CN102481362A - 表皮生长因子受体(egfr)与蛋白酶活化受体2(par2)对肠道通透性的调节 - Google Patents

表皮生长因子受体(egfr)与蛋白酶活化受体2(par2)对肠道通透性的调节 Download PDF

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Abstract

此发明提供了一种治疗自身免疫性疾病的方法，其步骤包括增加跨越表皮细胞的电阻，以导致细胞通透性的减少。此发明也提供了一种治疗人类乳糜泻病的方法，其步骤包括给予单链zonulin的抗体，以抑制表皮生长因子受体和PAR2。

Description

表皮生长因子受体(EGFR)与蛋白酶活化受体2(PAR2)对肠道通透性的调节
联邦基金注释
本发明自国立卫生研究院获得的基金(基金号DK048373)在政府支持下完成。政府对此发明具有一定权利。
相关申请的交叉索引
根据U.S.C.35第119(e)条，本国际专利申请案要求享有2009年6月10日归档的现已终止的美国临时专利申请第61/185,662号的优先权，并且上述专利申请案的内容以引用的方式合并于此。
发明背景
发明领域
本发明涉及细胞生物学和肠道通透性领域。更为具体地，本发明涉及表皮生长因子受体(EGFR)与蛋白酶活化受体2(PAR2)对肠道通透性的调节。
相关技术描述
卫生水平的提高而导致的与各种微生物接触的减少，被认为是过去三四十年里工业化国家中，造成有记录的过敏、炎症和自身免疫症等流行病的原因之一(1)。除了遗传体征和与环境因素的接触外，第三类重要因素，例如增加的肠道通透性(IP)，被认为是这些疾病的致病原因(2-4)。
肠道通透性与肠上皮细胞和肠内腔树突状细胞进行的抗原摄取共同调节肠腔与黏膜下层间的分子运输，导致对非自体抗原的免疫或耐受(5)。然而，胞旁空间的尺寸(10到15埃)表明分子半径大于15埃(分子量约3.5kDa，包括蛋白质)的溶质通常被排阻在这种摄取途径之外。细胞间紧密连接严密地调节这种胞旁抗原运输。
紧密连接是在生理和病理环境下都对肠上皮的多种重要功能有操控作用的动态结构(3)。然而，尽管对于细胞间紧密连接组成和功能上的了解有了很大进展，其调控机理尚不完全清楚。
一种能够增加紧密连接通透性的毒素——霍乱弧菌闭合带毒素(Zot)的发现，导致了对于其真核细胞对应物——连蛋白(zonulin)的确认。zonulin是已知的唯一一种能够通过调节细胞间紧密连接来可逆地调控小肠通透性的调节物(6，7)。人zonulin是约为47kDa的蛋白，能够增加非人灵长目动物肠上皮的肠道通透性(7)，参与肠道天然免疫(8)，并在紧密连接功能障碍居核心地位的自身免疫紊乱疾病，如乳糜泻(CD)(9，10)和一型糖尿病(11)中，高量表达。
触珠蛋白是一种急性时相反应蛋白，主要在肝脏、动脉壁、子宫内膜和腹膜合成。触珠蛋白的核心功能是作为血红蛋白(Hb)的结合蛋白，参与大部分在肝脏网状内皮系统中的，游离血红蛋白的终末过程和清除。该系统使血红蛋白基元中的铁得以保持。
触珠蛋白具有由二硫键连接的两条α-链和两条β-链组成的四聚体结构。β-链(245个氨基酸)的分子量约为40kDa(约30％的质量为糖类)，为所有表现型所共有。α-链存在两种形式：α-1(83个氨基酸，9kDa)和α-2(142个氨基酸，17.3kDa)。因此触珠蛋白具有三种表现型：Hp1-1，Hp2-1和Hp2-2。Hp1-1包含两条α-1链，Hp2-2包含两条α-2链，Hp2-1包含一条α-1链和一条α-2链。Hp1-1的分子量为100kDa，与血红蛋白结合时分子量为165kDa。Hp1-1以单体异构体存在，也被称为Hp二体。Hp2-1的平均分子量为220kDa，形成线性多聚体。Hp2-2的平均分子量为400kDa，形成环状多聚体。每种不同的多聚体形态均为一种不同的异构体。
触珠蛋白作为一种潜在治疗手段可用于溶血造成的肾脏损害。治疗上的潜在作用主要表现于作为一种清除游离血红蛋白的手段，其形成的复合物还具有潜在的抗炎症、抗氧化及血管生成剂的作用。然而，触珠蛋白被认为难于在保持其生物活性的同时进行大规模分离。
对于触珠蛋白前体2功能的阐释以及其调节肠道通透性的方法有着广泛的需求。本发明将填补这些方面的长期空白。
发明概述
虽然zonulin在健康和疾病中作为肠道通透性调节物的角色已有了功能性的描述，但其生化特性尚不清楚。本发明显示，通过对人血清的蛋白质组分析，zonulin等同于触珠蛋白前体2(HP2)。该分子先前只被认为是触珠蛋白的无活性前体，与HP1一样，是人触珠蛋白前体的两种遗传突变体之一。本发明展示了作为触珠蛋白前体2的zonulin的功能性描述。其作为一个多功能蛋白，以完整的单链前体形式，通过蛋白酶活化受体2(PAR2)的活化，反式激活表皮生长因子受体(EGFR)，来调节肠道通透性，而且被剪切后的双链形式则作为血红蛋白的清道夫。
因此，在本发明的一部分实施例中，提供了治疗一种自身免疫疾病的方法，由增加跨表皮细胞电阻，以导致细胞通透性减少的步骤组成。
在本发明的另一部分实施例中，提供了对于一个病患个体用此种手段进行自身免疫疾病治疗的方法，由抑制表皮生长因子受体和抑制蛋白酶活化受体2的步骤组成。
在本发明的另一部分实施例中，提供了对于一个病患个体用此种手段进行乳糜泻治疗的方法，包括了给予单链zonulin的抗体，由此抑制表皮生长因子受体和抑制蛋白酶活化受体2的步骤。
以专利信息公开为目的，本发明其他和进一步的方面、特点和优势将在后文中首选的实施例部分的描述中呈现。
附图说明
因此，上述特点、优势、发明的对象以及其他将明确的内容，会被涉及到并且在细节层面上也可以被理解，在附图中，将对以上简述的发明的某些部分和更具体的描述加以图示。这些附图形成具体阐释的一部分。然而需要注意的是，附图只图示发明的首选部分，因此并不仅限于此范围。
图1显示用zonulin交叉反应的抗zonulin多克隆抗体对去除了白蛋白和免疫球蛋白IgG的乳糜泻病人血清进行的免疫印记。检测到三个主要的条带式样：显示一条18kDa免疫反应条带和一条较模糊的45kDa条带的血清(列1)，只显示一条9kDa条带的血清(列2)，和显示18kDa和9kDa条带的血清(列3)。
图2A-2B显示纯化的人纯合HP1-1和HP2-2未经和经过肽N-糖苷酶(PGNase)去糖基化处理的考马斯染色和免疫印记。图2A：未经去糖基化处理的触珠蛋白考马斯染色显示共同的糖基化的β链迁移至分子量约52kDa处，而HP1-1的α链(α1)和HP2-2的α链(α2)各自迁移到预期的分子量，8kDa和18kDa处。肽N-糖苷酶去糖基化造成β链位移至分子量约36kDa处(完全去糖基化)或稍高的分子量处(不完全去糖基化)。与预期相一致，非糖基化的α1和α2链没有观察到位移变化。图2B：纯化的人纯合HP1-1和HP2-2未经和经过肽N-糖苷酶去糖基化处理的免疫印记，同一凝胶上对三个平行样品进行电泳，转膜，然后分别用多克隆抗Zot抗体(左列)，单克隆抗HP抗体(中间列)或多克隆抗HP抗体(右列)进行免疫印记。三种用于检测的抗体都能识别α1和α2链(所有栏中，列1和列2)，它们的条带式样在对HP1-1和HP2-2蛋白进行去糖基化处理后没有发生变化(列3和列4)。相反地，通过抗HP单克隆抗体(中间栏，列3和列4)或抗HP多克隆抗体(右栏，列3和列4)检测，去糖基化造成HP1-1和HP2-2β链预期的胶迁移位移。zonulin交叉反应的抗zonulin多克隆抗体在HP2-2而非HP1-1中识别了一条额外的约45kDa的条带，该条带在去糖基化后没有位移变化(箭头所示)。串联质谱(MS/MS)分析和N端测序确定该约47kDa的条带为触珠蛋白前体2(pre-HP2)。
