CN102428182A - 蛋白质功能体外分子进化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供自父本多核苷酸序列生成多核苷酸序列或序列集群的方法，该方法包括步骤(a)提供父本多核苷酸分子集群，该集群包括正链和负链，(b)处理父本多核苷酸分子集群以生成其多核苷酸片段集群，(c)在允许重叠片段对形成的条件下孵育多核苷酸片段集群，及(d)使用多聚酶扩增重叠片段对以生成一个或多个与父本多核苷酸分子序列不同的产物多核苷酸分子，其中在有利于引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子的条件下完成，至少部分，步骤(d)。

Description

蛋白质功能体外分子进化的方法

技术领域

本发明涉及蛋白质功能体外分子进化的方法。

背景技术

蛋白质功能可以通过多种方法进行体外修饰和改善，包括定点突变(Alber等，Nature，5；330(6143)：41-46，1987)、组合克隆(Huse等，Science，246：1275-1281，1989；Marks等，Biotechnology，10：779-783，1992)及与合适的选择系统相结合的随机突变(Barbas等，PNAS.USA，89：4457-4461，1992)。

连同选择的随机突变的方法已被用于若干案例以改善蛋白质功能，并且存在两种不同策略。第一，整个基因序列的随机化与具有所需特征的变体(突变)蛋白质的选择相结合，其后是新一轮的随机突变和选择。然后可以重复此方法直至发现被认为是最佳的蛋白质变体(Schier R.等，J.Mol.Biol.1996 263(4)：551-567)。这里，引入突变的传统方法是通过具有约0.7％突变率的易错PCR(聚合酶链式反应)(Leung等，Technique，1：11-15，1989)。第二，基因的限定区域可以用简并引物突变，简并引物使得突变率达到100％(Griffiths等，EMBO.J，13：3245-3260，1994；Yang等，J.Mol.Biol.254：392-403，1995)。

随机突变已被广泛用于抗体工程领域。体内形成的抗体基因可以被体外克隆(Larrick等，Biochem.Biophys.Res.Commun.160：1250-1256，1989)并且编码可变重链和轻链基因的基因的随机组合要经受选择(Marks等，Biotechnology，10：779-783，1992)。通过这些方法选择的功能性抗体片段可以用随机突变和另外轮次的选择来进一步改善(Schier R.等，J.Mol.Biol.1996 263(4)：551-567)。

通常，随机突变的策略后面是选择。可以选择带有感兴趣的特征的变体，并且每个具有感兴趣特征的来自不同变体的突变DNA区域可合并为一条编码序列(Yang等，J.Mol.Biol.254：392-403，1995)。

基因的组合配对也已被用于改善蛋白质功能，例如抗体亲和性(Marks等，Biotechnology，10：779-783，1992)。

另一个已知的用于蛋白质功能体外突变的过程，其通常被称为“DNA重排”，利用DNA随机片段化和组装片段成功能性的编码序列(Stemmer，Nature 370：389-391，1994)。DNA重排过程通过重组生成多样性，结合来自个别基因的有用突变。它已被成功用于不同蛋白质(如酶和细胞因子)的人工进化(Chang等Nature Biotech.17，793-797，1999；Zhang等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，4504-4509，1997；Christians等Nature Biotech.17，259-264，1999)。基因用DNA酶I随机片段化，并随后通过互相重组来再组装。起始材料可以是(首先用易错PCR随机突变的)单一基因，或者是(所谓的家族重排)自然产生的同源序列。

DNA酶I优选在邻近嘧啶核苷酸的位点水解DNA，因而它是用于DNA随机片段化的合适的选择。然而，活性依赖于镁或锰离子，镁离子限制片段长度为50bp(碱基对)，而锰离子会产生小于50bp的片段长度。因此，为了取得用于重组的所有可能的大小，待讨论的基因需要在两种不同离子的一种存在时用DNA酶I至少处理两次，随后去除这些完全相同的离子。

尽管理论上可以在任意克隆间重排DNA，如果所得的重排基因在关于表达和活性上有功能，待重排的克隆优先关联于或甚至等同于异常低水平随机突变。在基因不同的克隆间的DNA重排通常会产生非功能性基因。

本发明寻求提供用于体外蛋白质进化的改进的方法。特别是发明目的在于提供在重组过程中使得变异程度得到“微调”的方法。在第一轮重组期间创造出相对低数目的所需突变的时候，此方法将是特别有用的。

因而方法寻求在体外蛋白质进化的改进过程中能够显著地节省时间。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供自父本多核苷酸序列生成多核苷酸序列或序列集群的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供父本多核苷酸分子集群，该集群包括正链和负链；

(b)处理父本多核苷酸分子集群以生成其多核苷酸片段集群；

(c)在允许重叠片段对形成的条件下孵育多核苷酸片段集群；及

(d)用多聚酶扩增重叠片段对以生成一个或多个与父本多核苷酸分子序列不同的产物多核苷酸分子

其中步骤(d)(至少部分)在有利于引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子中的条件下完成。

步骤(a)包括提供父本多核苷酸分子集群，该集群包括正链和负链。

在本发明方法的优选实施方案中，父本多核苷酸分子编码一个或多个蛋白质基序。

父本多核苷酸分子可以是核酸(如DNA、cDNA或RNA)或核酸衍生物(如PNA(肽核酸)、GNA(甘油核酸)或TNA(苏糖核酸))。然而，在本发明方法的另一个实施方案中父本多核苷酸分子优选是cDNA分子。

在一实施方案中，父本多核苷酸分子是双链的。然而，在本发明方法的优选实施方案中，父本多核苷酸分子是单链的。

在另一优选实施方案中，父本多核苷酸分子集群包括第一亚群和第二亚群。有利的是，第一群多核苷酸由父本多核苷酸分子的正链组成且第二群多核苷酸由父本多核苷酸分子的负链组成。或者，第一和/或第二群可以包括父本多核苷酸分子的正链和负链。

步骤(b)包括处理父本多核苷酸分子集群以生成其多核苷酸片段集群。

合适的片段化方法为本领域内那些技术人员所熟知，并且包括基于酶的方法和物理方法。

通过控制步骤(b)中片段化处理的参数可以控制多核苷酸片段的大小。以这种方式确定多核苷酸片段的长度避免了不得不提供另外的步骤(如从凝胶中纯化所需长度的片段)的必要性。

在使用父本多核苷酸分子的第一和第二亚群的时候，可以将它们分别片段化。

在一实施方案中，用于片段化第一群多核苷酸分子的片段化处理条件的至少一个参数与用于片段化第二群多核苷酸分子的片段化处理条件的同样参数不同。“同样参数”意指用在另一群单链多核苷酸分子片段化处理条件中的相同参数。

例如，在使用酶获得片段化的情况下，可以变化的合适参数包括酶的类型、酶浓度、反应体积、消化反应持续时间、反应混合物温度、反应混合物pH、父本多核苷酸序列长度、父本多核苷酸分子的量和反应混合物的缓冲液组合物。

用于片段化第一和第二群多核苷酸分子的处理条件的不同参数的使用提供了增加本发明方法产生的变体多核苷酸中的多变性的优势。

在优选实施方案中，步骤(b)包括暴露父本多核苷酸分子于一个或多个核酸酶。

“核酸酶”意指具有核酸水解活性的多肽，如酶或其片段。

本领域技术人员应了解在消化步骤(b)中可以使用任何合适的核酸酶(例如核酸外切酶、核酸内切酶或限制性酶、或其组合)以生成多核苷酸片段。这样的酶的例子为领域内所熟知。

在一实施方案中，核酸酶是核酸外切酶。因而，多肽的核酸外切活性大于多肽的核酸内切活性。更优选的是，多肽有核酸外切活性，但基本上没有核酸内切活性。

例如，核酸外切酶可以选自BAL31、核酸外切酶I、核酸外切酶V、核酸外切酶VII、核酸外切酶T7基因6、噬菌体λ核酸外切酶和核酸外切酶Rec J_f。

在可选的实施方案中，步骤(b)包括暴露父本多核苷酸分子于物理片段化刺激物。例如，物理片段化刺激物可以选自雾化液、超声、热和流体力学剪切。

有利的是，步骤(b)包括通过随机剪切父本多核苷酸分子生成片段。然而，这样的随机剪切不必要。因而，在可选的实施方案中步骤(b)包括通过非随机剪切父本多核苷酸分子生成片段。

步骤(c)包括在允许重叠片段对形成的条件下孵育多核苷酸片段集群。

“重叠片段对”包括含有单链“正”链和单链“负”链的片段对，两条链以反平行的方向共退火(即5’-3’定向的链与3’-5’定向的链退火)，以形成在重叠区内具有序列互补性的一对部分重叠核酸链。重叠链的方向使得自由5末端在重叠区远端。例如：

3’-G-A-T-T-C-G-A-A-T-5’

5’-A-G-T-C-C-T-A-A-G-3’

技术人员应了解重叠区的互补性程度不需要是100％；互补程度只需要足够高而使得PCR反应温度循环期间重叠片段对能形成。

在一实施方案中，步骤(c)包括首先在允许双链片段变性的条件下孵育多核苷酸片段集群，然后在允许单链片段再退火的条件下孵育多核苷酸片段集群以生成重叠片段对。

步骤(d)包括用多聚酶扩增重叠片段对以生成一个或多个与父本多核苷酸分子的序列不同的产物多核苷酸分子。

应了解步骤(d)包括开始的组装阶段(此阶段中延伸片段来产生全长的产物多核苷酸)，然后是扩增阶段(此阶段中PCR扩增出全长的产物多核苷酸)。

在一实施方案中，步骤(d)包括以下的重复循环：

(i)延长重叠片段对的多核苷酸链以生成延长的片段对；

(ii)变性延长的片段对的组成链；和

(iii)再退火组成链以生成新的重叠片段对。

步骤(d)可以还包括添加引物来允许或促进全长产物多核苷酸分子的扩增。

在又一实施方案中，步骤(d)包括一个或多个产物多核苷酸分子的PCR扩增。

在另一实施方案中，步骤(d)包括克隆一个或多个产物多核苷酸分子于表达载体中。

步骤(d)的关键特征在于它(至少部分)在有利于引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子的条件下完成。这样的条件可用于开始的组装阶段和/或后面的扩增阶段。在一实施方案中，有利于引入突变的条件用于组装和扩增阶段。

有利于在后面组装和/或扩增阶段引入突变的条件的此种使用使本发明方法与现有技术下公布的那些(其通常依赖于在起始(父本)多核苷酸中自然产生的序列变异的重排)有所区别。在一些现有技术方法中，使用易错PCR，但这只为了在父本多核苷酸(即步骤‘a’中)生成序列变异、或为了在消化片段中通过用易错PCR扩增片段(即步骤‘b’中)产生序列变异。然而，突变方法(例如在后面组装和/或扩增阶段期间使用易错PCR)的使用在现有技术中或者未知，或者不建议使用。

“有利于引入突变的条件”包括在多聚酶驱动的链延长期间有利于引入核苷酸序列突变的任意条件、处理或状态。因而，我们包括在多聚酶驱动链延长期间(相对于标准PCR扩增，如利用Taq多聚酶)提供次优保真度的任意条件。例如，可以选择条件以提供突变频率为至少10^-5每碱基对每次复制，优选至少5×10^-5每碱基对每次复制、10^-4每碱基对每次复制、10^-3每碱基对每次复制、10^-2每碱基对每次复制或10^-1每碱基对每次复制。

核酸聚合，例如多聚酶链式反应(PCR)，当其刚被发明的时候多用于已知DNA序列的精确扩增。然而，基于聚合的基因操作从此变成了用来在分子水平改变遗传信息的无价之宝。

易错聚合通过加以不完全的、并因而致突变的、或‘不整齐的’反应条件(例如，通过加入Mn²⁺或Mg²⁺到反应混合物(Cadwell和Joyce，1991；Leung等，1989))或通过使用易错(和通常为无校对能力的)核酸多聚酶来引入随机复制错误。这个方法已被证明不仅能用于生成核酸序列的随机文库，而且能用于在突变步骤中的表达和筛选过程期间引入突变。

因而，在发明方法的优选实施方案中，步骤(d)中有利于引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子中的条件允许易错聚合。

多聚酶的首要功能是在复制和转录的过程中用存在的DNA或RNA模板聚合新DNA或RNA。DNA多聚酶“阅读”模板DNA链并使用其合成新的互补链。然而，在用一些比其他酶更易错的多聚酶聚合期间会发生错误。

