CN102510864A - 抗病毒杂环化合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抑制丙型肝炎病毒NS5b聚合酶抑制剂的式(I)的1-N-取代的-6-(杂)芳基-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮衍生物，

其中R¹、R²、R³和R⁴如本文所定义。还公开了用于治疗HCV感染和抑制HCV复制的组合物和方法。

Description

抗病毒杂环化合物

本发明提供了式I的非核苷化合物及其某些衍生物，它们是RNA依赖性RNA病毒聚合酶的抑制剂。这些化合物对于治疗RNA依赖性RNA病毒感染有用。它们作为丙型肝炎病毒(HCV)NSSB聚合酶的抑制剂、作为HCV复制的抑制剂以及对于治疗丙型肝炎感染特别有用。

丙型肝炎病毒是全世界慢性肝疾病的主要原因。(Boyer，N.等，J.Hepatol.200032：98-112)。感染HCV的患者有发生肝硬化以及随后发生肝细胞癌的风险，因此HCV感染是肝移植的主要指征。

HCV已经被分类为黄病毒科病毒家族的成员，该病毒家族包括黄病毒属、瘟病毒属和包括丙型肝炎病毒的丙型肝炎病毒属(hapaceivirus)(Rice，C.M.，黄病毒科：病毒和它们的复制(Flaviviridae：The viruses and theirreplication)，Fields Virology，编辑：B.N.Fields，D.M.Knipe和P.M.Howley，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，Pa.，第30章，931-959，1996)。HCV是一种包膜病毒，含有约9.4kb的正义单链RNA基因组。该病毒基因组由一个高度保守的5’非翻译区(UTR)、一个编码约3011个氨基酸的多蛋白前体的长可读框和一个短3’UTR组成。

HCV的遗传学分析已经鉴定了6种主要基因型，其DNA序列的30％以上不同。超过30种亚型已被鉴别。在美国约70％的受感染个体具有1a型和1b型感染。1b型是亚洲最为普遍的亚型。(X.Forns和J.Bukh，Clinicsin Liver Disease 1999 3：693-716；J.Bukh等，Semin.Liv.Dis.199515：41-63)。不幸的是，1型感染比2型或3型基因型更难以治疗(N.N.Zein，Clin.Microbiol.Rev.，200013：223-235)。

病毒结构蛋白包括一种核壳核心蛋白(C)和两种包膜糖蛋白-E1和E2。HCV还编码两种蛋白酶—被NS2-NS3区编码的锌依赖性金属蛋白酶和在NS3区编码的丝氨酸蛋白酶。这些蛋白酶是前体多蛋白的特定区域裂解为成熟的肽所必需的。非结构蛋白5(NS5B)的羧基半段含有RNA依赖性RNA聚合酶。其余非结构蛋白NS4A和NS4B的功能以及NS5A(非结构蛋白5的氨基端半段)的功能依然是未知的。人们认为HCV RNA基因组编码的大多数非结构蛋白参与RNA复制。

目前，对于治疗HCV感染，可用的被认可的治疗数量有限。新的和现存的治疗HCV感染和抑制HCV NS5B聚合酶活性的治疗方法已被综述：R.G.Gish，Sem.Liver.Dis.，199919：5；Di Besceglie，A.M.和Bacon，B.R.，Scientific American，10月：199980-85；G.Lake-Bakaar，慢性丙型肝炎病毒肝疾病的目前的和将来的疗法(Current and Future Therapy forChronic Hepatitis C Virus Liver Disease)，Curr.Drug Targ.Infect.Dis.20033(3)：247-253；P.Hoffmann等，最近的关于丙型肝炎病毒感染的实验性疗法的专利(1999-2002)(Recent patent on experimental therapy forhepatitis C virus infection(1999-2002))，Exp.Opin.Ther.Patents 200313(11)：1707-1723；M.P.Walker等，治疗慢性丙型肝炎的有前景的候选物(Promising Candidates for the treatment of chronic hepatitis C)，Exp.Opin.Investing.Drugs 200312(8)：1269-1280；S.-L.Tan等，丙型肝炎治疗：目前的状况和新出现的策略(Hepatitis C Therapeutics：Current Status andEmerging Strategies)，Nature Rev.Drug Discov.20021：867-881；J.Z.Wu和Z.Hong，靶向于NS5B RNA依赖性RNA聚合酶的抗-HCV化学治疗(Targeting NS5B RNA-Dependent RNA Polymerase for Anti-HCVChemotherapy)，Curr.Drug Targ.-Infect.Dis.20033(3)：207-219。

利巴韦林(1-((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟基-5-羟甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺；Virazole)是一种合成的非干扰素诱导的广谱抗病毒核苷类似物。利巴韦林具有对抗包括黄病毒科在内的多种DNA和RNA病毒的体外活性(Gary L.Davis.Gastroenterology 2000 118：S104-S114)。尽管在单一药物治疗中利巴韦林在40％患者中将血清氨基转移酶降低至正常水平，但它不降低血清HCV-RNA水平。利巴韦林还表现出显著的毒性并且已知会诱发贫血。Viramidine是利巴韦林的前药，在肝细胞中被腺苷脱氨酶转变为利巴韦林。(J.Z.Wu，Antivir.Chem.Chemother.2006 17(1)：33-9)。

在近十年干扰素(IFN)已经被用于治疗慢性肝炎。IFN是免疫细胞应答于病毒感染产生的糖蛋白。两种不同类型的干扰素得到确认：1型包括多种干扰素α和一种干扰素β，2型包括干扰素γ。1型干扰素主要由受感染的细胞产生并保护邻近细胞免受新感染。IFN抑制包括HCV在内的许多病毒的病毒复制，并且当用作丙型肝炎感染的唯一治疗时，IFN抑制血清HCV-RNA至不能被检测到的水平。此外，IFN使血清氨基转移酶水平正常化。不幸的是，IFN的作用是暂时性的。中止治疗造成70％复发率，仅10％-15％表现出持久的病毒学应答且和正常的血清丙氨酸转移酶水平。(Davis，Luke-Bakaar，同上)

早期IFN治疗的一个局限是蛋白质从血液中迅速清除。用聚乙二醇(PEG)对IFN的化学衍生化导致蛋白质具有大幅改善的药动学性质。PEGASYS

是轭合的干扰素α-2a和40kD分支单甲氧基PEG，PEG-INTRON

是轭合的α-2b和12kD单甲氧基PEG。(B.A.Luxon等，Clin.Therap.2002 24(9)：13631383；A.Kozlowski和J.M.Harris，J.Control.Release 200172：217-224)。

用利巴韦林和干扰素α组合治疗HCV目前是最佳的HCV疗法。组合利巴韦林和PEG-IFN(infra)在54％-56％患有1型HCV的患者中产生持久的病毒应答(SVR)。对于2型和3型HCV，SVR接近80％。(Walker，同上)不幸的是，组合治疗还产生副作用，其造成临床挑战。抑郁、流行性感冒样症状和皮肤反应与皮下注射INF-α相关，溶血性贫血与用利巴韦林持续治疗相关。

现在已经确定了许多潜在的分子靶标来进行抗HCV疗法的药物开发，包括但不限于NS2-NS3自体蛋白酶(autoprotease)、NS3蛋白酶、NS3解旋酶和NS5B聚合酶。RNA依赖性RNA聚合酶对于单链正义RNA基因组的复制是绝对必需的。该酶在药物化学工作者中已经引起了极大兴趣。

核苷抑制剂能用作链终止剂或用作干扰核苷酸与聚合酶结合的竞争性抑制剂。为了作为链终止剂发挥作用，核苷类似物必须在体内被细胞摄取并在体内被转化为其三磷酸化形式，以便在聚合酶核苷酸结合位点作为底物进行竞争。这种向三磷酸化形式的转化通常由细胞激酶介导，所述细胞激酶造成了对任意核苷的另外的结构限制。此外，这种磷酸化的要求将核苷作为HCV复制的抑制剂的直接评价限制到了以细胞为基础的测定法上(J.A.Martin等，美国专利No.6,846,810；C.Pierra等，J.Med.Chem.200649(22)：6614-6620；J.W.Tomassini等，Antimicrob.Agents and Chemother.200549(5)：2050；J.L.Clark等.，J.Med.Chem.200548(17)：2005)。

当彼此组合使用以及与其它生物活性剂组合使用时，本发明的化合物和它们的异构形式及其药学上可接受的盐还可用于治疗病毒感染，特别是丙型肝炎感染，以及活宿主的疾病，所述其它生物活性剂包括但不限于干扰素、聚乙二醇化的干扰素、利巴韦林、蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、干扰RNA的小化合物、反义化合物、核苷酸类似物、核苷类似物、免疫球蛋白、免疫调节剂、肝保护剂(hepatoprotectant)、抗炎剂、抗生素、抗病毒剂和抗感染化合物。所述组合治疗还可以包括与其它药物或增效剂一起并行或相继提供本发明的化合物，所述其它药物或增效剂例如利巴韦林和相关的化合物、金刚烷胺和相关的化合物、各种干扰素如干扰素α、干扰素β、干扰素γ等，以及干扰素的替代形式如聚乙二醇化的干扰素。此外利巴韦林和干扰素的组合也可以作为另外的组合治疗与至少一种本发明的化合物一起施用。

目前正在开发的其它干扰素包括白蛋白干扰素-α-2b(Albuferon)、使用DUROS的IFN-ω、LOCTERON^TM和干扰素-α-2b XL。因为这些干扰素和其它干扰素进入到了市场，它们与本发明的化合物一起在组合治疗中的使用是可预期的。

HCV聚合酶抑制剂对于药物发现而言是另一个靶标，开发中的化合物包括R-1626、R-7128、IDX184/IDX102、PF-868554(Pfizer)、VCH-759(ViroChem)、GS-9190(Gilead)、A-837093和A-848837(Abbot)、MK-3281(Merck)、GSK949614和GSK625433(Glaxo)、ANA598(Anadys)、VBY708(ViroBay)。

HCV NS3蛋白酶抑制剂也已被确定对于治疗HCV是潜在有用的。在临床试验中的蛋白酶抑制剂包括VX-950(Telaprevir，Vertex)、SCH503034(Broceprevir，Schering)、TMC435350(Tibotec/Medivir)和ITMN-191(Intermune)。其它处于开发早期阶段的蛋白酶抑制剂包括MK7009(Merck)、BMS-790052(Bristol Myers Squibb)、VBY-376(Virobay)、IDXSCA/IDXSCB(Idenix)、BI12202(Boehringer)、VX-500(Vertex)、PHX1766(Phenomix)。

在研究的抗HCV治疗的其它靶标包括抑制RNA与NS5b结合的亲环蛋白抑制剂、硝唑沙奈、西戈韦(Migenix)、α-葡糖苷酶-1抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、Toll样受体(Toll-like receptor)激动剂和免疫刺激剂如日达仙(SciClone)。

目前没有丙型肝炎病毒(HCV)的预防性疗法，并且目前批准的仅对抗HCV的治疗是有限的。设计和开发新的药物化合物是必需的。

本发明提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中：

R¹是任选被1至3个选自以下的基团取代的苯基或吡啶基：

(a)C_1-6烷基，

(b)C_1-6烷氧基，

(c)卤素，

(d)苯基-C_1-6烷氧基，所述苯基任选独立地被1至3个选自C_1-3烷氧基、卤素或C_1-3烷基或C_1-3-卤代烷基的基团取代，

(e)苯基，

(f)杂芳基-C_1-3烷氧基，其中所述杂芳基是吡啶基、嘧啶基或吡嗪基，所述杂芳基任选独立地被1或2个选自氨基、C_1-6烷基、卤素或C_1-6烷氧基的基团取代；

(g)任选独立地被1或2个选自氨基、C_1-6烷基、卤素或C_1-6烷氧基的基团取代的苯氧基甲基；

(h)吡啶基甲基硫基，

(i)杂芳基，其中所述杂芳基是吡啶基、[1，3，4]

二唑-2-基、呋喃并[3，2-b]吡啶-2-基、吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基，并且所述杂芳基任选独立地被1至3个选自C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、氨基、C_1-3烷基氨基、C_1-3二烷基氨基、环状胺的基团取代，

(j)苯基-C_1-3烷基硫基，

(k)羟基，

(l)卤素，

(m)羧基，

(n)氰基，

(p)C_1-6羟基烷基，

(p)CONR^cR^d，

(q)NR^aR^b，

(r)NHC(O)NR^gR^h，和

(s)氢。

R²是卤素、C_1-3烷基或C_1-3烷氧基，n是0至2。

R^a和R^b(i)独立地是：

(a)C_1-6烷氧基羰基，

(b)苄基，

(c)羟基-C_1-6烷酰基，

(d)C_1-6酰基，

(e)苯基羰基，所述苯基任选独立地被1至3个选自C_1-3烷氧基、卤素、羟基的基团取代，

(f)杂芳基羰基，其中所述杂芳基是任选被取代的吡唑、2-甲基-呋喃-5-基-羰基、嘧啶基-4-羰基、

唑-5-基-羰基、吡嗪-2-基-羰基、吡啶基-羰基，所述杂芳基羰基任选被1或2个独立地选自C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、氨基、C_1-3烷基氨基、C_1-3二烷基氨基、环状胺或C_1-6羟基烷氧基的基团取代，

(g)氢，或

(ii)与它们所连接的氮一起形成环状胺。

R^c和R^d独立地是氢、C_1-6烷基或苯基。

R³是任选被1至3个选自(a)C_1-6烷基、(b)C_1-6烷氧基、(c)卤素、(d)NR^eR^f、(e)氰基、(f)C_1-3卤代烷基和(g)羟基的基团取代的苯基，或者是任选被1至3个选自C_1-4烷基、卤素或C_1-4烷氧基的基团取代的C_3-7环烷基。

R^e和R^f独立地是氢、C_1-6烷基、C_1-6磺酰基。

R^g和R^h独立地是氢或C_1-3烷基，或者与它们所连接的氮一起形成吡咯烷或哌啶。

R⁴是氢或C_1-6烷基。

通式I的化合物可以是中性化合物或其药学上可接受的盐。

本发明还提供了一种通过给需要其的患者施用治疗有效量的式I化合物来治疗丙型肝炎病毒(HCV)病毒感染疾病的方法。化合物可以被单独施用或与其它抗病毒化合物或免疫调节剂共同施用。

本发明还提供了一种通过以抑制HCV有效的量施用式I化合物来抑制细胞中HCV复制的方法。

本发明还提供了包含式I化合物和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。

本文所用的短语“一个(种)”实体是指一个(种)或多个(种)该实体；例如，化合物是指一个(种)或多个(种)化合物或至少一个(种)化合物。因此，术语“一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可以互换使用。

短语“上文所定义的”、“如上文所定义”是指在最宽的权利要求中提供的每个基团的最宽的定义。在下文提供的所有其它实施方案中，能存在于每个实施方案中的和没有明确定义的取代基保留所提供的最宽的定义。

无论是在过渡性短语中，还是在权利要求书的主体中，本申请中所用的术语“包含”应解释为具有开放性含义。即，该术语应被解释为与短语“至少具有”或“至少包括”同义。当在方法的语境中使用时，术语“包含”意指该方法至少包括列举出的步骤，但还可以包括另外的步骤。当在化合物或组合物的语境中使用时，术语“包含”意指化合物或组合物至少包括列举出的特征或组分，但还可以包括另外的特征或组分。