图3显示zonulin在C57BL/6野生型小鼠中以剂量依赖和时间依赖的方式增加肠道通透性。5，10，25和50微克/孔zonulin添加到C57BL/6野生型小鼠肠道片断的内腔一侧。经胰蛋白酶剪切的pre-HP2添加到50微克/孔。当添加的浓度大于或等于10微克/孔时，从添加后60分钟开始，zonulin诱导显著的跨表皮细胞电阻下降(p值介于0.03至0.036之间)。所示数据为取自4次独立实验的平均值±样品均数标准差(SEM)。
图4A-4D显示活体实验中zonulin对小鼠胃肠道通透性的影响。相较于牛血清白蛋白(BSA)作用的对照组(空心柱)，zonulin(实心柱)(170毫克/小鼠)增加小鼠小肠(图4A)和胃十二指肠(图4B)的通透性。拉茨曼(lacman)比(小肠通透性)和蔗糖碎屑分泌(胃十二指肠通透性)的变化显示为在zonulin施加当天和三天前所测得的通透性变化的百分比。成熟的双链HP2(点线柱)(170毫克/小鼠)未造成小肠或胃十二指肠通透性的变化。小肠(图4C)和胃十二指肠(图4D)通透性在48小时内回到施加zonulin前的数值，表明zonulin的作用是完全可逆的。拉茨曼比和蔗糖碎屑分泌的变化显示为在zonulin施加当天和施加后2天所测得的通透性变化的百分比。*与BSA对照和双链HP2相比，拉茨曼P＜0.0024；*与BSA对照和双链HP2相比，蔗糖P＜0.0049(每组实验的个体数量为10)。
图5A-5D显示zonulin对于表皮生长因子受体磷酸化的作用。图5A：递增浓度的zonulin对血清饥饿的Caco-2细胞进行孵育。细胞经裂解，用抗表皮生长因子抗体进行免疫沉淀，再用抗磷酸化表皮生长因子抗体(PY plus)进行免疫印记。为保证相等的上样量，将已有的印记条带去除后对表皮生长因子再次进行免疫印记。zonulin导致表皮生长因子磷酸化水平剂量依赖性地提高，最终达到3毫升/毫升的平台。图5B：10毫升/孔zonulin对单独的(列2)或存在5微摩表皮生长因子受体选择性蛋白酪氨酸激酶抑制剂AG1478(列3)的血清饥饿的Caco-2细胞进行孵育。与培养基(列1)或只与AG1478(列4)接触的细胞作为附加对照。zonulin导致表皮生长因子磷酸化水平的提高，这种提高被蛋白酪氨酸抑制剂AG1478完全消除(3次实验)。图5C：10毫克/毫升zonulin，在添加或不添加5微摩AG1478的条件下，以10微克/孔的浓度加入到C57BL/6野生型小鼠肠道片断的内腔一侧。测量基线(空心柱)和孵育90分钟后(实心柱)的跨表皮细胞电阻。zonulin导致跨表皮细胞电阻的显著下降，这种下降被AG1478的存在所抑制(每组实验4只小鼠)。图5D：相比于单链zonulin处理(列2)，成熟双链HP2(10毫升/毫升)的处理(列3)使zonulin诱导的表皮生长因子受体磷酸化水平显著降低。列1显示只经培养基处理的细胞内表皮生长因子受体的磷酸化水平。
图6A-6B图示zonulin对于表皮生长因子受体磷酸化和肠道通透性的影响。图6A：当蛋白酶活化受体2表达被沉默时，zonulin诱导的表皮生长因子受体磷酸化降低。在Caco-2细胞中，蛋白酶活化受体2的表达被两个不同的小干扰RNA(siRNA)所沉默。细胞经zonulin(10毫克/毫升)或作为对照的培养基处理，裂解，用抗表皮生长因子受体抗体进行免疫沉淀，然后用抗磷酸化表皮生长因子抗体(PY plus)进行免疫印记。zonulin介导的表皮生长因子受体磷酸化被蛋白酶活化受体2的沉默所阻断。通过将已有的印记条带去除后对表皮生长因子再次进行免疫印记，确证有等量的蛋白被上样并进行了转膜。图6B：在蛋白酶活化受体2双缺失小鼠(PAR2-/-)中，zonulin不能增加肠道通透性。源自C57BL/6野生型小鼠和蛋白酶活化受体2双缺失小鼠(PAR2-/-)的小肠片断置于微膜嵌套系统中，在培养基或含10毫克经纯化的重组zonulin培养基中接触30分钟，检测0时刻(空心柱)和孵育后90分钟时(实心柱)的跨表皮细胞电阻。到在野生型小鼠中能够观察到zonulin诱导的跨表皮细胞电阻降低，在蛋白酶活化受体2双缺失小鼠(PAR2-/-)中，zonulin诱导的跨表皮细胞电阻降低不显著(小鼠数量为5)。
发明详述
以下缩写可能会在本文使用。Ab：抗体；EGFR：表皮生长因子受体；HP：触珠蛋白；IP：肠道通透性；PAR：蛋白酶活化受体；TJ：紧密连接；WB：免疫印记；CD：乳糜泻。
本发明和/或权利要求中所使用的“一”或“一个”，当其与“包括”连接使用时，指一，也等同于“一或多”、“至少一个”和“一或多于一”。本发明的某些实施例可能或实际上由一个或一个以上本发明的组件、方法步骤和/或方法组成。应了解，此处所描述的方法或组分可以由此处所描述的其他方法或组分实现。
尽管本公开文本支持仅指另一个和“和/或”的释义，但除非明确指出其仅指另一个或是指互斥的另一个，此处所使用的术语“或”指“和/或”。
本文使用的术语“接触”意为任意合适的携带一种(或多种)本文描述的化合物与(或不与)其他一种(或多种)治疗药剂一起进入与一个(或多个)细胞的接触的方法。对于活体实验的应用，在此描述的任何已知的给药方法都是适宜的。
本文使用的术语“有效剂量”、“药物学有效剂量”或“治疗性有效剂量”是可以互换的，其意为造成对体外细胞的影响或改善的剂量。这些技术理解中的技巧，有效剂量可能改善患者或实验对象的状况，但可能无法完全治愈病症。
本文使用的术语“实验对象”意为任意被实验操作的目标。
因此，此发明指向一种治疗自身免疫疾病的方法，由增加跨表皮细胞电阻，以导致细胞通透性减少的步骤组成。该方法可以被应用于任何需要降低细胞通透性的自身免疫疾病。代表性的细胞包括而不仅限于小肠细胞或胃十二指肠细胞。一方面，这些细胞将降低zonulin mRNA表达水平。在一个相关的方面，该方法进一步组成抑制表皮生长因子受体的步骤。一个在此领域中具有一般技能的人应能够容易地通过此方法中的已知技术来抑制表皮生长因子受体。一个选定的实施例通过给予直接作用于单链zonulin的抗体而抑制表皮生长因子受体。在另一个相关的方面，该方法进一步组成抑制PAR2的步骤。一个在此领域中具有一般技能的人应能够容易地通过已知技术来抑制PAR2。
在当前发明方法的一些实施例中，通过使用直接作用于单链zonulin的抗体或小干扰RNA(siRNA)而抑制PAR2。在另一个相关的方面，该方法进一步组成由麦胶蛋白通过化学介素受体CXCR3结合来避免zonulin释放的步骤。在此发明中，可以由该方法治疗的代表性自身免疫疾病包括而不仅限于一型糖尿病、全身性红斑狼疮、乳糜泻、强直性脊椎炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、克罗恩氏症和精神分裂症。
此发明进一步指向一种对需治疗个体的自身免疫疾病的治疗方法，该方法由抑制EGFR和抑制PAR2的步骤组成。使用该方法，使跨表皮细胞电阻增加，导致细胞通透性降低。在包括而不仅限于小肠细胞或胃十二指肠细胞的任意细胞中，细胞通透性可能降低。具有代表性地，这些细胞将表现出降低的zonulin mRNA表达水平。EGFR和PAR2可能如上所描述地受到抑制。在一个附加的方面，该方法进一步组成使用任意在此技术中具有一般技能的人所知的方法抑制麦胶蛋白的步骤，包括抗麦胶蛋白抗体等。此发明中的该方法可用于治疗的代表性疾病包括而不仅限于一型糖尿病、全身性红斑狼疮、乳糜泻、强直性脊椎炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、克罗恩氏症和精神分裂症。
