CN102410995B - 基于荧光偏振分析的ip3受体靶标药物的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于荧光偏振分析的IP3受体靶标药物的筛选方法,本发明首次测定了不同温度下配体的解离平衡常数K D 值,根据不同温度下配体的解离平衡常数K D 值首次测定了不同温度下配体结合的自由能变。本发明与目前最精确的药物功效预测技术相比,比如电生理技术(electrophysiology),核磁共振技术(NuclearMagneticResonance)等,它能更准确的预测药物效能(efficacy),因为它通过热动力学可以把药物对靶点的作用进行精确的量化。另外,本发明还具有高通量和微型实验性质的优点。因此,本发明将是靶向药物功效预测的趋势所在。
Description
技术领域
本发明涉及靶向药物功效预测方法的技术领域,具体的,涉及基于荧光偏振分析的IP3受体靶标药物的筛选方法。
背景技术
1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。以一束单一波长的偏振光照射溶液中的荧光物质,后者可吸收并释放出相应的偏振荧光。如果被激发的荧光物质处于静止状态,该物质仍将保持原有激发光的偏振性,如果其处于运动状态,该物质发出的偏振光将区别于原有激发光的偏振特性,也就是所谓荧光去偏振现象。
近年来,以这种物理学现象为基础的技术正在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。本申请人将荧光偏振现象结合现代物理中的热动力学应用于药学研究当中,发明了一套高通效的药物功效预测技术。
1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3受体)是调节Ca2+释放的配体门控通道。该受体可以结合IP3后被激活。IP3受体是四聚体。每个亚单位包括2700个残基,每个亚基N末端(NT,1-604)附近具有IP3结合中心(IBC,224-604),C-末端具有6个跨膜蛋白。最末端的一对跨膜区域,连同其四个亚单位的每个转弯环区,构成孔隙结构。当3~4个部位被IP3占据时, IP3受体复合物构象发生改变, 打开孔隙结构, 储存的Ca2+ 随即释放。现有技术中,大部分研究者采用电生理技术(electro physiology)或者核磁共振技术(Nuclear Magnetic Resonance)来预测候选的IP3靶向药物的药效。
电生理技术虽然精确度高,但是它操作十分复杂,且失败率非常高(98%),因此对实验人员的技术和经验要求相当高。一位拥有10年以上经验的电生理博士后研究员,可能会花上2天的时间才能预测一种候选药物的功效。对于核磁共振技术(Nuclear Magnetic Resonance),其耗费的时间起码在2天以上的时间。一个新药研发项目最初的候选药物通常超过10万个,经过初筛以后进入药学研究阶段的药物通常也超过1万个。因此,如果单一药物的预测时间都要几天的时间,那么对于上万种药物都进行精确预测所花费的时间和费用是非常高昂的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供基于荧光偏振分析的IP3受体靶标药物的筛选方法。该筛选方法可以把药物对细胞内信号传导通路的影响进行量化,比较精确的预测出药物的功效;基于荧光偏振技术操作简单的特点,结合现代机器人技术,还可以实现药物筛选的高通量,即能同时预测上百种药物的功效;大大缩减实验时间,节省药物研发费用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是基于荧光偏振分析的IP3受体靶标药物的筛选方法,步骤如下:
