1融合片段，再将这两个融合片段串联，克隆入克隆载体上，得到串联结构、能分别独立转录的重组质粒P-2B-VP1；
(2)通过体外连接法将PI-Sce I/I-Ceu I双酶切重组质粒P-2B-VP1得到的目的片段与人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X载体骨架连接，得到重组质粒pAdeno-2B-VP1；
(3)将重组质粒pAdeno-2B-VP1线性化后，通过包装细胞包装，得到重组腺病毒Adeno-2B-VP1；该重组腺病毒Adeno-2B-VP1即为抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，使用时将其接种到动物体身上即可；
所述的克隆载体优选为pMD19-T simple载体；
所述的包装细胞优选为人胚肾细胞株HEK293；
所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂在制备抗口蹄疫病毒制剂中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂能有抑制口蹄疫病毒复制和抗口蹄疫病感染。通过实验证实，重组腺病毒rAdeno-2B-VP1的防治效果优于重组腺病毒r Adeno-2B和rAdeno-VP1分别单独应用或联合应用的效果。
附图说明
图1是筛选重组腺病毒质粒pAdeno-2B-VP1进行的菌落PCR鉴定电泳图；其中，泳道1～9为被筛选的菌落；泳道10为阴性对照；泳道M为DNA MarkerDL15000。
图2是重组腺病毒质粒pAdeno-2B-VP1的PacI酶切鉴定电泳图；其中，泳道M1为DNA Marker DL2000；泳道M2为DNA Marker DL15000；泳道1为重组腺病毒质粒pAdeno-2B-VP1 PacI酶切产物。
图3是不同时间点上清中FMDV滴度的测定图。
图4是不同时间细胞上清液中FMDV滴度测定图。
图5是各试验组不同时间细胞上清液中FMDV拷贝数检测图。
图6是重组腺病毒感染量与豚鼠保护率的关系图。
图7是不同重组腺病毒对豚鼠保护效果的比较图。
图8是重组腺病毒的预防保护时机图。
图9是重组腺病毒多次治疗防控FMD的效果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本发明是以不同年代和地区分离的O型FMDV为基础，选择FMDV 2B、VP1基因高度保守序列设计合成siRNA，克隆入PSIREN-shuttle穿梭载体，构建重组质粒pShuttle-2B、pShuttle-VP1，具体过程如下：
(1)将siRNA-VP1的转录模板和siRNA-2B的转录模板分别用去离子水稀释成相同的浓度(5pmol/μL)，分别把互补的两段寡核苷酸(各5μL混合)混匀后放在PCR扩增仪上，95℃处理2min，然后自然降到常温进行处理。将处理后形成的双链siRNA寡核苷酸片段分别与经BamHI和EcoRI双酶切处理后的pSIREN-Shuttle(Clontech公司)连接(连接反应按照T4 DNA连接酶说明书操作，阳性克隆筛选按照分子克隆实验指南操作)，得到pShuttle-2B(siRNA-2B的转录模板位于U6启动子下游)和pShuttle-VP1(siRNA-VP1的转录模板位于U6启动子下游)。
siRNA-VP1的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
GATCCGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCTTTTTTTCTAGAG；
反义链为(5’-3’)：
AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCG；
siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
GATCCGCCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGCTTTTTTTCTAGAG；
反义链为(5’-3’)：
AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGGCG；
(2)分别设计2对引物PVP1-F/PVP1-R与P2B-F/P2B-R，模板分别为pShuttle-VP1和pShuttle-2B，用PCR方法分别扩增U6启动子与siRNA-VP1融合片段(理论扩增片段长为329bp)、U6启动子与siRNA-2B融合片段(理论扩增片段长为325bp)，引物序列如下(5’-3’)：
PVP1-F：CCGCTCGAGGGGCAGGAAGAGGGCCTA；
PVP1-R：AAAACTGCAGTGCCATTTCATTACCTCTTTCTC；
P2B-F：ATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCG；
P2B-R：AACTGCAGACTCTCGAGGCACCCGACATAGATGAATTC。
PCR反应过程：按TaKaRa公司Ex-Taq DNA聚合酶使用说明进行，扩增体系(50μL)组成分别如下：
混匀后，在核酸扩增仪上执行如下反应程序：94℃5min，94℃30s，60℃15s，72℃45s，30个循环，最后72℃延伸3min。
将U6启动子与siRNA-VP1融合片段、U6启动子与siRNA-2B融合片段分别克隆入pMD19-T simple载体(宝生物工程公司，按照说明书操作)中，得到的连接产物转化感受态细胞大肠杆菌DH5α(广州合达有限公司)后，筛选得到质粒TVP1和质粒T2B。
用限制性内切酶Pst I、Xho I进行双酶切质粒TVP1，回收和纯化大小约为350bp的片段，用限制性内切酶Pst I、Xho I进行双酶切质粒T2B，回收载体。酶切体系如下表所示：
反应条件：37℃酶切6h。
将长度为350bp的含有U6启动子与siRNA-VP1的片段克隆入质粒T2B载体中，得到含2B-VP1双基因串联shRNA表达盒的重组质粒T2B-VP1，VP1和2B的排列顺序为U6-2B-U6-VP1。