此发明进一步指向一种对需治疗个体的自身免疫疾病的治疗方法，该方法包括了给予通过直接作用于单链zonulin的抗体，由此抑制EGFR和抑制PAR2的步骤。使用本发明的此方法，使跨表皮细胞电阻增加，导致细胞通透性降低。代表性细胞包括小肠细胞或胃十二指肠细胞，但该方法也可以用于多种细胞类型。在该方法的一个相关方面，PAR2通过使用siRNA而进一步受到抑制。并且，该方法可以进一步组成抑制麦胶蛋白的步骤。
在后文中给出的实施例目的在于阐释发明中的各个部分，而不是将此发明限制于此。
在过敏、炎症和自身免疫症的发病机制中，提高肠道通透性已经成为在一种普遍而潜在的机理。作为已知唯一的能够可逆调节肠道通透性的生理调节物，zonulin的特性尚有待阐明。通过对人血清的蛋白质组分析，本发明确认人zonulin即为触珠蛋白前体2(pre-HP2)。虽然成熟的触珠蛋白已知作为游离血红蛋白的清道夫来抑制其氧化活性，但触珠蛋白的未剪切前体的功能尚不清楚。此发明表明单链zonulin包含表皮生长因子样基序，此基序能够通过PAR2的激活反式激活EGFR。这两种受体的激活与肠道通透性的提高相耦联。siRNA诱导的PAR2的沉默或PAR2双缺失小鼠(PAR2 -/-)的使用能够阻止障碍整体性的消失。将zonulin剪切成其α-2和β-链的蛋白酶切导致zonulin激活EGFR和提高肠道通透性能力的丧失。定量基因表达显示在乳糜泻患者的肠黏膜中zonulin高量表达。这是一种分子前体形式具有与其成熟形式不同生物活性的首例。因此，这些结果赋予zonulin作为一种全新配体的特性，即作为一个关键的信号转导体参与人免疫介导疾病的发病机制，该机制可作为治疗干预的靶向。
实施例1
人血清样品
从乳糜泻研究中心血清库获得健康和患乳糜泻病志愿者的血清。使用商用EnchantTM生命科学试剂盒(美国密歇根州安阿伯Pall公司)和免疫纯固定化G蛋白加强试剂盒(PIERCE，美国伊利诺斯州罗克福德)分别去除血清样品中的白蛋白和免疫球蛋白IgG。去除白蛋白和免疫球蛋白IgG的血清被用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、二维电泳和免疫印记分析。
实施例2
人触珠蛋白(HP)
源自人血浆的人HP1-1和HP2-2购自Sigma公司(美国密苏里州圣路易斯)。对人HP进行了一维和二维电泳(SDS-PAGE)，免疫印记和质谱分析。依照使用说明(密苏里州圣路易斯Sigma公司)，通过添加肽N-糖苷酶F(PNGase F)对人HP进行去糖基化处理。
实施例3
十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印记分析
在18％(变性条件下)和12％(非变性条件下)的Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)上对去除白蛋白和免疫球蛋白IgG的血清(50微克/孔)、人HP1-1(1微克/孔)和人HP2-2(1微克/孔)进行电泳分析。在变性胶电泳前，向样品中加入30微升Laemmli缓冲液，煮沸5分钟后上样。电泳后的蛋白由SimplyBlue SafeStain溶液(Invitrogen公司)进行染色，或转膜到PVDF膜上，然后用经亲和纯化的兔多克隆抗Zot免疫球蛋白抗体(5微克/毫升)或2微克/毫升小鼠单克隆抗人HP抗体(Sigma公司)或1微克/毫升兔多克隆抗人HP抗体(Sigma公司)作为一级抗体进行检测。过去的实验表明，兔多克隆抗Zot免疫球蛋白抗体能够与纯化的人zonulin蛋白发生交叉反应(人zonulin蛋白通过ImmunoPure IgG(Protein A)纯化试剂盒(PIERCE公司)纯化)。辣根过氧化物酶标记的抗兔免疫球蛋白(1∶50000稀释；Amersham公司)或抗鼠免疫球蛋白(1∶10,000稀释；Sigma公司)被用作二级抗体。蛋白条带用ECL Plus试剂(Amersham公司)进行显影。
实施例4
二维电泳分析和二维电泳免疫印记
使用ZOOM IPGRunner系统(Invitrogen公司)进行二维电泳分析。简要步骤：将去除白蛋白和免疫球球蛋白IgG的血清按1：2的比例加入到含有尿素、去污剂、还原剂、两性电解溶液和染料的商用样品再水化缓冲液(ReadyPrep再水化/样品缓冲液；Bio-Rad公司)中，在室温下再水化pH值为5.3-6.3的ZOOM胶条(Invitrogen公司)1小时。胶条加样到ZOOM IPGRunner盒(Invitrogen公司)中进行等电聚焦(IEF)。
为了使得样品能够分离，使用如下电压方案进行等电聚焦：200伏20分钟；450伏15分钟；；750伏15分钟；2,000伏105分钟。等电聚焦后，在二维聚丙烯酰胺凝胶电泳前，胶条先在含有NuPAGE样品还原剂的NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen)中平衡15分钟，而后在含有新加入的碘代乙酰胺(125毫摩；BioRad)的NuPAGE LDS样品缓冲液中进行烷基化处理15分钟。而后使用具有固定pH梯度孔(Invitrogen公司)的NuNovex 4-20％Tris-氨基乙酸ZOOM凝胶(1.0毫米)进行二维聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白带使用SimplyBlue SafeStain溶液(Invitrogen公司)进行显色。将蛋白条带转移到PVDF膜(Millipore公司)上。使用亲和纯化的(Immuno-Pure IgG(蛋白A)纯化试剂盒；PIERCE公司)兔多克隆zonulin交叉反应抗-Zot免疫球蛋白IgG(5微克/毫升)作为一抗，抗兔免疫球蛋白IgG(辣根过氧化物氧化酶交联的ECL兔免疫球蛋白IgG；Amersham生物科学公司)作为二抗来探测蛋白。然后使用ECL检测试剂(Amersham生物科学公司)曝光PVDF膜并显影。
实施例5
质谱分析
从经过SimplyBlue预染色的聚丙烯酰胺凝胶电泳或者是二维电泳胶中切下的蛋白条带，进行胶内胰蛋白酶消化处理，进而在斯坦福蛋白和核酸生物工程仪器公司使用蛋白序列分析和质谱图谱分析设备(美国加利福尼亚州斯坦福Beckman中心)进行串联质谱分析来鉴定蛋白。
实施例6
在昆虫细胞中zonulin/pre-HP2的表达
编码HP2蛋白的全长人cDNA克隆购自OriGene公司(TC116954；序列号：NM_005143；OriGene科技公司)。根据制造商提供的方法，使用pDEST8(杆状病毒真核表达载体)和Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen公司)构建携带野生型人zonulin cDNA基因(C-端带有6个组氨酸标记)的重组杆状病毒。使用Gateway技术(Invitrogen公司)进行重组，将zonulin从pENTR/D-TOPO载体上转移到pDEST8上。将pDEST8-zonulin转化到携带杆粒DNA的MAX EfficiencyDH10Bac细胞中。重组杆粒从DH10Bac细胞中分离，并通过脂质体转染试剂(Invitrogen公司)转染到草地夜蛾(Spodoptera frugiperda，sf9)细胞中以生成重组杆状病毒。Sf9细胞被用于连蛋白的基因表达。为表达zonulin蛋白，sf9细胞(3x107)于27℃在含SFM-900III培养基(Invitrogen公司)的悬浮培养瓶中生长。感染复数为3的重组杆状病毒感染细胞。感染后72小时，以2000g离心10分钟收集sf9细胞。为纯化zonulin，向条件培养基中加入磷酸缓冲液(pH 7.5)和氯化钠至溶液最终浓度分别为20毫摩和0.5摩(2)。此溶液上样到含镍离子(Ni2+)的螯合琼脂糖凝胶(组氨酸标记树脂；Novagen公司)柱，然后使用200mM的咪唑进行洗脱，透析到PBS中。纯化的人zonulin分装储存于-80℃备用。