错误改正(或‘校对’)是某些、但非全部DNA多聚酶的性质。此过程改正了新合成DNA中的错误。当识别了不正确碱基对的时候，DNA多聚酶反转了一个碱基对DNA上的方向。酶的3′->5′核酸外切酶活性使得不正确碱基对被切除(这个活性被称为校对)。在碱基切除后，多聚酶能重新插入正确碱基，而复制能够继续。

在发明的一实施方案中，步骤(d)包括使用热稳定的、非校对多聚酶来引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子。

优选多聚酶是DNA多聚酶。尽管可以使用任意的非校对多聚酶，优选选自Taq多聚酶、嗜黄曲霉(Thermus flavus)DNA聚合酶I、嗜热栖热(Thermus thermophilus)HB-8 DNA聚合酶I、嗜热曲霉(Thermophilus ruber)DNA聚合酶I、嗜热brokianus(Thermophilus brokianus)DNA聚合酶I、嗜热caldophilus(Thermophilus caldophilus)GK14 DNA聚合酶I、嗜热filoformis(Thermophilus filoformis)DNA聚合酶I、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶I、芽孢杆菌caldotonex(Bacilluscaldotonex)YT-G DNA聚合酶I、芽孢杆菌caldovelox(Bacillus caldovelox)YT-F DNA聚合酶I和其他真细菌DNA聚合酶。

用于引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子中的合适的多聚酶也能从市场上买到，如Mutazyme和Mutazyme II(自Stratagene)。

因而，在发明的优选实施方案中，步骤(d)包括使用易错PCR以引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子中。

有利的是，易错聚合具有至少0.01％(例如至少0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、2.0％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、10％、20％、30％或更高)的错误率。

最优选的是，易错聚合具有0.08％和5％间的错误率。

或者或此外，有利于引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子的条件可以包括在聚合反应中使用突变增强子。通过“突变增强子”我们意指能引起突变、增加突变率或此外修改突变过程(例如有利于特殊类型突变或有利于在特殊的产物多肽区域内突变)的任何物质。

在一优选实施方案中突变增强子是Mn²⁺。

在可选的实施方案中，突变增强子是链去稳定性核苷酸类似物。例如，链去稳定性核苷酸类似物可选自dITP、dUTP、7-脱氮-dGTP、8-氧代-dGTP和N4-甲基-2’-脱氧胞苷5′-三磷酸。

或者或此外，有利于引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子的条件可以包括改变聚合反应中一个或多个成分的浓度。在优选实施方案中，改变了聚合反应中的Mg²⁺浓度。例如，可以增加Mg²⁺浓度。因而，在一实施方案中，Mg²⁺浓度可以增加相比于传统PCR中所用的浓度的至少2倍(例如3倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍)。

在又一可选或此外的实施方案中，改变了聚合反应中的dNTP浓度。例如，在聚合反应中可改变dATP与dTTP的相对浓度。或者，在聚合反应中可改变dGTP与dCTP的相对浓度。在发明的一实施方案中，dATP与dTTP和/或dGTP与dCTP的相对浓度被改变至少2倍(例如3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍)。

或者或此外，有利于引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子的条件可以包括改变聚合反应中延伸步骤的温度。例如，可以升高延伸反应的温度(如0.1至60℃，例如，1至50℃、1至40℃、1至30℃、1至20℃、1至10℃或1至5℃)。

因而本发明提供生成父本多核苷酸序列的变体形式的方法。

应了解本发明方法可执行于编码多肽产物(包括具有结合或催化性质的任何蛋白质，如抗体或抗体的部分、酶或受体)的任何多核苷酸。此外，可以根据本发明突变具有可改变的功能的多核苷酸(如催化RNA)。优选编码一个或多个蛋白质基序的父本多核苷酸在长度上至少为12核苷酸，更优选至少20核苷酸的长度，甚至更优选大于50核苷酸长度。可以使用至少100核苷酸长度或甚至至少200核苷酸长度的多核苷酸。在使用编码如酶或抗体的大蛋白质的父本多核苷酸的情况下，这些多核苷酸可能为数以百计或数以千计的碱基长度。本发明可以执行于任意大小的父本多核苷酸。

有利的是，步骤(d)中引入到一个或多个产物多核苷酸分子中的突变与编码的多肽的改变的性质或特征相关。

由本发明方法产生的多核苷酸或多肽的改变的性质或特征可以是野生型(父本)多核苷酸或其编码的多肽、蛋白质或蛋白质基序的正常活性的任意变异或改变。例如，本发明方法可应用如下：

(i)正向或负向调节酶的催化活性；

(ii)调节抗体的结合特异性和/或亲和性；

(iii)(通过产生配体和/或受体的变体)调节配体-受体相互作用(如白介素和其受体间)的结合特异性和/或亲和性；

(iv)调节多肽单体的能力以形成多聚体构象(例如用于疫苗的病毒外壳蛋白)；

(v)调节免疫原的能力来刺激针对免疫原的特异抗体的产生；和

(vi)调节蛋白质的稳定性(如激素和生长因子的血清稳定性)。

因而，应了解本发明方法可用于改变任意蛋白质、多肽或多核苷酸的性质/功能。

本发明方法的一优选实施方案还包括表达步骤(d)中生成的至少一个产物多核苷酸分子以产生编码多肽的步骤。在又一优选实施方案中，包括检测编码多肽的改变的特征的步骤。

用于检测用本发明方法生成的变体多核苷酸或多肽的改变的性质的方法为本领域内所熟知。例如，噬菌体展示技术的发展给从分子文库中选择功能性蛋白质带来了革命(Parmley等，Gene，73：305-391 1988；McCafferty等，Nature，348：552-554，1990；Barbas等，PNAS.USA，88：7978-7982，1991)。在此方法中，表型(蛋白质)直接与它的相应基因型(DNA)相连，并且这使得遗传材料可被直接克隆、然后为改善蛋白质功能可被进一步修改。噬菌体展示已被用于自多达10¹¹转化子大小的多种分子文库中克隆功能性结合物(Griffiths等，EMBO.J.13：3245-3260，1994)。因而，噬菌体展示可被用于自分子文库中直接克隆功能性的结合物，并且还可用于进一步改进最初选择的克隆。曾被用于蛋白质文库表面表达和其选择的其他类型病毒是杆状病毒(Boublik等Biotechnol 13：1079-1084，1995；Mottershead等Biochem Biophys Res Com 238：717-722，1997；Grabherr等Biotechniques 22：730-735，1997)和逆转录病毒(Buchholz等NatureBiotechnol 16：951-954，1998)。

自分子文库中选择功能性蛋白质还可以通过细胞表面展示来完成。这里也是表型直接相关于其相应的基因型。细菌细胞表面展示已被用于如筛选改进的羧甲基纤维素酶(CMCase)变体(Kim等Appl Environ Microbiol 66：788-93，2000)。能用于此目的的其他细胞有酵母细胞(Boder和Wittrup Nat.Biotechnol 15：553-557，1997)、COS细胞(Higuchi等J Immunol Meth 202：193-204，1997)和昆虫细胞(Granzerio等J ImmunolMeth 203：131-139，1997；Ernst等Nucleic Acids Res 26：1718-1723，1998)。

父本多核苷酸优选编码一个或多个蛋白质基序。这些基序定义为多核苷酸序列的区域或元素，其编码具有特征性蛋白质功能的多肽(即氨基酸)序列。例如，蛋白质基序可能限定整个蛋白质的一部分，如表位、切割位点或催化位点等。

可利用蛋白质基序和潜在蛋白质基序的几个可搜索数据库，例如MOTIF、PROSITE、SMART和BLOCKS(www.blocks.fhcrc.org)。

在本发明第一方面的一特别优选实施方案中提供了包括以下步骤的方法：

(a)提供多核苷酸分子的第一群和单链多核苷酸分子的第二群，第一和第二群一起构成一个或多个父本多核苷酸分子的正链和负链；

(b)以核酸外切酶消化多核苷酸分子的第一和第二群以生成单链多核苷酸片段；

(c)(在允许片段退火的条件下)所述自正链生成的单链多核苷酸片段与自负链生成的单链片段相接触；及

(d)扩增互相退火的片段以生成产物多核苷酸分子文库，至少某些产物多核苷酸分子与父本多核苷酸分子序列不同

其中步骤(d)包括使用易错PCR来引入一个或多个突变至产物多核苷酸分子中。

发明的第二个相关方面提供了通过上述方法得到或可得到的具有改变的核苷酸序列(优选编码具有改变/所需的特征的多肽)的多核苷酸序列。这些多核苷酸序列可被用于生成基因治疗载体和复制缺陷性基因治疗构建体或基于DNA疫苗的疫苗载体。此外，多核苷酸序列可被用作研究工具。

发明的第三个方面提供通过上述方法生成的序列的多核苷酸文库，从文库中可以选择编码具有改变的/所需的特征的蛋白质的多核苷酸。

优选多核苷酸文库是DNA文库(例如cDNA文库)。

为获得生成的多核苷酸序列的表达，可以将多核苷酸并入具有有效连接于多核苷酸序列的调控序列的载体来控制其表达。载体可以包括其他序列，如启动子或增强子(来驱动插入多核苷酸序列的表达)、另外的多核苷酸序列(以使多核苷酸编码的蛋白质生产为融合蛋白)和/或编码分泌信号的核酸(以使宿主细胞中生产的蛋白质被分泌出细胞)。然后可以通过转化载体至宿主细胞中(在宿主细胞中载体是有功能的)、培养宿主细胞(以便蛋白质生产)和自宿主细胞或周边培养基中回收蛋白质来获得多核苷酸序列编码的蛋白质。本领域中用于此目的的原核和真核细胞包括大肠杆菌菌株、酵母和真核细胞如COS或CHO细胞。选择宿主细胞可用来控制在那些细胞中表达的蛋白质的性质，例如控制蛋白质在宿主细胞内沉积的部位或影响如其蛋白质糖基化的性质。

可以通过本领域内熟知的方法表达多核苷酸序列编码的蛋白质。方便的是，可以通过在导致或允许蛋白质表达的适当条件下在培养物中生长(含有这样的载体的)宿主细胞来获得表达。

在多种不同宿主细胞中克隆和表达蛋白质的系统为人们所熟知。合适的宿主细胞包括细菌、真核细胞如哺乳动物和酵母和杆状病毒系统。另外，使用逆转录病毒系统来克隆和表达是个好选择，因为此病毒可与许多细胞类型一起使用。本领域内能得到的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、COS细胞和很多其他细胞。普遍的优选细菌宿主是大肠杆菌。

可以选择或构建包含适当的调控序列(视情况而定，包括启动子序列、终止子片段、多腺苷化序列、增强子序列、标记物基因和其他序列)的合适载体。载体可以是质粒、病毒如噬菌体或噬菌粒，视情况而定。其他细节见(例如)Molecular Cloning：a LaboratoryManual：第三版，Sambrook和Russell，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press。用于操作多核苷酸序列的许多已知技术和步骤，如制备多核苷酸构建体、突变、测序、引入DNA至细胞和基因表达、和蛋白质分析，详述见于Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel等编，John Wiley & Sons，1992。

系统可用于创建包括变异序列的DNA文库，可以用若干方式筛选文库来获得所需的蛋白质功能。可以用特异于实际酶功能(如CMCase活性、β-糖苷酶活性和还有热稳定性)的方法筛选酶功能。此外，可以用噬菌体展示和细胞表面展示来筛选酶功能(Crameri A.等，Nature 1998 15；391(6664)：288-291；Zhang J.H.等，PNAS.USA 199794(9)：4504-4509；Warren M.S.等，Biochemistry 1996，9；35(27)：8855-8862；Kim等，Appl Environ Microbiol 66：788-93，2000)及改变的如抗体的结合性质(Griffith等，EMBOJ.113：3245-3260，1994)。