以限制性内切酶PI-Sce I/I-Ceu I双酶切(参照NEB产品说明操作)重组质粒T2B-VP1和人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X(Clontech公司)，利用体外连接法(参照BD Adeno-XTM Expression System说明书操作)获得了重组质粒；经过PCR扩增鉴定(上游引物P1：5′-CGGGAAAACTGAATAAGACG-3′和下游引物P2：5′-CATCAAACGAGTTGGTGCT-3′)、酶切鉴定(PacI酶切鉴定)及序列测定，证实成功构建了重组腺病毒质粒pAdeno-2B-VP1(图1、图2)。该含有2个串联的FMDV特异性siRNA片段，且每个独立片段前均带有U6启动子基因序列。
PCR扩增鉴定条件：94℃5min，94℃45s，50℃45s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
本发明构建的重组腺病毒质粒pAdeno-2B-VP1用PacI酶切线性化，参照BD Adeno-XTM Expression System说明书，将纯化后的酶切产物转染人胚肾细胞(HEK293细胞，中国科学院细胞库)，包装含有FMDV 2B、VP1基因串联的siRNA片段的重组腺病毒rAdeno-2B-VP1，病毒经增殖、纯化，利用终点稀释法测定病毒滴度为4×1010pfu/mL。
同上，通过体外连接法将PI-Sce I/I-Ceu I双酶切后的pShuttle-VP1和pShuttle-2B分别与PI-Sce I/I-Ceu I双酶切后的pAdeno-X载体连接，得到重组腺病毒质粒pAdeno-VP1和pAdeno-2B；再用PacI分别将重组腺病毒质粒pAdeno-VP1和pAdeno-2B线性化，将纯化后的酶切产物转染人胚肾细胞(HEK293细胞，中国科学院细胞库)，包装，得到重组腺病毒AdVP1和Ad2B。
本发明中将重组腺病毒rAdeno-2B-VP1分别以1、5、10MOI的量感染猪肾细胞IBRS-2细胞(美国模式培养物集存库ATCC)(细胞密度为1×105/mL，按每孔100μL的量加到96孔细胞培养板上)，12h后再接种100TCID50 FMDV O型(FMDV O/HKN/2003)(已在文献《口蹄疫病毒对猪树突状细胞的免疫生物学特性影响的研究》，中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集，2008，502-508”中公开)，病毒滴度检测结果显示，rAdeno-2B-VP1能够抑制FMDV在IBRS-2细胞中的复制，而且增加重组腺病毒的量，可增强其对FMDV复制的抑制效果(图3，每一组从左到右分别是口蹄疫病毒对照组、1MOI组、5MOI组以及10MOI组)。
将腺病毒AdVP1、Ad2B、混合AdVP1+Ad2B、Adeno-2B-VP1均以10MOI的量感染IBRS-2细胞，12h后再接种FMDV，病毒滴度检测结果显示，重组腺病毒rAdeno-2B-VP1介导的RNAi在细胞中抑制FMDV复制作用效果优于腺病毒AdVP1和Ad2B以及两种腺病毒的混合AdVP1+Ad2B感染(图4)。以10MOIAdeno-2B-VP1分别在接种FMDV前12h，接种FMDV(100TCID50，每孔100μl)后0h、12h、24h，接种FMDV前12h及接种FMDV后0h这三种条件下感染IBRS-2细胞，检测病毒RNA拷贝数。FMDV核酸PCR-荧光探针法检测试剂盒为中山大学达安基因公司产品。提取的总RNA为模板，按照FMDV核酸PCR-荧光探针法检测试剂盒说明书进行一步法荧光定量PCR，具体步骤如下：
①引物与探针
荧光定量所用引物和探针均来源于所购试剂盒，探针的5’端标记荧光发光基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。引物及探针序列如下：
上游引物Pa：5’-CGGTCCGATGGAGAGACAGA-3’；
下游引物Pb：5’-CTTCACCGGTCCTTCATAAGGT-3’；
TapMan探针：5’-(FAM)-TGAAAGCAAGAGCCCCGGTCGTC-(TAMRA)-3’。
一步法荧光定量PCR反应，反应体系如表3所示：
表3
混匀后，在荧光定量PCR仪上执行如下反应程序：40℃25min；94℃3min；然后93℃15s，55℃45s，40个循环。反应结束后，对获得的信号、数据进行处理，以获得各样品的数据。
检测结果显示，接种FMDV前12h及接种FMDV后0h两次对细胞感染重组腺病毒Adeno-2B-VP1可在48h内100％抑制FMDV复制(图5，每一组从左到右分别是口蹄疫病毒对照组、预防组、治疗组(0h)、治疗组(12h)、治疗组(24h)以及综合防控组)，说明在细胞水平上以10MOI重组腺病毒Adeno-2B-VP1可最大程度预防和治疗FMDV的感染。
应用豚鼠(250～300g/只豚鼠(雌雄各半)购自广东省医学实验动物中心)作为动物模型，评估重组腺病毒Adeno-2B-VP1在动物个体内对FMDV感染的抑制效应。将各组豚鼠(5只/组)分别接种滴度为106、107、108PFU的Adeno-2B-VP1，24h后感染100ID50 FMDV。结果发现，108PFU Adeno-2B-VP1对保护豚鼠免受FMDV感染的效果最佳(图6)；将豚鼠分别接种108PFU的AdVP1、Ad2B、混合AdVP1+Ad2B及Adeno-2B-VP1，24h后感染FMDV。结果发现，联合两种含siRNA的重组腺病毒在动物体内对FMDV感染的抑制具有相加效果(图7)。将豚鼠分别接种108PFU Adeno-2B-VP1后的0h、24h、48h及72h感染FMDV。结果发现，感染FMDV前24h使用Adeno-2B-VP1对豚鼠的预防保护效果最佳(图8)；用108PFU重组腺病毒Adeno-2B-VP1对豚鼠分别进行单次、两次及三次注射。结果显示，三次注射重组腺病毒Adeno-2B-VP1的保护效果最好，保护率在6天内达到了100％(图9)。以上结果说明用108PFU重组腺病毒Adeno-2B-VP1进行预防和治疗能最大程度地增强豚鼠对FMDV的抵抗力。另外，用重组腺病毒Adeno-2B-VP1对FMDV发病猪群进行了紧急注射治疗，也取得了较好的效果。