实施例7
应用微膜嵌套系统的体外肠道通透性研究
zonulin/pre-HP2对于体外肠道通透性的影响通过先前描述的方法(3)在微膜嵌套系统中进行监测。简要步骤：取自C57BL/6野生型小鼠的小肠片段置于微膜嵌套系统中，其内腔侧在培养基或含递增浓度的经纯化的重组zonulin培养基中接触30分钟。在2小时的时间内，用平面电极(恩都霍姆SNAP电极与伊沃姆WPI分析仪相连接，世界精密仪器公司)测量0时刻和每30分钟间隔的跨表皮细胞电阻(TEER)，结果经归一化后计为欧姆/平方厘米。所有微膜嵌套系统TEER实验在小鼠小肠以TEER值为77.9±3.5欧姆/平方厘米为基线进行(小鼠数量23)。在选定的实验中，在基本条件和用EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478预先作用的条件下，监测zonulin对TEER的影响。在另一组实验中，在C57BL/6野生型和PAR2双缺失小鼠(PAR2 -/-)中对zonulin进行测试。
实施例8
活体肠道通透性
129/SvEv野生型小鼠随机分为每30只一组的3组。这些小鼠在实验条件下进行三周的实验，其间禁食3小时，再用糖探测器灌胃，然后将它们置于代谢笼中。此实验每周进行两次。在施加蛋白当天，如先前所描述的方法(4)，实验动物摄取溶于60毫升溶液的170毫克纯化的单链zonulin或相似量的纯化的被剪切双链触珠蛋白2，同时进行糖灌胃。在接下来的22小时中，小鼠被置于代谢笼中，并给予不限量的饮用水；在此期间，收集小鼠的尿液。然后将它们放回常规笼中。给药两天后，再次将小鼠置于代谢笼中，测量它们经实验处理后的恢复情况。
实施例9
通过RNA干扰对PAR 2 进行基因下调
使用两种不同的PAR2siRNA(50纳摩HSS103471和HSS103473，Invitrogen公司)对Caco-2细胞中的PAR2进行基因沉默。依据使用说明，使用DharmaFECT1转染试剂(Dharmacon公司)将PAR2siRNA转染到置于10厘米培养皿的细胞中(含5％胎牛血清(FCS))24小时。通过免疫印记和实时PCR分析确认PAR2的基因下调效率。
实施例10
从肠道活组织中提取总RNA
总RNA使用TRizol RNA纯化方法。简要步骤：使用Polytron动力匀浆仪PT3100(Kinematica AG公司)将各肠道组织样本匀浆于1毫升TRizol试剂(Invitrogen公司)中。通过添加0.2毫升氯仿萃取RNA。用手猛烈摇动试管15秒，然后在室温孵育5分钟，于4℃15000转/分钟离心15分钟(马拉松21000R离心机；Fisher科学公司)。将富含RNA的液相转移到另一个试管中，通过向每1毫升起始匀浆时使用的TRizol试剂加入0.5毫升异丙醇沉淀RNA。样品在室温孵育10分钟，于4℃15000g离心10分钟。去除上清液，使用75％冰冷的乙醇洗涤RNA沉淀(每1毫升起始匀浆时使用的TRizol试剂至少加入1毫升75％乙醇)。沉淀风干少于2分钟，溶于20毫升去除RNA酶的水中，储存于-80℃。RNA的浓度由分光光度计(DU530紫外/可见光；Beckman Coulter公司)在260纳米处读取。测定每个样品的260∶280比值。
实施例11
cDNA合成
依据使用说明，使用高容量cDNA提取试剂盒反转录获得2毫克总RNA(应用生物系统公司)。
实施例12
聚合酶链式反应(PCR)扩增人肠道活组织中的触珠蛋白基因
cDNA的实验分样被用来扩增特异HP2片断，并使用我们特别设计的覆盖不同外显子的引物如下：正向引物(外显子5)：5’-ATGGCTATGTGGAGCACTCG-3’(序列编号：1)和反向引物(外显子7)：5’-TACAGGGCTCTTCGGTGTCT-3’(序列编号：2)。聚合酶链式反应使用0.1毫克cDNA，2.5单位TaqDNA聚合酶(Promega公司)，0.2毫摩dNTP混合物，0.5毫摩各种引物，5毫摩氯化镁和1∶10体积的10毫升PCR标准缓冲液(Promega公司)。聚合酶链式反应在温度循环仪(Thermo Electro公司)中进行。初始1分钟94℃变性之后，完成30个由94℃30秒(变性)，58℃30秒(退火)和72℃30秒(延伸)组成的循环，接着在72℃最终延伸10分钟。然后PCR产物由2％琼脂糖胶分离，溴化乙锭染色，用胶条带纯化试剂盒纯化(Amersham生物科学公司)，并用3730xl DNA分析仪测序(应用生物系统公司)。
实施例13
依据TaqMan步骤的实时PCR
对取自仅具HP2-2或HP2-1表型实验对象的cDNA进行实时PCR，该步骤使用HP-2特异性基因引物和探针(产品序号：Hs00978377m1)和持家18S(产品序号：Hs99999901S1(应用生物系统公司))。反应使用TagMan通用PCR混合母液(应用生物系统公司，Roche公司生产)并在7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司)上运行。所有反应都进行重复试验。相关基因的表达通过将18S作为持家基因的比较Ct方法计算。在使用18S mRNA进行归一化之后，记录活跃乳糜泻病人和去麸质饮食的乳糜泻病人的zonulin mRNA表达水平相较于非乳糜泻病对照的zonulinmRNA表达水平的倍数变化。
实施例14
人zonulin/pre-HP2的克隆、在昆虫杆状病毒表达系统中的表达和蛋白酶剪切
使用如上描述的昆虫杆状病毒系统和其纯化方法获取重组的zonulin/pre-HP2。纯化的单链zonulin被所述的丝氨酸蛋白酶蛋白酶解，通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)解析，然后用SimpleBlueTM SafeStain溶液(美国加利福尼亚州卡尔斯拜德Invitrogen公司)。为生成双链HP2，单链zonulin与胰蛋白酶-琼脂糖珠(Sigma公司T-1763)在25℃接触20分钟。离心除去琼脂糖珠，通过对于谷氨酸-甘氨酸-精氨酸-pNA底物(Bachem生物科学公司)的胰蛋白酶肽酶活性测试确认胰蛋白酶去除的有效性。
实施例15
体外和活体肠道通透性研究
zonulin对于体外和活体肠道通透性的影响如先前的描述(8，14)和上述的报道。为确定zonulin是否能够激活EGFR，将递增浓度的zonulin或双链成熟HP2加入到血清饥饿的EGFR高表达Caco-2细胞中，逐步增加接触的时间。按照先前的报道，细胞被裂解后，用抗磷酸化EGFR(Y1068)抗体(细胞信号技术公司)进行免疫印迹(40)。在存在5微摩EGFR选择性蛋白酪氨酸激酶抑制剂AG1478(美国纽约州吉布斯塘Calbiochem公司)的条件下进行重复实验。
实施例16
zonulin基因测序和对源自乳糜泻病人和非乳糜泻病人的肠道组织进行zonuiln 基因的定量分析