A.提供荧光标记配体、作为竞争配体的待测化合物、以及3种包含IP3结合结构域的受体多肽;分别为受体IBC、受体NT和受体V33K-NT;所述受体IBC是位于IP3R受体224-604位的IP3结合中心,所述受体NT是野生型的位于IP3R受体1-604 位的IP3受体N末端片段,所述受体V33K-NT是受体NT的33位氨基酸突变为赖氨酸的突变型IP3受体N末端片段;
B.竞争结合分析实验:将所述步骤A中的荧光标记配体、待测化合物、至少一种受体多肽置于容器内混合;
C.通过荧光偏振技术测定所述步骤B的容器在不同温度下对应的荧光各向异性度A,计算对应温度下待测化合物与相应受体多肽竞争结合时的平衡解离常数K D 值,根据平衡解离常数K D 值计算得到相应温度下的焓变ΔH,每种受体的焓变ΔH分别表示为ΔH IBC、ΔHNT 和ΔHV33K;
D.计算ΔH IBC与ΔHNT的差值,ΔH IBC与ΔHNT的差值用Δ(ΔH IBC -NT)表示,Δ(ΔH IBC -NT)的绝对值越小,则待测化合物的药效越强;或者计算ΔHV33K和ΔHNT的差值,ΔHV33K和ΔHNT的差值用Δ(ΔHV33K-NT)表示,Δ(ΔHV33K-NT)的绝对值越大,则待测化合物的药效越强。
进一步的技术方案,所述荧光标记配体是将荧光素通过共价键连接到IP3制备的。
进一步的技术方案,所述荧光标记配体是FITC-IP3。
综上所述,本发明与现有技术相比,具有如下优点:
(1)本发明首次测定了不同温度下配体的解离平衡常数KD值,首次测定了不同温度下配体结合的自由能变。
(2)本发明与目前最精确的药物功效预测技术相比,比如电生理技术(electro physiology),核磁共振技术(Nuclear Magnetic Resonance)等,它能更准确的预测药物效能(efficacy),因为它通过热动力学可以把药物对靶点的作用进行精确的量化。从热动力学的角度来说,药物与靶点结合是两种过程的推动结果,即熵(entropy,物质混乱的程度),和焓(enthalpy,物质能量)。把热动力学与分子生物学结合起来,则我们可以根据药物与靶点结合的熵值和焓值来推测药物与靶点结合后对其造成了多大的改变,从而预测该药物对细胞内信号传导通路产生了多大的影响。更为重要的是,通过这一技术,我们可以把药物对细胞内信号传导通路的影响进行量化,比较精确的预测出药物的功效。通过对8种已知药物的实验,并与电生理技术对比,证明了荧光偏振技术对药物功效预测的准确性。
(3)本发明的第二个特点是它的微型实验性质,本发明所需实验耗材的费用只有其它传统技术的一半。核磁共振技术需要大量高纯度的靶点蛋白,而电生理技术由于成功率非常低,也需要非常多的带有研究靶点的转基因细胞与其它实验试剂。而荧光偏振技术则不同,它对靶点蛋白的纯度与数量的需求相当小。通过应用现代机器人技术与高精度微量液体取样技术,本申请人实现了该技术的微型实验性质,大大降低了所需实验耗材,从而减小了新药研发的费用。
(4)本发明的第三个特点是它的高通效,本发明技术能以较高的成功率同时预测上百种药物的功效。传统药理研究中预测药物功效的技术,如电生理技术(electro physiology)操作十分复杂,且失败率非常高(98%),因此对实验人员的技术和经验要求相当高。一位拥有10年以上经验的电生理博士后研究员,可能会花上2天的时间才能预测一种候选药物的功效。对于核磁共振技术(Nuclear Magnetic Resonance),其耗费的时间起码在2天以上的时间。一个新药研发项目最初的候选药物通常超过10万个,经过初筛以后进入药学研究阶段的药物通常也超过1万个。因此,如果单一药物的预测时间都要几天的时间,那么对于上万种药物都进行精确预测所花费的时间和费用是非常高昂的。基于荧光偏振技术操作简单的特点,本申请人通过结合现代机器人技术,实现了该技术的高通效性,使该技术能同时预测上百种药物的功效。因此,本发明能大大缩减实验时间,节省研发费用。
附图说明
附图1为Δ(ΔH IBC -NT)值与药效的关系图。
附图2为Δ(ΔHV33K-NT)值与药效的关系图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图,对本发明作进一步的详细说明,但本发明的实施方式不仅限于此。