可见，Adeno-2B-VP1在动物水平上对FMDV感染具有较好的保护效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，其特征在于：包括siRNA-VP1和siRNA-2B；所述的siRNA-VP1的转录模板的正义链的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述的siRNA-VP1的转录模板的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的siRNA-2B的转录模板的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的siRNA-2B的转录模板的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，其特征在于：所述的siRNA-VP1和siRNA-2B是将其转录模板分别与U6启动子连接，克隆入载体制备得到。
3.根据权利要求2所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，其特征在于：所述的载体为人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X。
4.根据权利要求3所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，其特征在于：所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂为重组腺病毒Adeno-2B-VP1；
所述的重组腺病毒Adeno-2B-VP1通过如下方法制备得到：是将siRNA-VP1的转录模板和siRNA-2B的转录模板分别与U6启动子连接，克隆入人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X，得到能分别转录、串联结构的质粒；接着通过包装细胞包装，得到该重组腺病毒Adeno-2B-VP1。
5.权利要求1所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)将如下所示的siRNA-VP1的转录模板和siRNA-2B的转录模板分别克隆入PSIREN-shuttle穿梭载体，得到重组质粒pShuttle-2B和pShuttle-VP1；
siRNA-VP1的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为：
5’-GATCCGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCTTTTTTTCTAGAG-3’；
反义链为：
5’-AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCG-3’；
siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为：
5’-GATCCGCCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGCTTTTTTTCTAGAG-3’；
反义链为：
5’-AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGGCG-3；
正义链寡核苷酸的5’端突出部分是BamHI酶切位点粘性末端，反义链寡核苷酸的5’端突出部分是EcoRI酶切位点粘性末端，加粗部分为siRNA正义链，斜体部分为siRNA的反向互补链，小写字体为loop环序列，下划线部分为7个连续T终止信号及其互补序列；
(2)分别通过PI-Sce I/I-Ceu I双酶切重组质粒pShuttle-2B和pShuttle-VP1，得到目的片段；再通过体外连接法分别将目的片段与人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X连接，得到重组质粒pAdeno-2B和pAdeno-VP1；
(3)将重组质粒pAdeno-2B和pAdeno-VP1分别线性化后，通过包装细胞包装，得到重组腺病毒r Adeno-2B和rAdeno-VP1；该重组腺病毒Adeno-2B和Adeno-VP1即为抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂。
6.根据权利要求5所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)以所述的重组质粒pShuttle-2B和所述的pShuttle-VP1为模板，通过PCR分别得到U6启动子+2B融合片段和U6启动子+VP1融合片段，再将这两个融合片段串联，克隆入克隆载体上，得到串联结构、能分别独立转录的重组质粒P-2B-VP1；
(2)通过体外连接法将PI-Sce I/I-Ceu I双酶切重组质粒P-2B-VP1得到的目的片段与人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X载体骨架连接，得到重组质粒pAdeno-2B-VP1；
(3)将重组质粒pAdeno-2B-VP1线性化后，通过包装细胞包装，得到重组腺病毒Adeno-2B-VP1；该重组腺病毒Adeno-2B-VP1即为抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂。
7.根据权利要求6所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂的制备方法，其特征在于：所述的克隆载体优选为pMD19-T simple载体。
8.根据权利要求5或6所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂的制备方法，其特征在于：所述的包装细胞为人胚肾细胞株HEK293。
9.权利要求1～4任一项所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂在制备抗口蹄疫病毒制剂中的应用。
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