小肠粘膜样品取自接受上胃肠内腔镜诊断的实验对象十二指肠的第二或第三部分。实验对象包括10名健康对照，7名正患有乳糜泻的患者和3名在最近6个月接受去麸质饮食治疗的乳糜泻患者。所有患者都有对此过程的临床适应症，并且自愿接受以本研究为目的一次附加活检。本研究的步骤经马里兰大学伦理委员会批准。小肠活组织被迅速收集到RNAlater RNA稳定化试剂(美国加利福尼亚州维伦希亚Qiagen公司)中，于-20℃储存直至进一步处理。总RNA提取、cDNA合成和实时PCR如上所述。
所有数值以平均值±标准误差的形式给出。差异分析由双尾Student’s t检验对于两组成对或不成对变量的差异检验给出。在适宜的地方进行多变量分析。P值≤0.05被认为显著。
实施例17
对乳糜泻病人血清中zonulin的特征描述
由于人血清中的zonulin能够被基于与zonulin有交叉反应的抗Zot抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)所检测到，并且其含量在乳糜泻病人中较正常对照中增加(10)，因此，免疫印迹分析被初步用于检测源自乳糜泻病人的去除白蛋白和免疫球蛋白IgG的血清蛋白的zonulin免疫活性。这些血清显示两条主要的蛋白质条带，表观分子量为18kDa和9kDa(图1)。在乳糜泻病人血清中发现三种不同的反应性式样：一条18kDa的蛋白条带(图1列1)，一条9kDa的蛋白条带(图1列2)和同时具有18kDa和9kDa的蛋白条带(图1列3)。需要指出的是，约45kDa的条带只在显示单独18kDa条带的血清中出现(图1列1)，而不在含有9kDa或两条蛋白条带的血清中被检测到(图1列2、3)。对源自表达18kDa条带的乳糜泻病人的血清进行二维凝胶电泳(2-DE)，显示两个zonulin免疫活性斑点，这些斑点进一步通过串联质谱进行分析。18kDa的斑点被认定为HP2的α-2链(查询编号GI：223976)，9kDa的斑点被认定为HP1的α-1链(查询编号GI：3337390)。对14份来自乳糜泻病人的血清随机筛选显示其中7％为HP1纯合子，57％为HP1/HP2杂合子，36％为HP2纯合子。
实施例18
对源自人HP样品中zonulin的特征描述
为确认由多克隆与zonulin有交叉反应的抗Zot抗体在乳糜泻病人血清中识别的免疫活性条带的特征，对来自HP1-1或HP2-2纯合子的商业纯化制备的人触珠蛋白样品在同一块凝胶上通过SDS-PAGE同时进行解析，并通过考马斯染色进行分析(图2A)。如同所预期的，HP1-1的α-1链显示一条分子量约为9kDa，HP2-2的α-2链分子量约为18kDa(图2A列2)。由于糖基化作用，在HP1-1和HP2-2样品中的β-链都显示分子量约为52kDa(图2A列1、2)。在用肽N-糖苷酶F去糖基化3小时后，HP1-1和HP2-2中的β-链显示低于52kDa的多个条带，推测为去糖基化程度不同所造成(图2A列3、4)。如同所预期的，糖苷酶处理后HP1-1的α-1链(图2A，比较列1和列3)和HP2-2的α-2链(图2A，比较列2和列4)的凝胶迁移都没有显著变化。
图2B显示商用纯化的纯合子HP1-1和HP2-2在去糖基化之前和之后的免疫印迹。蛋白在同一块凝胶上同时电泳，然后用与zonulin有交叉反应的抗Zot抗体(图2B左栏)、单克隆抗糖基化β-链抗体(图2B中间栏)或多克隆抗HP抗体(图2B右栏)进行免疫印迹。抗Zot抗体与HP1-1α-1链和HP2-2α-2链强烈反应，并显示一条在HP2-2而不在HP1-1样品中的约45kDa的附加条带(图2B左栏，分别在列2和列1)。如同所预期的，由约52kDa的HPβ-链糖基化亚基生成的单克隆抗HP抗体只识别HP1-1或HP2-2的β-链(图2B中间栏，分别在列1和列2)。图2B也显示HP1-1和HP2-2样品在去糖基化后由同样三种抗体进行的免疫印迹。去糖基化后，非糖基化的9kDa α-1亚基和18kDa α-2亚基与三种抗体的免疫反应式样没有变化(图2B所有三个栏中，分别在列3和列4)。然而，去糖基化导致预期的HP1-1和HP2-2β-链的凝胶迁移位移。单克隆抗HP抗体(图2B中间栏列3和列4)只识别两条不完全去糖基化的β-链条带，而多克隆抗HP抗体也识别完全去糖基化的约36kDa的β-链(图2B右栏列3和列4)。只出现在HP2-2样品中被抗Zot抗体识别的45kDa条带不显示任何因去糖基化造成的凝胶迁移位移，但强度变浅(图2B左栏列4)。对两个不同样品的该45kDa蛋白条带在不同时间进行串联质谱分析和N-端测序，确定该蛋白为人HP2前体(pre-HP2，查询编号P00738)。组合的串联质谱分析整体覆盖了非重叠蛋白的49.8％和13个散布于整个蛋白序列中的13个独特肽段。因此，除了α-1和α-2链，抗Zot抗体还能识别未剪切的单链pre-HP2，但不能识别β-链。
这些结果表明，在ELISA中被用于测量血清zonulin的抗Zot抗体也应该能够像检测pre-HP2一样检测高丰度的HP1和HP2蛋白。但是，通过ELISA检测的血清zonulin量在纳克/毫升的水平(11)，而血清中的全部HP库在毫克/毫升的水平(12)。为探究这种表观上的分歧，使用抗Zot抗体在非变性条件下重复了对人血清和纯化的HP蛋白的免疫印迹分析。免疫印迹在HP2-2表型血清和商业纯化的HP2-2中显示一系列条带，而在HP1-1表型血清或商业纯化的HP2-2中则没有检测到条带。相反地，不识别未剪切pre-HP2的抗HP多克隆抗体在商业纯化的HP1-1和HP2-2样品中都检测到条带。综上，这些结果说明在非变性条件下，抗Zot抗体只识别单链pre-HP2，而不识别双链成熟HP，这进一步支持我们的观点：单链pre-HP2，而非其剪切后的双链成熟形式，与zonulin分子相对应。
实施例19
重组zonulin的功能分析
哺乳动物HP2mRNA转录本的初级翻译产物是一条在翻译同时发生二聚化的多肽链，当其仍在内质网时，即被丝氨酸蛋白酶Cr1LP蛋白酶切(13)。相反地，zonulin能够在人血清中作为pre-HP2被检测到(如上所述)。为确正zonulin是单链pre-HP2而非剪切后的成熟双链HP2，重组的pre-HP2通过将pre-HP2cDNA插入到昆虫细胞载体中得到表达，表达使用昆虫杆状病毒表达系统。所获得的高度纯化的重组pre-HP2与图2B相似地，被抗Zot多克隆抗体识别；由于C-端添加了6个组氨酸标签，其迁移的表观分子量约为53kDa。单链pre-HP2用一系列丝氨酸蛋白酶进行蛋白酶切。蛋白裂解酶、尿激酶、凝血酶和血浆激肽释放酶不剪切pre-HP2，而纤溶酶导致蛋白的完全降解。相反，肠道丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶处理导致出现两条主要条带，它们的迁移的分子量与zonulin的α-2和β-亚基相当。对这两个条带的N-端测序显示这两个蛋白与预测的在161位精氨酸剪切位点剪切的pre-HP2α-2和β-链一致。在下面的研究中将检测完整的单链pre-HP2和胰蛋白酶消化后得到的剪切的双链成熟HP2的生物活性。
实施例20
重组zonulin对于置于micro-snapwell系统的离体鼠小肠的TEER的作用
重组触珠蛋白前体pre-HP2(以下称为zonulin)被加入至置于micro-snapwell的野生型C57BL/6小鼠的小肠片断中。当加入的浓度大于或等于40微克/毫升时，加至鼠肠片断的粘膜(肠表皮)层的重组单链zonulin降低跨表皮细胞电阻(TEER)，即增加通透性(图3)。不同的是，经胰酶酶切过的双链HP2不能一致地改变TEER(图3).