术语“独立地”在本文中表示变量适用于任何一种情况，不考虑在同一化合物中是否存在具有相同或不同定义的变量。因此，在其中R”出现两次并被定义为“独立地是碳或氮”的化合物中，两个R”可以均是碳，两个R”可以均是氮，或者一个R”可以是碳且另一个R”是氮。

当任何变量(例如，R¹、R^4a、Ar、X¹或Het)在描绘和描述本发明中使用或要求保护的化合物的任何部分或结构式中出现一次以上时，每次出现时它的定义相对于每次其它出现时它的定义是独立的。此外，取代基和/或变量的组合只有当这样的化合物是稳定的化合物时才被允许。

在价键末端的符号“*”或穿过价键所画的符号“------”各自是指官能团或其它化学基团与其作为组成部分的分子的剩余部分的连接点。因此，例如：

MeC(＝O)OR⁴，其中

画入环系统的价键(与在一个明确的点连接相反)表示该价键可以与任何合适的环原子连接。

本文所用的术语“任选的”或“任选”意指随后描述的事件或情况可以发生，但不必需发生，该描述包括所述事件或情况发生的情形和所述事件或情况不发生的情形。例如，“任选被……取代”或“任选被取代”意指任选被取代的基团可以引入氢或取代基。

术语“约”在本文中用于意指近似、在……左右、大致或在……周围。当术语“约”与数值范围联用时，它通过将界限扩展至高于或低于所给出的数值来调整该范围。一般而言，术语“约”在本文中用于将所给出的数值调整至高于或低于该数值20％。

如本文所用的那样，对于变量的数值范围的列举是为了表达本发明可以用等于该范围内的任何数值的变量进行实施。因此，对于本质上是非连续的变量，该变量可以等于数值范围的任何整数值，包括该范围的端点。类似地，对于本质上是连续的变量，该变量可以等于该数值范围的任何实值(real value)，包括该范围的端点。举例来说，被描述为具有0至2的值的变量，对于本质上是非连续的变量可以是0、1或2，对于本质上是连续的变量可以是0.0、0.1、0.01、0.001或任何其它实值。

式I化合物表现出互变异构现象。互变异构化合物可以以两种或更多种可相互转化的种类存在。质子转移型互变异构体由两个原子之间的共价键合的氢原子的迁移产生。互变异构体一般以平衡方式存在，分离单个互变异构体的尝试通常产生混合物，其化学和物理性质与化合物的混合物一致。平衡的位置取决于分子内的化学特征。例如，在许多脂肪族的醛和酮如乙醛中，酮形式占优势；而在酚中，烯醇形式占优势。常见的质子转移型互变异构体包括酮/烯醇

酰胺/亚胺酸和脒互变异构体。后两者在杂芳基和杂环中特别常见，本发明包括所述化合物的所有互变异构形式。

本领域技术人员应当理解的是，一些式I化合物可以含有一个或多个手性中心，因此存在两种或更多种立体异构形式。这些异构体的外消旋物、单独的异构体和富含一种对映体的混合物以及当存在两个手性中心时的非对映体和部分富含特定非对映体的混合物均在本发明的范围内。本领域技术人员还应当理解的是，托烷环的取代可以是内或外构型，本发明涵盖这两种构型。本发明包括式I化合物的所有单独的立体异构体(例如对映体)、外消旋混合物或部分拆分的混合物，以及在适宜的情况下其单独的互变异构形式。

外消旋物可以以外消旋物的形式使用或可以将其拆分为它们单独的异构体。拆分可以得到立体化学上纯的化合物或富含一种或多种异构体的混合物。分离异构体的方法是公知的(参见Allinger N.L.和Eliel E.L.“Topicsin Stereochemistry”，第6卷，Wiley Interscience，1971)，包括物理方法，如使用手性吸附剂的色谱法。单独的异构体可以由手性前体以手性形式制备。作为替代选择，单独的异构体可以通过以下方法从混合物中分离出来：与手性酸如10-樟脑磺酸、樟脑酸、α-溴代樟脑酸、酒石酸、二乙酰基酒石酸、苹果酸、吡咯烷酮-5-甲酸等形成非对映体盐，将盐分级结晶，然后释放出一种或两种被拆分的碱，任选重复该方法，从而获得基本上不含另一种异构体的一种或两种异构体；即，以具有＞95％的光学纯度的形式获得一种或两种异构体。作为替代选择，可以将外消旋物与手性化合物(辅助化合物)共价连接以产生可以通过色谱法或通过分级结晶分离的非对映体，然后将手性辅助化合物通过化学方法去除，得到纯的对映体。

式I化合物可以含有碱性中心，由形成无毒的盐的酸形成合适的酸加成盐。无机酸盐的实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐。有机酸盐的实例包括乙酸盐、富马酸盐、双羟萘酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、樟脑磺酸盐、D和L-乳酸盐、D和L-酒石酸盐、乙磺酸盐、甲磺酸盐、丙二酸盐、乳清酸盐、葡庚糖酸盐、甲基硫酸盐、硬脂酸盐、葡糖醛酸盐、2-萘磺酸盐、甲苯磺酸盐、海苯酸盐、烟酸盐、羟乙基磺酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、琥珀酸盐、糖二酸盐、苯甲酸盐、乙磺酸盐和双羟萘酸盐。关于合适的盐的综述，参见Berge等，J.Pharm.Sci.，1977 66：1-19和G.S.Paulekuhn等，J.Med.Chem.200750：6665。

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义。本文参考本领域技术人员已知的各种方法和材料。给出药理学一般原理的标准参考著作包括Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw HillCompanies Inc.，New York(2001)。制备这些化合物所用的起始材料和试剂一般可从商业供应商如Aldrich Chemical Co.获得，或者是通过本领域技术人员已知的方法按照参考文献中给出的操作制备的。除非另有说明，否则在下面的描述和实施例中所提及的原料、试剂等可从商业来源获得。一般合成操作在论文中已有描述并且是本领域技术人员熟悉的，所述论文例如Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis；Wiley & Sons：NewYork，第1-21卷；R.C.LaRock，Compreh ensive Organic Transformations，第2版Wiley-VCH，New York 1999；Comprehensive Organic Synthesis，B.Trost和I.Fleming(编辑)第1-9卷Pergamon，Oxford，1991；Comprehensive Heterocyclic Chemistry，A.R.Katritzky和C.W.Rees(编辑)Pergamon，Oxford 1984，第1-9卷；Comprehensive Heterocyclic ChemistryII，A.R.Katritzky和C.W.Rees(编辑)Pergamon，Oxford 1996，第1-11卷；和Organic Reactions，Wiley & Sons：New York，1991，第1-40卷。

在本发明的一个实施方案中，提供了其中R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物。

在本发明的第二个实施方案中，提供了式Ia的化合物，其中R^1a是任选被取代的对-亚苯基，R^1b是NR^aR^b，R^a是氢，且R^b是羟基-C_1-6烷酰基、C_1-6酰基、任选被取代的苯基羰基或任选被取代的杂芳基羰基，

在本发明的第三个实施方案中，提供了式Ia的化合物，其中R^1a是任选进一步被卤素取代的对-亚苯基，R^1b是NR^aR^b，R²和R⁴是氢，R³是任选被卤素或C_1-6烷基取代的苯基，R^a是氢，且R^b是羟基-C_1-6烷酰基、C_1-6酰基、任选被取代的苯基羰基或任选被取代的杂芳基羰基。

在本发明的第四个实施方案中，提供了式Ia的化合物，其中R^1a是任选进一步被卤素取代的对-亚苯基，R^1b是NR^aR^b，R²和R⁴是氢，R³是任选被卤素或C_1-6烷基取代的苯基，R^a是氢，且R^b是任选被取代的苯基羰基或任选被取代的杂芳基羰基。

在本发明的第五个实施方案中，提供了式Ia的化合物，其中R^1a是任选被取代的对-亚苯基，R^1b是任选被取代的杂芳基，且R²和R⁴是氢。

在本发明的第六个实施方案中，提供了式Ia的化合物，其中R^1a是任选被取代的对-亚苯基，R^1b是任选被取代的吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基，R³是任选被卤素或C_1-6烷基取代的苯基，且R²和R⁴是氢。

在本发明的第七个实施方案中，提供了式Ia的化合物，其中R^1a是任选被取代的对-亚苯基，R^1b是7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基，R³是任选被卤素或C_1-6烷基取代的苯基，且R²和R⁴是氢。

在本发明的另一个实施方案中，提供了式Ia的化合物，其中R^1a是任选被取代的对-亚苯基，R^1b是任选被取代的嘧啶基，R³是任选被卤素或C_1-6烷基取代的苯基，且R²和R⁴是氢。

在本发明的第八个实施方案中，提供了式Ia的化合物，其中R^1a是任选被取代的对-亚苯基，且R^1b是任选被取代的苯基-C_1-3烷氧基或任选被取代的杂芳基-甲氧基。

在本发明的第九个实施方案中，提供了式Ia的化合物，其中R^1a是任选被取代的对-亚苯基，R^1b是任选被取代的苄氧基，且R²和R⁴是氢。

在本发明的另一个实施方案中，提供了式Ia的化合物，其中R^1a是任选被取代的对-亚吡啶基，R^1b是任选被取代的苄氧基，且R²和R⁴是氢。

在本发明的第十个实施方案中，提供了选自表I中的I-1至I-59的化合物。

在本发明的第十一个实施方案中，提供了其中R¹R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物用于治疗HCV感染的用途或在制备用于治疗HCV感染的药剂中的用途。

在本发明的第十二个实施方案中，提供了用于治疗HCV感染的其中R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物和至少一种免疫系统调节剂和/或至少一种抑制HCV复制的抗病毒剂或者其中R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物和至少一种免疫系统调节剂和/或至少一种抑制HCV复制的抗病毒剂在制备用于治疗HCV感染的药剂中的用途。

在本发明的第十三个实施方案中，提供了其中R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物和至少一种选自干扰素、白介素、肿瘤坏死因子或集落刺激因子的免疫系统调节剂用于治疗由HCV导致的疾病的用途或在制备用于治疗由HCV导致的疾病的药剂中的用途。

在本发明的第十四个实施方案中，提供了其中R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物和干扰素或化学衍生化的干扰素用于治疗HCV感染的用途或其中R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物和干扰素或化学衍生化的干扰素在制备用于治疗HCV感染的药剂中的用途。

在本发明的第十五个实施方案中，提供了其中R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物和选自HCV蛋白酶抑制剂、另外的HCV聚合酶抑制剂、HCV解旋酶抑制剂、HCV引发酶抑制剂和HCV融合抑制剂的另外的抗病毒化合物用于治疗HCV感染的用途或在制备用于治疗HCV感染的药剂中的用途。

在本发明的第十六个实施方案中，提供了与至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合的其中R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物用于抑制细胞中病毒复制的用途。

在本发明的第十一个实施方案中，提供了一种在需要其的患者中治疗HCV感染的方法，其包括施用治疗有效量的其中R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物。

在本发明的第十二个实施方案中，提供了一种在需要其的患者中治疗HCV感染的方法，其包括共同施用治疗有效量的其中R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物和至少一种免疫系统调节剂和/或至少一种抑制HCV复制的抗病毒剂。

在本发明的第十三个实施方案中，提供了一种在需要其的患者中治疗由HCV导致的疾病的方法，其包括共同施用治疗有效量的其中R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物和至少一种选自干扰素、白介素、肿瘤坏死因子或集落刺激因子的免疫系统调节剂。

在本发明的第十四个实施方案中，提供了一种在需要其的患者中治疗HCV感染的方法，其包括共同施用治疗有效量的其中R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物和干扰素或化学衍生化的干扰素。

在本发明的第十五个实施方案中，提供了一种在需要其的患者中治疗HCV感染的方法，其包括共同施用治疗有效量的其中R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物和选自HCV蛋白酶抑制剂、另外的HCV聚合酶抑制剂、HCV解旋酶抑制剂、HCV引发酶抑制剂和HCV融合抑制剂的另外的抗病毒化合物。

在本发明的第十六个实施方案中，提供了一种通过递送治疗有效量的与至少一种药学上可接受载体、稀释剂或赋形剂混合的其中R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物来抑制细胞中病毒复制的方法。

在本发明的第十七个实施方案中，提供了包含与至少一种药学上可接受载体、稀释剂或赋形剂混合的其中R¹、R²、R³和R⁴如上文所定义的式I化合物的组合物。

本文所用的没有另外限定的单独的或与其它基团组合使用的术语“烷基”表示含有1至10个碳原子的无支链的或支链的饱和的单价烃基。术语“低级烷基”表示含有1至6个碳原子的直链的或支链的烃基。本文所用的“C_1-6烷基”是指包含1至6个碳原子的烷基。烷基的实例包括但不限于低级烷基，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、新戊基、己基和辛基。任何碳氢键可以在不脱离本发明范围的情况下被碳氘键代替。

本文所述的定义可以拼接形成化学上相关的组合，如“杂烷基芳基”、“卤代烷基杂芳基”、“芳基烷基杂环基”、“烷基羰基”、“烷氧基烷基”等。当术语“烷基”作为后缀用在另一术语后面时，如在“苯基烷基”或“羟基烷基”中，这是指被1至2个选自其它具体命名的基团的取代基取代的上文所定义的烷基。因此，例如，“苯基烷基”是指具有1至2个苯基取代基的烷基，因此包括苄基、苯乙基和联苯基。“烷基氨基烷基”是具有1至2个烷基氨基取代基的烷基。“羟基烷基”包括2-羟基乙基、2-羟基丙基、1-(羟基甲基)-2-甲基丙基、2-羟基丁基、2，3-二羟基丁基、2-(羟基甲基)、3-羟基丙基等。相应地，本文所用的术语“羟基烷基”用于定义下文所定义的杂烷基的一个子集。术语“(芳)烷基”是指未被取代的烷基或芳烷基。术语“(杂)芳基”或“(杂)芳基”是指一种取代基，其可以是芳基或杂芳基。

本文所用的术语“环烷基”表示含有3至8个碳原子的饱和的碳环，即环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基。本文所用的“C_3-7环烷基”是指在碳环中包含3至7个碳的环烷基。

本文所用的术语“烷氧基”意指-O-烷基，其中烷基如上文所定义，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基，包括它们的异构体。本文所用的“低级烷氧基”表示具有之前定义的“低级烷基”的烷氧基。本文所用的“C_1-10烷氧基”是指-O-烷基，其中烷基是C_1-10烷基。

本文所用的术语“卤代烷基”表示其中1、2、3个或更多个氢原子被卤素代替的上文所定义的无支链的或支链的烷基。实例是1-氟甲基、1-氯甲基、1-溴甲基、1-碘甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氯甲基、1-氟乙基、1-氯乙基、12-氟乙基、2-氯乙基、2-溴乙基、2，2-二氯乙基、3-溴丙基或2，2，2-三氟乙基。本文所用的术语“氟烷基”是指其中卤素是氟的卤代烷基。

除非另有说明，否则本文所用的术语“芳基”是指可任选被1至3个独立地选自羟基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、卤代烷基、硝基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基的取代基取代的苯基环。