实施例1 FITC-IP3的制备及纯化
将以下反应设置在NMR样品管中反应,以便于通过核磁共振谱对反应过程进行监测。包括如下步骤:将20 μmol 2-氧-(2-氨乙基)-IP3溶解于0.75 ml四氘代甲醇中,添加50μl三乙基胺,添加30 μmol FITC固体,封口,摇匀,避光室温孵育4h后;再次添加20 μmol FITC固体,继续避光室温孵育44h。
上述步骤所得到的混合物纯化后,即得到产物FITC-IP3。
所述的纯化步骤为:用甲醇将步骤(2)处理后的反应体系冲洗到圆底烧瓶中,然后减压浓缩至圆底烧瓶中物质呈固体粉末状;往圆底烧瓶中添加10ml去离子水吸收减压浓缩后的固体;将圆底烧瓶的液体加载到避光的Q Sepharose Fast Flow resin凝胶(8×2cm, 碳酸氢盐)上;先用去离子水洗提,再用0.6M 的TEAB缓冲液洗提,直到洗脱液无色为止;Q Sepharose Fast Flow resin凝胶继续用梯度浓度的TEAB(0.6-2.0M,250ML)洗脱,收集10ml的洗脱液作为目标液体;将目标液体浓缩和结晶后,得到橙黄色的结晶体即为FITC-IP3。
进一步的纯化步骤还包括:将所得到的结晶体重新溶解于去离子水中,加载到Chelex 100 分子生物纯树脂柱(Na+,2.5ml),然后用去离子水洗提;洗提液经过冷冻干燥后,得到高纯度的FITC-IP3。通过核磁共振谱验证,产物分子式为C29H31N2O20P3S,分子量为851.0330。使用磷酸分析法精确定量,得到16umol FITC-IP3,产率为80%。
实施例2 IP
3
R1 的N 末端片段的表达和纯化
本实施例IP3R1 的N 末端片段是指具有IP3结合结构域的IP3受体多肽片段,本实施例使用的受体有3种,分别为位于残基1-604的N末端片段(简称为NT);残基224-604的IP3结合中心(简称为IBC);NT的突变体(简称为V33k-NT),V33k-NT与NT的区别仅在于,33位缬氨酸突变为赖氨酸。
V33k-NT核苷酸的制备可以采用 QuickChange mutagenesis kit突变试剂盒获得。
克隆制备的核苷酸序列都通过DNA测序确认后再转化表达。制备所得到的所有肽段都包括一个通过PreScission剪切位点连接的N末端的GST标签。GST标签的肽段纯化可以采用现有技术,也可以根据本实施例下文描述的方式进行。
将克隆制备的核苷酸序列转化到E. coli AVB101, 1 ml培养物,37℃在LB培养基(含100 ug/ml 氨苄青霉素)中培养12h,然后放置在22℃ 直到OD660 达到1.5,添加诱导剂异丙基-β- D-半乳糖苷(IPTG) ,15℃,诱导20h,使蛋白诱导表达。
取诱导后的菌液,离心(6000g,5min)收集菌体,固体重悬于 Tris/EDTA 培养基(TEM; 50 mM Tris和1 mM EDTA, pH=8.3)。
在上述菌悬液中添加溶菌酶(100 ug/ml)和RNAase(10 ug/ml) 后,冰上放置30分钟,然后裂解液超声粉碎。离心(30,000g, 60min),50 ml 上清液中添加0.5 ml glutathione Sepharose 4B beads (GST柱材料)20℃持续旋转30分钟使其结合。所有的GST柱材料填充到PD-10 空层析柱中,使用添加了1mM 4℃二硫苏糖醇(DTT)的无Ca 2+细胞液类似的CLM培养液冲洗5次。
GST柱材料然后在0.5 ml(1柱床体积) 的CLM培养液中,和1 mM 二硫苏糖醇和120单位/ml 的GST标签蛋白PreScission 蛋白酶,4℃,孵育12h。收集洗脱的不含PreScission 蛋白酶的IP3R片段。蛋白浓度以γ-球蛋白 (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Hertfordshire, UK) 作为对照标准,使用DC 蛋白定量试剂盒(去垢剂兼容)对蛋白进行定量。