实施例21
重组zonulin在体内对鼠胃肠通透性的作用
为了证实zonulin是否在体内有改变肠道通透性的作用，小鼠被单链重组pre-HP2蛋白(170毫克/只)所灌胃，胃十二指肠及小肠的通透性通过特异的糖类探针(分别为蔗糖和乳果糖/甘露醇)依文献所述测定(14).与牛血清白蛋白处理过的对照相比，Zonulin/preHP2增加小肠(图4A)及胃十二指肠(图4B)的通透性.在zonulin/preHP2处理后48小时之内，胃十二指肠及小肠的通透性各自回归基线(图4C和4D).
为了证实成熟的双链触珠蛋白HP2是否有改变肠道通透性的作用，我们用酶切过的双链蛋白重复了上述的体内试验.与单链zonulin不同的是，双链HP2不能胃十二指肠及小肠的通透性(与牛血清白蛋白处理过的对照相比，图4A和4B).纵上所述，这些数据显示单链zonulin，而不是由酶切产生的双链的成熟HP2，具有那些被报道过的zonulin的可逆性增加肠通透性的作用。
实施例22
zonulin的mRNA在人肠黏膜中的表达和定量
通过使用特定的引物和来自zonulin阳性个体的肠组织活检的cDNA，我们扩增了一个686个碱基对的片断，其144个碱基对属于HP1与HP2基因的alpha链而542个碱基对属于HP1与HP2基因的beta链。对这个片断的测序确认其系触珠蛋白，但是无法区分HP1和HP2，以为它们在扩增的片断中有同样的序列。为了克服这个缺点并且特异地定量zonulin基因在人肠组织中的表达，我们从以下的肠黏膜样品中提取的cDNA，健康人(n＝10)，克罗恩氏病人(急性发作期，n＝7)，遵循无谷蛋白食谱(GFD)的无发作期的克罗恩氏病人(n＝3)，并使用实时PCR及针对alpha2链的引物和探针对上述的cDNA进行了分析。与健康个体相比，克罗恩氏病发作的病人的肠黏膜中有更高的zonulin mRNA表达(3倍增加，P＜0.05)。相对于对照，患有乳糜泻并遵循无谷蛋白食谱的三例病人的肠黏膜中仅发现1.5倍的zonulin mRNA表达增加。
实施例23
重组zonulin增加EGFR的酪氨酸磷酸化
麦胶蛋白(gliadin)是一种在小麦及其他谷类中存在的糖蛋白，并且是在克罗恩氏病导致典型的免疫性小肠受损的环境诱因，可以完全模拟EGF对于肌动蛋白骨架的作用(16)，其作用与zonulin的作用十分相似(7，10，16)。其次，结构分析表明，触珠蛋白前体pre-HP2的beta链含有一个EGF基序，此基序包括六个空间结构上保守的半胱氨酸残基，这六个半胱氨酸残基形成了三个EGF样活性必须的分子内二硫键。
为了证实zonulin是否激活EGFR，递增浓度的重组zonulin(来自于杆状病毒)被加至Caco-2肠表皮细胞。细胞被裂解，与抗EGFR抗体免疫共沉淀，处理以进行酪氨酸磷酸化免疫印迹(PY-Plus)。在浓度大于等于3mg/ml时，zonulin增加EGFR的酪氨酸磷酸化增加(图5A)。为了进一步证实EGFR在zonulin介导的跨越表皮细胞电阻(TEER)变化中的作用，我们在上述的体外及离体试验中使用了EGFR选择性的酪氨酸蛋白酶抑制剂AG1478。Caco-2细胞与AG1478(5mM)预孵化两个小时后，zonulin/pre-HP2介导的EGFR在Y1068残基上的磷酸化被抑制(图5B)。同样，AG1478预孵化抑制了zonulin诱导的TEER的减少(图5C)。最后，zonulin的胰酶消化明显减少其激活EGFR的能力(图5D)。综上所述，这些数据提示单链zonulin激活EGFR并且诱导EGFR介导的TEER的减少，然而酶切过的双链触珠蛋白2无法激活EGFR或增加肠通透性。
实施例24
重组zonulin诱导的表皮生长因子受体(EGFR)激活及跨越表皮细胞电阻 (TEER)的改变依赖于蛋白酶活化受体2(PAR 2) 的介导
霍乱弧菌封闭带毒素(Zot)的活性肽段FCIGRL(AT1002)与蛋白酶活化受体2激活肽(PAR2AP)SLIGRL有结构相似性，并且可以诱导依赖于PAR2的TEER的改变(17)，此发现可以在野生型小鼠中证实，但在PAR2缺失小鼠(PAR2 -/-)中无法证实。另外，许多包括PAR2在内的G蛋白偶连受体(GPCR)可以反式激活EGFR(18).因为Zot和zonulin都具有相似的功能机理(6)并且zonulin的beta链具有相似于Zot和PAR2AP的片断(FCAGMS)，我们探讨zonulin诱导的EGFR是否依赖于PAR2的介导。
在Caco-2细胞中，siRNA诱导的PAR2的表达抑制减少了重组zonulin(10毫克/毫升)诱导的EGFR Y1068的磷酸化(图6A)，此现象符合依赖于PAR2的EGFR的反式激活。
为了进一步证实PAR2在于zonulin诱导的EGFR的激活中的作用，我们利用来自于C57BL/6野生型小鼠和PAR2缺失小鼠的小肠片断和microsnapwel系统，研究了两种小鼠的小肠屏障功能。正如所料，重组zonulin降低了来自于C57BL/6野生型小鼠的肠片断，但无法对来自于PAR2缺失小鼠的肠片断起作用(图6B)，由此将zonulin诱导的依赖于PAR2的EGFR反式激活与肠屏障功能联系在一起。
此发明发现zonulin和触珠蛋白前体2(pre-haptoglobin 2)系同一蛋白。成熟的人类触珠蛋白(HPs)为异二聚血浆糖蛋白，其包含由二硫共价键相连alpha多肽链和beta多肽链，其中beta链有糖基化(19)。与beta链(36kDa)不同的是，alpha链存在两种不同的异构体，alpha 1型(约9kDa)和alpha 2型(约18kDa)。
两条多肽链中一者的存在或两者同时的存在造就了三种亚型，HP1-1，HP2-1，和HP2-2.这些触珠蛋白亚型从一种与甘露糖结合并与凝集素相关的丝氨酸蛋白酶(MASP)演化而来(12，20)，其alpha链含有补体调控蛋白，其beta链含有失活的糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶区域(21-24)。MASP家族的其他成员包括一系列的与血纤维蛋白溶酶原相关的生长因子(EGF，HGF等)，这些成员涉及细胞的生长，增殖，分化，迁移，以及细胞间连接的破坏。尽管他们的结构包含很多亚区域，至今唯一确认的触珠蛋白的功能仅为与血红蛋白结合，以形成稳定的结构以阻止血红蛋白诱导的组织氧化性破坏(25)。触珠蛋白前体亚型的功能至今无人知晓。
触珠蛋白是一类特殊的分泌蛋白，因为它们的前体蛋白为补体C1r样蛋白酶(Cr1LP)在内质网中酶切处理，而不是在反面高尔基网复合物中被酶切处理(13)。有趣的是，内质网是细胞亚结构中zonulin浓度最高的(9)。
因为调控细胞间紧密连接是zonulin的一项重要的功能(7，9-11)，我们研究了重组触珠蛋白前体2(Pre-HP2)在肠通透性试验中的作用。在离体和体内试验中，Pre-HP2剂量依赖性地和时间依赖性地减少了鼠小肠黏膜的跨膜电阻。zonulin被酶切成两个alpga2和beta链后失去其膜穿孔力，这一现象进一步提示zonulin/pre-HP-2和成熟的双链触珠蛋白展现不同的生物活性。蛋白构相在触珠蛋白功能中的重要性进一步体现于，与zonulin有交叉反应的抗Zot抗体可以在变性的条件下识别HP1的alpha1链(图1A和2B)，但无法识别未变性的HP1。纵上所述，以上数据证实与zonulin是pre-HP2同一蛋白。
zonulin的氨基端的氨基酸序列与人类gamma球蛋白的轻链有惊人的相似之处(7)，而此相似性也存在与触珠蛋白中(26)。血红蛋白与触珠蛋白的复合物的清除是由单核/巨嗜细胞中的清道夫受体CD163介导的(25)。Clustal W树状图分析显示zonulin的beta链中的CD163结合位点前的一个区域有gamma球蛋白样共有基序QLVE---V---P.之前报道的zonulin序列与pre-HP2共有基序的差别可能源于种属间的差异性。
