CN102435599B - 一种预测抗生素类污染物联合慢性毒性的方法 - Google Patents
一种预测抗生素类污染物联合慢性毒性的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种预测抗生素类污染物联合慢性毒性的方法,其包括以下步骤:(1)获取抗生素理化参数;(2)获取受体蛋白及构建其同源模型,测定抗生素与受体蛋白的相互结合能;(3)测定抗生素联合毒性;(4)以抗生素理化参数、抗生素与受体蛋白的相互结合能和抗生素联合毒性为基础,建立慢性联合毒性预测模型;(5)应用步骤(4)得到的模型预测抗生素联合毒性。本发明的适用范围广,无需复杂的检测设备,不造成试验和环境污染,准确地预测抗生素类复合污染物毒性,根据污染物间的相互作用,为实施抗生素类污染物的排放、生态风险评价提供科学依据。
Description
技术领域
本发明属于环境污染检测技术领域,涉及一种分子模拟预测抗生素污染物联合毒性的方法。
背景技术
在环境中的污染物都是以混合形式存在的,而非单一污染;因此预测联合毒性有重大的意义及价值。
抗生素作为一种新型污染物,研究表明它具有以下特性:1)环境中抗生素的持续排放导致抗生素具有拟持久性污染物的特性。2)长期暴露在抗生素的环境中容易导致生物体产生耐药性,直接危害人类健康。3)抗生素对于环境中的其它有益生物具有毒害效应。研究表明,抗生素的存在导致污水处理微生物对污染物的降解能力大幅度下降。因此针对抗生素的环境特征开展生态毒理研究,对于我国抗生素污染治理和修复具有非常重要的科学意义和实践价值。
现阶段,人们主要围绕以下几个方面开展抗生素的生态毒理研究。
(1)单一毒性根据环境中的主要残留类型,研究人员对受体生物的敏感性进行了研究,认为藻是评价抗生素环境毒性的最敏感生物,而发光菌是经典便捷的受体生物。
(2)联合毒性抗生素在医疗中普遍存在的联合使用导致污染区域中多种抗生素同时被检测到成为常态。由于污染物组份间的相互作用,仅凭单一污染物的毒性数据往往会低估了混合物的真实环境毒性。如Quinn等测定了抗生素复合污染对水螅(Hydra attenuata)的联合毒性,结果表明该复合物毒性提高了2-3个数量级。
但是,现行方法的缺点有以下几种:1)联合毒性数据缺乏,导致毒性评价过程中忽视污染物间的联合效应;2)慢性毒性数据缺乏,导致毒性评价过程中忽视慢性效应;3)慢性毒性方法有费时费力等缺陷,需要投入大量人力物力。
自从二十世纪量子力学(quantum mechanics)的快速发展后,几乎分子的一切性质,如结构(structure),构象(conformation),偶极矩(dipole moment),游离能(ionization potential),电子亲和力(electron affinity),电子密度(electron density)...等,可经由量子力学计算获得。计算与实验的结果往往相当吻合,并且可经由分析计算的结果得到一些实验无法获得的资料。与实验相较,利用计算机计算研究化学有下列几项优点:1、降低成本,2、增加安全性,3、可研究极快速的反应或变化,4、得到较佳的准确度,5、增进对问题的了解。基于这些原因,分子的量子力学计算自1970年后乃逐渐受到重视。利用计算先行了解分子的特性,已成为合成化学家和药物设计家所依赖的重要方法。藉此可设计出最佳的反应途径,预测合成的可能性,并评估所欲合成分子的适用性,节省许多时间和材料的浪费。根据美国化学会数据库(ACSdatabase)的统计,计算机计算在化学报告的百分比重逐年增加。今日化学的各个领域都将计算视为不可缺的工具,而且,计算效果正随着方法的改良与计算机的发展,快速的提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种预测抗生素类污染物联合毒性的方法,建立利用同源建模对发光菌联合慢性毒性进行测定的方法,可为我国抗生素类污染物的环境危险性评价相关理论与方法的发展与应用提供科学依据。
为实现上述目的,本发明的技术方案如下:
一种预测抗生素类污染物联合慢性毒性的方法,其包括以下步骤:
(1)获取抗生素理化参数;
(2)获取受体蛋白及构建其同源模型,测定抗生素与受体蛋白的相互结合能;;
