CN102453086B - 一种天然免疫调节蛋白trim38及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种天然免疫调节蛋白功能及其用途。本发明公开了TRIM38蛋白可以负向调节先天免疫信号通路。用于治疗由细菌或病毒成分引起个体异常反应导致的疾病的制剂的用途。该发明揭示了调节先天免疫信号通路的新靶点,有助于进一步阐明机体的先天免疫调节机制,并为免疫调节药物靶点的设计提供依据。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和免疫学领域,涉及基因表达调控领域,具体是涉及抑制人体干扰素β活化的基因,该基因的制备方法,含有该基因的表达载体,
其编码的蛋白及限定蛋白功能的衍生蛋白,以及所述蛋白制备预防和治疗与人体干扰素β相关的疾病,尤其炎症、自身免疫病和肿瘤的药物上的用途。
背景技术
天然免疫是宿主抵抗病毒感染的第一道防线,也是激活适应性免疫的基础,在宿主清除病毒的免疫反应中具有关键作用,因此成为当前免疫学研究的热点。天然免疫应答是通过模式识别受体识别病原体相关分子模式来启动的。其中维甲酸诱导基因I样受体(Retinoic acid-inducible gene-I like receptors,RLRs)是细胞内识别病毒RNA,诱导天然免疫反应的重要模式识别受体之一。RLRs主要存在于胞浆中,主要包括两个分子:维甲酸诱导基因I(Retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)和黑色素瘤分化相关基因5(Melanomadifferentiation-associated gene-5),它们与病毒RNA结合之后,构象发生改变,从而募集下游效应分子IFN-β启动子激活因子1(IFN-βpromoter stimulator 1,IPS-1),引起TBK1/IKKi的激活,进一步引起干扰素调控因子(Interferon transcription factor,IRF)3/7的磷酸化,最终诱导I型干扰素(Type I interferon,I-IFN)、促炎症细胞因子等一系列抗病毒因子的产生。有关RLRs触发的天然免疫应答反应和信号传导过程的调节机制尚不十分清楚,成为近几年研究热点。
TRIM(Tripartite motif protein)家族是一类存在于胞浆中的,含有保守结构域的蛋白质,目前已经发现70多个成员,它们参与细胞增殖、分化、致癌和程序性死亡等很多细胞活动。近年的研究表明,部分TRIM蛋白具有调节免疫信号通路和抗病毒功能,但是目前仅有几个TRIM蛋白的功能得到阐述。
本发明所说的TRIM38具有TRIM蛋白家族典型的结构域特征,主要在细胞质中表达。因此,本领域需要进一步阐明TRIM38在先天免疫信号调节中的功能,深入了解机体抗病毒的免疫机制,开发新的免疫调节药物。
本发明的目的是一种天然免疫调节相关蛋白及其用途。
发明内容
本发明对TRIM38进行了生物信息学分析,通过对其蛋白序列的分析和同源搜索,明确了TRIM38的结构特征及同其他TRIM蛋白成员的关系。分析了TRIM38在细胞中的定位及其结构域的功能。并且通过模式病毒来研究TRIM38与病毒间的关系。同时本发明证明TRIM38有典型的TRIM家族蛋白的结构特征,它能够增加细胞内泛素化,并催化自身泛素化,可能具有E3泛素连接酶功能。
TRIM38还可以抑制RIG-I诱导的IFNβ启动子的激活。通过免疫共沉淀发现TRIM38与RIG-I共存于同一复合物中,二者可以发生相互作用,同时TRIM38与RIG-I的相互作用抑制了其与下游效应分子IPS-1、TBK1的结合,从而抑制干扰素的产生。通过对TRIM38的保守结构域的突变分析,TRIM38的RING结构域对于其抑制干扰素信号通路是必需的。
发明效果
本发明的积极效果在于细胞内证明了TRIM38表达抑制了I型干扰素的活性。干扰TRIM38的表达,病毒感染后I型干扰素的活性明显增强。本发明揭示,TRIM38有望成为治疗免疫疾病的新靶点。
附图说明
图1SeV病毒感染后TRIM38 mRNA转录增加。用SeV病毒感染A549细胞,分别在感染后4h、8h、12h、24h、36h时收获细胞提取细胞总RNA,进行荧光定量PCR检测TRIM38的转录水平。
图2TRIM38在病毒感染后降解。SeV(A)和VSV(B)病毒分别感染A549细胞,6h、12h、24h、36h、48h后,收获细胞,进行Western blot检测。