Zonulin含有生长因子样重复结构。与zonulin相似，生长因子影响细胞间紧密连接的完整(27，28)。此发明展示单链zonulin，而不是经酶切成熟的形式，通过PAR2反式激活EGFR，而其对于TEER的作用可以通过EGFR的药理抑制或siRNA诱导的TEER灭活来抑制。此现象提示单链zonulin中有生长因子样的基序，此基序有通过PAR2介导的反式激活诱发的紧密连接解聚所必须的分子构相，而成熟的双链HP2中无此活性基序。
麦胶蛋白，克罗恩氏病的环境诱因，据报道可以对细胞骨架肌动蛋白造成与EGF相似的作用(16)。这些作用与zonulin被报道的作用十分相似(7)。麦胶蛋白与化學介素受体CXCR3结合(29)，此结合整合于zonulin/pre-HP-2从肠细胞(9)及肠组织(10)的释放。因此，麦胶蛋白相关的EGF的作用有可能是通过zonulin释放介导的。肠道中细菌的繁殖也能刺激zonulin释放(8)。麦胶蛋白和微生物均造成极化的，肠上壁层的释放(8)。因此，研究主要集中于zonulin早期的作用，既其在肠上壁层的活性。此方法可能看起来违反直觉，因为EGFR和PAR2都是在基底膜层面表达的。然而，有证据显示它们在胞膜的上壁层也有表达(31)。因为被加至肠黏膜上壁层的zonulin在离体或体内均有膜穿孔作用，所以此现象与该蛋白对基底膜层有作用的可能并不矛盾。当环境诱因(如细菌，谷蛋白)存在于肠上壁时，zonulin从肠细胞中释放，此过程，至少在麦胶蛋白的例子中，是由CXCR3介导的(29)。伴随着zonulin的释放及紧接的肠通透性增加，这些诱导因子可以到达亚黏膜层，在此处表达zonulin的免疫细胞可以将zonulin递呈至基底膜层。据报道粒细胞蛋白酶II，也具有相似的基底膜作用，此丝氨酸蛋白酶可以从基底膜和胞膜上壁两层增加肠通透性(32)。
EGFR和PAR2对表皮细胞通透性的作用曾经被报道过(33，34)。然而，本发明提供了首例证据，证明这两个受体协同运作以调理肠道通透性。
有报道显示zonulin在克罗恩氏病的急性阶段有上调(9，10)。利用触珠蛋白特异性探针，本发明首次报道了zonulin mRNA在人肠道中的表达。另外，实时PCR试验显示zonulin在克罗恩氏病人中的表达高于正常人。zonulin表达的升高与疾病的严重度相关，因为规定饮食中不含有谷蛋白的克罗恩氏病人展现出的zonulin表达水平介于正常人与发作的克罗恩氏病人之间。有趣的是，Papp及其合作者最近报道了一种触珠蛋白基因的多态性，此基因多态性对于克罗恩氏病的发展和临床表现来说是一个新的基因危险因子(35)。
人类血浆中的触珠蛋白前体(Pre-HPs)的含量介于100至300毫克/100毫升，其中HP2-2的含量介于100至260毫克/100毫升(36)。大约8％的触珠蛋白以前体的形式被分泌(37)，这意味着在生理条件下人类血浆中的pre-HP2含量为80至208毫克/毫升。因此，本发明中使用的zonulin的浓度处于生理范围，并且很可能提示zonulin在病理过程中被上调所激活的信号通路。除克罗恩氏病外，zonulin的浓度的增高在其他自身免疫疾病中也有报道，包括一型糖尿病(11)，全身性红斑狼疮(38)，强直性脊椎炎(39)，这些发现进一步揭示了zonulin通路在自身免疫疾病病理中的重要性。这些发现，加上zonulin在许多免疫介导的疾病急性期的过量表达，以及zonulin的阻断抑制自身免疫疾病的发生的现象，提示zonulin在这些疾病的病理过程中起作用，并为免疫介导的疾病的病理生理学和治疗途径提供了新的选择。
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权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种治疗自身免疫性疾病的方法，其包括步骤：增加跨上皮电阻，导致细胞通透性的降低。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为小肠细胞或胃十二指肠细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞中连蛋白mRNA的表达有所减少。
4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括抑制表皮生长因子受体的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述表皮生长因子受体的抑制是通过给予针对单链连蛋白的抗体。
6.根据权利要求1所述的方法，进一步包括抑制蛋白酶活化受体2的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，给予针对单链连蛋白的抗体。
8.根据权利要求6所述的方法，其中使用siRNA抑制所述蛋白酶活化受体2。
9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括通过CXCR3受体结合来避免麦醇溶蛋白释放连蛋白的步骤。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自一型糖尿病、系统性红斑狼疮、乳糜泻、强直性脊椎炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、克罗恩氏病和精神分裂症。
11.一种在需要此类治疗的个体内治疗自身免疫性疾病的方法，包括步骤：
抑制表皮生长因子受体；以及
抑制蛋白酶活化受体2。
12.根据权利要求11所述的方法，其中增加跨上皮电阻导致细胞通透性的降低。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞为小肠细胞或胃十二指肠细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞中连蛋白mRNA表达有所减少。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述表皮生长因子受体的抑制是通过给予针对单链连蛋白的抗体。
16.根据权利要求11所述的方法，其中使用siRNA抑制所述蛋白酶活化受体2。
17.根据权利要求11所述的方法，进一步包括抑制麦醇溶蛋白的步骤。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自一型糖尿病、系统性红斑狼疮、乳糜泻、强直性脊椎炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、克罗恩氏病和精神分裂症。
19.一种在需要此类治疗的个体内治疗乳糜泻病的方法，包括步骤：
给予针对单链连蛋白的抗体，以抑制表皮生长因子受体和抑制蛋白酶活化受体2。
20.根据权利要求19所述的方法，其中增加跨上皮电阻导致细胞通透性的降低。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞为小肠细胞或胃十二指肠细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞中连蛋白mRNA的表达有所减少。
23.根据权利要求19所述的方法，其中使用siRNA进一步抑制所述蛋白酶活化受体2。
24.根据权利要求19所述的方法，进一步包括抑制麦醇溶蛋白的步骤。
25.一种用于诊断受试者体内与肠道通透性增加有关的疾病的方法，包括步骤：
从受试者中获取生物样品；
测定该生物样品中触珠蛋白前体或其糖型的表达水平；以及