(3)测定抗生素联合毒性;
(4)以抗生素理化参数、抗生素与受体蛋白的相互结合能和抗生素联合毒性为基础,建立慢性联合毒性预测模型;
(5)应用步骤(4)得到的模型预测抗生素联合毒性。
所述抗生素的理化参数,包括最高占有轨道能、解离常数(pKa)、极化率、偶极矩、分子体积、吉布斯自由能、分子最高-低轨道占有能差(Eh-l)。
所述获取抗生素的理化参数,具体包括以下步骤:
1、采用程序Chemoffice获取小分子结构及其分子坐标,用B3LYP/3-21G基组构建好Gaussian计算文件;
2、采用Gaussian计算上述计算文件;
3、从计算结果中获取理化参数:最高占有轨道能、解离常数(pKa)、极化率、偶极矩、分子体积、吉布斯自由能、分子最高-低轨道占有能差(Eh-l)。
所述获取受体蛋白及构建其同源模型,具体包括以下步骤:
1、获取受体蛋白的基因序列;
2、获取大肠杆菌中该受体蛋白的晶体结构;
3、将步骤2中的晶体结构与受体蛋白的基因序列作序列对比,获取两者的相似度和一致性;
4、根据步骤3中两者的相似度和一致性,建立同源模型;
5、基于拉氏图结果选定该同源模型中的不匹配区域,对所建同源模型进行优化,直至评价分数不再有变化。
所述受体蛋白所在的受试生物为明亮发光杆菌。
所述测定抗生素与受体蛋白的相互结合能,具体包括以下步骤:
1、对所建同源模型加Charm力场;
2、选择构建同源模型的受体蛋白为受体,根据大肠杆菌中的相应配体结合位置选定结合区域;
3、进行抗生素与受体蛋白的对接;
4、对接结束后,获取抗生素与受体蛋白的相互结合能。
所述测定抗生素联合毒性,具体包括以下步骤:
1、菌种活化 将明亮发光杆菌的冻干粉溶解,接种到斜面上传代3次后获得稳定发光性能的菌株备用;
2、菌种的培养 将传代好的菌种用接种环接种到液体培养基,20℃,180rpm培养12h,液体培养基配方:胰蛋白胨0.5g,酵母膏0.5g,甘油0.3g,KH2PO40.1g,Na2HPO40.5g,NaCl3g,琼脂2g,pH 7.0,水100mL;
3、高倍液体培养基的配制 由于毒性测试时间比较长(24h),测试样需加入适量培养基以保持发光菌正常生长所需营养,因此需提前配制高倍液体培养基以备加样时使用。高倍液体培养基配方:胰蛋白胨0.5g,酵母膏0.5g,甘油0.3g,KH2PO40.1g,Na2HPO40.5g,NaCl3g,琼脂2g,pH 7.0,水40mL;
4、菌液的平衡 移取适量菌液(以光值为控制指标来添加)到20mL3%NaCl溶液中,控制光值测定范围在20万左右,20℃条件下搅拌40min;
5、加样及发光强度检测 首先用连续进样器分别将400μL高倍液体培养基加入含400μL3%NaCl的空白组中、含400μL 3%NaCl的梯度污染液中,加样后立即在旋涡混匀器上混匀2min;然后用连续进样器将搅拌了40min的菌液200μL加入上述混合液,保持统一的1mL毒性测试体系,加样后立即在旋涡混匀器上混匀2min;20℃条件下,静置24h后将样品管置入荧光检测器中测定发光强度;
6、计算发光细菌的发光强度抑制率
抑制率(%)=100%×(对照抑制率-样品抑制率)/对照抑制率,其中,对照抑制率指的是样品前后的空白平均抑制率;
用发光细菌的发光强度抑制率为50%的受试化合物浓度的负对数来表征其毒性效应,即抗生素联合毒性-log(EC50),将计算的抑制率与受试化合物的浓度进行回归分析,根据所得回归方程可求出相应的EC值。
所述建立慢性联合毒性预测模型,以抗生素联合毒性-log(EC50)为因变量,以抗生素理化参数和抗生素与受体蛋白的互相结合能为自变量,建立线性相关方程,且以判定系数R2、组方差值F及概率P为评价标准评价预测的慢性联合毒性准确性。
目前,对于抗生素类污染物的污染控制所需的毒性数据全部需要实验测定。在本发明中,利用分子模拟得出抗生素与受体蛋白的结合能,将其运用于抗生素联合毒性的预测。与传统的毒性数据测定方法相比本发明具有如下优点:
1、根据已有的化学物结构和已有的受体(蛋白)信息,预测化学物质的毒理学性质,具有预测通量大、投入少、成本低、效率高等优点。
2、适用范围广,无需复杂的检测设备,不造成试验和环境污染。