除非另有说明，否则本文所用的术语“苄基”是指其中苯基环可任选被1至3个上文针对芳基所述的取代基取代的C₆H₅CH₂基团。

除非另有说明，否则本文所用的术语“苯氧基甲基”是指其中苯基环可任选被1至3个上文针对芳基所述的取代基取代的PhOCH₂-基团。

本文所用的术语“卤素”或“卤代”意指氟、氯、溴或碘。

本文所用的术语“羟基烷基”和“烷氧基烷基”表示其中在不同碳原子上的1至3个氢原子分别被羟基或烷氧基代替的本文所定义的烷基。C_1-3烷氧基-C_1-6烷基是指其中1至3个氢原子被C_1-3烷氧基代替的C_1-6烷基取代基，并且烷氧基的连接点是氧原子。

本文所用的术语“氰基”是指通过三键与氮连接的碳，即，-C≡N。本文所用的术语“硝基”是指基团-NO₂。本文所用的术语“羧基”是指基团-CO₂H。

本文所用的术语“酰基”(或“烷酰基”)表示式-C(＝O)R的基团，其中R是氢或本文所定义的低级烷基。本文所用的术语“烷基羰基”表示式C(＝O)R的基团，其中R是本文所定义的烷基。术语C_1-6酰基或“烷酰基”是指含有1-6个碳原子的-C(＝O)R基团。C₁酰基是甲酰基，其中R＝H，C₆酰基当烷基链无支链时是指己酰基。本文所用的术语“芳基羰基”或“芳酰基”意指式C(＝O)R的基团，其中R是芳基。本文所用的术语“杂芳基羰基”或“杂芳酰基”是指式C(＝O)R的基团，其中R是杂芳基。本文所用的术语“苯甲酰基”或“苯基羰基”是其中R是苯基的“芳基羰基”或“芳酰基”。

本文所用的术语“氨基”、“烷基氨基”和“二烷基氨基”分别是指-NH₂、-NHR和-NR₂并且R是上文所定义的烷基。二烷基部分中与氮连接的两个烷基可以相同或不同。本文所用的术语“氨基烷基”、“烷基氨基烷基”和“二烷基氨基烷基”分别是指NH₂(CH₂)_n-、RHN(CH₂)_n-和R₂N(CH₂)_n-，其中n是1至6且R是上文所定义的烷基。本文所用的“C_1-10烷基氨基”是指其中烷基是C_1-10烷基的烷基氨基。本文所用的术语“苯基氨基”是指-NHPh，其中Ph表示任选被取代的苯基。

本文所用的术语“环状胺”是指上文所定义的含有3至6个碳原子的饱和的碳环，其中至少一个碳原子被选自N、O和S的杂原子代替，例如哌啶、哌嗪、吗啉、硫吗啉、二-氧代-硫吗啉、吡咯烷、吡唑啉、咪唑烷、氮杂环丁烷，其中环碳原子任选被一个或多个取代基取代，所述取代基选自卤素、羟基、苯基、低级烷基、低级烷氧基，或者碳上的2个氢原子都被氧代基(＝O)代替。当环状胺是哌嗪时，一个氮原子可以任选被C_1-6烷基、C_1-6酰基、C_1-6烷基磺酰基取代。

本文所用的术语“烷基磺酰基”和“芳基磺酰基”表示式-S(＝O)₂R的基团，其中R分别是烷基或芳基，并且烷基和芳基如本文所定义。本文所用的术语C_1-3烷基磺酰基氨基是指基团RSO₂NH-，其中R是本文所定义的C_1-3烷基。术语C_1-6卤代烷基磺酰基、C_3-7环烷基磺酰基、C_3-7环烷基-C_1-3烷基-磺酰基或C_1-6烷氧基-C_1-6烷基磺酰基是指化合物S(＝O)₂R，其中R分别是C_1-6卤代烷基、C_3-7环烷基、C_3-7环烷基-C_1-3烷基和C_1-6烷氧基-C_1-6烷基。

本文所用的术语“吡啶基甲基硫基”是指基团(吡啶基)CH₂S-。术语“苯基-C_1-3烷基硫基”是指基团PhCH₂S-。

本文所用的术语“杂芳基C_1-3烷氧基”是指其中烷氧基上的氢被杂芳基代替的本文所定义的烷氧基，应当理解的是，“杂芳基C_1-3烷氧基”的连接点在烷氧基的氧原子上。

术语“4-(吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-”是指下面的基团：

本文所用的术语“亚苯基”是指具有两个开放价的苯环。亚苯基具有三种可能的区域异构体—邻-、间-或对-亚苯基。本文所用的短语“任选被取代的对-亚苯基”是指其中与碳连接的剩余氢之一任选被取代基代替的对-亚苯基。本文所用的术语“亚吡啶基”是指具有两个开放价的吡啶环。术语对-亚吡啶基具有两种区域异构体(i)和(ii)，其中A和B不同。

当彼此组合使用以及与其它生物活性剂组合使用时，本发明的化合物和它们的异构形式及其药学上可接受的盐还可用于治疗和预防病毒感染，特别是丙型肝炎感染，以及活宿主的疾病，所述其它生物活性剂包括但不限于干扰素、聚乙二醇化的干扰素、利巴韦林、蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、干扰RNA的小化合物、反义化合物、核苷酸类似物、核苷类似物、免疫球蛋白、免疫调节剂、肝保护剂、抗炎剂、抗生素、抗病毒剂和抗感染化合物。所述组合治疗还可以包括与其它药物或增效剂一起并行或相继提供本发明的化合物，所述其它药物或增效剂例如利巴韦林和相关的化合物、金刚烷胺和相关的化合物、各种干扰素如干扰素α、干扰素β、干扰素γ等，以及干扰素的替代形式如聚乙二醇化的干扰素。此外利巴韦林和干扰素的组合也可以作为另外的组合治疗与至少一种本发明的化合物一起施用。

在一个实施方案中，式I的本发明的化合物与其它活性治疗成分或治疗剂组合使用用于治疗HCV病毒感染的患者。根据本发明，与本发明的化合物组合使用的活性治疗成分可以是当与本发明的化合物组合使用时具有治疗作用的任何物质。例如，与本发明的化合物组合使用的活性剂可以是干扰素、利巴韦林类似物、HCV NS3蛋白酶抑制剂、HCV聚合酶的核苷抑制剂、HCV聚合酶的非核苷抑制剂和用于治疗HCV的其它药物，或它们的混合物。

核苷NS5b聚合酶抑制剂的实例包括但不限于NM-283、valopicitabine、R1626、PSI-6130(R1656)、IDX184和IDX102(Idenix)BILB1941。

非核苷NS5b聚合酶抑制剂的实例包括但不限于HCV-796(ViroPharma和Wyeth)、MK-0608、MK-3281(Merck)、NM-107、R7128(R4048)、VCH-759、GSK625433和GSK625433(Glaxo)、PF-868554(Pfizer)、GS-9190(Gilead)、A-837093和A848837(Abbot Laboratories)、ANA598(Anadys Pharmaceuticals)；GL100597(GNLB/NVS)、VBY 708(ViroBay)、苯并咪唑衍生物(H.Hashimoto等WO 01/47833，H.Hashimoto等WO 03/000254，P.L.Beaulieu等WO 03/020240A2；P.L.Beaulieu等US 6,448,281B1；P.L.Beaulieu等WO 03/007945A1)、苯并-1，2，4-噻二嗪衍生物(D.Dhanak等WO 01/85172A1，提交于5/10/2001；D.Chai等WO2002098424，提交于6/7/2002，D.Dhanak等WO 03/037262A2，提交于10/28/2002；K.J.Duffy等WO03/099801A1，提交于5/23/2003，M.G.Darcy等WO2003059356，提交于10/28/2002；D.Chai等WO 2004052312，提交于6/24/2004，D.Chai等WO2004052313，提交于12/13/2003；D.M.Fitch等WO2004058150，提交于12/11/2003；D.K.Hutchinson等WO2005019191，提交于8/19/2004；J.K.Pratt等WO 2004/041818A1，提交于10/31/2003)、1，1-二氧代-4H苯并[1，4]噻嗪-3-基衍生物(J.F.Blake等，在公开号为US20060252785的美国专利中)和1，1-二氧代-苯并[d]异噻唑-3-基化合物(J.F.Blake等，在公开号为2006040927的美国专利中)。

HCV NS3蛋白酶抑制剂的实例包括但不限于SCH-503034(Schering，SCH-7)、VX-950(telaprevir，Vertex)、BILN-2065(Boehringer-Ingelheim)、BMS-605339(Bristol Myers Squibb)和ITMN-191(Intermune)。

干扰素的实例包括但不限于聚乙二醇化的rIFN-α2b、聚乙二醇化的rIFN-α2a、rIFN-α2b、rIFN-α2a、共有序列IFNα(干复津)、feron、reaferon、intermaxα、r-IFN-β、干复津和干扰素γ-1b、使用DUROS的IFN-ω、albuferon、locteron、Albuferon、Rebif、口服干扰素α、IFNα-2bXL、AVI-005、PEG-干复津和聚乙二醇化的IFN-β。

利巴韦林类似物和利巴韦林前药viramidine(taribavirin)已经与干扰素一起施用用于控制HCV。

常用的缩写包括：乙酰基(Ac)、水性或含水或水溶液(aq.)、大气压(Atm)、2，2’-双(二苯基膦基)-1，1’-联萘(BINAP)、叔丁氧基羰基(Boc)、焦碳酸二叔丁酯或boc酸酐(BOC₂O)、苄基(Bn)、丁基(Bu)、化学文摘登记号(CASRN)、苄氧基羰基(CBZ或Z)、羰基二咪唑(CDI)、1，5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1，2-二氯乙烷(DCE)、二氯甲烷(DCM)、偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)、偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)、二异丁基氢化铝(DIBAL或DIBAL-H)、二异丙基乙基胺(DIPEA)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、4-N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、乙基(Et)、乙酸乙酯(EtOAc)、乙醇(EtOH)、2-乙氧基-2H-喹啉-1-甲酸乙酯(EEDQ)、乙醚(Et₂O)、六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’N’-四甲基脲

乙酸(HATU)、乙酸(HOAc)、1-N-羟基苯并三唑(HOBt)、高压液相色谱(HPLC)、异丙醇(IPA)、甲醇(MeOH)、熔点(mp)、MeSO₂-(mesyl或Ms)、甲基(Me)、乙腈(MeCN)、间氯过苯甲酸(MCPBA)、质谱(ms)、甲基叔丁基醚(MTBE)、N-甲基吗啉(NMM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、苯基(Ph)、丙基(Pr)、异丙基(i-Pr)、磅/平方英寸(psi)、吡啶(pyr)、室温(rt或RT)、satd.(饱和的)、叔丁基二甲基硅烷基或t-BuMe₂Si(TBDMS)、三乙胺(TEA或Et₃N)、三氟甲磺酸酯基或CF₃SO₂-(Tf)、三氟乙酸(TFA)、四氟硼酸O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲

(TBTU)、薄层色谱(TLC)、四氢呋喃(THF)、四甲基乙二胺(TMEDA)，三甲基硅烷基或Me₃Si(TMS)、对甲苯磺酸一水合物(TsOH或pTsOH)、4-Me-C₆H₄SO₂-或甲苯磺酸酯基(Ts)、N-尿烷-N-羧基环内酸酐(N-urethane-N-carboxyanhydride，UNCA)。包括前缀正(n-)、异(i-)、仲(sec-)、叔(tert-)和新(neo-)的常规命名法当与烷基一起使用时具有它们的惯常含义。(J.Rigaudy和D.P.Klesney，Nomenclature in OrganicChemistry，IUPAC 1979Pergamon Press，Oxford.)。

在下面的表中提供了本发明所包括的和在本发明范围内的代表性化合物的实例。提供接下来的这些实例和制备以使本领域技术人员能更清楚地理解和实施本发明。它们不应被认为是限制本发明的范围，而仅作为其举例说明和代表。

一般而言，在本申请中使用的命名法均基于AUTONOM^TM 4.0版，其是一种用于产生IUPAC系统命名的Beilstein Institute计算机系统。如果所描绘的结构与针对该结构给出的名称之间有差异，则所描绘的结构更为准确。此外，如果结构或结构的一部分的立体化学没有用例如粗线或虚线标明，则该结构或结构的一部分应当被解释为包括其所有立体异构体。

用下面的编号方案来描述本发明的化合物。

表I

本发明的化合物可以用下面所示的和描述的举例说明性合成反应流程中所描绘的各种方法来制备。制备这些化合物所用的起始材料和试剂一般可从商业供应商如Aldrich Chemical Co.获得，或者是通过本领域技术人员已知的方法按照参考文献中给出的操作制备的，所述参考文献例如Fieserand Fieser’s Reagents for Organic Synthesis；Wiley & Sons：New York，第1-21卷；R.C.LaRock，Comprehensive Organic Transformations，第2版Wiley-VCH，New York 1999；Compreh ensive Organic Synthesis，B.Trost和I.Fleming(编辑)第1-9卷Pergamon，Oxford，1991；ComprehensiveHeterocyclic Chemistry，A.R.Katritzky和C.W.Rees(编辑)Pergamon，Oxford 1984，第1-9卷；Comprehensive Heterocyclic Chemistry II，A.R.Katritzky和C.W.Rees(编辑)Pergamon，Oxford 1996，第1-11卷；和Organic Reactions，Wiley & Sons：New York，1991，第1-40卷。下面的合成反应流程仅仅是可合成本发明的化合物的一些方法的举例说明，可以对这些合成反应流程进行许多修改并且本领域技术人员参考本申请所包含的公开内容将意识到这些修改。

如果需要，可以用常规技术对合成反应流程中的起始材料和中间体进行分离和纯化，所述常规技术包括但不限于过滤、蒸馏、结晶、色谱法等。可以用包括物理常数和光谱数据在内的常规手段对该类材料进行定性。

除非有相反规定，否则本文所述的反应优选是在惰性气氛下、在大气压下、在约-78℃至约150℃、更优选约0℃至约125℃的反应温度下、最优选和方便地在约室温(或环境温度)、例如约20℃下进行的。

下面流程中的一些化合物是用泛化的取代基描绘的；但是，本领域技术人员应当立即意识到，基团R的性质可进行变化，以提供本发明考虑的各种化合物。此外，反应条件是举例性的，供替代选择的条件是公知的。下面的实例中的反应顺序并不意味着要对权利要求书中所述的本发明的范围进行限制。

本发明的化合物共同的1-N-取代的-6-(杂)芳基-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮骨架是由3-氨基-5-溴噻吩-l-甲酸甲酯通过以下方法制备的：通过还原胺化对胺进行烷基化，得到A-1b，用甲脒将其环化，得到A-2。C-7部分的引入是使用钯催化的偶联化学进行的，从而得到A-3。

当R³是任选被取代的苯基且R⁴是氢时，步骤1是用任选被取代的苯甲醛进行的。其中R⁴是烷基的相应化合物可以由相应的烷基苯基酮来制备。当R³是任选被取代的环烷基时，用环烷基甲醛来进行还原胺化。