因此，本发明还提供了蛋白质(如酶、抗体和受体)，具有不同于以本发明第一方面的方法生产的野生型之特征的特征。

这样表达的蛋白质可以单独使用，或作为疫苗或治疗用药剂(如免疫原、抗原)在药物可接受载体之内、或此外在得到的特异性抗体中使用。它们也可被用作研究工具。

本发明提供的多肽可用于筛选影响或调节其活性或功能的分子。这样的分子可用在治疗(可能包括预防)范围内。

本发明还提供包括以下的方法：在以上述方法鉴定了具有所需的特征的多核苷酸或多肽之后，整个或部分地生产那个任选连接于另外的多肽或多核苷酸的多肽或多核苷酸。

因此，本发明的又一方面提供了用于制造具有改变的/所需的性质的多肽的方法，该方法包括下列步骤：

(a)用如权利要求1到46任一项所述的方法生成父本多核苷酸的突变形式；

(b)表达步骤(a)生产的变异多核苷酸来生产变异多肽；

(c)筛选具有改变的性质的变异多肽；及

(d)从变异多肽中选择具有改变的性质的多肽。

本发明还提供了以上述方法得到的多肽。

在鉴定了具有改变的/所需的特征的多核苷酸或多肽之后，可以通过熟知的技术如PCR、克隆和宿主细胞内表达来生产以提供更大量的这些多核苷酸或多肽。

所得的多肽或多核苷酸可用于制备工业酶，例如洗衣粉酶(优选在较低温度下具有更高的活性)。或者，所得的多核苷酸或多肽可用作研究工具，即抗体可以用在免疫检测，及多核苷酸可以用作杂交探针或引物。或者，如下面所讨论的，所得的多肽或多核苷酸可用在制备诊断用、药用、治疗等用途的药剂。

以本发明方法生成并鉴定为具有改变的特征的多肽或多核苷酸可被配制到药物组合物中。除上面物质之一以外，这些组合物可以包括药物可接受的辅料、载体、缓冲剂、稳定剂或领域内那些技术人员所熟知的其它材料。这样的材料应该无毒而且不应干扰活性成分的效果。载体或其它材料的精确性质要取决于施用的方式，例如口服、静脉注射、皮肤或皮下、鼻、肌肉注射、腹腔内方式。

口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可以包括固体载体如明胶或佐剂。液体药物组合物一般包括液体的载体如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐溶液、葡萄糖或其他糖类溶液或甘油如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

对于静脉、皮肤或皮下注射或病痛点的注射，活性成分是肠外可接受的水溶液的形式，溶液是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。使用例如等渗的媒介如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸钠林格注射液，那些本领域内相关技术人员能够制备合适的溶液。如需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他添加剂。

因此，本发明还提供以本发明方法生产的多核苷酸或多肽用于药物、及以本发明方法生产的多核苷酸或多肽在制备疾病处理、治疗和/或诊断用药剂中的使用。

以本发明生成之后，经鉴定的将被给予到个体的无论是多肽(如抗体或抗体片段)、酶、多核苷酸或核酸分子，优选以“预防有效量”或“治疗有效量”施用(看情况而定，尽管预防可能被当做治疗)，这样足够在个体内显示益处。施用的实际量和施用的方式和时程取决于正治疗的疾病的性质和严重程度。治疗处方(如确定剂量等)在全科医生及其他医生责任之内，并且通常需要考虑要处理的疾病、病患个体的条件、输送位点、施用方法及其他医生所知的因素。可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编)，1980中找到上面提到的技术和步骤的例子。

或者，可以使用靶向治疗(通过使用靶向系统如抗体或细胞特异性配体)以更特异地运输活性试剂至某类型细胞。因为多种原因可能需要靶向；例如，如果试剂具有不可接受的毒性、或此外如果需要太高的剂量，或此外如果试剂不能进入靶标细胞。

代替直接施用这些试剂，可以通过从引入细胞的编码基因(例如在病毒载体中)表达的方式在靶标细胞中生产试剂(VDEPT技术的变体，即通过自病毒载体中的编码DNA表达的方式在载体中生产活性试剂如酶)。载体可以靶标于待治疗的特异细胞，或者载体包含靶标细胞会或多或少选择性打开的调控元件。

或者，试剂可以以前体的形式施用，通过待治疗细胞中生产的或靶标于细胞的活化剂转化为活性形式。此类方法有时被称为ADEPT或VDEPT。前者包括通过偶联细胞特异性抗体靶标活化剂于细胞，而后者包括通过从病毒载体中编码DNA表达在载体中生产活化剂如酶(见例如，EP-A-415731和WO 90/07936)

组合物可以单独施用或与其他治疗组合(取决于待治疗情况或者同时或者顺序)施用。

作为又一选择，在以本发明方法生成之后鉴定为具有所需的特征的多核苷酸能被用于基因治疗的方法，来治疗不能合成多核苷酸编码的活性多肽或不能以正常水平合成多肽的患者，因而提供了相应野生型蛋白质提供的效果。

在现有技术中已使用如病毒载体的载体来引入多核苷酸至各种各样不同的靶标细胞。通常暴露载体于靶标细胞，以便在足够比例的细胞中能发生转染，以提供表达所需的多肽产生的有效治疗或预防效果。转染的核酸可会永久并入每个靶标肿瘤细胞的基因组中，提供长久效果，或另一选择是不得不定期重复治疗。

本领域内所知的各种载体(病毒载体和质粒载体)见美国专利号5,252,479和WO93/07282。特别是，许多病毒已被用作基因转移载体，包括乳多空病毒(如SV40)、痘病毒、疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒和EB病毒)和逆转录病毒。现有技术中许多基因治疗方法使用了缺陷的小鼠逆转录病毒。

作为使用病毒载体的替代，其他已知的引入核酸至细胞中的方法包括电穿孔、磷酸钙共沉淀、机械技术如显微注射、脂质体介导的转移和DNA直接吸收和受体介导的DNA转移。

如上面所提到的，使用编码多肽或其活性部分的核酸的基因治疗的目的在于在野生型多肽水平缺乏或只有降低水平的细胞中提高核酸表达产物的量。此种疗法在治疗已癌变的细胞时可以是治疗性的，或在治疗经筛选已知具有易感性等位基因并因此易患例如肿瘤的个体时可以是预防性的。

本发明还提供用于生成具所需的特征的多核苷酸序列或序列集群的试剂盒，包括用于ssDNA制备的试剂、核酸外切酶和用于进行PCR技术的组分(如热稳定性DNA(核苷酸)和停止装置(例如EGTA)。

如上所述，本发明方便地提供突变酶基因序列的创建和它们与具有所需的特征的功能性酶的随机组合。作为本发明这个方面的例子，酶基因通过易错PCR突变，导致了大约0.7％的突变率。然后所得的突变酶基因集合以核酸外切酶(如BAL31)消化，并且在不同时间点通过添加EGTA或通过热失活抑制反应来产生不同大小的一组DNA片段。然后这些片段进行如上所述的基于PCR的重组。然后克隆产生的重组DNA片段并构建基因文库。可以从此文库选择克隆并测序。

此技术的进一步应用是生成变异DNA序列集群，可用之进行进一步选择和分析。除编码大些的蛋白质如抗体片段和酶以外，DNA可以编码分子的功能性特征可被用于设计不同选择系统的肽。编码肽的重组DNA序列的选择以前曾有叙述(Fisch等，PNAS.USA 1996 Jul 23；93(15)：7761-7766)。此外，可以使用变异DNA集群来生产具有如催化活性的RNA分子集群。Vaish等，(PNAS.USA 1998 Mar 3；95(5)：2158-2162)说明了用于选择催化性RNA的功能性系统的设计，并且Eckstein F(Ciba Found.Symp.1997；209；207-212)概述了通过特异性引入催化性RNA至细胞中的催化性RNA的应用。可以基于重组DNA序列用系统进一步搜索序列空间选择具有催化活性的功能性肽/分子。

现在将以实施例的方式、参考附图阐明本发明的各方面和实施方案。进一步的各方面和实施方案对于那些本领域内技术人员是显而易见的。

附图说明

图1显示使用Alligator Bioscience的FIND^TM技术(如WO 02/48351所述)的体外分子进化的一般原则。

图2显示本发明方法的变化，其中在步骤(b)中加入了带预定可变性的寡核苷酸。

图3显示本发明方法的变化，其中在步骤(c)中加入了带预定可变性的寡核苷酸。

图4显示降低CHIPS与人抗CHIPS IgG相互作用、但保持C5aR阻断活性的实验策略。开始一轮随机突变和噬菌体选择/ELISA筛选之后，接着是三轮FIND

和噬菌体选择/ELISA筛选，用于降低抗体结合和保持C5aR肽结合。然后分析了在改进的克隆中突变的结构分布并且通过合理设计引入了新突变。进一步分析这些克隆以降低抗体相互作用和保持C5aR结合和抑制。

图5显示来自第1轮(n＝400)、第3轮(n＝320)和第4轮(n＝96)的克隆(A)和最佳的克隆(B)的平均值与野生型CHIPS_1-121的比较，通过与人抗CHIPS_31-113IgG的结合百分数来衡量。第4轮产生的96个克隆的分布显示于C。

图6显示在筛选降低的抗CHIPS_31-113IgG结合和保持C5aR结合期间、在第四轮多样化之后鉴定的42个最佳克隆的图。显示出与人C5aR有最大结合的10个克隆(圆圈内)被选来做进一步计算机/合理设计。

图7显示在随机突变、FIND

和合理设计之后的排名靠前的七个克隆的序列比对(A)。在几乎全部克隆中，位置K40、D42、N77、N111和G112与位置K50、K69、K92、K100和K105的突变以不同的组合突变。突变的位置定位于α螺旋、β₁和β₂片层间的噜扑环、β₂和β₃片层间的噜扑环、β片层3、β₃和β₄片层间的噜扑环及β片层4中。(B)选择的克隆(376)中的突变以绿色标记于自CHIPS_31-121结构(PDB编号：1XEE)(Haas等，2005)修饰来的CHIPS_31-113结构中。通过PyMOL分子作图系统(DeLano，2008)生成了该图。

具体实施方式

实施例

本发明的方法特别适用于Alligator Bioscience AB，隆德，瑞典的FIND

技术。

图1至图3显示了FIND

技术的实施方案的示意图。

FIND

技术在WO 02/48351、WO 03/097834和WO 2007/057682中有所详述，其公布在此引入作为参考。

实施例1—FIND

技术

试剂

AmpliTaq

多聚酶购自Perkin-Elmer Corp.，dNTPs购自Boehringer MannheimBiochemica(曼海姆，德国)，及BAL31核酸酶购自New England Biolabs Inc.(贝弗利，美国)。所有限制性酶购自New England Biolabs Inc.(贝弗利，美国)。溴化乙锭购自Bio-Rad Laboratories(Bio-Rad Laboratories，赫拉克勒斯，加利福尼亚，美国)。T4 DNA连接酶购自New England Biolabs Inc.(贝弗利，美国)。EDTA和EGTA购自Kebo Lab(瑞典)。

所有引物在实验室设计并得自Life Technologies(泰比，瑞典)和SGS-DNA(雪平，瑞典)。

PCR

所有多聚酶链式反应(PCR)在自动热循环仪(Perkin-Elmer Cetus 480，诺瓦克，康涅狄格，和美国)上进行。用来扩增核酸的PCR技术见述于美国专利号4,683,195。PCR技术一般使用的参考包括Mullis等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，51：263，(1987)，Ehrlich(编)，PCR technology，Stockton Press，NY，1989，Ehrlich等，Science，252：1643-1650，(1991)，“PCR protocols；A Guide to Methods and Applications”，Eds.Innis等Academic Press，New York，(1990)。

测序

通过使用BigDye终端循环测序试剂盒(BigDye Terminator Cycle Sequencing kit，Perkin-Elmer，Elmervill，加利福尼亚，美国)进行了所有构建体的测序。测序在ABI Prism377 DNA测序仪上完成。

琼脂糖凝胶电泳

在三羧甲基氨基甲烷-乙酸缓冲液(TAE-缓冲液0.04M三羧甲基氨基甲烷-乙酸，0.001M EDTA)中，用含0.25微克/毫升溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶(AGAROSE(FMCBioproducts，罗克兰，缅因州，美国))完成DNA的琼脂糖凝胶电泳。电泳的样品与灭菌过滤的由25％聚蔗糖和溴酚蓝组成的上样缓冲液混合并上样至2％琼脂糖凝胶的孔中。除非另有说明，在含0.25微克/毫升溴化乙锭的三羧甲基氨基甲烷-乙酸缓冲液中以90伏电压跑电泳45分钟。必要时用Qiaquick凝胶抽提试剂盒(Qiaquick Gel ExtractionKit，Qiagen GmbH，希尔登，德国)对合适大小的条带进行凝胶纯化。作为分子量标准，使用DNA分子量标记1kb阶梯(DNA molecular weight 1kb ladder，Gibco BRL)。用分光光度计估计凝胶抽提的产物的DNA浓度。

细菌菌株

大肠杆菌菌株TOP10F’被用作转化用细菌宿主。基本上按Hanahan，D.1983.Studieson transformation of Escherichia coli with plasmids.J.Mol.Biol.166：557-580所述生产此菌株的化学感受态细胞。生产了此细菌菌株的电感受态细胞(Dower，W.J.，J.F.Miller& C.W.Ragsdale.1988：High efficiency transformation of E.coli by high voltageelectroporation.Nucleic Acids Res.16：6127)。

