CN102499105B - 水迷宫空间学习记忆树鼩模型的建立方法 - Google Patents

Abstract

一种水迷宫空间学习记忆树鼩模型的建立方法，包括实验前对动物的筛选，实验装置准备，实验操作以及成模指标四个步骤，确定水迷宫空间学习树鼩模型的建立方法成模指标为：在定位航行实验中，正确率在90%以上；平均潜伏期介于20-25s之间作为判定树鼩在水迷宫实验中建立了空间学习性学习模型的标准；在空间探索实验中，以在靶象限活动时间的比率和穿台次数在训练前后有显著性差异作为判定树鼩在水迷宫实验中建立了空间记忆性模型的标准。

Description

水迷宫空间学习记忆树鼩模型的建立方法

技术领域

本发明涉及生命科学领域中一种新型实验动物行为学模型的建立方法，特别是一种水迷宫空间学习记忆树鼩模型的建立方法。

背景技术

Morris水迷宫实验是目前世界公认的较为客观的空间学习记忆功能评价方法，由Richard Morris在1981年设计并应用于学习记忆脑机制研究，是一种动物能够学会在水箱内游泳并找到藏在水下逃避平台的实验方法，由于没有任何可接近的线索以标识平台的位置，所以动物的有效定位能力需应用水箱外的结构，例如贴于水迷宫箱体上的一些简单图形标志，作为空间定位的线索。

近年来水迷宫实验广泛应用于神经生物学、神经心理学，神经药理学，老年病学等研究领域，基于强迫动物在池中游泳，通过寻找在水中设置的平台，来测试动物对空间位置觉和方位觉的学习记忆能力。迷宫由圆形水池、自动摄像及分析系统两部分组成，图像自动采集和处理系统主要由摄像机、计算机、图像监视器组成，动物入水后启动监测装置，记录动物运动轨迹，试验完毕自动分析报告相关参数。

空间学习记忆是脑的高级神经生理活动之一，是检测空间定向，反应时间，视知觉和结构应用等能力，从而评价其认知水平的一种行为模式，是一类关于场景和事件的学习记忆，牵涉多个脑区、多种神经递质和细胞内信号分子，是一项十分复杂的神经生理活动过程。在以往的经典的海马损伤实验中，在定向航行中海马损伤组的潜伏期明显长于皮质损伤组和对照组的结果，确认了海马与空间识别学习的联系，海马突触的可塑性和长时程增强效应是空间学习和记忆的神经功能基础。因此，实验动物脑结构功能系统特别包括海马结构功能与人的一致性程度决定了水迷宫实验在医学生物学中的作用，而在所有文献报道及使用的Morris水迷宫实验中，现成功应用的均为大鼠及小鼠Morris水迷宫空间学习记忆模型，由于大鼠和小鼠均属于低等啮齿类，脑结构功能与人相差甚远，水迷宫空间学习记忆模型得到的数据参考性有限，因此大大限制了此模型在各个领域的作用。

树鼩(Tupaia belangeri，tree shrews)是一种新型的实验动物，在分类学上属哺乳纲，有胎盘类，是一个独立的目，称为攀鼩目(Scandentia)，介于灵长目与食虫目之间。由于其具有体型小，易饲养和操作，管理方便，廉价经济，且其进化程度高，远比大小鼠接近于人类，新陈代谢和大体解剖与人较为接近等优点，因此其作为较理想的实验动物，已经被广泛地应用于医学与生物学的研究中。

在以往的研究中发现，树鼩脑神经组织在其形态、细胞构筑、分布、各大脑皮质区的比例、丘脑一些核团的体积和灵长目高度分化的脑神经组织有许多相似之处；且树鼩脑结构分化程度较高，与灵长目一致，从其种系发生较晚的前额区型皮质所占比例，是脑高级功能研究的理想对象。体重与脑的关系，可用Jerisian公式中的K值来表示，K值随物种的不同而异，在一定程度上代表着脑重随体重的变化速率，其大小除能反映动物脑的演变水平外，尚能反映动物的智力水平，在假设的个体大小相等的动物中，分类地位越高，K值越大，脑的重量也随之增加。在最近的研究中，从树鼩，恒河猴以及大鼠三种动物的K值看，树鼩是大鼠的2.25倍，结果说明树鼩的分类地位高于大鼠，脑智力水平也更高。而在对海马的研究上发现，树鼩与恒河猴的海马发育模式较之大鼠更为类似，在发育过程中，海马的绝对增重倍数比例较低；且树鼩和恒河猴两种动物的海马相对重量在亚成体中低于新生个体，变化趋势是同样逐渐降低，而大鼠的海马相对重量在亚成体中高于新生个体，变化趋势是逐渐升高。从三种动物的海马变化情况推测：随着脑组织从新生到亚成体的发育，智力水平高的恒河猴和树鼩其海马的重要性相对减弱；而对于低智力水平的大鼠其重要性相对增强，在海马的系统发育及系统的脑结构功能上，树鼩较大鼠更为接近人类。

