CN102393451A - 基于能斯特电势荧光染料的细胞钾电极特性的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明特别涉及基于Nernst电势荧光染料的细胞钾电极特性评价方法，具体步骤为：构建具Nernst钾电极特性的细胞，以电势荧光染料技术得到[K⁺]_i/f；用钠离子荧光染料评价胞内钠离子浓度；在梯度钾溶液中测量经电势荧光染料染色的待测细胞胞内外荧光强度比，根据Goldman方程以非线性迭代拟合得出f、[K⁺]_i和细胞表观钠/钾通透性比P_Na/K，以P_Na/K作为评价细胞钾电极特性的定量指标；本发明建立的细胞钾电极特性评价法，为以电势荧光染料技术研究细胞电生物物理特性及离子通道功能表达提供了新的指标和方法，并为材料三维结构下细胞电生物物理特性乃至神经细胞功能分化的非侵入性原位检测提供了可能。

Description

基于能斯特电势荧光染料的细胞钾电极特性的检测方法

技术领域

本发明属于生物领域，特别涉及基于能斯特电势荧光染料的细胞钾电极特性评价值的检测方法。

背景技术

细胞的电生物物理特性或电生理特性是细胞离子通道表达及功能分化或功能成熟的直接表现，也是一些细胞尤其是可兴奋细胞功能评价的重要指标。尽管细胞电生物物理特性或电生理特性评价最常用和经典的方法仍然是膜片钳为代表的玻璃微电极技术，这一手段的侵入性以及在某些条件下(如活组织及材料三维结构内部)应用的局限性使得人们逐渐采用更加实用的非侵入性研究或评价方法。电势荧光染料技术是近二十余年发展起来的评价细胞电生物物理特性的非侵入性检测手段。它依靠电势敏感荧光染料及显微荧光技术来评价细胞的电生物物理特性或电生理特性进而了解细胞的功能特性。尽管当今电势荧光染料技术的发展已经使得该技术可以被用于可兴奋细胞动作电位的显示与研究，细胞静息电位的评价与研究仍然是电势荧光染料技术最为常见的用途。

细胞静息电位的评价对于成熟前的可兴奋细胞(不具备动作电位特征)及非兴奋细胞的研究及功能评价具有极其重要的意义。这里的一个典型的应用实例是在神经干细胞以及以神经干细胞为基础的组织工程植入体的应用研究。

神经干细胞以其可自我更新及多分化潜能在神经组织修复、退行性疾病治疗和神经组织工程研究等方面有着巨大的应用潜能。神经干细胞的一个重要功能是分化为神经元并修复神经组织的缺损或病变。成熟神经元的主要功能是接收、处理和传递电化学信号。在这一过程中，膜上离子通道的表达及功能成熟是神经细胞完成其功能的基础。在神经干细胞没有分化或分化的早期，离子通道尤其是电压依赖性离子通道稀少且细胞不能产生稳定的动作电位时，细胞膜静息电位是神经干细胞所能检测到的最重要的电生物物理特性。因此，研究细胞静息电位建立成为了解神经干细胞离子通道功能表达情况的重要途径。为实现以细胞静息膜电位了解细胞离子通道功能表达情况，一个核心的问题是细胞静息膜电位的高内含解析。

细胞电极特性是与细胞静息膜电位对细胞外离子浓度依赖关系相关的重要细胞电生物物理特性功能参数。其中最重要的是细胞钾电极特性(细胞静息电位变化对细胞外K⁺浓度的依赖性)。细胞静息电位的建立涉及钾通道电流、钠通道电流以及少量其他通道电流。从这一角度看，细胞电极特性可以理解为与静息膜电位建立中各通道电流相对贡献有关的物理量。理论上，如果细胞的静息膜电位完全由钾通道电流参与建立，细胞的静息膜电位与胞外钾离子浓度的依赖关系将完全符合Nernst方程的定量关系，细胞膜的钠/钾通透性比值将为零。容易理解，在神经干细胞分化的不同时期，随着细胞离子通道表达谱的改变，神经干细胞应该具有不同的细胞钾电极特性或钠/钾通透性比值。采用膜片钳的研究表明，在神经干细胞分化前及分化初期，当细胞钾通道电流密度表达增加成为优势通道电流而又同时缺少钠通道电流、钙通道电流时，可以发现细胞静息电位变化对细胞外K⁺的依赖性接近Nernst方程的描述，即Nernst(能斯特)钾电极特性，推测这一现象可能与神经干细胞存在的延迟整流性钾电流以及大量的主要由钾离子介导的被动电流有关。随着神经干细胞的进一步分化和钠通道和钙通道等电流的表达和增加，细胞静息膜电位值可能明显偏离钾平衡电位或Nernst钾电极特性，同时，细胞膜的钠/钾通透性比值可能会明显地增加。因此考察细胞的钾电极特性可以作为神经干细胞功能分化程度的一个重要客观指标。