3、可以弥补有机物环境行为与生态毒理数据的缺失,大幅度降低实验费用,有助于减少和替代实验及评价实验数据的不确定性。
4、准确地预测抗生素类复合污染物毒性,根据污染物间的相互作用,为实施抗生素类污染物的排放、生态风险评价提供科学依据。
附图说明
图1为本发明方法的流程图。
图2为空白及抗生素样品设置示意图。
图3为本发明的具体方法流程图。
具体实施方式
如图1所示,一种预测抗生素类污染物联合慢性毒性的方法,其包括以下步骤:
(1)获取抗生素理化参数;
(2)获取受体蛋白及构建其同源模型,测定抗生素与受体蛋白的相互结合能;
(3)测定抗生素联合毒性;
(4)以抗生素理化参数、抗生素与受体蛋白的相互结合能和抗生素联合毒性为基础,建立慢性联合毒性预测模型;
(5)应用步骤(4)得到的模型预测抗生素联合毒性。
具体步骤如下:
(1)获取抗生素的理化参数
1、采用程序Chemoffice获取小分子结构及其分子坐标,用B3LYP/3-21G基组构建好Gaussian计算文件;
2、采用Gaussian计算上述计算文件;
3、从计算结果中获取理化参数:最高占有轨道能、解离常数(pKa)、极化率、偶极矩、分子体积、吉布斯自由能、分子最高-低轨道占有能差(Eh-l)等;
(2)受体蛋白的获取及模型构建
本发明中,受试生物是明亮发光杆菌(Photobacteriumphosphoreum)。在目前已有的蛋白结构中,虽然其基因序列大多已经清楚,但该菌种的相关蛋白数据非常少。另一方面,大肠杆菌的基因序列也非常明确且相关蛋白数据较丰富。因此,受体蛋白的获取方式为与大肠杆菌相关蛋白为模板的同源建模(Homology models)方式。具体操作步骤为:
1、获取发光菌中该蛋白的基因序列,如可采用将该蛋白的名称输入uniprot数据库(http://www.uniprot.org),从而获得该蛋白的基因序列。
2、从PDB蛋白数据库(http://www.pdb.org)获取大肠杆菌中该受体蛋白的晶体结构。
3、将步骤2中的晶体结构与试验发光菌中该蛋白的基因序列作序列对比,获取两者的相似度和一致性,两者的序列对比可通过程序Discovery studio(DS)实现。
4、根据两者的相似度和一致性,利用DS中的“Build Homology models”程序建立同源模型。
5、基于拉氏图结果选定该模型中的不匹配区域,对所建模型进行优化;根据Fiser等人研究,判定标准为评价分数(Verify Scores)不再有变化。
(3)计算抗生素与受体蛋白的相互结合能
1、对所建同源模型加Charm力场(由Field等开发一种可以描述分子能量和分子结构之间关系的函数,参见参考文献2),来分析生物大分子间的相互作用;
2、选择同源建模的受体蛋白(发光菌)为受体(receptor),根据大肠杆菌中的相应配体结合位置选定结合区域(Binding sphere);
3、采用Discovery Studio中“CDOCKER”程序开展抗生素与受体蛋白的对接(默认参数);
4、对接结束后,产生相应的报告显示抗生素与受体蛋白的相互结合能(interaction energy)。
(4)抗生素联合毒性的测定
1、菌种活化 将购自南京土壤所的明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)的冻干粉溶解,接种到斜面上传代3次后获得稳定发光性能的菌株备用。
2、菌种的培养 将传代好的菌种用接种环接种到液体培养基,20℃,180rpm培养12h。液体培养基配方:胰蛋白胨0.5g,酵母膏0.5g,甘油0.3g,KH2PO40.1g,Na2HPO40.5g,NaCl3g,琼脂2g,pH 7.0,水100mL。
3、高倍液体培养基的配制 高倍液体培养基配方:胰蛋白胨0.5g,酵母膏0.5g,甘油0.3g,KH2PO40.1g,Na2HPO40.5g,NaCl 3g,琼脂2g,pH 7.0,水40mL;
4、菌液的平衡 移取适量菌液(以光值为控制指标来添加)到20mL3%NaCl溶液中,控制光值测定范围在20万左右,20℃条件下搅拌40min。