还原胺化典型地是通过将胺和羰基化合物在存在复合金属氢化物如NaBH₄、LiBH₄、NaBH₃CN、Zn(BH₄)₂、三乙酰氧基硼氢化钠或硼烷/吡啶的情况下、方便地在约1-7的pH下、任选在存在脱水剂如分子筛或Ti(IV)(O-i-Pr)₄的情况下(以促进中间体亚胺的形成)、在环境温度下进行的。或者，可以在氢气气氛下、在存在氢化催化剂的情况下、例如在存在Pd/C的情况下、在1至5巴的氢气压下、优选在20℃至所用溶剂的沸腾温度的温度下形成亚胺。如果在反应期间用常规保护基团对反应性基团进行保护，则在反应期间可能也是有利的，在反应后再用常规方法裂解所述常规保护基团。对还原胺化已有综述：R.M.Hutchings和M.K.Hutchings，用金属氢化物将C＝N还原成CHNH(Reduction of C＝N to CHNH by MetalHydrides)，Compreh ensive Organic Synth esis col.8，I.Fleming(编辑)Pergamon，Oxford 1991，第47-54页。

7-(杂)芳基取代基是利用A-2和任选被取代的(杂)芳基硼酸的钯催化的Suzuki偶联引入的。本领域技术人员将意识到，被取代的(杂)芳基硼酸易于获得并且步骤3中A-3的Suzuki偶联可直接生成所需的产物或可进一步对最初引入的(杂)芳基部分进行修饰。因此，如实施例1中所述，如果所述硼酸是[4-(叔丁氧基羰基氨基)-苯基]硼酸，则除去Boc基团生成胺，可通过例如将未屏蔽的胺酰基化或烷基化将其进一步官能化。在接下来的实施例中公开了随后转化Suzuki偶联产物的代表性实例。

Suzuki反应是烃代硼酸(R-B(OH)₂，其中R是芳基或乙烯基)与芳基或乙烯基卤化物或三氟甲磺酸酯(R′Y，其中R′＝芳基或乙烯基；Y＝卤素或OSO₂CF₃)的钯-催化的偶联，得到化合物R-R′。典型的催化剂包括Pd(PPh₃)₃、Pd(OAc)₂和PdCl₂(dPPf)。用PdCl₂(dPPf)，可以使伯烷基硼烷化合物与芳基或乙烯基卤化物或三氟甲磺酸酯在不进行β-消除的情况下进行偶联。已经鉴定了高活性的催化剂(参见例如J.P.Wolfe等，J.Am.Chem.Soc.1999 121(41)：9550-9561和A.F.Littke等，J.Am.Chem.Soc.2000122(17)：4020-4028)。反应可以在各种有机溶剂(包括甲苯、THF、二

烷、1，2-二氯乙烷、DMF、DMSO和乙腈)、水性溶剂中以及在双相条件下进行。反应典型地于约室温至约150℃进行。添加剂(例如CsF、KF、TlOH、NaOEt和KOH)常常加速偶联。Suzuki反应中有大量参数，包括钯源、配体、添加剂和温度，对于给定的一对反应物的最佳条件有时需要优化参数。A.F.Littke等(同上)披露了利用Pd₂(dba)₃/P(tert-Bu)₃于室温以高收率与芳基硼酸进行Suzuki交叉偶联的条件和利用Pd(OAc)₂/P(C₆H₁₁)₃于室温与三氟甲磺酸芳基酯和三氟甲磺酸乙烯基酯交叉偶联的条件。J.P.Wolf等(同上)披露了利用Pd(OAc)₂/邻-(二叔丁基膦基)联苯或邻-(二环己基膦基)联苯进行Suzuki交叉偶联的有效条件。本领域技术人员无需过度实验就能确定最佳条件。

胺的酰化方便地是用酰卤或酸酐在溶剂如DCM、CHCl₃、四氯化碳、醚、THF、二

烷、苯、甲苯、MeCN、DMF、NaOH水溶液或环丁砜中、任选在存在无机械或有机碱的情况下、在-20至200℃的温度下、但是优选在-10至160℃的温度下进行的。典型的有机碱包括叔胺，包括但不限于TEA、吡啶。典型的无机碱包括但不限于K₂CO₃和NaHCO₃。

然而，酰化也可以用游离酸、任选在存在酸活化剂或脱水剂的情况下、例如在存在氯甲酸异叔丁酯、亚硫酰氯、三甲基氯硅烷、氯化氢、硫酸、甲磺酸、p-TsOH、PCl₃、P₂O₅、DCC、DCC/N-羟基琥珀酰亚胺或HOBt、CDI、四氟硼酸O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲

/NMM、四氟硼酸O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲/DIPEA、N，N′-亚硫酰二咪唑(N，N’-thionyldiimidazole)或PPh₃/CCl₄的情况下、在-20至200℃的温度下、但是优选在-10至160℃的温度下进行。

被取代的胺和硫烷可通过胺或苯硫酚的烷基化类似地制备。

本发明所包括的其中R″是苯基醚的化合物可以通过被适宜取代的硼酸的偶联(例如实施例8)来制备。苯酚代硼酸如4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苯酚的烷基化提供了许多结构不同的烃代硼酸，其可用来制备本文所述的化合物(例如实施例10)。

苯酚的烷基化典型地是在溶剂如DMF、THF、NMP、MeCN、丙酮、DCM和DCE中、在0℃至100℃的温度下进行的。典型地使用的碱是与烷基化剂如烷基卤、甲磺酸烷基酯和三氟甲磺酸烷基酯联合的碳酸钾、氢化钠、六甲基二硅基胺基锂(lithium hexamethyldisilazide)、六甲基二硅基胺基钠(sodium hexamethyldisilazide)和六甲基二硅基胺基钾(potassiumhexamethyldisilazide)。供替代选择的操作如Mitsunobu偶联在本领域中是公知的并且可在有利时使用。硫醇或胺的类似的烷基化可以在类似条件下进行。

本发明所包括的其中R″是被杂芳基取代的苯基环的化合物是通过A-2和烃代硼酸如2-[4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苯基]-吡唑并[1，5-a]嘧啶或其本领域中已知的衍生物的钯-催化的偶联制备的。

本发明的化合物作为HCV活性抑制剂的活性可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法测量，包括体内和体外测定法。例如，式I化合物的HCV NS5B抑制活性可使用以下文献中所述的标准测定法操作来测定：Behrens等，EMBO J.199615：12-22，Lohmann等，Virology 1998249：108-118和Ranjith-Kumar等，J.Virology 2001 75：8615-8623。除非另外说明，否则本发明的化合物已经在这些标准测定法中被证明具有体外HCV NS5B抑制活性。用于本发明的化合物的HCV聚合酶测定法的条件如实施例20中所述。已经开发了以细胞为基础的HCV复制子系统，其中非结构蛋白在Huh7细胞中稳定地复制亚基因组病毒RNA(V.Lohmann等，Science 1999 285：110和K.J.Blight等，Science 2000 290：1972)。用于本发明的化合物的以细胞为基础的复制子测定法的条件如实施例21中所述。在不存在由病毒非结构蛋白和宿主蛋白组成的纯化的功能性HCV复制酶的情况下，我们对黄病毒科RNA合成的理解来源于使用活性重组RNA依赖性RNA-聚合酶进行的研究和对这些研究在HCV复制子系统中的验证。化合物在体外生物化学测定法中对重组纯化HCV聚合酶的抑制作用可以使用复制子系统(其中聚合酶与其它病毒和细胞的多肽以适宜的化学计量一起存在于复制酶复合物内)验证。以细胞为基础的HCV复制的抑制的证明比体外生物化学测定法中HCV NS5B抑制活性的证明可更强地预测体内功能。

本发明的化合物可以被配制在多种多样的口服施用剂型和载体中。口服施用可以是片剂、包衣片、糖衣丸(dragée)、硬和软明胶胶囊、溶液、乳剂、糖浆或混悬剂的形式。当通过其它施用途径施用时本发明的化合物是有效的，在所述其它施用途径中包括连续(静脉内滴注)局部胃肠外施用、肌内施用、静脉内施用、皮下施用、透皮施用(其可包括渗透促进剂)、口含施用、鼻施用、吸入施用和栓剂施用。优选的施用方式一般是使用方便的每天给药方案的口服施用，所述给药方案可以根据疾患的程度和患者对活性成分的反应而调整。

本发明的一种或多种化合物以及它们的可药用盐与一种或多种常规赋形剂、载体或稀释剂一起可以被置于药物组合物形式和单位剂型中。药物组合物和单位剂型可以包含常规比例的常规成分，包含或不包含另外的活性化合物或成分，且单位剂型可以含有与预期使用的日剂量范围相称的任何合适的有效量的活性成分。药物组合物可以以下列形式使用：用于口服使用的固体如片剂或填充胶囊、半固体、粉末、持续释放制剂或液体如溶液、混悬液、乳剂、酏剂或填充胶囊；或用于直肠或阴道施用的栓剂；或用于胃肠外使用的无菌注射液。典型的制剂将含有约5％至约95％活性化合物(w/w)。术语“制剂”或“剂型”既包括活性化合物的固体制剂，也包括活性化合物的液体制剂，本领域技术人员应当理解的是，活性成分能存在于不同的制剂中，这取决于靶器官或组织以及所需的剂量和药动学参数。

本文所用的术语“赋形剂”是指在制备药物组合物中有用的化合物，其通常是安全的、无毒的并且在生物学方面和其它方面不具有不希望的性质，包括兽医用途以及人药学用途可接受的赋形剂。本发明的化合物能单独施用，但一般与一种或多种基于预期的施用途径和标准制药实践而选择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载体混合施用。

“药学上可接受的”意指在制备药物组合物中有用，通常是安全的、无毒的并且在生物学方面和其它方面不具有不希望的性质，包括对人药学用途是可接受的。

活性成分的“药学上可接受的盐”形式也可以首先赋予活性成分合乎需要的非盐形式不具备的药动学性质，甚至可以在活性成分的体内治疗活性方面对活性成分的药效学产生积极影响。短语化合物的“药学上可接受的盐”意指药学上可接受的并具有所需的母体化合物的药理学活性的盐。所述盐包括：(1)与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成的酸加成盐；或与有机酸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等形成的酸加成盐；或(2)当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子代替时所形成的盐；或与有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等的配位化合物。

固体形式制剂包括散剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和可分散的颗粒剂。固体载体可以是一种或多种也可用作稀释剂、矫味剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料的物质。在散剂中，载体一般是精细粉碎的固体，它是与精细粉碎的活性组分的混合物。在片剂中，活性组分一般与具有必要粘合能力的载体以合适的比例混合并压制成所需的形状和大小。合适的载体包括但不限于碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。除活性组分之外，固体形式制剂还可含有着色剂、矫味剂、稳定剂、缓冲剂、人造的和天然的甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。

液体制剂也适合用于口服施用，液体制剂包括乳剂、糖浆、酏剂、水溶液、水性混悬液。这些包括旨在在使用前即刻转化为液体形式的制剂的固体形式的制剂。乳剂可以在溶液中、例如在丙二醇水溶液中制备，或者可以含有乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇单油酸酯或阿拉伯胶。水溶液可以通过将活性组分溶于水并加入合适的着色剂、矫味剂、稳定剂和增稠剂来制备。水性混悬液可以通过将精细粉碎的活性组分分散在含有粘性材料如天然或合成的树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其它公知的助悬剂的水中来制备。

本发明的化合物可以被配制用于胃肠外施用(例如，通过注射，例如推注或连续输注)，可以是在安瓿、预填充注射器、小容量输液中的单位剂量形式或处于其中加入了防腐剂的多剂量容器中。组合物可以采取在油性或水性介质中的混悬剂、溶液或乳剂，例如在聚乙二醇水溶液中的溶液。油性或非水性载体、稀释剂、溶剂或介质的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如，橄榄油)和注射用有机酯(例如，油酸乙酯)，可以含有制剂物质如防腐剂、润湿剂、乳化剂或助悬剂、稳定剂和/或分散剂。作为替代选择，活性成分可以是粉末形式，其通过将无菌固体进行无菌分装或通过将溶液冷冻干燥而得到，在使用前用合适的介质例如无菌无热原的水进行重构。

本发明的化合物可以被配制为软膏剂、乳膏剂或洗剂或被配制为透皮贴剂用于局部施用于表皮。软膏剂和乳膏剂可以例如使用水性或油性基质、加入合适的增稠剂和/或胶凝剂来配制。洗剂可以用水性或油性基质配制，一般还含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、助悬剂、增稠剂或着色剂。适用于在口中局部施用的制剂包括：在经矫味的基质中包含活性剂的锭剂，所述经矫味的基质通常是蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶；在惰性基质中含有活性成分的软锭剂，所述惰性基质例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶；以及在合适的液体载体中包含活性成分的漱口剂。

本发明的化合物可以被配制用于以栓剂形式施用。首先将低熔点蜡如脂肪酸甘油酯的混合物或可可脂熔化，并将活性组分均匀分散，例如通过搅拌均匀分散。然后将熔化的均匀混合物倒入合适大小的模具中，使其冷却并固化。

本发明的化合物可以被配制用于鼻施用。溶液或混悬剂通过常规方法直接应用于鼻腔，例如，用滴管、吸管或喷雾器应用。制剂可以以单剂量或多剂量形式提供。在后者的滴管或吸管情况下，这可以通过对患者施用适宜的、预设体积的溶液或混悬剂而实现。在喷雾器的情况下，这可以例如借助计量雾化喷雾器泵实现。

本发明的化合物可以被配制用于气雾剂施用，特别是施用于呼吸道，包括鼻内施用。化合物一般具有小粒度，例如五(5)微米或更小级别的粒度。这样的粒度可以通过本领域已知的方法获得，例如通过微粉化获得。活性成分与合适的抛射剂一起在加压包装中提供，所述抛射剂如含氯氟烃(CFC)例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷，或二氧化碳或其它合适的气体。气雾剂也可方便地含有表面活性剂如卵磷脂。药物的剂量可以通过计量阀控制。作为替代选择，活性成分可以以干粉形式提供，例如化合物在合适的粉末基质如乳糖、淀粉、淀粉衍生物如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷(PVP)中的粉末混合物。粉末载体将在鼻腔中形成凝胶。粉末组合物可以以单位剂量形式提供，例如以胶囊或药筒、例如明胶胶囊或药筒或泡罩包装的形式提供，借助吸入器可从中施用粉末。

合适的制剂以及药物载体、稀释剂和赋形剂在E.W.Martin编辑的Remington：The Science and Practice of Pharmacy 1995，Mack PublishingCompany，第19版，Easton，Pennsylvania中有描述。制剂领域的技术人员可以在本说明书的教导内对制剂进行调整以提供多种制剂用于特定的施用途径，而不使本发明的组合物不稳定或损害它们的治疗活性。

为了使它们在水或其它介质中具有更大溶解性而对本发明的化合物进行的修饰例如可以容易地通过微小的修饰(成盐、酯化等)来完成，这些完全在本领域的普通技能范围内。为了在患者中达到最大的有益作用而调整特定化合物的施用途径和剂量方案以控制本发明的化合物的药动学也完全在本领域的普通技能范围内。