质粒

如Sambrook，Molecular cloning；a laboratory manual(第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)所述在pFab5chis中完成所有基因操作。pFab5chis载体被设计带有插入于SfiI和NotI位点间的任意scFv基因(见Emgberg等，1995，Methods Mol.Biol.51：355-376)。SfiI位点位于pelB前导而NotI位点正位于VL区域之后，以便于插入VH-连接体-VL。在此案例中，使用了针对CD40的抗体。

引物

设计了围绕pFab5chis抗体基因的两个生物素化引物，具有包括特定的唯一限制性位点的下列序列：

1736 SfiI正向引物：

5′-ATT ACT CGC GGC CCA GC▼C GGC CAT GGC CCA CAG GTC AAG CTCGA[SEQ ID NO：1]

和1735 NotI反向引物：

5′-TTA GAG CCT GC▼G GCC GCC TTG TCA TCG TCG TCC TT[SEQ ID NO：2]

(其中‘▼’特指切割位点)

设计了围绕pFab5chis抗体基因的两个非生物素化引物，具有包括特定限制性位点的下列序列：

1664 SfiI正向引物：

5′-ATT ACT CGC GGC CCA GC▼C GGC CAT GGC CCA CAG GTC AAG CTCGA[SEQ ID NO：3]

和1635 NotI反向引物：

5′-TTA GAG CCT GC▼G GCC GCC TTG TCATCG TCG TCC TT[SEQ ID NO：4]

标准PCR

标准PCR反应跑25个循环，由下列条件组成：变性(94℃、1分钟)，引物退火(55℃、1分钟)和延伸(72℃、3分钟)。每个PCR反应在100μl终体积中含有10mM Tris-HCl，pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，200μM dNTP，1μM正向引物，1μM反向引物，1.25U AmpliTaq

热稳定性DNA多聚酶(Perkin-Elmer Corp.)和50纳克模板。

易错PCR

在含有500mM NaCl、100mM Tris-HCl，pH 8.8、5mM MgCl₂ 100微克白明胶的10x缓冲液中进行易错PCR反应(根据Kuipers等，Nucleic Acids Res.1991，Aug 25；19(16)：4558，但是MgCl₂浓度从2mM增加到5mM)。

每100微升反应中混合下列：

加入50纳克pFab5chis载体中的模板。加入10微升10mM MnCl₂并检查管子没有MnO₂沉淀产生。最后加入5个单位的Taq酶。以下列温度跑易错PCR 25个循环，不用热启动：94℃1’，45℃1’，72℃1’，+72℃7分钟。得到的产物是750bp的易错(即突变的)插入。在进一步处理前，以Gibco PCR纯化试剂盒(Gibco PCR purification kit)纯化此插入。

通过生物素化引物生成单链DNA

以两次分开的PCR反应扩增相关片段。这些反应可以是上述的标准PCR或也是上述的易错PCR。应设计引物以便一个反应中正向引物被生物素化而另一反应中反向引物被生物素化。例如，以pFab5chis-抗体为模板，用A)引物1736和1635和B)引物1664和1735，以上述条件完成PCR反应25个循环。这产生了约750bp的PCR产物：A中上游链被生物素化；B中下游链被生物素化。

通过使用包被有链霉亲和素如Dynabeads的固相基质纯化收回了非生物素化链。洗涤磁珠并以PBS/1％BSA和含有5mM Tris pH 7.5，1M NaCl，和0.5mM EGTA的B&W缓冲液平衡。100微升每PCR产物与100微升融散于2xB&W缓冲液的珠子混合并于室温旋转孵育15分钟。通过以B&W小心洗涤两次去除未结合的PCR产物。通过室温下让DNA与25微升0.1M NaOH孵育10分钟，以碱变性洗脱捕获DNA的非生物素化链。从珠子分离溶液并以7.5微升0.33M HCl和2.5微升1M Tris pH 8中和。

用噬菌体生成单链DNA

用PstI/HindIII限制性酶克隆相关片段至细菌噬菌体M13载体M13mp18和M13mp19。按照传统方法用大肠杆菌菌株TOP10F’繁殖细菌噬菌体。自细菌噬菌体载体M13mp18制备上游链的单链DNA并自细菌噬菌体载体M13mp19制备下游链的单链DNA。简单的讲，在4℃以12000g离心1.5毫升感染的细菌培养物5分钟。上清以200微升20％ PEG8000/2.5M NaCl沉淀。沉淀的细菌噬菌体重悬于100微升TE。加入50微升以Tris-Cl(pH 8.0)平衡的苯酚并涡旋样品。在室温下以12000g离心1分钟之后，转移含有DNA的上层相并以乙醇沉淀。DNA沉淀溶解于50微升TE(pH 8.0)并储存在-20℃。(Sambrook等.Molecular Cloning，A laboratory manual第二版.Cold SpringHabor Laboratory Press.1989，第4章)。自噬菌体制备的单链DNA是环状的，并且在BAL31处理前必须打开。可以用能切割单链DNA的核酸内切酶完成这个操作。

使用不对称PCR生成单链DNA

用离心式柱纯化PCR产物以从之前的PCR中去除过量引物。150纳克纯化产物用作线性扩增的模板，扩增于100微升含1.5mM MgCl₂(Applied Biosystems)、200μM每种dNTP(New England BioLabs)、1.25U AmpliTaq

DNA多聚酶(Applied Biosystems)和1.0μM单个引物的1xGeneAmp

10xPCR缓冲液中进行。PCR循环条件是：在94℃变性1分钟、35个循环的94℃(30秒)、55℃(30秒)、72℃(1分钟)，然后是72℃延伸7分钟。

在1％琼脂糖凝胶上，非对称PCR产物大小可与双链模板分开，并用Qiaquick凝胶抽提试剂盒(Qiaquick Gel Extraction Kit，Qiagen)纯化。

用λ核酸外切酶生成单链DNA

最初用标准PCR反应生产dsDNA片段，创建出在5’和3’-末端分别带有单独限制性酶(RE)位点的DNA。PCR反应分为两个，并优选用创建3’突出或平末端的限制性酶分别进行RE消化来创建5’磷酸化。在合适的缓冲液中并过夜完成消化以实现完全消化。如果不得不使用创建5’突出的酶，在使用DNA多聚酶时突出会被填补。纯化后，在配加的特定缓冲液中、37℃下、以10Uλ核酸外切酶(如Novagen的Strandase^TM或NEB的λ核酸外切酶)处理1-4微克dsDNA 30分钟，并且在75℃下终止反应10分钟。用标准凝胶抽提方法进一步从琼脂糖凝胶上的任意dsDNA残留中分离ssDNA。

用BAL 31生成单链片段化DNA

ssDNA链(分别含有上游和下游链)进行分别的使用如BAL31的酶处理(即分开消化上游链和下游链)。每个消化反应包含0.02□克/□升ssDNA、600mM NaCl、20mMTris-HCl、12mM CaCl₂、12mM MgCl₂、1mM EDTA pH 8.0和0.1-5单位/毫升范围内不同酶浓度的BAL31。反应于30℃孵育，并且在10、30、60和120秒或更长时间顺序收集消化的ssDNA部分。通过添加EDTA并在65℃热处理10分钟来终止反应。通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀来纯化ssDNA片段。重悬ssDNA于10mM Tris pH 8.0。

通过1％琼脂糖凝胶电泳评估消化的情况。

消化生产的片段的纯化

通过苯酚/氯仿/异戊醇抽提纯化消化的DNA片段。向每管100微升样品中同时加入50微升缓冲苯酚和50微升氯仿和异戊醇(24∶1)混合物。涡旋管子30秒并随后在离心机中以14000转/分离心1分钟。然后收集上层相并与2.5体积的99.5％乙醇(1/10为3M乙酸钠，pH 5.2)混合。在-80℃沉淀DNA1小时。然后通过在离心机中以14000转/分离心30分钟沉淀DNA。沉淀用70％乙醇洗涤一次并随后重悬于10微升灭菌水中。

在琼脂糖凝胶上分析消化生产纯化的片段

5微升溶解的来自每个时间点和来自空白的沉淀与2.5微升上样缓冲液(25％聚蔗糖和溴酚蓝)混合并上样到2％琼脂糖凝胶的孔中。如上完成不同时间点的电泳。

全长片段的重组

通过两个连续的PCR反应实现ssDNA片段的重组。第一个PCR反应应包含10mMTris-HCl，pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、200μM dNTP、0.3U Taq多聚酶和2微升BAL31处理的样品，均在25微升终体积中，并以下列条件进行5个循环：94℃1分钟，50℃1分钟和72℃2分钟+72℃5分钟。第二个PCR反应应包含10mM Tris-HCl，pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl₂、200μM dNTP、0.6U Taq多聚酶、1μM正向引物、1μM反向引物和5微升来自第一个PCR反应的样品，均在50微升终体积中，并以下列条件进行15个循环：94℃1分钟，55℃1分钟和72℃2分钟+72℃7分钟。

所得的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳来评估。

用SfiI和NotI限制性消化重组片段和质粒

通过用包括BSA和11U酶/微克DNA的NEB缓冲液2，首先用SfiI切割重组片段和质粒pFab5chis。在50℃进行反应4小时。此后通过加入转换缓冲液和6U酶/微克DNA以NotI切割DNA。此反应于37℃过夜进行。

限制性消化载体和限制性消化重组片段的凝胶纯化

在1％琼脂糖凝胶上分析切割反应。限制性消化的插入显示为约750bp的切割产物。这个和预期大小非常符合。切出切割的插入和质粒的条带并如前所述做凝胶抽提。

重组限制性消化片段和限制性消化pFab5chis的连接

在12℃水浴中连接纯化的切割pFab5chis与纯化的重组限制性消化片段16小时。50微升载体和50微升插入、和15微升(与酶一起提供的)10x缓冲液、7.5微升连接酶(5单位/微升)及灭菌水混合至终体积为150微升。以同样方式也完成了不加任意插入的限制性消化pFab5chis的连接。

以连接的重组插入和pFab5chis转化化学感受态大肠杆菌TOP10F’

如上所述用苯酚/氯仿抽提纯化连接反应。收集来自抽提的上层相并与2.5体积的99.5％乙醇(1/10是3M乙酸钠，pH 5.2)混合。在-80℃沉淀DNA1小时。然后通过在离心机中以14000转/分离心30分钟沉淀DNA。沉淀用70％乙醇洗涤一次并随后重溶于10微升灭菌水中。每个连接的5微升分别与95微升化学感受态大肠杆菌TOP10F′混合，在冰上孵育1小时并随后转化(Sambrook等.Molecular Cloning，A laboratory manual第二版.Cold Spring Habor Laboratory Press，1989)。在一小时生长后，来自两个转化的细菌被涂布于含氨苄青霉素(100微克/毫升)的琼脂平板。在37℃孵箱中倒置平板生长14小时。

实施例2-CHIPS定向进化以生成与人抗体相互作用降低的功能性变异

介绍

炎症是对于损伤或病原感染的组织反应。吸引免疫细胞和可溶性分子到损坏或感染部位起始了愈合过程。尽管提高炎症反应的能力对于存活至关重要，控制炎症的能力对于健康也必不可少。抗炎症药物目的在于阻断炎症中关键事件，用来治疗具有过度或不受控炎症的疾病。这样的药物的例子是Remicade

和Kineret，经批准用于治疗类风湿关节炎。

很多细菌已进化出逃避人免疫系统的策略，例如通过避免识别、或通过分泌中和免疫系统介导的抗菌效应的蛋白质。金黄色葡萄球菌的趋化抑制蛋白(CHIPS)是个14.1kDa的蛋白质，通过结合和阻断C5a受体(C5aR)和甲酰化肽受体，该蛋白质成为炎症相关的免疫细胞招募和激活的有效抑制剂((De Haas等，2004；Postma等，2004)。这样，CHIPS是有前景的抗炎症蛋白质，用于治疗若干炎症性疾病，例如败血症(Rittirsch等，2008)或缺血再灌注损伤和免疫复合物疾病(Heller等，1999)。然而，多数个体具有预形成滴度的特异于CHIPS的抗体(Wright等，2007)。这些抗体可以中和CHIPS的功能或诱导免疫反应，因此CHIPS分子会从优化中受益以作为人循环系统中药物很好地行使功能。