图3TRIM38对于SeV刺激的IFNβ启动子活性的影响。将PCMV-Flag-TIRM38与PGL3-IFNβ-Luc共转染293T细胞,pRL-SV40作为内参同时转染。24小时后,使用SeV刺激16小时,然后收集细胞,使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测,图中显示值为萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的比值。Westernblotting检测转染质粒蛋白的表达,β-actin作为上样对照。
图4TRIM38下调可以促进IFNβmRNA的转录。(A)A549细胞中分别转染对照siRNA和TRIM38siRNA,72小时后收获细胞,Western Blot检测内源TRIM38蛋白的表达;(B)转染TRIM38 siRNA72小时后,感染SeV病毒,12小时后,提取细胞总RNA,进行荧光定量PCR检测IFNβ的转录水平。
图5TRIM38过表达可以促进病毒VSV的复制。293T细胞中过表达TRIM38后,感染VSV病毒,24小时后收获病毒上清,在BHK细胞中用噬斑实验检测病毒复制。
本发明更详细的实施方法可参见实施例,本实施例是用于解释、而不是以任何方式限制本发明。
实施例1、病毒感染后TRIM38转录水平的变化
SeV病毒(2HA units/mL)感染A549细胞,分别在感染后4h、8h、12h、24h、36h时收获细胞,提取细胞总RNA,经逆转录后进行荧光定量PCR,检测TRIM38的mRNA水平(见图1)。结果显示,SeV病毒感染后,TRIM38的mRNA转录水平上调。
SeV仙台病毒由本所赵振东教授提供;人肺癌细胞A549购自ATCC;
荧光定量PCR引物:
TRIM38
Forward:5′tttgagcaggagttgggc 3′
Reverse:5′gcttggaaacattgcacata 3′
GAPDH:
Forward:5’gaaggtgaaggtcggagtc 3’
Reverse:5’gaagatggtgatgggatttc 3’
荧光定量PCR方法检测目的基因的表达
(1)细胞总RNA提取:
弃掉培养皿中的培养基,加入1ml TRIzol,室温放置5min;加入200μl氯仿,剧烈振荡15s后室温放置3min,使其自然分相;4℃12,000rpm离心10min,将上清小心移至新的Eppendorf管(无RNAase)中,加入等体积的异丙醇,混匀后室温放置10min;4℃12,000rpm离心10min,小心弃上清;向RNA沉淀中加入1ml 75%乙醇(用RNase-free水配制),温和悬浮沉淀;4℃8,000rpm离心5min,小心弃上清,室温干燥沉淀;向沉淀中加入50μl RNase-free水,置于55℃10min,以充分溶解RNA,测定浓度,分装于-80℃保存备用。
(2)逆转录反应(RT)
按下列组份配制RT反应液:
反转录条件:37℃15min,85℃5s.
(3)荧光定量PCR
按下列组份配制PCR反应液:
PCR扩增程序:95℃10s;95℃5s,60℃30s+Plate Read,共49个循环;95℃,10s;熔解曲线65℃-95℃:0.5℃,5s递增。
(4)扩增过程及荧光信号检测、数据的存储和分析均由荧光定量PCR仪及自带软件完成。每个样品定量PCR的Ct值减去相应样品GAPDH的Ct,样品扩增的倍数变化的计算采用2ΔΔCt法。
实施例2、病毒感染后TRIM38蛋白水平的变化
仙台病毒SeV或水泡性口膜炎病毒VSV感染A549细胞6h、12h、24h、36h、48h后,收获细胞,经WesternBlot检测内源TRIM38的表达,我们发现随着病毒感染时间的增加,TRIM38的蛋白水平减少(见图2)。
VSV水泡性口膜炎病毒由中国药品生物制品检定所提供;兔抗TRIM38多克隆抗体(AV38787)、、小鼠抗-β-actin单克隆抗体(A5441)、购自Sigma公司。
VSV病毒的扩增
取水泡性口膜炎VSV病毒10μl与10%FBS的DMEM混合接种于80%-90%融合的293细胞,37℃5%CO2孵育,每日观察细胞病变。直至大部分293细胞病变后,收集病变细胞沉淀以及上清,冻融释放的病毒保存于-80℃备用。
SeV病毒的扩增
取9日龄SPF级鸡胚,用照蛋器照射,在鸡胚上画出气室、胚位和血管。酒精棉消毒蛋壳,1ml注射器取病毒液,沿气室边缘避开血管刺入尿囊腔,注射0.1-0.2ml病毒液,融化的蜡块滴一滴封针口。37℃培养鸡胚3日,然后将鸡胚置于4℃过夜,使血管收缩。次日,用酒精消毒气室蛋壳,镊子去除气室上方蛋壳,无菌镊子撕开壳膜,吸取尿囊液。每只鸡胚能收集4-6ml,无菌冻存管分装病毒。
病毒感染方法
取水泡性口膜炎VSV病毒或仙台病毒10μl与10%FBS的DMEM混合接种于80%-90%融合的293细胞,37℃5%CO2孵育。
Westernblot