5、加样及发光强度检测 首先用连续进样器分别将400μL高倍液体培养基加入含400μL3%NaCl的空白组中、含400μL 3%NaCl的梯度污染液中作为受试化合物,加样后在旋涡混匀器上混匀2min;然后用连续进样器将搅拌了40min的菌液200μL加入上述混合液,保持统一的1mL毒性测试体系。加样后立即在旋涡混匀器上混匀2min。20℃条件下,静置24h后将样品管置入荧光检测器中测定发光强度。
6、测试样品设置及发光强度抑制率的计算
所以,对于浓度C1,其对发光菌的平均
通常用发光细菌的发光强度抑制率为50%的受试化合物浓度的负对数来表征其毒性效应(-log(EC50)),将计算的抑制率与受试化合物的浓度进行回归分析,根据所得回归方程可求出相应的EC值(effective concentration,有效浓度)。
(5)抗生素联合毒性的预测
获取抗生素联合毒性数据(-log(EC50))后,将其与结合能数据及理化常数一起输入到SPSS软件(SPSS13.0,SPSS lnc.)中以便回归分析。以抗生素联合毒性数据为因变量,以理化参数和结合能数据为自变量,利用程序“stepwise”建立线性相关方程。方程评价以判定系数R2、组方差值F及概率P为评价标准以评价预测的联合毒性准确性。
具体实验:
所用仪器:生化培养箱、摇床、旋涡振荡器、空调。
所用菌种:明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)冻干粉,购自中科院南京土壤所。
液体培养基配方:胰蛋白胨0.5%,酵母膏0.5%,甘油0.3%,KH2PO40.1%,Na2HPO40.5%,NaCl 3%,琼脂2%,pH7.0。
分子模拟软件及计算体系:SPSS13.0、Gaussian09W、Discovery studio 2.5.5、Chemoffice2010;上述程序在Pentium XX服务器(6核,4G内存)上运行;
实施例1:磺胺类抗生素及甲氧苄氨嘧啶的联合毒性预测
(1)理化参数的获取
按步骤(1),获取了磺胺类抗生素及甲氧苄氨嘧啶(TMP)的理化参数,结果如表1所示。
表1 所试抗生素理化参数
(2)受体蛋白的获取及构建
将大肠杆菌相关蛋白的晶体结构与发光菌蛋白基因序列做序列比对,基于生成的序列比对文件,分别构建了磺胺类抗生素的受体蛋白叶酸二氢合成酶(DHPS)和TMP的受体蛋白叶酸二氢还原酶(DHFR)的模型,模型评价结果如表2所示。
表2 建立的同源模型评价结果
(3)抗生素与受体蛋白相互作用(kcal/mol)的计算
将获取的DHPS和DHFR模型,分别利用磺胺类抗生素、TMP与之对接,表3所示为抗生素与受体蛋白相互结合能。
表3 抗生素与受体蛋白结合能
(4)抗生素联合毒性的测定
测定磺胺类-TMP二元复合物联合慢性毒性,结果如表4所示。
表4 磺胺-TMP二元复合体系联合毒性
(5)抗生素联合毒性的预测
n=7,R2=0.965,SE=0.107,F=27.552,P=0.011
磺胺类-TMP二元复合物联合慢性毒性的预测值与实测值,结果如表5所示。
表5 预测毒性与实测毒性比较
实施例2:磺胺类抗生素(3#Sulfamonomethoxine)与其它磺胺类抗生素的二元复合体系联合毒性的预测
(1)理化参数的获取
(2)受体蛋白的获取及构建
(3)抗生素与受体蛋白相互作用(kcal/mol)的计算,以上全部采用实施例1中的所有数据;
(4)磺胺类抗生素二元复合体系联合毒性的测定
测定磺胺类抗生素二元复合体系联合毒性,结果如表6所示。
表6 磺胺二元复合体系联合毒性
(5)抗生素联合毒性的预测
n=7,R2=0.956,SE=0.044,F=44.87。
磺胺类抗生素二元复合物联合毒性的预测值与实测值,结果如表7所示。
表7 预测毒性与实测毒性比较1
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于这里的实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
参考文献
Fiser A,Sali A.(2003).Methods Enz.374:461-9.Modeller:generation and refinement ofhomology-based protein structure models.