应用膜片钳技术评价细胞钾电极特性的局限性是：①膜片钳技术操作精细，仪器昂贵，技术要求高，不便于普通研究与开发机构推广；②检测通量低，每次只能测定一个细胞。同时，细胞取样的随机性及取样不足可能给结果的解释带来困难；③是一种侵入性测量手段，测量对细胞的侵入或封接不可避免地会引起细胞功能特性的改变；④操作过程往往需要细胞脱离原来生长环境进行检测，难于在原位或in situ实现对细胞钾电极特性或其他电生物物理特性的评价；⑤难于在活组织或材料三维结构条件下应用。与之相对应的是，电势荧光染料技术的特点是：①技术要求低，易于广泛推广和使用；②检测通量高，一次能测定一个视野内的所有细胞；③是一种非侵入性测量手段；④操作过程细胞不需要脱离原来生长环境进行检测，可在原位或in situ实现对细胞钾电极特性或其他电生物物理特性的评价；⑤结合激光共聚焦显微技术，可以直接在活组织或材料三维结构条件下应用。

能斯特电势荧光染料是一类根据细胞膜电位在细胞内外分布呈Nernst平衡的电势敏感荧光染料。它可以依据染料在细胞内外的分布浓度比值或荧光强度比值来评价细胞的静息膜电位及变化。然而，由于染料带有电荷，在跨膜平衡分布的同时会不可避免地与细胞膜或细胞内的生物大分子相结合，即非电势依赖性结合。非电势依赖性结合是影响以能斯特染料确定细胞静息电位数值的主要干扰因素。在进行细胞静息膜电位的有关比较研究时，非电势依赖性结合是这一方法系统误差的组成部分。显然，忽略非电势依赖性结合并不会影响有关比较研究的结论。另一种权宜的校正非电势依赖性结合的方法是，以高钾离子浓度的溶液(通常130mM)刺激细胞，在这一“零电位”状态标定细胞的非电势依赖性染料结合量。很显然，这一标定方法在很大程度上取决于“零电位”状态的实际电位值。上述标定方法显然不适用于在评价细胞钾电极特性、需要更准确了解细胞静息膜电位与细胞外钾离子浓度依赖关系时非电势依赖性染料结合的标定。

发明内容

本发明的目的在于提供基于能斯特电势荧光染料的细胞钾电极特性评价值的检测方法，该方法准确性高，操作简单。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

1、基于能斯特电势荧光染料的细胞钾电极特性的检测方法，具体包括以下步骤：

A 建立具有能斯特钾电极特性的细胞

用钾离子载体对细胞进行处理，得具有能斯特钾电极特性的细胞；

B 对细胞内平均钾离子浓度与染料非电势依赖性结合系数的比值的计算

将步骤A所述具有能斯特钾电极特性的细胞浸浴在设定的梯度钾离子浓度，即[K⁺]_o的溶液中，用能斯特电势荧光染料染色并平衡，用荧光显微技术对染色平衡后的细胞在同一参数条件下拍照、图像分析，求得细胞内外荧光强度比值[F]_i/[F]_o，将已知的各组[K⁺]_o和[F]_i/[F]_o值代入公式中，进行线性拟合，求得具有能斯特钾电极特性的细胞胞内平均钾离子浓度与染料非电势依赖性结合系数的比值，即[K⁺]_i/f；

C 胞内钠离子的检测

用钠离子载体对细胞通透使细胞内外的钠离子平衡，让细胞浸浴在预先设定的梯度钠离子浓度[Na⁺]_o的缓冲液中，对细胞加载Na⁺荧光染料并平衡，拍照，对图像进行分析，得到不同的[Na⁺]_o浓度所对应的荧光强度读数，以细胞内钠离子的荧光强度对设定浓度作图，对其进行线性拟合求得标准曲线方程；在相同的条件下，另取未使用用钠离子载体处理的细胞使用相同浓度的Na⁺荧光染料染色，拍照，对图像进行分析，得出对应的荧光强度读数，以胞内钠离子荧光强度代入上述标准曲线方程，可以直接计算胞内钠离子浓度；

