CN102499061A

CN102499061A - 一种固体介质花粉、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN102499061A
Application number: CN2011103410254A
Authority: CN
Inventors: 刘建; 丁瑞丰; 李海强; 王冬梅; 王剑; 汪飞; 李号宾; 阿克旦; 徐遥; 宁新民; 孔捷; 朱家辉
Original assignee: Institute Of Plant Protection Of Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Plant Protection Of Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-08-30
Filing date: 2011-11-01
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2031-11-01
Also published as: CN102499061B

Abstract

本发明涉及一种固体介质花粉以及其制备方法和该固体介质花粉在转基因作物例如转基因棉花的生态安全性评价中的应用。所述固体介质花粉为用赤藓红B溶液浸泡采集的花粉使其染色并晾干后过筛而制得的红色粉末状花粉。使用所述固体介质花粉可以检测转基因作物例如转基因棉花花粉扩散的距离和方向，从而可以研究转基因作物例如转基因棉花的生态安全性。

Description

一种固体介质花粉、其制备方法及应用

发明领域

本发明涉及一种固体介质花粉，特别是涉及一种以虫媒传粉为主要传粉方式的作物的固体介质花粉。本发明还涉及制备所述固体介质花粉的方法以及该固体介质花粉在转基因作物例如转基因棉花的生态安全性评价中的应用。

背景技术

转基因抗虫棉种植面积逐步扩大。1998年，我国黄河流域开始推广转基因抗虫棉，当年种植面积只占棉花总种植面积的5.4％。之后，转基因抗虫棉种植面积迅速扩大。其中，国产转基因抗虫棉的种植面积比例不断提高。2004年国产转基因抗虫棉品种种植面积首次超过国外品种，达到52.4％，2005年达到64.8％，2006年接近70％，2007年超过80％。目前，我国抗病、抗除草剂、抗盐碱、品质改良等方面的转基因棉花正在加紧研究开发之中，不久就会投入生产应用。

转基因育种一般是把亲缘关系很远的供体生物的一种或几种功能基因转入受体生物，对生物的影响远远超过了常规育种，既可以产生人们期望的新品种，又可能对生态环境具有潜在的负面影响。正因如此，各国在大力开发转基因生物新品种的同时，对转基因生物新品种的生态安全性评价也非常重视。在转基因棉花品种大力开发和大面积种植的同时，其生态安全性问题也成为人们关心与争论的焦点。其中，转基因棉花基因漂移问题是目前的研究重点之一。转基因棉花基因漂移是指外源基因通过花粉受精杂交途径在非转基因棉花及其野生近缘种的种群中进行扩散的过程。花粉传播是转基因棉花外源基因漂移的主要途径。

现有技术中检测花粉传播的方法是将赤藓红B(也称为藻红B)溶解于水中，然后喷雾于花朵内正在散粉的花药上，使花粉被染色，再观察被染色的花粉的传播情况(王长永，刘燕，周骏，陈建群，钦佩.花粉介导的转Bt基因棉花田间基因流监测.应用生态学报，2007，18(4)：801-806.)。经过大田试验发现，使用此种方法不利于棉花散粉，也不利于传粉昆虫的活动，对花粉的自然传播有不利影响。因此需要开发既不影响散粉，也不影响传粉昆虫活动，可以保证花粉自然传播的检测花粉传播的方法，以评价转基因作物例如转基因棉花的生态安全性。

发明内容

本发明提供了一种制备固体介质花粉的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)收集花药，其是采集已经明显伸长和膨大、第二天将开花的花蕾，将花蕾中的花药分离；

(ii)收集花粉，其是在阴凉处摊开所述花药，使其散粉，用筛子筛出花粉；

(iii)染色花粉，其是使用赤藓红B溶液浸泡花粉一段时间，对花粉进行染色；以及

(iv)晾干并筛粉，其是用滤纸过滤出所述染色的花粉、晾干、并用筛子筛出粉末状的花粉，即得所需的固体介质花粉。

在本发明提供的制备固体介质花粉的方法中，所述采集的花蕾可以为以虫媒为主要传粉方式的作物的花蕾，例如棉花、油菜、大豆、西瓜、苹果、梨、石榴等作物的花蕾，优选棉花花蕾，更优选转基因棉花花蕾；所述赤藓红B溶液的质量百分比浓度为0.25％-1％，优选0.5％；所述花粉与所述赤藓红B溶液用量的比例为1克花粉用100-200毫升赤藓红B溶液，优选用150毫升赤藓红B溶液；所述浸泡花粉的一段时间为15-60分钟，优选30分钟；所述筛子为100目金属筛子或者尼龙筛子。