综上所述，选用无论是脑结构功能、还是针对水迷宫空间学习记忆模型中最重要的海马结构功能的发育，都远比低等的啮齿动物大小鼠更为接近人类的实验动物树鼩，建立的水迷宫空间学习记忆树鼩模型，更适合于脑结构功能的研究，水迷宫空间学习记忆树鼩模型的建立将可以很大程度上替代和扩展原有的模型在人类的卫生医药事业服务的应用范围，很大程度上解决现有的水迷宫空间记忆模型缺陷与科研生产对模型开发需求的矛盾，在学习记忆、海马研究、智力与衰老、新药开发、筛选、评价等多个学科和领域取得更大的进展。

水迷宫空间学习记忆模型一般分为以定位航行实验作为评判空间学习能力的空间学习模型和以空间探索实验作为评判空间记忆能力的空间记忆模型两个部分。经典的水迷宫空间学习记忆的大小鼠模型中，将定位航行实验中的正确率正确率，即正确上站台的次数/总训练次数在90％以上，平均潜伏期逐渐缩短至25秒以内，并在之后持续的实验中进入一个稳定的平台期，平均总距离随训练次数增加逐渐降低直至稳定，平均速度随训练次数增加逐渐升高直至稳定，搜索策略由边缘式或随机式逐渐转为趋向式和直线式，作为空间学习模型成立的成模指标；而将空间探索实验中在靶象限活动时间的比率和穿台次数在训练前后有显著性差异作为空间记忆模型成立的成模指标。

发明内容

鉴于现在对水迷宫空间学习记忆新兴实验动物模型开发的需求，并针对现有的科研用树鼩人工饲养驯化时间短，胆小，易受惊，难以建立水迷宫空间学习记忆模型等特点，本发明设计了一种水迷宫空间学习记忆树鼩模型的建立方法，该方法包括实验前对动物的筛选，实验装置准备，实验操作以及成模指标四个步骤，

一、实验前对动物的筛选

实验前树鼩一直饲养于安静及光照节律如常的环境中，在实验前对树鼩施以用手抓放的预处理。将候选的子一代树鼩轻柔的放入水迷宫水池中，选择10s之内开始游动，游泳速度≥15cm/s的树鼩，总筛选游动时间为30s。在10s之内仍漂浮于水面上静止不动，或游泳速度过慢的树鼩不具备游泳能力的树鼩不适合于水迷宫空间学习记忆模型的建立。

二、实验装置准备

水迷宫的水池内水温保持在23±0.5℃，水温需严格控制，水温过高，则树鼩很可能会选择游泳或漂浮而不是上台。在水迷宫水池中加入奶粉增强树鼩和周围环境的对比度，在一吨水中约加入300g奶粉，水迷宫实验视频分析系统参数选择为黑鼠白色背景，二值化处理的阈值设定为75，在同样灯光条件下，此阈值在整个水迷宫实验中是一个稳定值。

所用的水迷宫水池直径为160cm，站台直径为9cm。实验装置应放置在安静宽敞的房间内，设备周围用围帘以阻隔实验者和受试树鼩。

三、实验操作

1、定位航行实验

在每1个训练日，每1只树鼩施以2组训练，每组实验包括：实验前将树鼩控制置于站台上适应15s，随后将树鼩采用半随机方式从不同象限面壁置入池内，树鼩登上站台5s后终止记录，最长记录时间为75s，若树鼩在75s内不能上台，引导其登上站台适应15s。如此将树鼩置入游泳池，2次为1组。在前3天的训练中，在1组训练结束后，额外增加一次上台训练，即在离站台较近距离处置入树鼩，辅助其上台，教导其在台上停留15s，此步骤的目的是使树鼩学会实验的规则，即在隐藏平台上等待“救援”及理解如何得到救援。每个训练日中将树鼩置入同一个水池象限中，录像记录每次上台潜伏期、游泳距离等数据，计算得到如下数据：(1)正确率，所有树鼩每天成功登上站台的次数/总训练次数；(2)平均潜伏期，所有树鼩每天的潜伏期总和/总训练次数；(3)平均总距离，所有树鼩每天登上站台前的游泳总距离/总训练次数；(4)平均速度，所有树鼩每天登上站台前的速度总和/总训练次数；(5)训练前后的搜索策略变化趋势；主要以此5个数据来评判树鼩的空间学习记忆能力。