本文所用的术语“治疗有效量”意指在个体中减轻疾病症状所需要的量。剂量将在每个特定的病例中根据个体需要加以调整。剂量可以在宽限度内变化，这取决于多种因素，如被治疗的疾病的严重程度、患者的年龄和一般健康状况、正用于治疗患者的其它药物、施用的途径和方式以及所涉及的医师的偏好和经验。对于口服施用，在单一药物治疗和/或组合治疗中，约0.01至约1000mg/kg体重/天的日剂量应是适宜的。优选的日剂量为每天约0.1至约500mg/kg体重，更优选0.1至约100mg/kg体重，最优选1.0至约10mg/kg体重。因此，对于70kg的人的施用，剂量范围将是约7mg至0.7g/天。日剂量可以以单剂量的形式或以多个分剂量、通常每天1至5个剂量的形式施用。一般而言，治疗以小于化合物最佳剂量的较小剂量开始。之后，剂量以小的增幅增加，直到达到单个患者的最佳效果。在治疗本文所述的疾病时，普通技术人员将无需过度的实验并且依靠个人的知识、经验和本申请所公开的内容就能够确定本发明的化合物用于给定的疾病或患者的治疗有效量。

在本发明的实施方案中，活性化合物或盐可以与另外的抗病毒剂如利巴韦林、核苷HCV聚合酶抑制剂、另外的HCV非核苷聚合酶抑制剂或HCV蛋白酶抑制剂组合施用。当活性化合物或其衍生物或盐与另外的抗病毒剂组合施用时，活性可超过母体化合物。当治疗是组合治疗时，所述施用可以与核苷衍生物的施用同时或相继进行。因此本文所用的“同时施用”包括在同一时间或在不同时间施用活性剂。两种或更多种活性剂在同一时间的施用可以通过含有两种或更多种活性成分的单个制剂或通过基本上同时施用含有单一活性剂的两种或更多种剂型来实现。

本文所用的术语“治疗有效量”意指在个体中减轻疾病症状所需要的量。剂量将在每个特定的病例中根据个体需要加以调整。剂量可以在宽限度内变化，这取决于多种因素，如被治疗的疾病的严重程度、患者的年龄和一般健康状况、正用于治疗患者的其它药物、施用的途径和方式以及所涉及的医师的偏好和经验。对于口服施用，在单一药物治疗和/或组合治疗中，约0.01至约1000mg/kg体重/天的日剂量应是适宜的。优选的日剂量为每天约0.1至约500mg/kg体重，更优选0.1至约100mg/kg体重，最优选1.0至约10mg/kg体重。因此，对于70kg的人的施用，剂量范围将是约7mg至0.7g/天。日剂量可以以单剂量的形式或以多个分剂量、通常每天1至5个剂量的形式施用。一般而言，治疗以小于化合物最佳剂量的较小剂量开始。之后，剂量以小的增幅增加，直到达到单个患者的最佳效果。在治疗本文所述的疾病时，普通技术人员将无需过度的实验并且依靠个人的知识、经验和本申请所公开的内容就能够确定本发明的化合物用于给定的疾病或患者的治疗有效量。

治疗有效量的本发明的化合物和任选的一种或多种另外的抗病毒剂是有效降低病毒载量或实现病毒对治疗持续响应的量。除了病毒载量外，持续响应的有用的指示物还包括但不限于肝纤维化、血清转氨酶水平升高和肝脏中的炎性坏死活动(necroinflammatory activity)。一个旨在举例而非限制的常见的标记物的例子是血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)，其通过标准临床测定法测量。在本发明的一些实施方案中，有效的治疗方案是将ALT水平降低至小于约45IU/mL血清的方案。

为了使它们在水或其它介质中具有更大溶解性而对本发明的化合物进行的修饰例如可以容易地通过微小的修饰(成盐、酯化等)来完成，这些完全在本领域的普通技能范围内。为了在患者中达到最大的有益作用而调整特定化合物的施用途径和剂量方案以控制本发明的化合物的药动学也完全在本领域的普通技能范围内。

下列实施例举例说明了本发明范围内的化合物的制备和生物学评价。提供以下这些实施例和制备是为了使本领域技术人员能更清楚地理解和实施本发明。它们不应被认为是对本发明的范围的限制，而仅是其举例说明和代表。

在下面的实验操作中，本文所用的与SiO₂色谱洗脱剂有关的术语“magic”是指DCM/MeOH/NH₄OH的60/10/1的溶液。

参考实施例1

6-溴-1-(4-甲基-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(30)

步骤1-向冷却至0℃的32a(1.58g，6.75mmol，CASRN 07818-55-3)和在CH₂Cl₂(20mL)和HOAc(4mL)中的4-甲基-苯甲醛(1mL，8.5mmol)在DCM(20mL)和HOAc(4mL)中的溶液中加入NaBH(OAc)₃(1.6g，7.5mmol)。将反应混合物搅拌并使其温热至室温。(在一些情况下，加入另外的醛和NaBH(OAc)₃以推动反应进行完全。)将反应冷却至0℃，用2NNaOH淬灭，用DCM萃取，干燥(Na₂SO₄)，过滤，浓缩。将粗产物用SiO₂色谱纯化，用EtOAc/己烷梯度(2％至5％EtOAc)洗脱，得到1.65g 32b。

步骤2-向32b(700mg，2.06mmol)在甲酰胺(12mL)中的浆液中滴加KOtBu(12mL，12mmol，1.0M在THF中的溶液)。将反应混合物加热至回流过夜，使其冷却至室温，通过加入H₂O将其淬灭，用DCM萃取。将合并的萃取物干燥(Na₂SO₄)，过滤，浓缩。将粗产物用SiO₂色谱纯化，用由60/10/DCM/MeOH/NH₄OH溶液和DCM组成的梯度(98％至85％DCM)洗脱，得到0.5g 30。

在一些情况下，环化进行不完全。在这些情况下，将起始材料和产物的混合物分离，再用环化条件进行处理，得到所需产物。

参考实施例2

6-溴-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮

6-溴-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(34)是按照实施例1中所述的操作合成的，不同的是在还原胺化步骤中使用4-氯-苯甲醛。

参考实施例3

6-溴-1-(反式-4-甲基-环己基甲基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(36)

6-溴-1-(反式-4-甲基-环己基甲基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(36)是按照实施例1中所述的操作合成的，不同的是在还原胺化步骤中使用反式-4-甲基-环己烷甲醛。

反式-4-甲基-环己烷甲醛是以反式-4-甲基-环己烷甲酸为原料合成的。用TMSCHN₂形成甲基酯，然后于-78℃进行Dibal还原，得到反式-4-甲基-环己烷甲醛。

参考实施例4

6-溴-1-(2-氟-4-甲基-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(35)

6-溴-1-(2-氟-4-甲基-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(35)是按照实施例1中所述的操作合成的，不同的是在还原胺化步骤中使用2-氟-4-甲基-苯甲醛。

实施例1

吡啶-2-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4--二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺(I-39)

步骤1-向34(300mg，0.85mmol)、[4-(叔丁氧基羰基氨基)-苯基]硼酸(260mg，1.1mmol)和Pd(PPh₃)₄(125mg)在DMF(5mL)中的浆液中加入饱和Na₂CO₃水溶液(3mL)。将反应混合物于100℃搅拌，直至所有的起始材料都被消耗掉(约30min)。将反应混合物冷却至室温，用H₂O淬灭，用EtOAc萃取，干燥(Na₂SO₄)，浓缩。将粗产物用SiO₂色谱纯化，用Magic/CH₂Cl₂梯度(2％至30％Magic)洗脱，得到250mg 38a。

在一些情况下，在将反应混合物淬灭后，在将反应用H₂O淬灭后产物沉淀出来。在这些情况下，收集沉淀物，将上清液用EtOAc萃取，干燥(Na₂SO₄)并用SiO₂色谱进行处理。

步骤2-将38a(50mg)和HCl-二

烷(1mL，4.0M在二

烷中的溶液)的溶液于室温搅拌，直至所有的起始材料都被消耗掉。蒸发掉溶剂，得到38b的盐酸盐，将其不经进一步纯化即使用。

步骤3-向得自步骤2的38b、吡啶-2-甲酸(20mg，0.16mmol)在DMF(1mL)和TEA(0.05mL)中的溶液中加入EEDQ(40mg，0.16mmol)。将反应混合物加热至60℃，反应完全，冷却至室温，然后用H₂O淬灭。收集所得固体，得到10mg I-39：C₂₅H₁₇ClN₄O₂S的MS[M+H]⁺计算值473，实测值473；¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ10.87(宽s，1H)，8.78-8.73(m，1H)，8.67(s，1H)，8.21-8.15(m，1H)，8.13-8.03(m，3H)，7.86-7.79(m，3H)，7.74-7.68(m，1H)，7.46(s，4H)，5.49(s，2H)

类似地制备了5-羟基-吡啶-2-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺(I-46)，不同的是在步骤3中，用5-羟基-吡啶-2-甲酸(CASRN 15069-92-8)代替吡啶-2-甲酸，用HATU代替EEDQ。

类似地制备了4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-N-苯基-苯甲酰胺(I-47)，不同的是在步骤1中，用B-[4-[(苯基氨基)羰基]苯基]-硼酸(CASRN 330793-45-8)代替[4-(叔丁氧基羰基氨基)-苯基]硼酸并省略步骤2和3。

类似地制备了6-联苯-4-基-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-13)，不同的是在步骤1中，用B-(4-苯基-苯基)硼酸(CASRN 5122-94-1)代替[4-(叔丁氧基羰基氨基)-苯基]硼酸并省略步骤2和3。

类似地制备了1-(4-氯-2-氟-苄基)-6-苯基-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-21)，不同的是在步骤1中，用苯基硼酸(CASRN 98-80-6)代替[4-(叔丁氧基羰基氨基)-苯基]硼酸，用35代替34并省略步骤2和3。

类似地制备了1-(4-氯-苄基)-6-(4-氯-苯基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-22)，不同的是在步骤1中，用4-氯-苯基硼酸(CASRN 1679-18-1)代替[4-(叔丁氧基羰基氨基)-苯基]硼酸，用30代替34并省略步骤2和3。

类似地制备了1-(4-氯-苄基)-6-(4-苯氧基-苯基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-24)，不同的是在步骤1中，用4-苯氧基-苯基硼酸(CASRN51067-38-0)代替[4-(叔丁氧基羰基氨基)-苯基]硼酸并省略步骤2和3。

类似地制备了6-(4-丁氧基-3-氯-苯基)-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-25)，不同的是在步骤1中，用4-丁氧基-3-氯-苯基硼酸(CASRN480438-55-9)代替[4-(叔丁氧基羰基氨基)-苯基]硼酸并省略步骤2和3。

类似地制备了1-(4-氯-苄基)-6-对甲苯基-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-29)，不同的是在步骤1中，用4-叔丁基-苯基硼酸(CASRN 123324-71-0)代替[4-(叔丁氧基羰基氨基)-苯基]硼酸，用30代替34并省略步骤2和3。

N-{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-乙酰胺(I-37)是通过在存在吡啶和DMAP的情况下用乙酸酐对38b进行乙酰化来制备的。

类似地制备了4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苄腈(I-52)，不同的是在步骤1中，用4-氰基-苯基硼酸(CASRN126747-14-6)代替[4-(叔丁氧基羰基氨基)-苯基]硼酸并省略步骤2和3.

4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯甲酸(I-56)是从使用用于制备I-52的4-氰基-苯基硼酸(CASRN 126747-14-6)进行的Suzuki偶联反应中分离出来。

类似地制备了1-(4-氯-苄基)-6-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-56)，不同的是在步骤1中，用4-(吡咯烷-1-基)-苯硼酸(CASRN229009-41-0)代替[4-(叔丁氧基羰基氨基)-苯基]硼酸并省略步骤2和3。

可类似地制备吡咯烷-1-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺(I-54)，不同的是在步骤3中，脲可以通过依次用DCI和吡咯烷处理38b来制备。

实施例2

N-{2-氯-4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-4-羟基-丁酰胺(I-30)

步骤1-向34(500mg，0.85mmol)、4-氨基-3-氯苯基硼酸频哪醇酯(465mg，1.84mmol)和Pd(PPh₃)₄(250mg)在DMF(5mL)中的浆液中加入饱和Na₂CO₃水溶液(3.5mL)。将反应混合物于100℃搅拌，直至起始材料被消耗掉。将反应混合物冷却至室温，然后用H₂O淬灭。将所得沉淀物滤出，然后依次用己烷/EtOAc和己烷/DCM洗涤，得到417mg 6-(4-氨基-3-氯-苯基)-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(40)：C₁₉H₁₃Cl₂N₃OS的MS[M+H]⁺计算值402，实测值402。

步骤2-将AlMe3(0.25mL，2.0M，0.5mmol)加入到40(50mg，0.12mmol)在DCM(0.5mL)中的浆液中。将混合物搅拌15min，然后加入γ-丁内酯(0.02mL)，将混合物于30℃搅拌48h。将混合物冷却至室温，加入1N HCL并收集固体。将该固体在制备型SiO₂TLC上纯化，用30％己烷/70％Magic展开，得到10mg N-{2-氯-4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-4-羟基-丁酰胺(I-30)：C₂₃H₁₉Cl₂N₃O₃S的MS[M+H]⁺计算值488，实测值488。

¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ9.57(宽s，1H)，8.67(s，1H)，7.99-7.87(m，3H)，7.75-7.69(m，1H)7.45(s，4H)，5.49(s，2H)，4.51(t，1H)，3.46(q，2H)，2.49(t，2H)，1.81-1.68(m，2H)。

类似地制备了I-35，不同的是在步骤2中，用α-甲基-丁内酯代替γ-丁内酯。

实施例3

吡啶-2-甲酸{2-氯-4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺(I-1)

将吡啶-2-甲酰氯盐酸盐(40mg，0.23mmol)加入到被维持在0℃的40(50mg，0.12mmol)和TEA(0.05mL，0.37mmol)在DCM₂中的浆液中。将反应混合物搅拌过夜并使其温热至室温。将反应混合物于35℃搅拌3天。收集固体，依次用DCM、MeOH和H₂O洗涤，得到30mg I-1：C₂₅H₁₆Cl₂N₄O₂S的MS[M+H]⁺计算值507，实测值507：¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ10.78(宽s，1H)，8.81-8.76(m，1H)，8.69(s，1H)，8.55(d，1H)，8.28-8.06(m，3H)，7.99(s，1H)，7.90-7.82(m，1H)，7.80-7.72(m，1H)，7.48(m，4H)，5.49(s，2H)。

实施例4

N-{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-2-氟-苯基}-苯甲酰胺(I-14)

步骤1-向34(200mg，0.56mmol)、4-Boc-氨基-3-氟苯基硼酸(200mg，0.78mmol)和Pd(PPh₃)₄(90mg)在DMF(3mL)中的浆液中加入饱和NaHCO₃水溶液(1.2mL)。将反应混合物于70℃搅拌，直至所有的起始材料都被消耗掉，冷却至室温，用H₂O淬灭。将溶液用EtOAc萃取，干燥(Na₂SO₄)，过滤，浓缩。将粗产物用SiO₂色谱纯化，用Magic/DCM梯度(2％至30％Magic)洗脱，得到200mg{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-2-氟-苯基}-氨基甲酸叔丁酯(42)：C₂₄H₂₁ClFN₃O₃S的MS[M+H]⁺计算值486，实测值486。