本发明还提供了由上述方法制备的固体介质花粉。

本发明还提供了由本发明的方法制备的固体介质花粉在生态安全性评价中的应用，其中使用所述固体介质花粉检测转基因作物例如转基因棉花的花粉扩散的距离和方向，从而可以研究转基因作物例如转基因棉花的基因漂移的规律。

为了研究转基因棉花的生态安全性，本发明通过下述方法检测转基因棉花花粉扩散的距离和方向：于早上田间棉花花朵开始散粉时，用棉签蘸取一定量本发明的固体介质花粉，优选约35mg，涂抹于田间棉花花朵的柱头和花药上，使其与棉田花朵的花粉混合。让其自然扩散一段时间后，在涂抹过所述固体介质花粉的棉花花朵周围一定区域，用放大镜查看该区域内花朵是否有所述红色的固体介质花粉，并记录具有所述红色固体介质花粉的棉花花朵相对于涂抹所述固体介质花粉的棉花花朵之间的距离和方向。

本发明通过在转基因作物例如转基因棉花的花粉上的人工辅助标记，研究转基因作物例如转基因棉花的花粉的扩散距离和方向，从而为转基因作物例如转基因棉花生态安全性评价研究奠定基础。

相对于现有技术本发明具有如下优点：本发明中使用赤藓红B溶液染色的花粉经处理后为红色干燥粉状物，更接近花粉的自然情况，既不影响散粉，也不影响传粉昆虫活动，能够更真实地反映转基因棉花花粉的传播情况。

本发明克服了现有技术的不足，提供了一种棉花花粉扩散距离试验中所需要的固体介质花粉及其快速制备方法，从而为转基因棉花花粉的扩散研究提供理论和基础。

附图说明

图1：研究棉花花粉扩散的距离和方向的田间试验示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但它们不是对本发明的限定。本实施例所选的试验田位于新疆维吾尔自治区喀什地区莎车县塔尕尔其乡转基因棉花田。所用棉花为转Cry1Ac基因陆地棉(Gossypium hirsutumL.)中棉所43，棉花种植密度为15000株/亩。

实施例1

一、固体介质花粉的制备

本发明所述固体介质花粉制备的一个实例如下：

(1)采集棉田中已经明显伸长和膨大、第二天将要开花的转基因棉花的花蕾1500朵，用镊子将花蕾中的花药分离，并收集所述花药，在阴凉处摊开所述花药使其散粉，用100目的分样筛(广州市宏达筛网厂生产)筛出花粉，收集所述花粉备用；以及

(2)将2.5克赤藓红B(美国Amresco公司生产)溶解于497.5克蒸馏水中，配制成质量百分比浓度为0.5％的赤藓红B溶液，按1克花粉使用150毫升溶液的比例把花粉放入溶液中浸泡30分钟，之后用滤纸过滤出花粉并晾干，使用100目的分样筛(广州市宏达筛网厂生产)筛出花粉，即得所需的被染成红色的粉末状的固体介质花粉。

二、固体介质花粉在转基因棉花花粉扩散研究中的应用

1.试验方法

(1)本发明方法：于当日田间棉花花朵开始散粉时，在棉田中心选取5m×5m的区域。在此区域内，用棉签蘸取本发明所述的固体介质花粉涂抹于所有当日开放的花朵的柱头和花药上，使其与花朵内的花粉混合。每朵花涂抹约35mg上述方法制备的固体介质花粉。待其散粉7小时后开始调查此区域东、南、西、北四个方向1、3、5、7、10、15米处的花朵，使用10×放大镜查看花朵内是否有所述红色的固体介质花粉。每个方位上观察30朵花朵，记载每朵花的方位和花朵内所含有的所述固体介质花粉的粒数。

(2)现有技术方法：于当日田间棉花花药开始开裂时，在棉田中心选取5m×5m的区域。在此区域内，用微型喷雾器将质量百分比浓度为1％的赤藓红B溶液喷到所有当日开放的花朵上。7小时后开始调查此区域东、南、西、北四个方向1、3、5、7、10、15米处的花朵，使用10×放大镜查看花朵内是否有所述红色的固体介质花粉。每个方位上观察30朵花朵，记载每朵花的方位和花朵内所含有的所述固体介质花粉的粒数。

2.数据处理

计算在每个方向和每个距离上所观察的花朵中，含有所述红色的固体介质花粉的花朵所占的百分率和花朵中含有的所述红色固体介质花粉的粒数的平均数，计算公式为：某一方向或距离含有所述红色的固体介质花粉的花朵所占的百分率＝该方向或距离含有所述红色的固体介质花粉的花朵数÷该方向或距离观察的花朵总数×100％；某一方向或距离花朵中含有的所述红色固体介质花粉的粒数的平均数＝该方向或距离花朵中含有的所述红色的固体介质花粉的粒数÷该方向或距离观察的花朵总数×100％。