定向进化是已建立的用于改进蛋白质的方法。它已被用于改进许多蛋白质功能如稳定性、活性或亲和性(Johannes等，2006)。对于发展蛋白质疗法重要的是，定向进化已被证明是用于生成具有增强的治疗潜力的蛋白质变异的有效工具((Yuan等，2005)。定向进化方法特别有效，因为它不需要预先了解蛋白质结构。代替使用基于定点突变的低效和耗时的方法，可以完成数轮的基因重组及高通量筛选来鉴定改进的变异。如(Yuan等，2005)和(Zhao，2007)所综述的，可以重复过程，并且在相关性质不需要的突变被排除的情况下积累有益突变。

在文献中描述了用于定向进化的若干不同方法；其中有DNA重排(Stemmer，1994a；Stemmer，1994b)和交错延伸过程(StEP)(Yuan等，2005；Zhao等，1998)。另一DNA重组技术称为片段诱导多样性(FIND

)，以前已被证明可用于最优化羧肽酶U的热稳定性((Knecht等，2006)和白介素1受体拮抗剂的活性(Dahlen等，2008)。

尽管定向进化已被成功用于鉴定新的和改进的蛋白质变异，这类技术的局限在于不能筛选蛋白质的整个序列空间。然而，如果定向进化与计算机工具和合理设计结合，可以更有效地探索序列空间(Wong等，2007；Zhao，2007)。

在此实施例中，FIND

重组与CHIPS基因的合理/计算机设计结合使用，目的在于创建具有和特异人抗体较低相互作用的新蛋白质变异。改进的CHIPS分子特征在于，和预先存在的抗体的反应降低、但还保留对C5aR的活性。因此，监测受体结合与筛选降低的抗体相互作用的过程同时进行。这样，我们能分离出具有和人抗CHIPS抗体相互作用显著降低但保留C5aR阻断活性的新的CHIPS变异。

材料&方法

重组蛋白质的克隆、表达和纯化

如早些所述，克隆、表达和纯化野生型(Wt)CHIPS_1-121(De Haas等，2004)。带截短C-末端的CHIPS(CHIPSΔC)是112个氨基酸长，作为克隆(CHIPS_1-112)的结果，在表达的蛋白质的C-端末尾包含有两个额外的非相关氨基酸。编码CHIPSΔC和其相应单突变K61A、K69A和K100A还有CHIPSΔN/C(CHIPS_31-113)的基因通过截短和定点突变创建自编码野生型全长CHIPS_1-121的基因。然后如上所述克隆并表达这些CHIPS变异。单突变被用于Haas等所做的结构分析(Haas等，2005)，还筛选了其抗CHIPS IgG结合，并且突变K61A、K69A和K100A显示了结合降低(未显示数据)。

在此研究中选自文库的CHIPS变异以同样方式表达、但从包涵体中纯化(Gustafsson等，2009)或按生产商推荐以Expressway无细胞大肠杆菌表达系统(ExpresswayCell-Free E.coli Expression System，Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚)表达。

文库构建

随机突变

为了创建CHIPS变异的不同文库，使用随机突变的两种不同方法以创建总共四个文库。如前所述完成易错PCR((Leung等，1989)。创建了一个具有高突变频率的文库(文库1.1)和一个具有低突变频率的文库(文库1.2)。在7.5mM MgCl₂和0.64mM MnCl₂存在的情况下，使用引物(Fw：5’TCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTTTACTTTTGAACCG-3’[SEQ ID NO：5]和Rev：5’-GCCTGCGGCCGCAGATCTACCATTAATTACATAAG-3’[SEQ ID NO：6])完成了20循环的PCR。加入2.5U AmpliTaq热稳定性DNA多聚酶(Applied Biosystems，福斯特市，加利福尼亚)，并使用程序(94℃，5分钟/20次(94℃，30秒/55℃，30秒/72℃，40秒)和72℃最终延伸10分钟)完成反应。按生产商推荐，使用GeneMorph II(Stratagene，拉霍拉，加利福尼亚)。使用10皮克DNA(CHIPSΔC和相应的K61A、K69A和K100A单突变的混合物)来设计低突变频率文库(文库1.4)和1纳克DNA设计具有高些的突变频率的文库(文库1.3)。PCR反应包含上述的引物，并且PCR程序是95℃，2分钟/40次(95℃，1分钟/60℃，1分钟和72℃，1分钟)和72℃最终延伸10分钟。为增加1纳克文库中的突变频率，文库经受了又一轮Genemorph II突变。这一次，PCR反应中的DNA量是10纳克。纯化后，按照生产商推荐亚克隆PCR产物于pGEM-T载体(Promega，麦迪逊，威斯康辛州)并且分析序列并评估碱基交换。

FIND

如专利EP 1 341 909和EP 1 504 098所述完成FIND

重组。简单地讲，通过使用一个生物素化和一个常规引物生成PCR产物来制备单链DNA。固定PCR产物于含有链霉亲和素偶联的磁珠(Miltenyi Biotec GmbH，贝尔吉施 格拉德巴赫，德国)的柱子上并放置于μMACS分离器的磁场中。以0.1M NaOH变性PCR产物并收集洗脱的非生物素化DNA链，并且按照生产商推荐，通过琼脂糖凝胶电泳使用Recochips(Takara Bio Inc.，志贺，日本)纯化PCR产物。

在分开的管中，在生产商推荐的缓冲液里，通过用(100U/微克DNA)核酸外切酶I(Exo I)(New England Biolabs，伊普斯威奇，马萨诸塞州)10分钟、(25U/微克DNA)核酸外切酶V(Exo V)(USB，克利夫兰，俄亥俄州)45分钟和(10U/微克DNA)核酸外切酶VII(Exo VII)(USB)30分钟分别片段化有义和反义ssDNA起始FIND

实验。核酸外切酶消化产生的ssDNA片段在不加引物的类PCR反应中重组，随后在标准PCR反应中扩增。纯化后，按生产商推荐，亚克隆PCR产物于pGEM-T载体(Promega)并分析序列。

平板形式的蛋白质表达

克隆通过随机突变或FIND

重组创建的CHIPS文库到修改的pRSET B载体(Invitrogen)的BbsI和BglII位点间以在大肠杆菌中表达。转化文库至大肠杆菌BL21明星菌株DE3 pLysS(E.coli BL21 star DE3 pLysS，Invitrogen)中，铺板于含有添加50微克/毫升氨苄青霉素和34微克/毫升氯霉素的LB琼脂的20厘米Qtray平板上，并在37℃孵育过夜。第二天，用克隆挑选机器人挑选大肠杆菌克隆并接种于含有添加50微克/毫升氨苄青霉素和34微克/毫升氯霉素的150微升卢里亚肉汤(Luria Broth)(LB)的96孔圆底平板中。在37℃以78％湿度和在Multitron平板振荡器(Multitron plateshaker，Infors HT，Bottmingen，瑞士)中以700转/分振荡过夜孵育培养物。通过1/100稀释过夜培养物到含50微克/毫升氨苄青霉素的新鲜培养基并如上继续在37℃孵育制备白天培养物。为诱导蛋白质表达，3小时后加入0.5mM IPTG(异丙基β-D-半乳糖苷)至培养物，并且随后再培养培养物三个小时。通过离心沉淀大肠杆菌培养物并在-20℃冷冻沉淀。通过在含完全无EDTA蛋白酶抑制剂(Roche，巴塞尔，瑞士)、25U/mlBenzonase(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州)和1KU/ml rLysozyme(EMD Chemicals，达姆施塔特，德国)的PBS 0.05％Tween 20中冻融大肠杆菌沉淀并在室温下振荡孵育10分钟来制备裂解物。

定点突变

用带有特异突变的引物、按照生产商推荐使用QuikChange II突变试剂盒(QuikChange II mutagenesis kit，Stratagene)完成定点突变。新CHIPS变异经序列证实并转化至大肠杆菌BL-21 Star(DE3)pLysS(E.coli BL-21 Star(DE3)pLysS，Invitrogen)用于蛋白质表达。

人抗CHIPS_31-113IgG的亲和纯化

按照生产商的指导，纯化的CHIPS_31-113连接于溴化氢活化的Sepharose 4B(Amersham Biosciences，乌普萨拉，瑞典)并装填于Tricon 5/20柱(AmershamBiosciences)。按照生产商方法，在

 Prime系统(Amersham Biosciences)上完成亲和纯化。(1克)总人IgG(IV-IgG)(Sanquin，阿姆斯特丹，荷兰)跑过柱子。以0.1M甘氨酸pH 3.0洗脱结合的人IgG并以1M Tris，pH 8.0中和pH。集合含有蛋白质的洗脱部分并在PD-10柱(Amersham Biosciences)上将缓冲液换为PBS。

噬菌体选择

随机突变文库和FIND

文库被克隆至噬菌粒pFAB75(Johansen等，1995)的SfiI和NotI位点并转化至大肠杆菌TOP10F′(Invitrogen)用于在噬菌体颗粒上表达。按标准步骤制备噬菌体储库，使用VSCM13(Stratagene)作为辅助噬菌体(CicortasGunnarsson等，2004)。在包被有终浓度10^-7M的生物素化7-28位氨基酸组成的C5aR肽(生物素-C5aR肽)(AnaSpec，圣何塞，加利福尼亚)和链霉亲和素的磁性Dynabeads(Invitrogen)上完成正向选择。在室温下旋转孵育混合物1小时，然后用含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS 0.05％Tween 20(选择缓冲液)充分洗涤。以1M甘氨酸0.1％BSA，pH 2.2完成肽结合物的洗脱，然后加入1M Tris pH 9.0来中和洗脱物。然后如上所述重复一次选择步骤。在第二轮正向选择之后，CHIPS噬菌体储库直接经受一轮人抗CHIPS_31-113IgG结合的负向选择。在选择缓冲液中洗涤包被人抗CHIPS_31-113IgG的Estapor 0.83微米磁珠(Bangs-Laboratories Inc.，Fishers，印第安纳州)三次，并且随后在选择缓冲液中室温旋转封闭1小时。加入正向选择的洗脱物到珠子并且在室温再孵育其15分钟。在磁铁上分离后，保存上清并用于感染指数生长的大肠杆菌TOP10F′并从大肠杆菌中纯化噬菌粒。

ELISA

整个研究过程中使用ELISA来筛选和鉴定结合。在PBS中用特异蛋白质或抗体4℃过夜包被Maxisorb透明或白色96或384孔板(Nunc，罗斯基勒，丹麦)。如无另外描述，室温下、在100或25微升体积中进行孵育1小时，通常随后以PBS 0.05％Tween 20洗涤三次。使用Super Signal ELISA Pico化学发光底物(Super Signal ELISA PicoChemiluminescent Substrate，Pierce，罗克福德，伊利诺斯州)并测定发光。

蛋白质表达的分析

为定量表达的蛋白质，以3微克/毫升识别CHIPS 24-30位氨基酸的肽的单克隆抗CHIPS抗体2H7包被平板(Haas等，2004)。在含3％奶粉的PBS 0.05％Tween 20中封闭平板，洗涤平板并以ΔC CHIPS变异的裂解物的稀释物来孵育平板。用3微克/毫升多克隆兔抗CHIPS N末端IgG(通过用KLH连接的相应于CHIPS N末端1-14位氨基酸的合成肽免疫兔子所生产的IgG)和辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗兔IgG(Southern Biotech，伯明翰，阿拉巴马州)检测结合。

抗CHIPS IgG结合的分析

为检测人抗CHIPS_31-113IgG与CHIPSΔC变异的结合，如所述包被、封闭和用大肠杆菌裂解物孵育平板来分析蛋白质表达。加入亲和纯化的人抗CHIPS_31-113IgG并用山羊抗人IgG HRP(Jackson ImmunoResearch，西格罗夫，宾夕法尼亚州)检测结合。在最初筛选期间，完成了CHIPS裂解物的单点测定并将其和野生型CHIPS_1-121滴度曲线比较。结果与表达ELISA的结果相关联。绘制了在后面筛选/鉴定中有限数目的变异的全滴度曲线。

肽结合的分析

为了测定CHIPS变异对C5aR肽的结合，包被了5微克/毫升链霉亲和素(Sigma-Aldrich)。此外，在洗涤和封闭平板(2％BSA，在PBS 0.05％Tween 20中)后，加入终浓度至0.3微克/毫升的生物素-C5aR肽(Anaspec)。然后用CHIPS裂解物孵育平板并以1微克/毫升mAb 2H7和HRP-偶联兔抗-小鼠IgG(Dako，Glostmp，丹麦)完成检测。