步骤2-将HCl-二烷(1mL，4.0M溶液)加入到42(70mg)中。将反应混合物于室温搅拌，直至所有的起始材料都被消耗掉。将反应浓缩，得到HCl盐形式的6-(4-氨基-3-氟-苯基)-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(44)，将其不经进一步纯化即用于下一步。

步骤3-向维持在0℃的得自步骤2的HCl盐44和TEA(33μL，0.24mmol)在DCM中的浆液中加入苯甲酰氯(17μL，0.14mmol)。将反应混合物于室温搅拌过夜。将混合物在制备型SiO₂TLC板上纯化，用40％Magic/60％DCM展开，然后用SiO₂柱色谱纯化，用Magic/DCM梯度(0％至20％Magic)洗脱，得到1.8mg I-14：C₂₆H₁₇ClFN₃O₂S的MS[M+H]⁺计算值490，实测值490：¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ10.28(宽s，1H)，8.69(s，1H)，8.03-7.97(m，2H)，7.97(s，1H)，7.88-7.78(m，2H)，7.69-7.49(m，4H)，7.48(m，4H)，5.49(s，2H)。

实施例5

2-氨基-嘧啶-4-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺(I-8)

步骤1-将HCl-二

烷(1mL，4.0M)加入到38a(70mg)中，将反应混合物于室温搅拌，直至所有的起始材料都被消耗掉。真空除去溶剂，得到HCl盐形式的38b，将其不经进一步纯化即用于下一步。

步骤2-向38b的HCl盐、2-氨基-嘧啶-4-甲酸(30mg，0.22mmol)和EEDQ(54mg，0.22mmol)在DMF中的溶液中加入TEA(56μL，0.41mmol)。将反应混合物加热至60℃。再加入一些试剂，将反应于65℃搅拌，直至所有38b都被消耗掉。将反应真空浓缩。将粗产物用SiO₂色谱纯化，用Magic/DCM梯度(0％至20％Magic)洗脱，得到略带杂质的I-8，将其依次用DCM和MeOH洗涤，得到6.3mg所需产物：C₂₄H₁₇ClN₆O₂S的MS[M+H]⁺计算值489，实测值489：¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ10.49(宽s，1H)，8.66(s，1H)，8.53(d，1H)，7.99-7.79(m，5H)，7.48(m，4H)，7.16(d，1H)，6.95(bs，2H)，5.49(s，2H)。

类似地制备了5-甲基-呋喃-2-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺(I-3)，不同的是用5-甲基-呋喃-2-甲酸(CASRN 1917-15-3)代替2-氨基-嘧啶-4-甲酸。

类似地制备了2-氨基-N-{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-异烟酰胺(I-9)，不同的是用2-氨基-异烟酸(CASRN13362-28-2)代替2-氨基-嘧啶-4-甲酸。

类似地制备了吡嗪-2-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺(I-12)，不同的是用吡嗪-2-甲酸(CASRN98-97-5)代替2-氨基-嘧啶-4-甲酸。

类似地制备了5-甲基-1H-吡唑-3-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺(I-15)，不同的是用5-甲基-1H-吡唑-3-甲酸(CASRN 402-61-9)代替2-氨基-嘧啶-4-甲酸。

类似地制备了4-甲基-

唑-5-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺(I-18)，不同的是用4-甲基-5-

唑甲酸(CASRN 2510-32-9)代替2-氨基-嘧啶-4-甲酸。

类似地制备了异

唑-5-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺(I-32)，不同的是用5-异唑甲酸(CASRN21169-71-1)代替2-氨基-嘧啶-4-甲酸。

实施例6

N-{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-2，5-二氟-苯甲酰胺(I-7)

步骤1-向维持在0℃的38b的HCl盐(50mg)和TEA(35μL，0.25mmol)在DCM中的溶液中加入2，5-二氟-苯甲酰氯(26mg，0.15mmol)。将反应混合物搅拌2h并温热至室温。收集固体，用DCM洗涤，得到16mgI-7：C₂₆H₁₆ClF₂N₃O₂S的MS[M+H]⁺计算值508，实测值508。¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ10.70(宽s，1H)，8.72(s，1H)，8.00-7.40(m，12H)，5.49(s，2H)。

实施例7

吡啶-2-甲酸{6-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-3-基}-酰胺(I-40)

步骤1-向34(150mg，0.42mmol)、5-氨基吡啶-2-硼酸频哪醇酯(150mg，0.68mmol；CASRN 1176723-60-6)和Pd(PPh₃)₄(150mg)在DMF(5mL)中的溶液中加入饱和Na₂CO₃水溶液(3mL)。将反应混合物于95℃搅拌，直至所有的起始材料都被消耗掉，冷却至室温，用H₂O淬灭。将固体滤出，依次用己烷/EtOAc和己烷/DCM洗涤，得到25mg 6-(5-氨基-吡啶-2-基)-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(46)：C₁₈H₁₃ClN₄OS的MS[M+H]⁺计算值469，实测值469。

步骤2-将吡啶-2-甲酰氯盐酸盐(17mg，0.10mmol)加入到维持在0℃的46(20mg，0.05mmol)和TEA(17μL，0.12mmol)在DCM中的溶液中。将反应混合物于35℃搅拌3h，其后加入另外的试剂，将混合物于35℃再搅拌2h。将反应真空浓缩。将粗产物用SiO₂色谱纯化，用Magic/CH₂Cl₂梯度(0％至20％Magic)洗脱，得到略带杂质的I-40，将其用H₂O和DCM洗涤，得到1mg所需产物。C₂₄H₁₆ClN₅O₂S的MS[M+H]⁺计算值474，实测值474；¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ10.99(宽s，1H)，9.11(s，1H)，8.80-8.73(m，1H)，8.61(s，1H)，8.53-8.45(m，1H)，8.22-8.02(m，3H)，7.98(s，1H)，7.75-7.66(m，1H)，7.48(s，4H)，5.49(s，2H)。

实施例8

吡啶-2-甲酸{5-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-基}-酰胺(I-41)

步骤1-向34(100mg，0.45mmol)、2-氨基-吡啶-5-硼酸频哪醇酯(0.100g，0.45mmol，CASRN 827614-64-2)和Pd(PPh₃)₄(70mg)在DMF(1.2mL)中的溶液中加入饱和Na₂CO₃水溶液(0.7mL)。将反应混合物于70℃搅拌，直至所有的起始材料都被消耗掉，使其冷却至室温并用H₂O淬灭。收集固体，依次用己烷/EtOAc和己烷/DCM洗涤，得到70mg 6-(6-氨基-吡啶-3-基)-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(48)：C₁₈H₁₃ClN₄OS的MS[M+H]⁺计算值369，实测值369。

步骤2-将吡啶-2-甲酰氯盐酸盐(52mg，0.29mmol)加入到维持在0℃的48(60mg，0.16mmol)和Et₃N(50μL，0.36mmol)在DCM中的溶液中。将反应混合物搅拌并使其温热至环境温度过夜。再加入试剂，将混合物再搅拌10天。收集固体，依次用DCM、MeOH和H₂O洗涤，得到10mg吡啶-2-甲酸{5-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-基}-酰胺(I-41)。C₂₄H₁₆ClN₅O₂S的MS[M+H]⁺计算值474，实测值474：¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ10.62(宽s，1H)，8.89(d，1H)，8.80-8.76(m，1H)，8.69(s，1H)，8.43-8.08(m，4H)，7.99(s，1H)，7.79-7.71(m，1H)，7.52-7.43(m，4H)，5.49(s，2H)。

实施例9

6-(4-苄氧基-3-氯-苯基)-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-44)

向一个含有小搅拌棒的微波小瓶中装入34(142.5mg)和4-苄氧基-3-氯-硼酸(266mg，ASRN 845551-44-2)、K₂CO₃(372mg)和Pd(dppf)Cl₂(30mg)。加入二烷(4mL)和H₂O(1mL)，向该溶液中用氩气简短鼓泡。将小瓶盖上盖并在微波合成器中于125℃辐射45min。在冷却后，将小瓶打开，将内含物倾倒到盐水中，将溶液用DCM萃取两次。将合并的萃取物干燥(MgSO₄)，过滤，浓缩。将粗产物用SiO₂色谱纯化，用阶式梯度(5％MeOH在1/1己烷/EtOAc中的溶液，然后5％MeOH在EtOAc中的溶液)洗脱，得到29mg褐色固体形式的I-44。

实施例10

1-(4-氯-苄基)-6-[4-(吡啶-2-基甲氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-28)

步骤1-向一个烧瓶中装入4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苯酚(510mg，CASRN 269409-70-3，50)和吡啶-2-基甲醇(280mg)，然后装入溶解于DCM(20mL)中的PPh₃(690mg)。将溶液冷却至0℃，加入偶氮二甲酸二异丙酯(0.57mL)并除去冷却浴。30min后，使反应通过SiO₂垫并除去溶剂。将粗产物用SiO₂色谱纯化，用20％EtOAc/己烷洗脱，得出610mg白色固体形式的2-[4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苯氧基甲基]-吡啶(52)。

步骤2-向一个含有小搅拌棒的微波小瓶中装入34(108mg)和52(135mg)，然后装入NR₂CO₃(255mg)和Pd(PPh₃)₄(15mg)。加入甲苯(2.5mL)、EtOH(1mL)和H₂O(0.5mL)，然后用氩气简短向该溶液中鼓泡。将小瓶密封并在微波合成器中辐射至110℃达45min。将反应混合物冷却，用DCM稀释，将有机萃取物依次用H₂O和盐水洗涤。将萃取物干燥(MgSO₄)，过滤，浓缩。将所得固体用EtOAc、MeOH和己烷研磨，得到91mg固体形式的I-28。

类似地制备了1-(4-氯-苄基)-6-[4-(吡啶-3-基甲氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-50)，不同的是在步骤1中，用吡啶-3-基甲醇代替吡啶-2-基甲醇。用DCM和己烷研磨所得的产物表现出255-257℃的熔点。

类似地制备了1-(4-氯-苄基)-6-[4-(吡啶-4-基甲氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-58)，不同的是在步骤1中，用吡啶-4-基甲醇代替吡啶-2-基甲醇。用DCM和己烷研磨所得的产物表现出257-259℃的熔点。

实施例11

6-[4-(4-氨基-6-甲基-嘧啶-2-基甲氧基)-苯基]-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-45)

步骤1-将2-碘甲基-6-甲基-嘧啶-4-基胺(580mg，CASRN108260-15-7)和50(500mg)在丙酮(40mL)中的溶液用K₂CO₃(1g)处理，于50℃在氩气下加热过夜。将反应冷却并倾倒到1∶1的EtOAc/己烷(200mL)中。将溶液依次用H₂O和盐水洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤，浓缩。将粗产物用SiO₂色谱纯化，用EtOAc/己烷梯度(50至100％EtOAc)洗脱，得到6-甲基-2-[4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苯氧基甲基]-嘧啶-4-基胺(54)。

步骤2-向一个含有小搅拌棒的微波小瓶中装入34(103mg)和54(123mg)，然后加入Na₂CO₃(122mg)和Pd(PPh₃)₄(10mg)，然后加入DCM(2.5mL)、MeOH(2.5mL)和H₂O(0.1mL)。向溶液中用氩气简短鼓泡，将小瓶密封并在微波合成器中于105℃辐射35min。将反应冷却后，将混合物用DCM稀释，依次用H₂O和盐水洗涤。将萃取物干燥(MgSO₄)，过滤，蒸发。将所得固体用热DCM、MeOH和己烷研磨，得到74mg黄色固体形式的I-45：mp 272-274℃。

通过将通过50的烷基化制备的适宜的烃代硼酸与所示的苄基溴交叉偶联类似地制备了下列化合物：1-(4-氯-苄基)-6-[4-(3-三氟甲基-苯氧基甲基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(3-三氟甲基-苄基溴，CASRN402-23-2)、1-(4-氯-苄基)-6-[4-(4-氯-苄氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(4-氯-苄基溴，CASRN 622-95-7)、1-(4-氯-苄基)-6-(4-苯氧基甲基-苯基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(苄基溴)、1-(4-氯-苄基)-6-[4-(4-氯-3-甲基-苯氧基甲基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(CASRN 117890-58-1)、1-(4-氯-苄基)-6-[4-(4-甲氧基-苄氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-11，CASRN 2746-25-0)、1-(4-氯-苄基)-6-[4-(4-氟-苄氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-5，CASRN 459-46-1)、1-(4-氯-苄基)-6-[4-(2-甲氧基-苄氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(1-(溴甲基)-2-甲氧基-苯，CASRN52289-93-7)、1-(4-氯-苄基)-6-[4-(2-氯-5-三氟甲基-苯氧基甲基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-31，2-氯-5-(三氟甲基)苄基溴，CASRN237761-77-20)、1-(4-氯-苄基)-6-[3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-6，2-碘甲基吡啶，CASRN 929876-97-1)、1-(4-氯-苄基)-6-[4-(吡嗪-2-基甲氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-16，2-碘甲基-吡嗪，CASRN 120276-51-9)、1-(4-氯-苄基)-6-[3-(4-氟-苄氧基甲基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-34，1-(溴甲基)-4-氟-苯，CASRN459-46-1)。

实施例12

1-(4-氯-苄基)-6-[4-(吡啶-2-基甲基硫基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-48)

步骤1-将对-溴苯硫酚(380mg，2mmol)和2-溴甲基吡啶氢溴酸盐(500mg，2mmol，CASRN 31106-82-8))与在DMF(10mL)中的Na₂CO₃(1g)搅拌过夜。将混合物在Et₂O和水之间进行分配并将产物用SiO₂色谱纯化，用EtOAc/己烷梯度(0至20％EtOAc)洗脱，得到2-(4-溴-苯基硫基甲基)-吡啶(56)。

步骤2-将56、KOAc(800mg)、双(频哪醇合)二硼(bis-(pinacolato)diboron)(1g)和PdCl₂(dppf)(150mg)在二

烷中的溶液于100℃加热过夜。将混合物在Et₂O和H₂O之间进行分配。将硼酸酯(borinate ester)用SiO₂色谱纯化，用EtOAc/己烷梯度(0至25％EtOAc)洗脱，得到2-[4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苯基硫基甲基]-吡啶(58)

步骤3-按照实施例11的步骤2中所述的操作进行58和34的钯-催化的交叉偶联。

类似地制备了1-(4-氯-苄基)-6-[4-(吡啶-3-基甲基硫基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-51)，不同的是在步骤1中，用3-溴甲基吡啶氢溴酸盐(CASRN 4916-55-6)代替2-溴甲基吡啶氢溴酸盐。

类似地制备了1-(4-氯-苄基)-6-[4-(吡啶-4-基甲基硫基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-60)，不同的是在步骤1中，用4-溴甲基吡啶氢溴酸盐(CASRN 73870-24-3)代替2-溴甲基吡啶氢溴酸盐。

类似地制备了6-(4-苄基硫基-苯基)-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-20)，不同的是在步骤1中，用苄基溴代替2-溴甲基吡啶氢溴酸盐。

实施例13

6-(4-苄基氨基-苯基)-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-49)