使用EXCEL 2003和SAS 8.0软件进行方差分析，并使用DUNCAN新复极差法进行多重比较。

3.结果与分析

结果如下表1和表2所示。试验当天为当地当季常见的晴朗微风天气，试验期间气温为25.0～31.6℃，空气相对湿度为39.4～56.9％，主风向为西北风，瞬时最大风速为2.3米/秒。

表1.不同方向的花粉传播

表2.不同距离的花粉传播

运用本发明的方法，在所调查的花中，含有所述红色的固体介质花粉的花朵中的所述红色的固体介质花粉粒的数量相差很大，最少为1粒，最多为64粒。在东、西、南、北四个方向上，在所观察的花朵中，含有所述红色固体介质花粉的花朵所占的百分率平均分别为8.8％、12.1％、5.7％、0.0％，花朵中含有的所述红色固体介质花粉的粒数的平均数分别为0.4、0.6、0.1、0.0，在生物统计学上都没有达到显著差异(P值分别为0.29和0.47)。在1m、3m、5m、7m、10m、15m距离上，在所观察的花朵中，含有所述红色固体介质花粉的花朵所占的百分率平均分别为17.5％、6.1％、2.5％、2.5％、5.6％、5.6％；含有所述红色固体介质花粉的粒数的平均数分别为0.9、0.1、0.1、0.3、0.1、0.1，在生物统计学上也都没有达到显著差异(P值分别为0.45和0.59)。

转基因棉花花粉传播的主要动力为昆虫访花活动。本发明方法的研究结果表明，红色固体介质花粉的传播符合昆虫在田间随机访花携粉传播的特征，表明本发明的方法能够较好地反映转基因棉花花粉的自然传播情况。

相比之下，运用现有技术方法时，在所研究的不同方向和距离上都没有观察到被赤藓红B染成红色的花粉。分析原因，在此方法中，棉花花朵中喷洒赤藓红B溶液两个小时后花朵才能变干，在此之前传粉昆虫无法正常访花。而且即使在花粉变干之后，染色的花粉粒相互粘成一团，不能分散，昆虫也不能正常携带花粉。这说明现有技术既限制了昆虫的访花时间，也不利于昆虫携带花粉，导致本试验调查中没有观察到染色花粉的传播。而本发明方法是先制出染好色并干燥过筛的固体介质花粉，然后人工授粉，所以能与棉花花朵中的花粉充分混合，花粉粒的分散性也和正常的棉花花粉一样，不影响昆虫访花和携带花粉。因此认为本发明方法能够在田间准确地调查转基因棉花花粉的正常传播情况，而如果采用现有方法的话则会造成对转基因棉花花粉传播情况的低估。

上述实施例仅示例性地详细说明本发明，并不意欲限制本发明的范围，本发明所述固体介质花粉的制备并不限于使用所举例的棉花花朵的花粉，本领域技术人员将理解，可采用以虫媒传粉为主要传粉方式的作物的花粉制备本发明所述的固体介质花粉。并且本领域技术人员还将理解，本发明所述的固体介质花粉并不限于研究转基因棉花花粉扩散的距离和方向来研究转基因棉花的生态安全性，本发明所述的固体介质花粉还可用于研究其他转基因作物的花粉扩散的距离和方向来研究其他转基因作物的生态安全性。在实质上不违反本发明所公开内容的精神和原理的基础上，可以对本发明上述实施例进行很多变动和修改。所有这种修改和变动旨在包括于本文所公开的范围内，而且受到本发明权利要求的保护。

Claims

1.一种制备固体介质花粉的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)采集已经明显伸长、第二天将要开花的花蕾，将花蕾中的花药分离；

(ii)在阴凉处摊开所述花药，使所述花药散粉，用筛子筛出花粉；

(iii)使用赤藓红B溶液浸泡所述花粉一段时间，对花粉进行染色；以及

(iv)用滤纸过滤出染色的花粉、晾干、并用筛子筛出粉末状的花粉，即得所需的固体介质花粉。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述花蕾为以虫媒传粉为主要传粉方式的作物的花蕾。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述花蕾为转基因棉花的花蕾。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述一段时间为15-60分钟。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述一段时间为30分钟。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中，所述赤藓红B溶液的质量百分比浓度为0.25％-1％；所述花粉与所述赤藓红B溶液的用量比例为1克花粉用100-200毫升赤藓红B溶液。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述赤藓红B溶液的质量百分比浓度为0.5％；所述花粉与所述赤藓红B溶液的用量比例为1克花粉用150毫升赤藓红B溶液。

8.通过权利要求1-7任一项所述的方法制备的固体介质花粉。

9.如权利要求8所述的固体介质花粉在转基因作物生态安全性评价中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其中使用所述固体介质花粉检测转基因作物例如转基因棉花花粉扩散的距离和方向，来研究转基因作物例如转基因棉花的生态安全性。