2、空间探索实验

7天后定位航行成立，撤除水面下的站台，然后将树鼩随机从不同象限面壁置入池内1次，记录树鼩在75s内的游泳轨迹并进行分析，最后将树鼩擦干放入树鼩笼。测量树鼩在靶象限活动时间的比率和穿台次数，以评判树鼩的空间记忆能力。

定位航行实验和空间探索实验应选择在树鼩进食期刚过，处于活动高峰期，比较适合模型的建立。每组训练过后，将树鼩放回笼具中，并喂食面包虫给予奖励。

若树鼩在75s内不能上台，引导其登上站台适应15s。

四、成模指标

根据以往有关文献规定，并考虑树鼩水迷宫实验的数据，确定水迷宫空间学习树鼩模型的建立方法成模指标为：在定位航行实验中，正确率(正确次数/总训练次数)在90％以上；平均潜伏期介于20-25s之间作为判定实验动物树鼩在水迷宫实验中建立了空间学习记忆性学习模型的标准；在空间探索实验中，以在靶象限活动时间的比率和穿台次数在训练前后有显著性差异作为判定树鼩在水迷宫实验中建立了空间记忆性模型的标准；模型在第7个训练日结束时即达到标准。

平均总距离和平均速度以及搜索策略的变化趋势作为参考指标，平均总距离随训练次数增加逐渐降低直至稳定，平均速度随训练次数增加逐渐升高直至稳定，搜索策略由本能的边缘式或盲目的随机式逐渐转为较高级的趋向式和准确的直线式，边缘式是一种沿池壁以大幅度轨迹搜索平台的方式，是一种本能行为，处于较低级的认知水平；随机式的搜索轨迹往往出现在迷宫大部分区域，带有很大的盲目性。而趋向式是以曲线逐步向平台靠拢，是一种较高级的策略，但定位不够准确，直线式为从起点以直线方式向平台搜索，表明有明确的空间定位。

本发明公开了以上所述的关于树鼩水迷宫空间学习记忆模型的建立中所有特征的具体步骤，所述方法包括实验前对树鼩的筛选，实验设备准备中针对树鼩的水温、水池各参数优化设置，实验操作步骤中针对树鼩的训练，在训练步骤、次数、时间、频率以及奖励政策上均经过多次实验反复论证得到，最后由于树鼩与大小鼠在游泳能力、脑结构功能及动物特征上的不同，水迷宫空间学习记忆树鼩模型比大小鼠模型具有与人更为类似的优势，且在第7天成模，比之大小鼠第10天成模也更具有时间上的优势。

通过此水迷宫空间学习记忆树鼩模型的建立方法，使得水迷宫空间记忆树鼩模型成功建立。实验结果表明，本发明最终能够使得正确率，即正确上站台的次数/总训练次数在95％以上，平均潜伏期逐渐缩短至25秒以内，并在之后持续的实验中进入一个稳定的平台期，平均总距离随训练次数增加逐渐降低直至稳定，平均速度随训练次数增加逐渐升高直至稳定，搜索策略由边缘式或随机式逐渐转为趋向式和直线式，表明水迷宫空间学习树鼩模型已成功建立。同时通过这学习过程，导致在空间探索实验中，树鼩在靶象限活动时间延长，约为30％-60％停留于靶象限，穿越平台位置的次数大大增加，在训练前后有显著性差异，树鼩几乎均停留于靶象限附近活动，说明树鼩在训练之后空间记忆形成，水迷宫空间记忆树鼩模型模型成立。

附图说明

图1为正确率随训练次数增加的变化趋势图，可以看出正确率随训练次数增加而增加，至第7天达到95％，证明空间学习模型成立。

图2为平均潜伏期随训练次数增加的变化趋势图，可以看出平均潜伏期随训练次数增加而减少，至第7天达到25秒以内，证明空间学习模型成立。

图3为平均总距离随训练次数增加的变化趋势图，可以看出平均总距离随训练次数增加而减少。

图4为平均速度随训练次数增加的变化趋势图，可以看出平均速度随训练次数增加而减少，直至稳定。

图5为训练前后的搜索策略变化趋势图，圆形水池中的小圆圈表示站台的位置。可以看出搜索策略由本能且盲目的边缘式或随机式逐渐转为有高级策略的趋向式和有明确空间定位的直线式，证明空间学习模型成立。