实施例3 使用FITC-IP
3
为荧光标记的荧光偏振(FP)实验
FP测量在温控室内,96-孔、半区、黑色圆底的聚苯乙烯微孔板(Greiner Bio-One, Gloucester, UK)上进行,使用Pherastar 酶标仪(BMG Labtech, Aylesbury, UK)读数。本实施例使用一套自动液体处理系统(Qiagility;QIAGEN, Crawley,WestSussex, UK)进行液体稀释的自动操作。往微孔板添加液体的大部分动作也是由这套系统自动化进行。隔一定时间定期评价这套自动化系统的精度和重复性(经过8次连续稀释后通常是5%的误差)都高于人工移液。
荧光偏振饱和结合分析实验:用CLM培养液按梯度浓度稀释的受体多肽(包含0.4-400 nM 的IP3结合位点)与FITC-IP3(0.5 nM )混合,最终体积为 50ul 。
荧光偏振竞争结合分析实验:将用CLM培养液按梯度浓度稀释的作为竞争配体的待测化合物、固定浓度0.5 nM的 FITC-IP3、以及饱和浓度的受体多肽(NT 80 nM或IBC 15 nM)三种成分置于容器内混合。
每个温度(4-37℃)的微孔板在达到平衡(约20分钟后)进行FP测量。在4-37℃这个温度范围内进行,FP测量时,激发波长为485 nm,发射波长为538 nm,测定水平方向和垂直方向的荧光强度。
游离态FITC-IP3的荧光各向异性度(A F )是在不含受体多肽时测量的,结合态FITC-IP3的荧光各向异性度(A B )是在饱和浓度IBC(100 nM)或饱和浓度NT(300 nM)和饱和浓度V33K-NT (200 nM)情况下测量。FITC-IP3结合率(F B )与体系荧光各向异性度(A M )之间的关系如下:。
FITC-IP3结合率(F B )是指与受体多肽结合的结合态FITC-IP3在荧光体总量中所占的分数。
非特异性结合导致的荧光各向异性度(A NS )通过检测受体多肽在每个浓度条件下被IP3饱和结合(浓度10 μM)时的荧光各向异性度(A I )来进行校正。因为当FITC-IP3与NT或IBC结合时,游离的FITC-IP3浓度减少,对于IP3没有饱和的情况,A I 值必定高估了其非特异性结合。我们的校正使非特异性结合和游离的FITC-IP3浓度呈线性关系:
实施例4 基于荧光偏振分析FP的平衡解离常数计算
测量FITC-IP3与IBC、NT、V33K-NT结合时的平衡解离常数K D ,固定浓度的FITC-IP3(0.5 nM)和不同浓度的受体多肽一起孵育。测定能导致50%的FITC-IP3(本实验中是0.25 nM)被结合的总受体多肽浓度(R 50 )。导致50% FITC-IP3被结合的游离蛋白浓度(K D )可以通过下式纠正: nM 。
IP3和其他IP3的2-氧替代物,与FITC-IP3 平衡竞争结合实验可以测定其平衡解离常数K D 。导致50%的FITC-IP3被结合的竞争配体浓度(IC 50 ),可以计算每个温度下作为竞争配体的待测化合物的K D 值(K I ) (Kenakin, 1997):
其中,K D 为FITC-IP3在每个温度下的K D ;
L T =总 [FITC-IP3];
R T =总[NT]或总[IBC];
B=在IC 50 条件下的[NT/IBC- FITC-IP3复合物] ;
计算如下,B= L T ×F BS 。
I=在IC 50条件下的[游离的竞争配体],得自
I= IC 50-0.5 R T 。
K D 和吉布斯自由能变的关系:ΔG=RTlnK D。R为理想气体常数(8.314J(mol·k)-1);T为绝对温度(K)。
ΔS和ΔH通过K D 计算得来。假设热容ΔC是温度依赖性的函数,ΔH和ΔS,ΔC,ΔG和绝对温度(T)都与参考温度To(To本实施例为296K)相关,(Wittmann et al., 2009):