D 非电势依赖性染料结合系数的标定及待测细胞钾电极特性评价值的获得

将待测钾电极特性的细胞浸浴在设定的梯度钾离子浓度的溶液中，该溶液是以不同浓度钾离子依次置换钠离子的等渗盐溶液，其中钾离子浓度与钠离子浓度之和为依据等渗条件设定的常量；用能斯特电势荧光染料分别染色并平衡，用荧光显微技术对染色平衡后的细胞在同一参数条件下拍照、图像分析，求得细胞内外荧光强度比值[F]_i/[F]_o；将上述所得各浓度梯度下对应的[F]_i/[F]_o比值、步骤B所得[K⁺]_i/f值以及步骤C所得的[Na⁺]_i值代入公式 $\frac{{\left[F\right]}_i}{{\left[F\right]}_o}=\frac{{\left[K^{+}\right]}_i/f+{\left[{\mathrm{Na}}^{+}\right]}_i\·P_{\mathrm{Na}/K}/f}{{\left[K^{+}\right]}_o+P_{\mathrm{Na}/K}{\left[{\mathrm{Na}}^{+}\right]}_o}$ 中，取得的数据采用非线性迭代拟合法求出染料非电势依赖性结合系数f、胞内钾离子浓度[K⁺]_i和细胞表观钠/钾通透性比值P_Na/K值；

所述步骤B和步骤C的进行无时间上的先后区分，[F]_i、[F]_o分别为胞内、外荧光强度，[K⁺]_o为胞外钾离子浓度，[K⁺]_i为胞内钾离子浓度，f为非电势依赖性染料结合系数，[Na⁺]_o为胞外钠离子浓度，[Na⁺]_i为胞内钠离子浓度。

2 根据1所述的检测方法，在步骤A中，钾离子载体为缬氨霉素。

3 根据1所述的检测方法，在步骤B中，能斯特电势荧光染料为四甲基罗丹明甲酯染料或其它依据能斯特平衡原理进行细胞膜电位测量的电势荧光染料。

4、根据1所述的检测方法，在步骤B中，细胞浸浴的梯度钾离子浓度溶液为无钠离子的盐溶液，钾离子浓度梯度由有机阳离子置换钾离子获得。

5、根据1所述的检测方法，根据梯度钾离子浓度条件下的细胞内外荧光强度比值首先计算出细胞内钾离子平均浓度[K⁺]_i与染料非电势依赖性结合系数f的比值[K⁺]_i/f。

6、根据1所述的检测方法，在步骤C中，在对细胞进行钠离子荧光染料染色的同时，使用梯度钠离子浓度溶液浸浴经钠离子载体通透的细胞进行标定，获取钠离子浓度与荧光强度的标准曲线方程。

7、根据1所述的检测方法，在步骤D中，采用梯度钾离子浓度的盐溶液平衡浸浴待测细胞，其中平衡盐溶液中钠离子浓度高于步骤C中所测胞内钠离子浓度的数据点不少于三个。

8、根据1所述的检测方法，在步骤D中，采用最小二乘法非线性迭代拟合法求出染料非电势依赖性结合系数f、胞内钾离子浓度[K⁺]_i和细胞表观钠/钾通透性比值P_Na/K值。

本发明的目的之二在于提供上述检测方法的运用，该运用为细胞离子通道功能表达或功能分化的评价以及材料三维结构对细胞功能影响的评价提供了新思路。

9、1-8任一项所述的检测方法在细胞离子通道功能表达或功能分化的非侵入性评价中的应用。

10、根据9所述的应用，所述的检测方法在材料三维结构条件下对神经干细胞离子通道功能表达或功能分化的非侵入性评价中的应用。

上述发明通过构造TMRM染色的具有Nernst特性的神经干细胞，通过Nernst方程变式拟合，求出神经干细胞胞内钾离子浓度和非电势依赖性结合系数相结合的校正因子[K⁺]_i/f，然后根据TMRM染色的正常神经干细胞在梯度钾溶液中的细胞内外荧光强度比，代入简化的Goldman方程，求出染料非电势依赖性结合系数f、胞内钾离子浓度[K⁺]_i和细胞表观钠/钾通透性比值P_Na/K值。