图6为空间探索实验中树鼩的典型游泳轨迹图，圆形水池中的小圆圈表示站台的位置。可以看出在空间探索实验中，树鼩在靶象限活动时间比率几乎达到60％，说明树鼩在训练之后空间记忆形成，空间记忆模型成立。

具体实施方式

一、实验前对动物的筛选：

实验用树鼩为实验室自繁的子一代中缅树鼩，12月龄，体重在110g-120g，实验前树鼩一直饲养于安静及光照节律如常的环境中，在实验前对树鼩施以用手抓放的预处理。从13只雄性树鼩中选择得到10只10s之内开始游动，游泳速度≥15cm/s的树鼩，总筛选游动时间为30s的子一代树鼩；从15只雌性树鼩中选择得到10只放入水迷宫实验水池中10s之内开始游动，游泳速度≥15cm/s的树鼩，总筛选游动时间为30s的子一代树鼩。

二、实验装置准备

水迷宫实验按照要求为一直径160cm、高50cm的圆形水池，购自上海移数信息科技有限公司。水池内壁被漆为黑色，池内水深30cm，水温保持在23±0.5℃。房间内光照恒定，无光线直射在水池内。池壁上以四个等距离点将水池分为四个象限，在靶象限，也即设为第一象限内的距离池壁25cm处放有一个直径为9cm、高29cm的圆形透明站台，站台上设置有条纹，以供树鼩攀爬，防止打滑，站台位于水面下1cm。池壁内贴有不同形状及颜色的标记物。迷宫上方安置连接显示系统的摄像机，同步记录树鼩运动轨迹。采用上海移数软件科技有限公司研制开发的Morris水迷宫实验视频分析系统进行信息处理。在水迷宫水池中加入奶粉增强树鼩和周围环境的对比度，在一吨水中约加入300g奶粉，水迷宫实验视频分析系统参数选择为黑鼠白色背景，二值化处理的阈值设定为75，在同样灯光条件下，此阈值在整个水迷宫实验中是一个稳定值。

三、实验操作

1、定位航行实验

在每1个训练日，每1只树鼩施以2组训练，每组实验包括：实验前将树鼩控制置于站台上适应15s，随后将树鼩采用半随机方式从不同象限面壁置入池内，树鼩登上站台5s后终止记录，最长记录时间为75s，若树鼩在75s内不能上台，引导其登上站台适应15s。如此将树鼩置入游泳池，2次为1组，在前3天的训练中，在1组训练结束后，额外增加一次上台训练，即在离站台较近距离处置入树鼩，辅助其上台，教导其在台上停留15s，使树鼩学会实验的规则，在隐藏平台上等待“救援”及理解如何得到救援。每个训练日中将树鼩置入同一个水池象限中，录像记录上台潜伏期、游泳距离等数据，计算得到正确率、平均潜伏期、平均总距离、平均速度并记录训练前后的搜索策略变化趋势5个指标评判树鼩的空间学习记忆能力，以证明水迷宫空间学习树鼩模型的建立。

2、空间探索实验

定位航行7天后撤除水面下的站台，然后将树鼩随机从不同象限面壁置入池内1次，记录树鼩在75s内的游泳轨迹并进行分析，最后将树鼩擦干放入树鼩笼。测量靶象限的游泳时间以及穿越平台位置的次数，评判树鼩的空间记忆能力，以证明水迷宫空间记忆树鼩模型的建立。

定位航行实验和空间探索均在树鼩进食过的时间进行，每组训练过后，将树鼩放回笼具中，并喂食1g面包虫/只树鼩。实验装置放置于安静宽敞的房间内，设备周围用围帘以阻隔实验者和受试树鼩。

四、成模指标

通过此水迷宫空间学习记忆树鼩模型的建立方法，使得水迷宫空间记忆树鼩模型成功建立。实验结果如图1、2、3和4表明，20只树鼩用于建立水迷宫空间学习记忆模型实验，在第7个训练日结束时达到水迷宫空间学习模型的成模指标：正确率为95％，平均潜伏期逐渐缩短至24.96秒，并在之后持续的实验中进入一个稳定的平台期，平均总距离随训练次数增加逐渐降低直至稳定，平均速度随训练次数增加逐渐升高直至稳定，搜索策略由边缘式或随机式逐渐转为趋向式和直线式，结果如图5所示，表明水迷宫空间学习树鼩模型已成功建立。

同时通过这学习过程，导致在空间探索实验中，树鼩在靶象限活动时间延长，约为30％-60％停留于靶象限，穿越平台位置的次数大大增加，在训练前后有显著性差异，树鼩几乎均停留于靶象限附近活动，说明树鼩在训练之后空间记忆形成，水迷宫空间记忆树鼩模型模型成立。