ΔH,ΔS和ΔC通过最小二乘法曲线拟合(ΔG-T曲线)的方式得到(Motulsky and Christopoulos, 2003) 。其中,ΔH不受温度影响(即ΔC= 0)(Borea et al., 2000), 方程简化为van’t Hoff方程(Wittmann et al., 2009)。如
因此,ΔH/R 可以通过 lnK D 对1/T 的曲线斜率表示。
表1为利用荧光偏振分析竞争结合实验测得的不同温度下的K D 值(nM)。
表1
实施例5
待测化合物与N末端结合的荧光偏振配体分析
本实施例选用的高亲和性的IP3R激动剂,它们都有相类似的结构: 4,5-二磷酸和6-羟基。激动剂3-8 (3, 2-deoxy-IP3; 4, 2-adamantane-IP3; 5, IP3-IP5; 6, IP3-L-IP3; 7, FITC-IP3; 8, 2-spermine-CBZ-IP3) 都是 2-O-修饰的 IP3 类似物。激动剂3 没有2-羟基。激动剂4, 7 和 8 在2-氧位附近有较大的疏水基团。激动剂5 和 6 有高电荷的2-氧取代物。
本实施例所选的化合物采用电生理学技术预先测定其药效(用离子通道开放概率Po表征),见表2所示:
表2为电生理技术测定IP3类似物的药效。
表3表示使用实施例2所述的方法测定的IP3类似物与受体多肽结合时的热动力学参数。
表3
计算ΔH IBC与ΔHNT的差值,ΔH IBC与ΔHNT的差值用Δ(ΔH IBC -NT)表示,Δ(ΔH IBC -NT)的绝对值越小,则待测化合物的药效越强。
计算ΔHV33K和ΔHNT的差值,ΔHV33K和ΔHNT的差值用Δ(ΔHV33K-NT)表示,Δ(ΔHV33K-NT)的绝对值越大,则待测化合物的药效越强。
表4表示根据上述表3计算所得到的参数。
表4
本实施例的结果呈现了Δ(ΔH IBC -NT)和药效的关系,以及Δ(ΔHV33K-NT)和药效关系,这一结果证明了本发明筛选方法的可靠性。
如上所述,便可较好地实现本发明。
Claims (3)
1.基于荧光偏振分析的IP3受体靶标药物的筛选方法,其特征在于,步骤如下:
A. 提供荧光标记配体、作为竞争配体的待测化合物、以及3种包含IP3结合结构域的受体多肽,所述3种包含IP3结合结构域的受体多肽分别为包含IP3结合结构域的受体IBC、包含IP3结合结构域的受体NT和包含IP3结合结构域的受体V33K-NT;所述受体IBC是位于IP3R受体224-604位的IP3结合中心,所述受体NT是野生型的位于IP3R受体1-604 位的IP3受体N末端片段,所述受体V33K-NT是受体NT的33位氨基酸突变为赖氨酸的突变型IP3受体N末端片段;
B.竞争结合分析实验:将所述步骤A中的荧光标记配体、待测化合物、至少一种受体多肽置于容器内混合;
C.通过荧光偏振技术测定所述步骤B的容器在不同温度下对应的荧光各向异性度A,计算对应温度下待测化合物与相应受体多肽竞争结合时的平衡解离常数KD值,根据平衡解离常数KD值计算得到相应温度下的焓变ΔH,每种受体的焓变ΔH分别表示为ΔH IBC、ΔHNT 和ΔHV33K;
D.计算ΔH IBC与ΔHNT的差值,ΔHIBC与ΔHNT的差值用Δ(ΔHIBC -NT)表示,Δ(ΔHIBC -NT)的绝对值越小,则待测化合物的药效越强;或者计算ΔHV33K和ΔHNT的差值,ΔHV33K和ΔHNT的差值用Δ(ΔHV33K-NT)表示,Δ(ΔHV33K-NT)的绝对值越大,则待测化合物的药效越强。
2.根据权利要求1所述的基于荧光偏振分析的IP3受体靶标药物的筛选方法,其特征在于,所述荧光标记配体是将荧光素通过共价键连接到IP3制备的。
3.根据权利要求2所述的基于荧光偏振分析的IP3受体靶标药物的筛选方法,其特征在于,所述荧光标记配体是FITC-IP3。
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