将该样品中触珠蛋白前体或其糖型的表达水平与参照样品中的同一表达物的表达水平相比较；其中，触珠蛋白前体或其糖型相比于参照的高表达是自身免疫性疾病存在的指示物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中触珠蛋白前体的表达水平在mRNA水平上测定。
27.根据权利要求26所述的方法，其中触珠蛋白前体为触珠蛋白前体2，而测定其表达水平包括：
从样本中分离mRNA；以及
扩增并定量样本中的触珠蛋白前体2的mRNA。
28.根据权利要求25所述的方法，其中触珠蛋白前体及其糖型的表达水平在蛋白质水平上测定。
29.根据权利要求28所述的方法，其中测定触珠蛋白前体及其糖型表达水平包括：
使用针对触珠蛋白α链或β链或其糖型的抗体与样品接触；
使用特异于触珠蛋白前体或其触珠蛋白前体糖型的抗体与抗体结合的触珠蛋白链或抗体结合的其糖型接触；以及
检测并定量样品中的触珠蛋白前体或触珠蛋白前体糖型。
30.根据权利要求28所述的方法，其中测定触珠蛋白前体或其糖型的表达水平包括：
使用针对触珠蛋白前体或其糖型的多克隆或单克隆抗体与样品接触；以及
检测并定量样品中的触珠蛋白前体蛋白质或其糖型。
31.根据权利要求25所述的方法，其中与肠道通透性增加有关的疾病是过敏、炎症或自身免疫性疾病。
32.根据权利要求31所述的方法，其中自身免疫性疾病是一型糖尿病、系统性红斑狼疮、乳糜泻、强直性脊椎炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、克罗恩氏病或精神分裂症。
33.根据权利要求25所述的方法，其中样品为血清、尿、粪便、或组织活检。
34.根据权利要求25所述的方法，其中触珠蛋白前体为触珠蛋白前体2。
35.一种用于在受试者中诊断自身免疫性疾病的方法，包括步骤：
从受试者中获取生物样品；
扩增生物样品中的触珠蛋白前体2的mRNA；以及
定量扩增产物中的触珠蛋白前体2；其中，相比于参照的触珠蛋白前体2产物的增加是自身免疫性疾病存在的指示物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中自身免疫性疾病是一型糖尿病、系统性红斑狼疮、乳糜泻、强直性脊椎炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、克罗恩氏病或精神分裂症。
37.根据权利要求36所述的方法，其中自身免疫性疾病是乳糜泻。
38.根据权利要求35所述的方法，其中样品为血清、尿、粪便、或组织活检。
39.一种用于在受试者中诊断自身免疫性疾病的方法，其包括步骤：
从受试者中获取生物样品；
检测生物样品中的触珠蛋白前体2的蛋白质；以及
定量检测到的触珠蛋白前体2蛋白质；其中，该样品中相比于参照的触珠蛋白前体2水平增加是自身免疫性疾病存在的指示物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中检测步骤包括：
使用针对触珠蛋白α链或β链的抗体与生物样品接触；
使用特异于触珠蛋白前体2的抗体与抗体结合的触珠蛋白接触。
41.根据权利要求39所述的方法，其中检测步骤包括：
使用针对触珠蛋白前体2的抗体与生物样品接触。
42.根据权利要求39所述的方法，其中自身免疫性疾病是一型糖尿病、系统性红斑狼疮、乳糜泻、强直性脊椎炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、克罗恩氏病或精神分裂症。
43.根据权利要求42所述的方法，其中自身免疫性疾病是乳糜泻。
44.根据权利要求39所述的方法，其中样品为血清、血浆、尿、粪便、或组织活检。

Claims (24)

1.一种治疗自身免疫性疾病的方法，其包括步骤：增加跨上皮电阻，导致细胞通透性的降低。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为小肠细胞或胃十二指肠细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞中连蛋白mRNA的表达有所减少。
4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括抑制表皮生长因子受体的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述表皮生长因子受体的抑制是通过给予针对单链连蛋白的抗体。
6.根据权利要求1所述的方法，进一步包括抑制蛋白酶活化受体2的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，给予针对单链连蛋白的抗体。
8.根据权利要求6所述的方法，其中使用siRNA抑制所述蛋白酶活化受体2。
9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括通过CXCR3受体结合来避免麦醇溶蛋白释放连蛋白的步骤。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自一型糖尿病、系统性红斑狼疮、乳糜泻、强直性脊椎炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、克罗恩氏病和精神分裂症。
11.一种在需要此类治疗的个体内治疗自身免疫性疾病的方法，包括步骤：
抑制表皮生长因子受体；以及
抑制蛋白酶活化受体2。
12.根据权利要求11所述的方法，其中增加跨上皮电阻导致细胞通透性的降低。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞为小肠细胞或胃十二指肠细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞中连蛋白mRNA表达有所减少。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述表皮生长因子受体的抑制是通过给予针对单链连蛋白的抗体。
16.根据权利要求11所述的方法，其中使用siRNA抑制所述蛋白酶活化受体2。
17.根据权利要求11所述的方法，进一步包括抑制麦醇溶蛋白的步骤。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自一型糖尿病、系统性红斑狼疮、乳糜泻、强直性脊椎炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、克罗恩氏病和精神分裂症。
19.一种在需要此类治疗的个体内治疗乳糜泻病的方法，包括步骤：
给予针对单链连蛋白的抗体，以抑制表皮生长因子受体和抑制蛋白酶活化受体2。
20.根据权利要求19所述的方法，其中增加跨上皮电阻导致细胞通透性的降低。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞为小肠细胞或胃十二指肠细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞中连蛋白mRNA的表达有所减少。
23.根据权利要求19所述的方法，其中使用siRNA进一步抑制所述蛋白酶活化受体2。
24.根据权利要求19所述的方法，进一步包括抑制麦醇溶蛋白的步骤。
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Wielento et al. TLR2 activation by Porphyromonas gingivalis requires both PPAD activity and fimbriae
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