将38a DCM(10mL)和等体积的4M HCl的二

烷溶液中的混悬液搅拌1h，然后蒸发。向含有在DMF(1mL)中的一半所得产物的溶液中加入苄基溴(60μL，1eq.)和DIPEA(200μL)。在反应完全后，将混合物在EtOAc和水之间进行分配。将产物在制备型SiO₂TLC板上纯化，用5％MeOH/DCM展开，得到10mg 60。

类似地制备了1-(4-氯-苄基)-6-{4-[(吡啶-2-基甲基)-氨基]-苯基}-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮，不同的是用苄基溴代替2-溴甲基-吡啶。

实施例14

6-[4-(7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-苯基]-1-(4-甲基-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-38)

步骤1-向5-溴-3-(2，2，2-三氟-乙酰基氨基)-噻吩-2-甲酸甲酯(62，200mg，0.60mmol)和5-甲基-2-[4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苯基]-吡唑并[1，5-a]嘧啶-7-基胺(64，316mg，0.9mmol，CASRN642589-62-0)在DMF(6mL)和饱和Na₂CO₃水溶液(3mL)中的浆液中加入Pd(PPh₃)₄(98mg)。将反应混合物加热至100℃达3h，然后冷却至室温。除去溶剂，将粗产物用SiO₂色谱(Isco)纯化，用10％MeOH/DCM洗脱，得到75mg 66a：C₂₁H₁₆F₃N₅O₃S的MS[M+H]⁺计算值476，实测值476。(在一些情况下，三氟乙酰胺基团被(部分)水解)。

步骤2-将K₂CO₃水溶液加入到66a在MeOH中的溶液中。在反应完全后，除去溶剂，将粗产物66b不经进一步纯化即用于下一步。

步骤3-向冷却至0℃的66b(75mg，0.2mmol)和4-甲基-苯甲醛(67，25μL，0.36mmol)在DCM(1mL)和HOAc(21μL)中的溶液中加入NaBH(OAc)₃(53mg，0.25mmol)。将反应混合物搅拌并温热至室温。加入另外的醛和NaBH(OAc)₃以推动反应完全。将混合物在制备型SiO₂板上纯化，用10％MeOH/DCM展开，得到100mg 68：C₂₇H₂₅N₅O₂S的MS[M+H]⁺计算值484，实测值484。

步骤4-向68(100mg，0.21mmol)在甲酰胺(0.06mL)和DMF(1mL)中的溶液中加入NaOMe(0.15mL，25％在MeOH中的溶液)。将反应混合物加热至100℃，然后冷却至室温，在制备型SiO₂TLS板上纯化，用30％MeOH/DCM展开，得到5mg I-38：C₂₇H₂₂N₆OS的MS[M+H]⁺计算值479，实测值479。¹H NMR(MeOH-d₄，300MHz，2H未观察到)：δ8.49(s，1H)，8.18-8.09(m，2H)，7.85-7.79(m，2H)，7.67(s，1H)，7.35-7.20(m，4H)，6.69(s，1H)，6.05(s，1H)，5.51(s，2H)，2.41(s，3H)，2.31(s，3H)。

实施例15

1-(4-甲基-苄基)-6-(4-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基-苯基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-57)

步骤1-向62(100mg，0.29mmol)和2-[4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苯基]-吡唑并[1，5-a]嘧啶(141mg，0.44mmol，CASRN642589-50-6)在DMF(2mL)和饱和Na₂CO₃水溶液(1.3mL)中的溶液中加入Pd(PPh₃)₄(47mg)。将反应混合物加热至100℃达2h，然后冷却至室温。除去溶剂，将残余物用SiO₂色谱(Isco)纯化，用Magic/DCM梯度(0％至20％Magic)洗脱，得到100mg 3-(4-甲基-苄基氨基)-5-(4-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基-苯基)-噻吩-2-甲酸甲酯(70)：C₂₆H₂₂N₄O₂S的MS[M+H]⁺计算值455，实测值455。

步骤2-向70(100mg，0.22mmol)在甲酰胺(0.06mL)和DMF(1mL)中的溶液中加入NaOMe(0.14mL，25％在MeOH中的溶液)。将反应混合物加热至120℃，然后冷却至室温，在制备型SiO₂TLC板上纯化，用30％Magic/DCM展开，得到2mg I-57：C₂₆H₁₉N₅OS的MS[M+H]⁺计算值450，实测值450；¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ9.15(d，1H)，8.69(s，1H)，8.55(d，1H)，8.18(d，2H)，7.99(s，1H)，7.92(d，2H)，7.26(s，1H)，7.35(d，2H)，7.19(s，2H)，7.06(m，1H)，5.46(s，2H)，2.24(s，3H)。

类似地制备了6-(4-呋喃并[3，2-b]吡啶-2-基-苯基)-1-(4-甲基-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-19)，不同的是在步骤1中，用2-[4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苯基]-呋喃并[3，2-b]吡啶代替2-[4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苯基]-吡唑并[1，5-a]嘧啶。

实施例16

1-(4-氯-苄基)-6-[4-(5-甲基-[1，3，4]

二唑-2-基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2d]嘧啶-4-酮(I-33)

向34(50mg，0.14mmol)和2-甲基-5-[4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苯基]-[1，3，4]二唑(43mg，0.15mmol，CASRN913835-70-8)在DMF(1mL)和饱和Na₂CO₃水溶液(1.4mL)中的浆液中加入Pd(PPh₃)₄(46mg)。将反应混合物加热至100℃达1h，然后冷却至室温。除去溶剂，将粗产物用SiO₂色谱(Isco)纯化，用Magic/DCM梯度(0％至30％Magic)洗脱，得到12mg I-33：C₂₂H₁₅ClN₄O₂S的MS[M+H]⁺计算值435，实测值435。¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ8.70(s，1H)，8.12-8.00(m，4H)，8.03(s，1H)，7.47(s，4H)，5.52(s，2H)，2.61(s，3H)。

实施例17

6-[4-(7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-3-氯-苯基]-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-2)

向34(50mg，0.14mmol)和4-(7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-3-氯-苯基硼酸(51mg，0.17mmol)在DMF(1mL)和饱和Na₂CO₃水溶液(0.7mL)中的浆液中加入Pd(PPh₃)₄(23mg)。将反应混合物加热至100℃达1h，然后冷却至室温。除去溶剂，将粗产物用SiO₂色谱(Isco)纯化，用Magic/DCM梯度(0％至20％Magic)洗脱，得到16mg I-2：C₂₆H₁₈Cl₂N₆OS的MS[M+H]⁺计算值533，实测值533。¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ8.69(s，1H)，8.14-8.09(m，3H)，7.87(dd，1H)，7.62(宽s，2H)，7.48(s，4H)，6.77(s，1H)，6.04(s，1H)，5.52(s，2H)，2.38(s，3H)。

类似地制备了6-[4-(7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-3-氯-苯基]-1-(4-甲基-环己基甲基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮，不同的是用36代替34，得到6mg I-4：C₂₇H₂₇ClN₆OS的MS[M+H]⁺计算值519，实测值519；¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ8.42(s，1H)，8.20-8.18(m，2H)，8.12(d，1H)，7.94(dd，1H)，7.62(宽s，2H)，6.78(s，1H)，6.05(s，1H)，4.10(d，2H)，2.39(s，3H)，1.90-0.90(m，10H)，0.85(d，3H)。

类似地制备了6-[6-(7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-吡啶-3-基]-1-(4-甲基-环己基甲基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮，不同的是用36代替34，用2-(7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-吡啶-5-基硼酸代替4-(7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-3-氯-苯基硼酸，得到13mgI-43：C₂₆H₂₇N₇OS的MS[M+H]⁺计算值486，实测值486。¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ9.19(s，1H)，8.48-8.40(m，2H)，8.29(d，1H)，8.18(s，1H)，7.65(宽s，2H)，6.85(s，1H)，6.04(s，1H)，4.10(d，2H)，2.39(s，3H)，1.90-0.90(m，10H)，0.85(d，3H)。

类似地制备了6-[6-(7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-吡啶-3-基]-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮，不同的是用2-(7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-吡啶-5-基硼酸代替4-(7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-3-氯-苯基硼酸，得到2mg I-42：C₂₅H₁₈ClN₇OS[M+H]⁺计算值500，实测值500。¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ9.10(s，1H)，8.71(s，1H)，8.37-8.25(m，2H)，8.06(s，1H)，7.65(宽s，2H)，7.54-7.45(m，4H)，6.84(s，1H)，6.05(s，1H)，5.52(s，2H)，2.39(s，3H)。

实施例18

6-[4-(2-氨基-嘧啶-4-基)-苯基]-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-10)

步骤1-向4-(4-溴-苯基)-嘧啶-2-基胺(300mg，1mmol)、二(频哪醇合)二硼(400mg，1.6mmol)、KOAc(330mg，3.3mmol)在二

烷(7mL)中的浆液中加入Pd(dppf)Cl₂(60mg)。将反应混合物加热至100℃达2h，然后冷却至室温。除去溶剂。将残余物溶解于DCM中，用H₂O洗涤，干燥(Na₂SO₄)。浓缩后，一些产物沉淀出来，对其进行收集，得到90mg4-[4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苯基]-嘧啶-2-基胺(70)和相应的硼酸的混合物。

步骤2-向34(60mg，1.2mmol)和混合物70和相应的烃代硼酸(50mg)在DMF(1.2mL)和饱和Na₂CO₃水溶液(0.7mL)中的浆液中加入d(PPh₃)₄(50mg)。将反应混合物加热至70℃达1.5h，然后冷却至室温。加入H₂O和EtOAc，收集所得沉淀物，得到12mg I-10：C₂₃H₁₆ClN₅OS的MS[M+H]⁺计算值446，实测值446。¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ8.69(s，1H)，8.36(d，1H)，8.24-8.16(m，2H)，7.99(m，1H)，7.97-7.90(m，2H)，7.48(s，4H)，7.19(d，1H)，6.71(宽s，2H)，5.52(s，2H)。

实施例19

6-(4-羟基甲基-苯基)-1-(4-甲基-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮(I-53)

步骤1-向5-溴-3-(4-甲基-苄基氨基)-噻吩-2-甲酸甲酯(154mg，0.45mmol)和[4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-苯基]-甲醇(158mg，0.68mmol)在DMF(4.5mL)和饱和Na₂CO₃水溶液(1.9mL)中的浆液中加入Pd(PPh₃)₄(73mg)。将反应混合物加热至100℃达3h，然后冷却至室温。除去溶剂，将粗产物用SiO₂色谱(Isco)纯化，用EtOAc/己烷梯度(0％至30％EtOAc)洗脱，得到255mg 5-(4-羟基甲基-苯基)-3-(4-甲基-苄基氨基)-噻吩-2-甲酸甲酯(72)：C₂₁H₂₁NO₃S的MS[M+H]⁺计算值368，实测值368。

步骤2-向72(255mg，0.7mmol)在甲酰胺(0.2mL)和DMF(4mL)中的溶液中加入NaOMe(0.38mL，25％在MeOH中的溶液)。将反应混合物加热至100℃。将反应冷却至室温并在制备型SiO₂TLC板上纯化，用30％MeOH/DCM展开，得到26mg I-53：C₂₁H₁₈N₂O₂S的MS[M+H]⁺计算值363，实测值363；¹H NMR(MeOH-d₄，300MHz，1H未观察到)：δ8.58(s，1H)，7.74-7.69(m，2H)，7.60(s，1H)，7.48-7.41(m，2H)，7.30-7.19(m，4H)，5.50(s，2H)，4.65(s，2H)，2.31(s，3H)。

实施例20

HCV NS5B RNA聚合酶活性

以放射性标记的核苷酸一磷酸向酸不溶性RNA产物中的掺入的形式测量HCV聚合酶(NS5B570n-Con1)的酶活性。未掺入的放射性标记的底物通过过滤除去，将闪烁剂加入洗涤并干燥的含有放射性标记的RNA产物的滤板中。反应结束时由NS5B570-Con1产生的RNA产物的量与闪烁剂发出的光的量成正比。

该酶活性测定法中所用的HCV聚合酶是21个氨基酸的C-末端缺失的源自HCV Conl株基因型1b的全长HCV聚合酶(GenBank登记号AJ242654)(NS5B570n-Con1)。NS5B570n-Con1被下游亚克隆到质粒表达构建体pET17b的T7启动子并被转化入大肠杆菌(E.coli)株BL21(DE3)pLysS中进行蛋白表达。用单个菌落来启动一种接种体(innoculum)用于于37℃的10L在补充了100μg/mL氨苄西林的LB培养基中的培养物。当培养物在600nM处的光密度为0.8时，通过加入0.25mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达。于30℃进行蛋白质表达诱导16h，然后通过离心收获细胞。用一种三柱纯化方案(包括依次在Ni-NTA、SP-Sepharose HP和Superdex 75树脂上进行柱色谱)将NS5B570n-Con1纯化至均质。

在存在cIRES RNA模板(参见第[00213]段)的情况下的酶促反应含有20nM cIRES RNA、20nM NS5B570n-Con1酶、0.5μCi氘化UTP (PerkinElmer目录号TRK-412；比活度：30至60Ci/mmol；)、ATP、CTP和GTP各1μM、40mM Tris-HCl pH 8.0、40mM NaCl、4mM DTT(二硫苏糖醇)、4mM MgCl2、5μl用DMSO系列稀释的化合物，以及无核酸酶的水加至50μl的最终反应体积。在存在聚A RNA模板(参见第[00213]段)的情况下的酶促反应含有20nM预混合的聚A：寡(rU)16(参见第0004部分)、20nMNS5B570n-Con1酶、1μCi氘化UTP(Perkin Elmer目录号TRK-412；比活度：30至60Ci/mmol)、40mM Tris-HCl pH 8.0、40mM NaCl、4mMDTT(二硫苏糖醇)、4mM MgCl2、5μl用DMSO系列稀释的化合物，以及无核酸酶的水加至50μl的最终反应体积。将反应混合物集合在96-孔过滤板(目录号MADVN0B，Millipore Co.)中并于30℃孵育2h。通过加入10％终浓度(v/v)的三氯乙酸终止反应，于4℃孵育40min。将反应过滤，用8倍反应体积的10％(v/v)三氯乙酸、4倍反应体积的70％(v/v)乙醇洗涤，风干，向每个反应孔中加入25μl闪烁剂(Microscint 20，Perkin-Elmer)。

用两种RNA模板来对本文所述的化合物进行测定。cIRES RNA模板长度为377个核苷酸，组成为核蛋白的部分互补序列(36个核苷酸)，后接内核糖体进入部位的互补序列的341个核苷酸。聚A RNA模板(GEAmersham目录号27-4110)是一种以3∶1(引物∶模板)的摩尔比预退火至寡(rU)16引物的均聚RNA。

在Topcount

读板仪(Perkin-Elmer，能量范围：低，效能模式：正常，计数时间：1分钟，背景差：无，减少失真(Cross talk reduction)：关闭)上将闪烁剂发出的光的量转换为每分钟计数(CPM)。

在Excel

(Microsoft

)和ActivityBase

(idbs

)中分析数据。在不存在酶的情况下的反应用于确定从酶促反应中减去的本底信号。阳性对照反应在不存在化合物的情况下进行，由其得到的经本底校正的活性被设定为100％聚合酶活性。所有数据均以阳性对照的百分比的形式表示。通过将数据用方程(i)拟合计算出了酶催化的RNA合成率降低50％的化合物浓度(IC₅₀)：