Field,M.J.,Bash,P.A.,Karplus,M.(1990).JComput Chem 11.11:700-733.A combinedquantum mechanical and molecular mechanical potential for molecular dynamics simulations.
Claims (2)
1.一种预测抗生素类污染物联合慢性毒性的方法,其特征在于:其包括以下步骤:
(1)获取抗生素理化参数;具体包括以下步骤:
1、采用程序Chemoffice获取小分子结构及其分子坐标,用B3LYP/3-21G基组构建好Gaussian计算文件;
2、采用Gaussian计算上述计算文件;
3、从计算结果中获取理化参数:最高占有轨道能、解离常数pKa、极化率、偶极矩、分子体积、吉布斯自由能和分子最高-低轨道占有能差Eh-l;
(2)获取受体蛋白及构建其同源模型,测定抗生素与受体蛋白的相互结合能;
其中获取受体蛋白及构建其同源模型,具体包括以下步骤:
1、获取受体蛋白的基因序列;
2、获取大肠杆菌中该受体蛋白的晶体结构;
3、将步骤2中的晶体结构与受体蛋白的基因序列作序列对比,获取两者的相似度和一致性;
4、根据步骤3中两者的相似度和一致性,建立同源模型;
5、基于拉氏图结果选定该同源模型中的不匹配区域,对所建同源模型进行优化,直至评价分数不再有变化;
其中,测定抗生素与受体蛋白的相互结合能,具体包括以下步骤:
1、对所建同源模型加Charm力场;
2、选择构建同源模型的受体蛋白为受体,根据大肠杆菌中的相应配体结合位置选定结合区域;
3、进行抗生素与受体蛋白的对接;
4、对接结束后,获取抗生素与受体蛋白的相互结合能;
(3)测定抗生素联合毒性;具体包括以下步骤:
1、菌种活化 将明亮发光杆菌的冻干粉溶解,接种到斜面上传代3次后获得稳定发光性能的菌株备用;
2、菌种的培养 将传代好的菌种用接种环接种到液体培养基,20℃,180rpm培养12h,液体培养基配方:胰蛋白胨0.5g,酵母膏0.5g,甘油0.3g,KH2PO40.1g,Na2HPO40.5g,NaCl3g,琼脂2g,液体培养基的pH为7.0,水100mL;
3、高倍液体培养基的配制高倍液体培养基配方:胰蛋白胨0.5g,酵母膏0.5g,甘油0.3g,KH2PO40.1g,Na2HPO40.5g,NaCl3g,琼脂2g,高倍液体培养基的pH为7.0,水40mL;
4、菌液的平衡 移取适量菌液以光值为控制指标来添加到20mL3%NaCl溶液中,控制光值测定范围在20万左右,20℃条件下搅拌40min;
5、加样及发光强度检测 首先用连续进样器分别将400μL高倍液体培养基加入含400μL3%NaCl的空白组中、含400μL3%NaCl的梯度污染液中,加样后立即在旋涡混匀器上混匀2min;然后用连续进样器加入搅拌了40min的菌液200μL,保持统一的1mL毒性测试体系,加样后立即在旋涡混匀器上混匀2min;20℃条件下,静置24h后将样品管置入荧光检测器中测定发光强度;
6、计算发光细菌的发光强度抑制率
抑制率(%)=100%×(对照抑制率-样品抑制率)/对照抑制率,其中,对照抑制率指的是样品前后的空白平均抑制率;
用发光细菌的发光强度抑制率为50%的受试化合物浓度的负对数来表征其毒性效应,即抗生素联合毒性-log(EC50),将计算的抑制率与受试化合物的浓度进行回归分析,根据所得回归方程可求出相应的EC值;
(4)以抗生素理化参数、抗生素与受体蛋白的相互结合能和抗生素联合毒性为基础,建立慢性联合毒性预测模型;
(5)应用步骤(4)得到的模型预测抗生素联合毒性。
2.如权利要求1所述的预测抗生素类污染物联合慢性毒性的方法,其特征在于:所述建立慢性联合毒性预测模型,以抗生素联合毒性-log(EC50)为因变量,以抗生素理化参数和抗生素与受体蛋白的互相结合能为自变量,建立线性相关方程,且以判定系数R2、组方差值F及概率P为评价标准评价预测的慢性联合毒性准确性。
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Legal Events
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