树鼩在训练前后穿台次数有了显著性的差异，训练前20只树鼩的总穿台次数仅为3次，训练后为36次，如表1所示；且树鼩在靶象限活动时间延长，约为30％-60％停留于靶象限，典型游泳轨迹如图6所示，树鼩几乎均停留于靶象限附近活动，说明树鼩在训练之后空间记忆形成，证明空间记忆模型成立。

表1 空间探索实验中穿台次数的比较

Claims (6)

1.一种水迷宫空间学习记忆树鼩模型的建立方法，其特征在于：该方法包括实验前对动物的筛选，实验装置准备，实验操作以及成模指标四个步骤，

一）、实验前对动物的筛选

将候选的子一代树鼩轻柔的放入水迷宫水池中，选择10s之内开始游动，游泳速度≥15cm/s的树鼩，总游动时间为30s； 

二）、实验装置准备

水迷宫水池的水温保持在23±0.5 ℃，在水迷宫水池中加入奶粉增强树鼩和周围环境的对比度，一吨水中约加入300g奶粉，水迷宫实验视频分析系统参数选择为黑鼠白色背景，二值化处理的阈值设定为75，在同样的灯光条件下，此阈值在整个水迷宫实验中是一个稳定值；

三）、实验操作

（1）、定位航行实验

在每个训练日，每只树鼩施以2组训练，每组实验包括：实验前将树鼩控制置于站台上适应15s，随后将树鼩采用半随机方式从不同象限面壁置入水池内开始记时，树鼩登上站台5 s后终止记录，最长记录时间为75s，2次为1组；每个训练日中将树鼩置入同一个水池象限中，根据录像记录每次上台前的游动轨迹，计算得到下面数据

正确率：所有树鼩每天成功登上站台的次数/总训练次数；

平均潜伏期：所有树鼩每天的潜伏期总和/总训练次数；

平均总距离：所有树鼩每天登上站台前的游泳总距离/总训练次数；

平均速度：所有树鼩每天登上站台前的速度总和/总训练次数；

绘制得到训练前后的搜索策略变化趋势；

主要以上述数据来评判树鼩的空间学习记忆能力；

（2）、空间探索实验

7天后定位航行成立，撤除水面下的站台，然后将树鼩半随机从不同象限面壁置入池内1次，记录树鼩在75 s内的游泳轨迹并进行分析，最后将树鼩擦干放入树鼩笼；测量并计算树鼩在靶象限活动时间的比率和穿台次数，以评判树鼩的空间记忆能力；

定位航行实验和空间探索实验应选择树鼩进食期刚过，每组训练过后，将树鼩放回笼具中，并喂食面包虫给予奖励； 

四）、成模指标

确定水迷宫空间学习树鼩模型的建立方法成模指标为：在定位航行实验中，正确率在90%以上；平均潜伏期介于20-25s之间作为判定树鼩在水迷宫实验中建立了空间学习性学习模型的标准；在空间探索实验中，以在靶象限活动时间的比率和穿台次数在训练前后有显著性差异作为判定树鼩在水迷宫实验中建立了空间记忆性模型的标准；模型在第7个训练日结束时即达到标准。

2.如权利要求1所述的水迷宫空间学习记忆树鼩模型的建立方法，其特征在于：步骤二）中实验装置应放置在安静宽敞的房间内，周围用围帘以阻隔实验者和受试树鼩。

3.如权利要求1所述的水迷宫空间学习记忆树鼩模型的建立方法，其特征在于：模型建立中所用的水迷宫水池直径为160cm，站台直径为9cm。

4.如权利要求1所述的水迷宫空间学习记忆树鼩模型的建立方法，其特征在于：步骤三）中若树鼩在75 s内不能上台，引导其登上站台适应15s。

5.如权利要求1所述的水迷宫空间学习记忆树鼩模型的建立方法，其特征在于：步骤三）中，在前3天的训练中1组训练结束后，额外增加一次上台训练，即在离站台较近距离处置入树鼩，辅助其上台，教导其在台上停留15s，此步骤的目的是使树鼩学会实验的规则，即在隐藏平台上等待“救援”及理解如何得到救援。

6.如权利要求1所述的水迷宫空间学习记忆树鼩模型的建立方法，其特征在于：步骤三）中，平均总距离和平均速度以及搜索策略的变化趋势作为参考指标，平均总距离随训练次数增加逐渐降低直至稳定，平均速度随训练次数增加逐渐升高直至稳定，搜索策略由本能的边缘式或盲目的随机式逐渐转为较高级的趋向式和准确的直线式。

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