$Y=\%\mathrm{Min}+\frac{(\%\mathrm{Max}-\%\mathrm{Min})}{[1+\frac{X}{{\left({\mathrm{IC}}_{50}\right)}^S}]}---\left(i\right)$

其中“Y”是相对酶活性(单位是％)，“％Min”是在饱和化合物浓度下剩余的相对活性，“％Max”是最大相对酶活性，“X”是化合物浓度，“S”是Hill系数(或斜率)。

HCV复制子测定法

本测定法测量式I化合物抑制HCV RNA复制的能力，因此测量它们治疗HCV感染的潜在效用。本测定法利用报道基因作为细胞内HCV复制子RNA水平的简单读数。将海肾萤光素酶(Renilla luciferase)基因引入基因型1b复制子构建体NK5.1的第一开放可读框(N.Krieger等，J.Virol.200175(10)：4614)，就在内核糖体进入位点(IRES)序列之后，并通过来自口蹄疫病毒的自切割肽2A与新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因融合(M.D.Ryan & J.Drew，EMBO 199413(4)：928-933)。在体外转录后，将RNA电穿孔入人肝细胞癌Huh7细胞中，分离出抗G418集落并扩大。稳定选择的细胞系2209-23含有复制型HCV亚基因组RNA，复制子表达的海肾萤光素酶活性反映了细胞中的其RNA水平。为了平行测量化合物的抗病毒活性和细胞毒性以确保观察到的活性不是由于减少的细胞增殖或由于细胞死亡造成的，本测定法一式两板进行，一个测定在不透明的白色板中进行，一个测定在透明板中进行。

将表达海肾萤光素酶报道基因的HCV复制子细胞(2209-23)在含有5％胎牛血清(FBS，Invitrogen目录号10082-147)的Dulbecco’s MEM(Invitrogen目录号10569-010)中培养，以5000个细胞/孔铺在96-孔板中，并孵育过夜。24小时后，向细胞中加入在生长培养基中的不同稀释度的化合物，然后再于37℃孵育三天。在孵育时间结束时，收获在白色板中的细胞，使用海肾萤光素酶测定系统(Promega目录号E2820)测量萤光素酶活性。制造商的试剂盒包括在下面的段落中所描述的所有试剂，按照制造商的说明书制备试剂。用每孔100μL磷酸盐缓冲盐水(pH 7.0)(PBS)洗涤细胞一次，并用20μL 1×海肾萤光素酶测定裂解缓冲液裂解，然后于室温孵育20分钟。然后将板插入Centro LB 960微量培养板发光计(BertholdTechnologies)中，将100μL海肾萤光素酶测定缓冲液注入每个孔，并使用2秒延迟、2秒测量程序测量信号。可以由上文所述的萤光素酶活性降低百分比对药物浓度的曲线计算出IC₅₀-与未处理的细胞对照值相比将复制子水平降低50％所需的药物浓度。

来自Roche Diagnostic的WST-1试剂(目录号1644807)用于细胞毒性测定法。将10μL WST-1试剂加入透明板的每个孔中，包括作为空白的仅含有培养基的孔。然后将细胞于37℃孵育2小时，使用MRX Revelation微量滴定板读板仪(Lab System)在450nm下(参比滤光片在650nm)测量OD值。再次可以由上文所述的WST-1值的降低百分比对药物浓度的曲线计算出CC₅₀-与未处理的细胞对照值相比将细胞增殖降低50％所需的药物浓度。

实施例22

如本实施例中所述制备了用于通过多种途径施用的主题化合物的药物组合物。

用于口服施用的组合物(A)

将各成分混合并分配入胶囊中，每粒胶囊含有100mg；一粒胶囊近似为一个总日剂量。

用于口服施用的组合物(B)

将各成分混合并用溶剂如甲醇制粒。然后将配制物干燥并用适宜的压片机制成片剂(含有约20mg活性化合物)。

用于口服施用的组合物(C)

将各成分混合，从而形成用于口服施用的混悬液。

胃肠外制剂(D)

将活性成分溶解于一部分注射用水中。然后在搅拌下加入足够量的氯化钠使溶液等张。用剩余的注射用水将溶液补足重量，通过0.2微米膜过滤器过滤，在无菌条件下包装。

以它们的具体形式或者在执行所公开的功能的工具或实现所公开的结果的方法或工艺方面表达的在上面的描述或下面的权利要求中所公开的特征酌情可以被分别利用或以这些特征的任何组合的形式利用，用于以其多样的形式实现本发明。

为了清楚和理解的目的，已经通过举例说明和实例的方式详细地描述了上面的发明。可以在所附的权利要求的范围内实施变化和修改对于本领域技术人员是显而易见的。因此，应当理解的是，上述描述是举例说明性的，而非限制性的。因此，本发明的范围不应根据上述描述来确定，而是应当根据后面所附的权利要求以及与这些权利要求的等价方案的全部范围来确定。

本文所参考的专利、公开的申请和科学文献建立了本领域技术人员的认识，在此通过引用的方式将其全文合并入本文，就如同将它们各自具体地和逐一地通过引用合并入本文一样。在本文所引用的任何参考文献与本申请的具体教导之间有任何矛盾的情况下，应当以后者为准。同样地，在一个词或短语的本领域理解的定义与该词或短语在本申请书中具体教导的定义有任何矛盾的情况下，应当以后者为准。

Claims (22)

1.式I的化合物：

其中

R¹是任选被1至3个选自以下的基团取代的苯基或吡啶基：

(a)C_1-6烷基，

(b)C_1-6烷氧基，

(c)卤素，

(d)苯基-C_1-6烷氧基，所述苯基任选独立地被1至3个选自C_1-3烷氧基、卤素或C_1-3烷基或C_1-3-卤代烷基的基团取代，

(e)苯基，

(f)杂芳基-C_1-3烷氧基，其中所述杂芳基是吡啶基、嘧啶基或吡嗪基，所述杂芳基任选独立地被1或2个选自氨基、C_1-6烷基、卤素或C_1-6烷氧基的基团取代；

(g)任选独立地被1或2个选自氨基、C_1-6烷基、卤素或C_1-6烷氧基的基团取代的苯氧基甲基；

(h)吡啶基甲基硫基，

(i)杂芳基，其中所述杂芳基是吡啶基、[1，3，4]

二唑-2-基、呋喃并[3，2-b]吡啶-2-基、吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基，并且所述杂芳基任选独立地被1至3个选自C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、氨基、C_1-3烷基氨基、C_1-3二烷基氨基、环状胺的基团取代，

(j)苯基-C_1-3烷基硫基，

(k)羟基，

(l)卤素，

(m)羧基，

(n)氰基，

(p)C_1-6羟基烷基，

(p)CONR^cR^d，

(q)NR^aR^b，

(r)NHC(O)NR^gR^h，和

(s)氢；

R²是卤素、C_1-3烷基或C_1-3烷氧基，n是0至2；

R^a和R^b(i)独立地是：

(a)C_1-6烷氧基羰基，

(b)苄基，

(c)羟基-C_1-6烷酰基，

(d)C_1-6酰基，

(e)苯基羰基，所述苯基任选独立地被1至3个选自C_1-3烷氧基、卤素或羟基的基团取代，

(f)杂芳基羰基，其中所述杂芳基是任选被取代的吡唑、2-甲基-呋喃-5-基-羰基、嘧啶基-4-羰基、唑-5-基-羰基、吡嗪-2-基-羰基、吡啶基-羰基，所述杂芳基羰基任选被1或2个独立地选自C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素、氨基、C_1-3烷基氨基、C_1-3二烷基氨基、环状胺或C_1-6羟基烷氧基的基团取代，

(g)氢，

或

(ii)与它们所连接的氮一起形成环状胺；

R^c和R^d独立地是氢、C_1-6烷基、苯基；

R³是任选被1至3个选自(a)C_1-6烷基、(b)C_1-6烷氧基、(c)卤素、(d)NR^eR^f、(e)氰基、(f)C_1-3卤代烷基和(g)羟基的基团取代的苯基，或者是任选被1至3个选自C_1-4烷基、卤素或C_1-4烷氧基的基团取代的C_3-7环烷基；

R^e和R^f独立地是氢、C_1-6烷基、C_1-6磺酰基；

R^g和R^h独立地是氢或C_1-3烷基，或者与它们所连接的氮一起形成吡咯烷或哌啶；

R⁴是氢或C_1-6烷基；或

其药学上可接受的盐。

2.权利要求1的化合物，其包括式Ia的化合物：

其中R^1a是任选被取代的对-亚苯基，R^1b是NR^aR^b，R^a是氢且R^b是羟基-C_1-6烷酰基、C_1-6酰基、任选被取代的苯基羰基或任选被取代的杂芳基羰基。

3.权利要求2的化合物，其中R³是任选被卤素或C_1-6烷基取代的苯基，R^1a是任选进一步被卤素取代的对-亚苯基，且R⁴和R²是氢。

4.权利要求3的化合物，其中R^b是任选被取代的苯基羰基或任选被取代的杂芳基羰基。

5.权利要求1的化合物，其包括式Ia的化合物，其中R^1a是任选被取代的对-亚苯基，R^1b是任选被取代的杂芳基，且R²和R⁴是氢。

6.权利要求5的化合物，其中R^1b是任选被取代的吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基，且R³是任选被卤素或C_1-6烷基取代的苯基。

7.权利要求6的化合物，其中R^1b是7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基。

8.权利要求1的化合物，其包括式Ia的化合物，其中R^1a是任选被取代的对-亚苯基，且R^1b是任选被取代的苯基-C_1-3烷氧基或任选被取代的杂芳基-甲氧基。

9.权利要求8的化合物，其中R^1b是任选被取代的苄氧基，且R²和R⁴是氢。

10.权利要求1的化合物，所述化合物选自：

吡啶-2-甲酸{2-氯-4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺；

6-[4-(7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-3-氯-苯基]-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

5-甲基-呋喃-2-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺；

6-[4-(7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-3-氯-苯基]-1-(4-甲基-环己基甲基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

1-(4-氯-苄基)-6-[4-(4-氟-苄氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

1-(4-氯-苄基)-6-[3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

N-{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-2，5-二氟-苯甲酰胺；

2-氨基-嘧啶-4-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺；

2-氨基-N-{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-异烟酰胺；

6-[4-(2-氨基-嘧啶-4-基)-苯基]-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

1-(4-氯-苄基)-6-[4-(4-甲氧基-苄氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

吡嗪-2-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺；

6-联苯-4-基-1-(4-甲基-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

N-{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-2-氟-苯基}-苯甲酰胺；

5-甲基-1H-吡唑-3-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺；

1-(4-氯-苄基)-6-[4-(吡嗪-2-基甲氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

1，5-二甲基-1H-吡唑-3-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺；

4-甲基-

唑-5-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺；

6-(4-呋喃并[3，2-b]吡啶-2-基-苯基)-1-(4-甲基-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

6-(4-苄基硫基-苯基)-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

1-(2-氟-4-甲基-苄基)-6-苯基-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

6-(4-氯-苯基)-1-(4-甲基-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

1-(4-氯-苄基)-6-{4-[(吡啶-2-基甲基)-氨基]-苯基}-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

1-(4-氯-苄基)-6-(4-苯氧基-苯基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

1-(4-氯-苄基)-6-(3-氯-4-丙氧基-苯基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

N-{2-氯-4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-3-甲氧基-苯甲酰胺；

1-(2-羟基-4-甲基-苄基)-6-苯基-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

1-(4-氯-苄基)-6-[4-(吡啶-2-基甲氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

6-(4-叔丁基-苯基)-1-(4-甲基-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

N-{2-氯-4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-4-羟基-丁酰胺；

1-(4-氯-苄基)-6-[4-(2-氯-5-三氟甲基-苯氧基甲基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

异

唑-5-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺；

1-(4-氯-苄基)-6-[4-(5-甲基-[1，3，4]

二唑-2-基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

1-(4-氯-苄基)-6-[3-(4-氟-苄氧基甲基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

N-{2-氯-4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-4-羟基-2-甲基-丁酰胺；

4-[1-(4-甲基-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯甲酸；

N-{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-乙酰胺；

6-[4-(7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-苯基]-1-(4-甲基-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

吡啶-2-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺；

吡啶-2-甲酸{6-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-3-基}-酰胺；

吡啶-2-甲酸{5-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-吡啶-2-基}-酰胺；

6-[6-(7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-吡啶-3-基]-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

6-[6-(7-氨基-5-甲基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-吡啶-3-基]-1-(4-甲基-环己基甲基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

6-(4-苄氧基-3-氯-苯基)-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

6-[4-(4-氨基-6-甲基-嘧啶-2-基甲氧基)-苯基]-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

5-羟基-吡啶-2-甲酸{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺；

4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-N-苯基-苯甲酰胺；

1-(4-氯-苄基)-6-[4-(吡啶-2-基甲基硫基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

6-(4-苄基氨基-苯基)-1-(4-氯-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

1-(4-氯-苄基)-6-[4-(吡啶-3-基甲氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

1-(4-氯-苄基)-6-[4-(吡啶-3-基甲基硫基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苄腈；

6-(4-羟基甲基-苯基)-1-(4-甲基-苄基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

吡咯烷-1-甲酸{2-氯-4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-苯基}-酰胺；

N-{4-[1-(4-氯-苄基)-4-氧代-1，4-二氢-噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基]-2-氟-苯基}-异丁酰胺；

1-(4-氯-苄基)-6-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

1-(4-甲基-苄基)-6-(4-吡唑并[1，5-a]嘧啶-2-基-苯基)-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；

1-(4-氯-苄基)-6-[4-(吡啶-4-基甲氧基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮；和

1-(4-氯-苄基)-6-[4-(吡啶-4-基甲基硫基)-苯基]-1H-噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-酮，或它们的药学上可接受的盐。

11.权利要求1的化合物用于治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的用途。

12.权利要求1的化合物与至少一种免疫系统调节剂和/或至少一种抑制HCV复制的抗病毒剂组合用于治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的用途。

13.权利要求1的化合物在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染。

14.权利要求1的化合物与至少一种免疫系统调节剂和/或至少一种抑制HCV复制的抗病毒剂组合在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染。

15.用于治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的药盒，其包含权利要求1的化合物和至少一种免疫系统调节剂和/或至少一种抑制HCV复制的抗病毒剂。

16.治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其包括给需要其的患者施用治疗有效量的权利要求1的化合物。

17.权利要求16的方法，其进一步包括共同施用至少一种免疫系统调节剂和/或至少一种抑制HCV复制的抗病毒剂。

18.权利要求17的方法，其中所述免疫系统调节剂是干扰素、白介素、肿瘤坏死因子或集落刺激因子。

19.权利要求17的方法，其中所述免疫系统调节剂是干扰素或化学衍生化的干扰素。

20.权利要求17的方法，其中所述抗病毒化合物选自HCV蛋白酶抑制剂、另外的HCV聚合酶抑制剂、HCV解旋酶抑制剂、HCV引发酶抑制剂和HCV融合抑制剂。

21.通过递送权利要求1的化合物来抑制细胞中HCV复制的方法。

22.组合物，其包含与至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合的权利要求1的化合物。