与CHIPS_1-121竞争的抗CHIPS IgG结合分析

室温下，在聚丙烯平板(Nunc)中，5倍系列稀释的CHIPS变异与60纳克/毫升亲和纯化的人抗CHIPS_31-113多克隆IgG预孵育2小时。包被纯化的野生型CHIPS_1-121于ELISA平板中。以PBS-0.05％吐温20中的4％BSA封闭之后，加入抗体/CHIPS变异混合物至平板并在室温下再孵育2小时。用山羊-抗-人IgG HRP和o-邻苯二胺二盐酸(OPD)底物完成检测。

血清IgG结合的分析

检验了来自人采集血清的IgG与ELISA中CHIPS变异的反应性。用等摩尔量的蛋白质或PBS包被平板。在含3％奶粉的PBS-0.05％吐温20封闭之后，加入系列稀释的人血清。用兔抗人IgG-HRP(Dako)检测IgG与CHIPS变异的结合。

生物学分析

与人C5aR的结合

通过Percoll(Sigma-Aldrich)密度梯度离心，从得自隆德大学医院(隆德，瑞典)的血块黄层中制备人中性粒细胞。用冰冷的水裂解剩余红细胞30秒。最后收集细胞到含有0.05％BSA的RPMI 1640(Lonza，巴塞尔，瑞士)中。

研究了人中性粒细胞及稳定转染细胞系U937/C5aR(从E.Prossnitz博士(新墨西哥大学，阿尔伯克基，新墨西哥州)处得到的慷慨礼物)对于人C5aR的结合。在37℃下、5％CO₂孵箱内、于75cm²细胞培养瓶中生长细胞并在含L-谷氨酸(Lonza)和10％胎牛血清(FBS)(Lonza)的RPMI 1640培养基中维持。通过流式细胞仪以两种方式分析与C5aR的结合。第一种方法中，系列稀释的(通过Invitrogen的Expressway无细胞大肠杆菌表达系统表达的)ΔC CHIPS变异与细胞孵育，并且通过2H7单克隆抗CHIPS抗体、随后的R-藻红蛋白(RPE)标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Dako)检测CHIPS结合。第二种方法中，如上孵育CHIPSΔC变异和细胞，然后通过加入单克隆抗C5aR抗体和RPE-标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白到细胞来定量结合的抑制程度。

C5aR抑制和中性粒细胞迁移的抑制

通过流式细胞仪研究了人中性粒细胞中C5a诱导的钙流动。室温下(RT)在含0.05％BSA的RPMI1640培养基中以2μM Fluo-3AM(Sigma-Aldrich)孵育5×10⁶/毫升中性粒细胞30分钟，然后洗涤并重悬于含0.05％BSA的RPMI1640。然后室温下细胞与3倍系列稀释的纯化CHIPS变异(再克隆成ΔN/C形式)预孵育30分钟并加入C5a(Sigma-Aldrich)(终浓度为3nM)来诱导钙释放。以FACScalibur流式细胞仪(BDBiosciences，圣何塞，加利福尼亚)上荧光的方法测定了此现象。

在transwell系统(Neuro Probe，盖瑟斯堡，马里兰州)中测定C5a诱导的人中性粒细胞的迁移(趋化)。因此用4μM钙黄绿素-AM(Sigma-Aldrich)标记5×10⁶/毫升人中性粒细胞，在含1％人血清白蛋白(HSA)的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)中洗涤并重悬于含1％HSA的HBSS。细胞和一定滴度的纯化CHIPSΔN/C变异在室温下再孵育15分钟。将C5a加至孔的下层部分至终浓度1nM。标记的细胞加至在上层部分。在37℃、5％CO₂条件下孵育平板30分钟。然后以PBS润洗滤膜以去除未迁移细胞，并在荧光读板仪上、于激发485nm和发射530nm测定荧光。

圆二色谱(CD)光谱检测热变性

以1℃/分钟的扫描速率、16秒响应和1nm带宽，在CHIPS变异从4-85℃热解叠期间监测212nm的CD信号。蛋白质浓度是在PBS pH 7.2中0.5毫克/毫升，并使用1毫米光程的石英比色皿。为研究可逆性，在向上扫描之后监测了从85-4℃的热扫描。在每次热扫描之前和之后，在4℃或85℃，自远紫外CD光谱确定结构变化。记录了250-195nm间的光谱，扫描速率是20nm/分钟，响应时间8秒及带宽为1nm。所有CD光谱在带有JASCO PTC-343 Peltier型恒温细胞容器的Jasco(Jasco Inc.，伊斯顿，马里兰州)J-720光谱仪上进行。因为对于所有变异来说热解叠是不可逆的，没有得到热力学稳定性。然而，因为对于所有变异来说以同样速度监控解叠，T_m给出了变异之间的可比较的热稳定性。通过拟合方程1到CD数据获得Tm。

${\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{obs}}=\frac{(k_N\·T+b_N)+(k_U\·T+b_U)\·e^{-(A-(1-(T/T_m))+3000(T-T_m-T\·\ln (T/T_m)))/\mathrm{RT}}}{(1+e^{-(A-(1-(T/T_m))+3000(T-T_m-T\·\ln (T/T_m)))/\mathrm{RT}})}$

(方程1)

在方程1中，ε_obs是在212nm观察到的椭圆率，k_N、b_N、k_U和b_U分别定义为天然和未折叠状态的基线。A是拟合过程中的参数但对于非可逆性解叠没有数值，T是开尔文温度及R是气体常数。在方程中，假设蛋白质遵守双态变性过程并在温度区间内具有常数ΔC^o _p，以使变性遵守Gibbs-Helmholtz方程。对于这样的解叠，参数A是ΔH^o并且ΔC^o _p测量值估计是3000，但这些参数对于非可逆性解叠没有相关性。

分子建模

通过使用可获得的CHIPS_31-121NMR结构(PDB号：1XEE)(Haas等，2005)和PyMol分子绘图程序(DeLano，2008)完成了建模。

结果

创建具有低抗体结合的CHIPS变异的策略

在一轮随机突变和三轮FIND

重组、随后是计算机分析和合理设计(图4)中完成了用于降低抗CHIPS抗体相互作用但保留C5aR封闭活性的进化。在N-和C-末端截短的短些的CHIPS变异(CHIPSΔN/C)和单突变K61A、K69A和K100A(这些突变之前显示出较不容易结合人抗CHIPS抗体(数据未显示))被选做用于优化过程的起始材料。保留CHIPS中前面的30个N末端氨基酸(不对其做突变或重组)作为ELISA中捕获抗体的识别序列。然后在鉴定生物学活性(C5aR抑制)前将选择的克隆再克隆成截短的(CHIPSΔN/C)形式。

为增加找到具有降低抗体结合的新CHIPS变异的可能性，应用若干ELISAs来研究CHIPS和亲和纯化抗CHIPS_31-113IgG间的相互作用。对于文库1、3和4的每一个，用ELISA完成若干轮筛选。通过单点测定完成每轮的最初筛选，而在后期各轮筛选中通过绘制每个所选突变的完全滴度曲线来更全面地完成分析。

此外，为在选择和筛选期间保持新CHIPS变异的生物功能性，持续监测了与C5aRN末端7-28位氨基酸的肽的结合。之前C5aR的10-18位残基显示是CHIPS的结合结构域(Postma等，2005)。C5aR的11和14位酪氨酸残基曾显示被硫酸化，其显示对于C5a依赖性激活C5aR至关重要(Farzan等，2001)。最近的对于CHIPS结合于C5aR N末端的肽的研究，强调了11位和14位处的硫酸化酪氨酸对于CHIPS结合的作用并显示了CHIPS以高亲和性结合于硫酸化C5aR N末端肽(Ippel等，2009)。

随机突变文库及筛选

通过随机突变在CHIPSΔC序列中引入多样性。创建了具有不同突变频率的四个文库(表1描述了文库的细节)。所有四个文库经过噬菌体选择；首先是C5aR肽结合(正向选择)，然后是选择降低的抗CHIPS抗体结合(负向选择)。集合负向选择的上清，用其感染大肠杆菌并纯化噬菌粒。再克隆自突变集合的CHIPS编码序列至表达载体pRSET B，并且随后以平板形式表达了360个CHIPS变异并以ELISA筛选其降低的抗CHIPS_31-113IgG结合(图5A)。以ELISA进一步分析了具有最低的抗CHIPS_31-113IgG结合的64个克隆的保留的C5aR肽结合。从这些克隆中，选择出具有高C5aR肽结合的30个克隆，通过在ELISA中绘制完全滴度曲线进一步分析其降低的抗CHIPS_31-113IgG结合。最终，具有显著降低的抗CHIPS_31-113IgG结合但保留C5aR肽结合的9个克隆被选择用于FIND

的DNA重组。

FIND

文库及筛选

FIND

第一轮

从随机突变步骤选择的9个克隆(含有总共18个氨基酸置换)创建了具有不同重组频率(即不同数目的交换体)的两个文库(表1)。使用易错条件用FIND

创建了文库2.2以增加文库中所用的父本多核苷酸的多样性。

如上所述对文库进行噬菌体选择并集合来自负向选择的上清，并从大肠杆菌中纯化噬菌粒。此DNA集合被用作第二轮FIND

的起始材料。

FIND第二轮

在第二轮FIND重组中，创建了一文库(表1)。以平板形式表达并筛选了6.3×10³个克隆。ELISA中显示了最大70％的野生型CHIPS_1-121与抗CHIPS_31-113IgG的结合、及至少80％的野生型CHIPS_1-121与C5aR肽的结合的320个克隆被选择，用于第二轮ELISA筛选较低的抗CHIPS_31-113IgG结合(图5A)。

在这些克隆中，40个克隆显示了与野生型CHIPS_1-121相比小于40％的结合，并随后以ELISA中剂量依赖性设置(set up)对其进一步分析。确定了每个变异的EC₅₀值(即介导最大值一半结合的每个CHIPS变异的浓度)和平稳值并与野生型CHIPS_1-121比较。在抗CHIPS_31-113IgG结合中显示了至少2.4倍高EC₅₀和最大54％的野生型CHIPS_1-121平稳值的12个克隆被选择用于最后一轮FIND

重组。

FIND

第三轮

在最后一轮FIND

重组中创建了两个文库。第一个文库基于呈现出14个氨基酸变化的所选克隆的六个，而第二个文库由上一轮FIND(总共25个氨基酸变化)(表1)期间所选的所有12个克隆制成。两个文库都通过使用两轮重复的FIND

、两轮间不加选择或筛选来设计，这生成了比以前的文库(表1)有更高频率的重组克隆(92％)。以平板形式表达了9.6×10³个克隆并以ELISA筛选了其降低的人抗CHIPS_31-113IgG结合。1000个克隆显示了最大10％的野生型CHIPS_1-121与抗CHIPS_31-113IgG的结合，并以ELISA进一步分析了其C5aR肽结合。显示了与野生型CHIPS_1-121相比至少95％的C5aR肽结合的96个克隆被选择，用于以ELISA进一步分析降低的抗CHIPS_31-113IgG结合，和以流式细胞仪分析保留的C5aR结合(图5A，C)。与野生型CHIPS_1-121相比克隆显示了平均7.1％的与抗CHIPS_31-113IgG的结合。与野生型CHIPS_1-121相比最改进的克隆显示了2.5％的结合(图5B)。在图5C中显示了96个克隆的分布。

测序之后，鉴定了42个独特的克隆。在最后一轮筛选后，与野生型CHIPS_1-121相比，所有42个克隆显示了小于10％的与抗CHIPS_31-113IgG的结合。通过无细胞蛋白质表达系统表达这些克隆以改善蛋白质产量，并且进一步以ELISA和流式细胞仪鉴定产物。显示了与人C5aR的最高结合及与抗CHIPS_31-113IgG的低结合(小于13％的CHIPSΔC)的10个克隆(图6)被选择用于进一步突变。在此彻底鉴定期间，与之前筛选中所测定的相比，少量的克隆显示出与抗CHIPS_31-113IgG的更高结合，因此设定截止值为13％代替之前的10％。

分子建模与合理设计

为更进一步降低与抗CHIPS_31-113IgG的相互作用，通过定点突变10个所选克隆的四个创建了27个新CHIPS变异(表3和4)。通过引入新突变至这些特定克隆，呈现了定向进化期间鉴定的所有12个突变位点。通过分析蛋白质结构、并对于定向进化期间生成的突变氨基酸残基的结构作用给予特别的关注，设计了定点突变。建议在这些突变位点的某些中进行新的置换，并且这些置换也加入到与定向进化期间生成的克隆相比的新组合。