(1)瞬时转染后48h,收获细胞,弃培养基,用冷PBS洗涤细胞2次,每106细胞加入100μl RIPA裂解液,轻轻混匀,冰浴裂解30min;4℃,12000g离心10min,收集上清,用BCA蛋白定量方法定量(参见说明书)细胞裂解液的蛋白浓度,调节各样品的蛋白浓度一致,加6×上样缓冲液制备成蛋白样品,100℃加热变性5min后置于-20℃保存。
(2)将蛋白样品用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,然后经2mA/cm2恒流将蛋白质转移至硝酸纤维素薄膜上;
(3)转膜完成后,将硝酸纤维素膜经5%脱脂牛奶/PBST(PBS 0.1%Tween20)室温封闭2h,加一抗稀释液4℃过夜,然后用1‰TweenPBST洗涤三次,加入抗鼠IgG Dy800二抗(5%脱脂奶以1∶10000稀释),室温下避光孵育40min;1‰Tween的PBST洗膜三次,每次10min;之后用Odyssey进行扫描鉴定。
实施例3、TRIM38抑制SeV病毒诱导激活的IFNβ
通过荧光素酶检测系统,将Flag-TRIM38与含有IFNβ启动子的荧光素酶报告质粒共转染293T细胞。24小时后,使用SeV病毒感染,感染16小时后检测荧光素酶活化情况,通过荧光素酶产生的变化检测发现TRIM38的表达可以抑制SeV刺激的IFNβ启动子的活化。
真核细胞的基因转染
PEI转染方法如下:将适量的293T细胞接种到24孔板中,次日细胞待长至50%~60%时即可转染。转染前换为无血清和无抗生素的培养液。转染质粒的剂量24孔板:200-1μg/孔。
转染液为:A液(无血清、无抗生素的Opti-MEM培养液150μl,加入200ng质粒,混匀),B液(无血清、无抗生素的Opti-MEM培养液150μl,加入PEI 0.2μl,混匀,室温放置5min);将A液和B液轻轻混匀即为转染液,室温放置20min,弃掉原来24孔板中的液体,将转染液覆盖培养细胞,37℃,5%CO2孵育4-6h;加入含10%胎牛血清的DMEM培养液,37℃,5%CO2继续孵育。
报告基因转录活性检测
将生长良好的293T细胞传代于24孔板(3×105/孔)中,次日当细胞密度至50-60%时,用PEI转染IFN-β报告基因质粒,与SV40-海肾荧光素酶质粒,以及TRIM38等真核表达质粒(对照组用空载体质粒代替),转染的质粒总量相等(不足的用空载体质粒补足)。转染前为换无血清和无抗生素的培养液。转染液为:A液(无血清、无抗生素的Opti-MEM培养液150μl,加入适量质粒,混匀),B液(无血清、无抗生素的Opti-MEM培养液150μl,加入与质粒等比例的PEI,混匀,室温放置5min);将A液和B液轻轻混匀即为转染液,室温放置20min,弃掉原来24孔板中液体,将转染液覆盖培养细胞,37℃,5%CO2孵育4-6h;加入含10%胎牛血清的DMEM培养液,37℃,5%CO2继续孵育。
转染后24-36h,收取细胞。弃细胞培养液,加入1×被动裂解液(Promega,150μl/孔),室温放置30min,放置-80℃冻融一次,然后按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书,吸取20-30μl/孔的细胞裂解液放入白底不透明的96孔检测板中,加入20-30μl/孔LARII,在微孔板检测系统仪器上进行萤火虫荧光素酶活性检测,然后加入20-30μl/孔Stop&Glo试剂,检测海肾荧光素酶活性。为去除转染效率的影响,所得数据为萤火虫荧光素酶活性值除以海肾荧光素酶活性值。所测报告基因的活化情况用相对于对照组的倍数来表示。剩余的全细胞裂解液,用于Western Blot检测蛋白表达。
实施例4、TRIM38表达下调促进了内源IFNβmRNA的转录
A549细胞转染TRIM38 siRNA72小时后,使用SeV感染,感染24小时后通过荧光定量PCR检测细胞内IFNβmRNA的水平,结果发现转染TRIM38 siRNA后细胞内IFNβmRNA量增加。Western Blot检测TRIM38的蛋白表达,结果表明转染TRIM38 siRNA后,细胞中TRIM38蛋白的表达明显下降(图4)。说明TRIM蛋白表达降低后可以使得SeV刺激的IFNβ产生增加。
siRNA干扰TRIM38
TRIM38的siRNA(small interference RNA,siRNA),四个靶序列(吉玛公司合成),分别为:
TRIM38-1:5’-GCGAAUAACUAAAUGGAAA-3’
TRIM38-2:5’-AGAAAUUGCUGCAGAAUGU-3’
TRIM38-3:5’-CAACUUGAAGACAGAUGUA-3’
TRIM38-4:5’-AGAUACAGCUCAUCACGAA-3’