以ELISA分析了突变的抗CHIPS_31-113IgG结合并以流式细胞仪分析了突变的C5aR结合和封闭(基于C5a依赖性激活C5aR的Ca²⁺释放的抑制)。具有C5aR封闭最大IC₅₀值为野生型CHIPS_1-121的四倍的16个克隆被选择用于进一步鉴定。112位为甘氨酸或丙氨酸的克隆比此位为缬氨酸的克隆显示了更高的与C5aR结合。因为此原因，在最后的克隆中V112突变为丙氨酸。

CHIPS变异的鉴定

为了研究所选CHIPS变异和抗CHIPS_31-113IgG之间以及和人C5aR之间的相互作用，再克隆最终的16个克隆成CHIPSΔN/C形式，并且生产蛋白质，并如前所述(Gustafsson等，2009)通过充分洗涤包涵体、增溶、复性(向PBS中逐滴加入蛋白质溶液)及凝胶过滤从包涵体中纯化蛋白质。在以ELISA进一步分析CHIPS与血清IgG的结合及以流式细胞仪分析生物功能性之后，最终有7个克隆可以被选出作为最有前景的备选物。此选择基于下列标准：血清IgG滴度最大为所观察到的野生型CHIPS_1-121的2.5％及C5aR封闭活性至少为所观察到的野生型CHIPS_1-121的25％。通过研究中性粒细胞迁移(趋化)的抑制及通过以圆二色谱确定T_m值(表2)，进一步鉴定了这些克隆。温度变性显示了所有克隆与CHIPSΔN/C相比具有高溶解温度。某些变异显示了低温处的些微转变及高温处的主要转变，说明了低温处的部分解叠。CHIPSΔN/C显示了可逆解叠而所有七个克隆显示了不可逆热解叠。这暗示了与CHIPSΔN/C相比解叠状态下克隆的更高聚集倾向。

图7显示了在随机突变、FIND

和合理设计之后获得的顶端七个克隆的序列比对。克隆的每条序列含有五个到八个突变。三个突变位置位于α螺旋，一个位于β₁和β₂链间的噜扑环，两个位于β₂和β₃链间的噜扑环，一个位于β链3，一个位于β₃和β₄链间的噜扑环以及两个位于β链4。更特异的是，在四个或更多克隆中，K40、D42、N77、K100、N111和G112位以K50、K69、K92和K105位的突变的不同组合突变。在克隆中最普遍的是N77Y、111K和G112A置换，在七个克隆中的六个中有所呈现。人们已发现，在顶端七个克隆中，突变的特异性组合对于低IgG滴度、高C5aR封闭活性及趋化抑制的低IC₅₀方面来说是有利的。

讨论

以前，药物主要依赖于化学或合成生产的小分子药物。最近，随着重组DNA技术、高通量筛选和蛋白质组学的发展，蛋白质药物已经变得更为重要。尽管对于药物开发来讲，蛋白质的某种特征是相关的，但为了设计有前景的药物备选物，需要改进蛋白质的其他性质。现在，已经有许多(获准或在临床试验期)的药物通过使用蛋白质工程进行了优化。组织纤维蛋白溶酶原活化子(t-PA)已经进行几次改进以最终具有血清中较长的半衰期以及对于纤维蛋白的较高特异性((Keyt等，1994)。tPA的这种工程化版本(TNKase)目前已获准用于治疗急性心肌梗死。ANYARA是个具有肿瘤特异性的超抗原偶联的抗体，现正进行临床试验。超抗原SEA(葡萄球菌肠毒素A)的抗原性已被降低以使ANYARA成为更吸引人的抗肿瘤药物备选物(Erlandsson等，2003)。

与精心设计的筛选方法相结合，定向进化可被用以改进蛋白质的几乎任意特征，即改进的亲和性、更高的药性或降低的免疫原性。然而，在改进相关特定性质时，持续监测蛋白质的其他(在优化特定性质时也会被改变)显著特征是很重要的。

在此研究中，我们能够降低与人抗体的相互作用到只有野生型CHIPS_1-121的0.5％而保持C5aR封闭活性。通过各轮次定向进化及筛选期间持续监测C5aR结合(以保证优化过程中不会丢失此性质)实现了这个结果。此外，为增加找到具有降低的抗体结合的新CHIPS变异的可能性，在各轮筛选期间应用了若干方法来证实此性质。

应用定向进化(随机突变和FIND

)和计算机/合理设计相结合，以朝与特异性人抗体相互作用更低的方向改进CHIPS分子。首先以随机突变引入多样性至序列中，其后是顺序完成三轮FIND

重组。不需要事先知道CHIPS的抗原表位，在上一轮中发现的有益突变被重组以形成新的CHIPS变异，并且随每轮进行抗体结合显示出有所降低。在最后一轮FIND之后，最好的克隆显示了与人抗CHIPS_31-113IgG的结合降低到只有与野生型CHIPS_1-121结合的2.5％。这个是通过应用定向进化实现的结合的显著降低。然而，为更进一步降低结合，通过分子建模设计定点突变并引入了另外的突变。通过分析在定向进化过程中发现的重要位点的结构分布实现了这个目的。

顶部七个克隆中的突变组合决定了这些变异的独特性质。在尝试研究不同突变残基的贡献时，进行了在最终七个克隆中最经常突变的位置；D42、N77、N111和G112的结构分析。D42是在α-螺旋中的氨基酸，它看起来对于分子间相互作用是重要的。置换成缬氨酸(V)潜在地打断了D42和R46间形成的H-H键。此变化可以改变CHIPS的结构并可能还改变了一抗体表位。在42位引入疏水的缬氨酸看起来增加了分子的稳定性。最可能的是，这个疏水残基与结构内部非常吻合并稳定了疏水核心，而那可能是为什么在七个所选克隆的六个中都呈现出此突变的原因。然而，因增加的疏水性，突变可以影响未折叠状态的可逆性和聚集倾向性。N77在六个克隆中突变为酪氨酸(Y)并在一个克隆中突变为组氨酸(H)。在β2-β3噜扑中N77是暴露的，并能够直接涉及抗体结合。比较N77Y和N77H，显示了此位置上酪氨酸比组氨酸相比增加了稳定性。另一方面，与除了77位处的酪氨酸之外均相同的克隆335相比，在此位置上具有组氨酸的克隆376更好地保留了生物功能(趋化抑制)。N111是β4内暴露的残基。此位置在置换为赖氨酸(K)时变为带更多正电，这是个表面的显著变化，在七个克隆的六个中显示为有益的。β4中的G112不是特别暴露。发现在此位置小氨基酸是有利的。如果是大氨基酸(如缬氨酸)被插入此位置，它可能与M93冲突，并且结果是影响到结构。人们发现，在带G112V突变的所有克隆中，改变定向进化中选出的G112V突变为丙氨酸(A)对于保留C5aR封闭活性是有益的。有趣的是，七个顶部克隆的三个(变异335、338和377)与定向进化中发现的一样，但在112位置换为A而非V。

其他人也曾成功应用了随机突变或定向进化与计算机/合理设计相结合的方法((Buskirk等，2004)。例如，可以首先使用突变来提供关于突变中重要的残基的信息。这样，可以从随机化观点而不是基于合理的选择指导突变((Lingen等，2002)。

去除抗体表位相关于免疫学内几个学科。在过敏研究中，去除IgE表位以创建用作备选疫苗的防过敏的过敏原衍生物((Linhart等，2008；Mothes-Luksch等，2008；Szalai等，2008；Vrtala等，2004)。我们所知的是，这项工作通过表位作图和随后的基因工程或通过设计镶嵌蛋白质或杂合分子来完成，以获得具有降低的过敏活性和保留免疫原性的衍生物。我们的结果阐明了通过使用定向进化和计算机/合理设计能够有效降低蛋白质中人IgG的表位。此消除抗体表位的随机方法可以有效用于如设计抗过敏过敏原衍生物。

总之，通过使用定向进化、计算机分析和合理设计我们生成了具有降低的与特异人IgG相互作用、而不高度影响CHIPS和C5aR相互作用的新CHIPS分子。此工作产生了比野生型CHIPS_1-121蛋白质更适于治疗用途的CHIPS变异，因为这些变异最不可能与人抗体形成复合物，并且因此它们能被更好地耐受并更有效地作为人血清中的C5aR拮抗剂发挥作用。在这些变异中，有一个变异(376)被鉴定为具有未预期的有利性质。这个克隆被命名为ADC-1004。

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表1.文库特征

¹对来自每个文库的24个克隆完成了序列分析。

²突变显示为碱基变化和括号中的氨基酸变化。

³N/D未确定

⁴N/A不可应用

表3.在第四轮多样化和筛选之后10个所选克隆中的突变

表4.在FIND

重组之后所选的四个克隆中的定点突变

实施例3-3C4 scFv的定向进化

3C4 scFv

对于FIND实验，使用载体特异性引物(MWG，埃伯斯贝格，德国)扩增相关基因。除非另外指明，100μl总体积的PCR反应包括1mM每种引物、200mM每种dNTP(New England Biolabs，马萨诸塞州，USA)、1xAmpliTaq反应缓冲液，1.25U AmpliTaq热稳定性DNA多聚酶(Applied Biosystems，加利福尼亚，USA)。标准PCR程序由变性步骤(94℃，2分钟)，25个循环的94℃、1分钟，60℃、1分钟及72℃、1分钟及最终延伸(72℃，7分钟)组成。

从3.10E5、2.7G5、2.10H3或3.10D1(3C4 scFv的四个突变)制备代表正义和反义链的ssDNA。使用一生物素化和一非生物素化引物生产PCR产物，因而生物素被偶联到正义或者反义链上。PCR产物被固定至放置于μMACS分离器磁场中、含链霉亲和素偶联磁珠的柱子上(珠子和分离器均来自Miltenyi Biotec，贝尔吉施 格拉德巴赫，德国)。以0.1M NaOH变性PCR产物并收集洗脱的ssDNA。获得的ssDNA以琼脂糖凝胶(Cambrex，马里兰州，美国)电泳进行分析，根据生产商推荐使用Recochip(TaKaRa，志贺，日本)纯化，并最终乙醇沉淀。

FIND

实验通过片段化正义和反义ssDNA来起始，在分开的管子中、生产商推荐的条件下分别用核酸外切酶I(Exo I)(100U/μg DNA，New England Biolabs，马萨诸塞州，美国)(Lehman等，1964)处理10分钟、核酸外切酶V(Exo V)(25U/μg DNA，USB，俄亥俄州，美国)(Anai等，1970a；Anai等，1970b)处理30分钟和核酸外切酶VII(Exo VII)(5U/μg DNA，USB，俄亥俄州，美国)(Chase等，1974a；Chase等，1974b)处理30分钟。通过在96℃热灭活10分钟来终止外切酶催化反应。

使用第一步(易错)PCR反应(PCR1)重组外切酶消化(每个消化的20ng)得到的ssDNA片段并组装为全长产物多核苷酸，PCR反应包括变性步骤(94℃，60秒)，25个循环的94℃、30秒，45℃、30秒及72℃、60秒和最终延伸(72℃，7分钟)，在50μl总体积中含0.2mM dATP、0.2mM dGTP、1mM dTTP、1mM dCTP、7mM MgCl₂、0.5mM MnCl₂、和1.25U的AmpliTaq DNA而不加引物。

然后在第二个PCR反应(PCR2)中、以两种不同方式扩增来自PCR1的材料：

1.传统(即非易错)PCR2a反应由变性步骤(94℃，60秒)，15或20个循环的94℃、30秒，55℃、30秒及72℃、60秒和最终延伸(72℃，7分钟)组成，包括有0.8mM的每种引物。

2.易错PCR2b反应由变性步骤(94℃，60秒)，20个循环的94℃、30秒，55℃、30秒及72℃、60秒和最终延伸(72℃，7分钟)组成，在50μl总体积中含0.8mM每种引物，含0.2mM dATP、0.2mM dGTP、1mM dTTP、1mM dCTP、7mM MgCl₂、0.5mM MnCl₂、和1.25U的AmpliTaq DNA。

以SfiI/NotI消化FIND EP1和EP2文库，并连接至pFAB75(Jan Engberg，药理学系，哥本哈根，丹麦)的SfiI/NotI位点。对单个克隆进行测序并分析重组和新引入的突变。

结果

突变版本scFv 3C4的建立

生成了三个不同的突变文库：

a.FIND1.4EP1文库在FIND实验中使用下列克隆：3.10E5、2.7G5、2.10H3和3.10D1。第一个PCR在易错条件(即PCR1随后为PCR2a条件)下完成。55％的克隆包含重组并引入了0.7突变/基因。

b.FIND1.4EP2文库在FIND实验中使用下列克隆：3.10E5、2.7G5、2.10H3和3.10D1。PCRI和PCRII均在易错条件(即PCR1随后为PCR2a条件)下完成。所有测序的克隆包含重组并引入了3.5突变/基因。

c.FIND1.8文库在FIND实验中使用下列克隆：3.10E5、2.7G5、3.7D9、3.3D7、2.10H3、3.7C10、3.9G2和3.10D1。60％的克隆包含重组，并且使用标准FIND条件(即如WO 02/48351、WO 03/097834和WO 2007/057682中所述)引入了0.8突变/基因。

总结

在扩增阶段使用易错PCR使得产生的文库的突变水平降低。

实施例4-CHIPS定向进化

对于FIND

实验，使用载体特异性引物(MWG，埃伯斯贝格，德国)扩增相关基因。除非另外指明，在总体积50μl的PCR反应中包括0.5mM每种引物、200mM每种dNTP(New England Biolabs，马萨诸塞州，美国)、1xAmpliTaq反应缓冲液，1.25U AmpliTaq热稳定性DNA多聚酶(Applied Biosystems，加利福尼亚，美国)。标准PCR程序由变性步骤(94℃，2分钟)，35)个循环的94℃、1分钟(30秒)，54℃、30秒及72℃、30秒及最终延伸(72℃，7分钟)组成。

从CHIPS：3H1、2C9、7E4、6E1、7B3、2D5、4E4、1F8和5H制备代表正义和反义链的ssDNA。使用一生物素化和一非生物素化引物生产PCR产物，因而生物素被偶联到正义或者反义链上。PCR产物被固定至放置于μMACS分离器磁场中、含链霉亲和素偶联磁珠的柱子上(珠子和分离器均来自Miltenyi Biotec，贝尔吉施 格拉德巴赫，德国)。以0.1M NaOH变性PCR产物并收集洗脱的ssDNA。获得的ssDNA以琼脂糖凝胶(Cambrex，马里兰州，美国)电泳进行分析，根据生产商推荐使用Recochip(TaKaRa，志贺，日本)纯化，并最终乙醇沉淀。

通过分别片段化正义和反义ssDNA来起始FIND

实验，在分开的管子中、生产商推荐的条件下分别用核酸外切酶I(Exo I)(100U/μg DNA，New EnglandBiolabs，马萨诸塞州，美国)(Lehman等，1964)处理10分钟、和核酸外切酶VII(Exo VII)(10U/μg DNA，USB，俄亥俄州，美国)(Chase等，1974a；Chase等，1974b)处理30分钟。通过在96℃热灭活10分钟来终止外切酶催化反应。

核酸外切酶消化产生的ssDNA片段(每个消化的30ng，fw/rev ExoI/ExoVII；总共120ng)或者以上述不加引物的PCR反应重组(文库2.1)或者在第一个PCR反应(PCR1)中重组，PCR1反应由变性步骤(94℃，2分钟)，25个循环的94℃、30秒，50℃、45秒及72℃、60秒和最终延伸(72℃，7分钟)组成，在50μl总体积中含0.5mM dATP、0.5mM dGTP、1mM dTTP、1mM dCTP、7mM MgCl₂、0.5mM MnCl₂、和1.25U的AmpliTaq DNA多聚酶而不加引物(文库2.2)。

或者以标准PCR反应(文库2.1)或者以第二个易错PCR反应(PCR2)扩增来自PCR1的材料，PCR2反应由变性步骤(94℃，2分钟)，20个循环的94℃、30秒，57℃、30秒及72℃、60秒和最终延伸(72℃，7分钟)组成，在100μl总体积中，包括有0.3mM的每种引物，0.2mM dATP、0.2mM dGTP、1mM dTTP、1mM dCTP、7mM MgCl₂、0.5mM MnCl₂、和1.25U的AmpliTaq DNA多聚酶(文库2.2)。每PCR1反应完成5个PCR2反应。

结果

表5.

¹对来自每个文库的24个克隆进行了序列分析。

²突变显示为碱基变化

Claims (57)

1.一种自父本多核苷酸序列生成多核苷酸序列或序列集群的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供父本多核苷酸分子集群，该集群包括正链和负链；

(b)处理父本多核苷酸分子集群以生成其多核苷酸片段集群；

(c)在允许重叠片段对形成的条件下孵育多核苷酸片段集群；及

(d)用多聚酶扩增重叠片段对以生成一个或多个与父本多核苷酸分子序列不同的产物多核苷酸分子

其中在有利于引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子的条件下完成，至少部分，步骤(d)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中父本多核苷酸分子编码一个或多个蛋白质基序。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中父本多核苷酸分子是cDNA分子。

4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中父本多核苷酸分子是双链的。

5.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中父本多核苷酸分子是单链的。

6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中父本多核苷酸分子集群包括第一亚群和第二亚群。

7.根据权利要求6所述的方法，其中第一亚群包括父本多核苷酸分子的单链正链或由父本多核苷酸分子的单链正链组成并且第二亚群包括父本多核苷酸分子的单链负链或由父本多核苷酸分子的单链负链组成。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中父本多核苷酸分子的第一亚群和第二亚群在步骤(b)中被分别处理。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，在步骤(b)中，用于处理多核苷酸分子第一亚群的反应的至少一个参数与用于处理多核苷酸分子的第二亚群的等价参数不同。

10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(b)包括暴露父本多核苷酸分子于一个或多个核酸酶。

11.根据权利要求10所述的方法，其中核酸酶选自核酸外切酶、核酸内切酶和限制性酶。

12.根据权利要求11所述的方法，其中核酸酶是核酸外切酶。

13.根据权利要求12所述的方法，其中核酸外切酶选自于BAL31、核酸外切酶I、核酸外切酶V、核酸外切酶VII、核酸外切酶T7基因6、细菌噬菌体λ核酸外切酶和核酸外切酶Rec J_f。

14.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(b)包括暴露父本多核苷酸分子于物理片段化刺激物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中物理片段化刺激物选自雾化、超声、热和流体力学剪切。

16.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(b)包括通过随机切割父本多核苷酸分子生成片段。

17.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(b)包括通过非随机切割父本多核苷酸分子生成片段。

18.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(c)包括，首先在允许双链片段变性的条件下孵育多核苷酸片段集群，随后在允许单链片段再退火的条件下孵育多核苷酸片段集群，以生成重叠片段对。

19.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(d)包括以下的重复循环：

(i)延伸重叠片段对的多核苷酸链以生成延长的片段对；

(ii)变性延长的片段对的组成链；及

(iii)再退火组成链以生成新的重叠片段对。

20.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(d)包括加入引物以允许全长产物多核苷酸分子的扩增。

21.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(d)包括一个或多个产物多核苷酸分子的PCR扩增。

22.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(d)包括克隆一个或多个产物多核苷酸分子至表达载体。

23.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中，在步骤(d)中，有利于引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子的条件允许易错聚合。

24.根据权利要求23所述的方法，其中步骤(d)包括使用易错多聚酶以引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子。

25.根据权利要求24所述的方法，其中易错多聚酶选自Taq多聚酶、嗜黄曲霉DNA聚合酶I、嗜热栖热HB-8DNA聚合酶I、嗜热曲霉DNA聚合酶I、嗜热brokianusDNA聚合酶I、嗜热caldophilusGK14 DNA聚合酶I、嗜热filoformisDNA聚合酶I、嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶I、芽孢杆菌caldotonexYT-G DNA聚合酶I、芽孢杆菌caldovelox YT-F DNA聚合酶I和其他真细菌DNA聚合酶V。

26.根据权利要求23或25所述的方法，其中步骤(d)包括使用易错PCR以引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子。

27.根据权利要求23至26任一项所述的方法，其中易错聚合具有至少0.01％的错误率，例如至少0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、2.0％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、10％、20％、30％或更高、并最优选0.08％至5％。

28.根据权利要求23至27任一项所述的方法，其中，在步骤(d)中，有利于引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子的条件包括在聚合反应中突变增强剂的使用。

29.根据权利要求28所述的方法，其中突变增强剂是Mn²⁺。

30.根据权利要求28所述的方法，其中突变增强剂是链稳定性核苷酸类似物。

31.根据权利要求30所述的方法，其中链稳定性核苷酸类似物选自dITP、dUTP、7-脱氮-dGTP、8-氧代-dGTP和N4-甲基-2′-脱氧胞苷5′-三磷酸。

32.根据权利要求23至31任一项所述的方法，其中，在步骤(d)中，有利于引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子的条件包括改变聚合反应中的一个或多个组分的浓度。

33.根据权利要求32所述的方法，其中Mg²⁺浓度被改变。

34.根据权利要求33所述的方法，其中Mg²⁺浓度被增加。

35.根据权利要求34所述的方法，其中Mg²⁺浓度与传统PCR所使用的浓度相比增加了至少两倍，例如3倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。

36.根据权利要求32至35任一项所述的方法，其中在聚合反应中改变了dNTP浓度。

37.根据权利要求36所述的方法，其中在聚合反应中改变了dATP与dTTP的相对浓度。

38.根据权利要求36所述的方法，其中在聚合反应中改变了dGTP与dCTP的相对浓度。

39.根据权利要求37或38所述的方法，其中dATP与dTTP和/或dGTP与dCTP的相对浓度至少改变了2倍，例如3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。

40.根据权利要求23至39任一项所述的方法，其中，在步骤(d)中，有利于引入突变至一个或多个产物多核苷酸分子的条件包括改变聚合反应中延伸步骤的温度。

41.根据权利要求40所述的方法，其中升高延伸步骤的温度。

42.根据权利要求41所述的方法，其中延伸步骤的温度升高0.1至60℃，例如1至50℃、1至40℃、1至30℃、1至20℃、1至10℃或1至5℃。

43.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中，在步骤(d)中引入至一个或多个产物多核苷酸分子的突变与编码多肽的改变的性质相关。

44.根据前述权利要求任一项所述的方法，还包括表达至少一个步骤(d)中生成的产物多核苷酸分子以生产编码多肽的步骤。

45.根据权利要求44所述的方法，还包括检验编码多肽的改变的特征的步骤。

46.根据前述权利要求任一项所述的方法，包括以下步骤：

(a)提供第一群多核苷酸分子和第二群单链多核苷酸分子，第一和第二群一起组成一个或多个父本多核苷酸分子的正链和负链；

(b)以核酸外切酶消化第一和第二群多核苷酸分子以生成单链多核苷酸片段；

(c)(在允许片段退火的条件下)所述自正链生成的单链多核苷酸片段与自负链生成的单链多核苷酸片段接触；及

(d)扩增相互退火的片段以生成产物多核苷酸分子文库，至少某些产物多核苷酸分子与父本多核苷酸分子序列不同

其中步骤(d)包括使用易错PCR来引入一个或多个突变至产物多核苷酸分子。

47.一条通过如权利要求1至46任一项所述的方法获得的或可获得的多核苷酸。

48.一个包括如权利要求47所述的多个多核苷酸的多核苷酸文库。

49.一个包括如权利要求47所述的多核苷酸的载体。

50.一种用于制备具有改变的性质的多肽的方法，该方法包括下列步骤：

(a)使用如权利要求1至46任一项所述的方法生成突变形式的父本多核苷酸；

(b)表达步骤(a)中生产的变异多核苷酸以生产变异多肽；

(c)筛选变异多肽的改变的性质；及

(d)自变异多肽中选择具有改变的性质的多肽。

51.一条通过如权利要求50所述的方法获得的或可获得的多肽。

52.一种药物组合物，包括如权利要求47所述的多核苷酸或如权利要求51所述的多肽及药物可接受的载体。

53.根据权利要求47所述的多核苷酸或根据权利要求51所述的多肽用于药物。

54.根据权利要求47所述的多核苷酸或根据权利要求51所述的多肽在制备用于疾病处理、治疗和/或诊断的药剂中的用途。

55.用于制备药物组合物的方法，该方法包括，通过如权利要求1至46任一项所述的方法鉴定具有改变的序列或特征的多核苷酸和/或编码多肽之后，加入所述多核苷酸和/或编码多肽至药物可接受的载体中。

56.参考实施例，生成基本上如上文所述的多核苷酸序列或序列集群的方法。

57.参考实施例，制备具有基本上如上文所述的改变的性质的多肽的方法。

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