siRNA的转染如下:干扰前一天将细胞铺板,采用siRNA转染试剂DharmaconFECT转染siRNA,方法参考产品说明书。将siRNA配成20μM的母液-20℃储存备用,工作母液为2μM。以96孔板为例,转染液A:取7.5μl Opti-MEM加入siRNA工作母液2.5μl混匀;转染液B:另取10μl Opti-MEM加入0.2μlDharmaconFECT混匀,静置5min。将A液加入B液中,轻轻混匀,室温孵育20min。然后在上述20μl混合物中加入80μl无PS的含有10%胎牛血清的DMEM,即为转染液,弃掉96孔板中细胞培养基,加入上述转染液。24小时后,换液。继续培养48小时。然后感染病毒,合适的时间收获细胞,作Western印迹或RT-PCR分析。
实施例5、TRIM38过表达可以促进病毒VSV的复制
表达TRIM38的载体和空载体分别转染293T细胞,转染24小时后,感染VSV病毒(MOI=0.01),感染24小时后,分别收取细胞培养上清即病毒上清。将收获的病毒上清按10倍梯度在离心管中逐级稀释(10-1-10-8),用BHK细胞进行噬斑实验,检测上清中病毒的滴度。如图4,我们可以看到,TRIM38表达后,可以促进病毒VSV的复制,空斑个数大约是空载体对照组的两倍。因此TRIM38过表达后,抑制了I型干扰素的生成,从而促进了病毒VSV的复制。
噬斑实验
(1)前一天将BHK细胞以1.2-1.5×105个细胞传代于24孔板中,置于CO2孵箱培养过夜,使细胞长成单层(铺满80%以上);
(2)用PBS洗涤24孔板内的BHK细胞3次,吸净孔内的液体;
(3)取出-80℃冻存的VSV病毒液,融化后,在1.5ml离心管中加入适量无血清无抗生素DMEM培养液。按照10倍梯度在离心管中逐级稀释病毒液(10-1-10-8)。
(4)将不同稀释度的病毒液加入24孔板,每个稀释度3个平行孔,每孔300ul,留一个孔做正常细胞对照,置于37度孵箱孵育两个小时;
(5)弃掉病毒液,将24孔板用PBS洗3次,尽量去除残余的液体;
(6)在水浴锅中75℃加热融化2%低熔点琼脂糖(超纯水配制)。待其冷却到50℃左右时,与37℃预热的无酚红DMEM培养液以1∶1比例混合(DMEM中含有2%胎牛血清),混匀后迅速加到24孔板中,每孔500ul。
(7)将24孔板在室温孵箱放置半小时,待琼脂糖凝固后再将24孔板翻转过来倒置培养,每天在显微镜下观察细胞病变情况。培养第2-3天时,将24孔板从孵箱中取出,加入2ml 4%多聚甲醛,固定过夜使之充分渗透过覆盖层。固定时间24h以上,无上限;
(8)剔除覆盖层,用PBS轻柔的冲洗平板边缘残留的琼脂;用0.1%的结晶紫染色,对着光线计数空斑数。
除非另有定义,本文中应用的全部技术和科学术语均具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的意义。尽管与本文所述那些类似或等同的方法和技术可用于实施或测试本发明,但下文将描述恰当的方法和材料。所有的出版物、专利申请、专利和本文提到的其他参考文献的全部内容均结合于此供参考。如果出现矛盾,将以本说明书包括的定义为准。此外,所述材料、方法和实例仅仅是示例性的而非为了限制的目的。
如本文中使用的,术语“下调”的意思是,基因的表达或者RNA、或编码一种或多种蛋白的等效RNA的水平、或者一种或多种蛋白的活性,降至不存在本发明核酸分子时观察到的水平以下。
“上调”的意思是,基因的表达或者RNA、或编码一种或多种蛋白亚单位的等效RNA的水平、或者一种或多种蛋白亚单位的活性,高于不存在本发明核酸分子时观察到的水平。
“调节”的意思是,基因表达、RNA或编码一种或多种蛋白的等效RNA的水平、或者一种或多种蛋白的活性,被上调或下调,从而使得该表达、水平或活性高于或低于不存在本发明核酸分子时观察到的水平。
Claims (1)
1.蛋白TRIM38用于制备抑制I型干扰素反应的药物中的应用。
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Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Benyamin,B.et al.,.GenBank:ACCESSION:NP_006346.《GenBank》.2009, * |
TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity;Keiko Ozato et al.,;《NATURE REVIEWS》;20081130;第8卷;849-860 * |
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