本发明的有益效果在于：1、在计及染料非电势依赖性结合量的条件下用电势荧光染色方法评价细胞钾电极特性、胞内钾离子浓度等的方法尚未见报道。本发明克服了以往电位测量时对非电势依赖性结合量不计算或计量粗糙的不足，并因此评价了常规电势荧光染料方法不易测出的细胞内钾离子浓度。2、本发明率先应用电势荧光染色方法归纳细胞钾电极特性，为以后研究神经干细胞分化的电生理学标志奠定了基础，并使材料三维结构条件下细胞的电生理学特性和神经干细胞功能特性的非侵入性和原位检测成为可能。更多有益效果，将在实施例中体现。

附图说明

图1为Na⁺荧光标定曲线；

图2为缬氨霉素处理的细胞以TMRM染色，在不同钾离子梯度浓度中，胞内外荧光强度的变化。a)表示细胞在白光下照片，b-g)分别为细胞在含K⁺：5mM，7.5mM，15mM，55mM，80mM，130mM的HBS缓冲液(K⁺浓度梯度由氯化胆碱置换产生)中荧光照片，h)为背景荧光照片(本底，以水拍照)。标尺示50μm；

图3为细胞内钾离子浓度与非电势依赖性结合系数比值[K⁺]_i/f拟合曲线；

图4为采用本发明计算的经缬氨霉素处理的细胞(左，Nernst电极钾电极响应曲线)和未经缬氨霉素处理的细胞(右，非Nernst电极钾电极响应曲线)的细胞静息膜电位值对胞外钾离子浓度的依赖关系。

图5为膜片钳技术测得的的经缬氨霉素处理的细胞(左，Nernst电极钾电极响应曲线)和未经缬氨霉素处理的细胞(右，非Nernst电极钾电极响应曲线)的细胞静息膜电位值对胞外钾离子浓度的依赖关系。

图6为三维微结构扫描电镜图。

图7为神经干细胞的三维培养照片。

具体实施方式

主要材料和试剂：四甲基罗丹明甲酯(tetramethylrhodamine methyl ester，perchlorate，TMRM.Invitrogen，USA，Lot：481787)；Zeiss激光共聚焦显微镜(LSM 510 META，ZEISS，Germany)；C17.2神经干细胞，由哈佛医学院Snyder教授建株。

实施例1  细胞钾电极特性评价理论归纳方法的建立

一 理论分析

对于具有Nernst钾电极特性的细胞，细胞静息膜电位V_m与钾离子浓度的关系以Nernst方程描述，即：

$V_m=-2.303\frac{\mathrm{RT}}{\mathrm{zF}}\log \frac{{\left[K^{+}\right]}_i}{{\left[K^{+}\right]}_o}---\left(1\right)$

这里R为理想气体常数；T为绝对温度；Z为离子所带电荷数，对于钠钾来说，Z的数值为1；F为法拉第常数。[K⁺]_i为细胞内钾离子浓度；[K⁺]_o为细胞外钾离子浓度。前述电势荧光染料TMRM是能斯特(Nernstian)电势荧光染料染料，即其在胞膜两侧的浓度平衡分布也符合Nernst方程，因此有

$V_m=-2.303\frac{\mathrm{RT}}{\mathrm{zF}}\log \frac{{\left[\mathrm{TMRM}\right]}_i}{{\left[\mathrm{TMRM}\right]}_o}---\left(2\right).$

[TMRM]_i、[TMRM]_o分别为细胞内外的TMRM的浓度。经标定TMRM的荧光强度与其浓度在5nM-50000nM的浓度范围内成高度的线性关系(R²＝0.9875)，这一浓度范围涵盖了500nM的TMRM染色时细胞内外可能的分布浓度。故公式(2)可化为：

$V_m=-2.303\frac{\mathrm{RT}}{\mathrm{zF}}\log \frac{{\left[F\right]}_i}{[{F]}_o}---\left(3\right)$

这里[F]_i为胞内荧光强度，[F]_o为胞外荧光强度。TMRM除了依据细胞膜电势的变化而在膜内外跨膜平衡外，还与细胞内的某些成分如蛋白质非特异性结合，细胞内的这部分TMRM含量称为非电势依赖性结合。容易从文献中发现，在研究条件下染料与非特异性成分的亲合力可以被设定为常数，即非电势依赖性结合量正比于电势依赖性染料分布浓度。

在实验条件下，非电势依赖性结合量或亲合力可以用细胞接近零电位时细胞内外荧光强度比来表示。我们定义接近零电位时细胞外/内荧光强度比为：f＝[F]_o/[F]_i，这里[F]_o和[F]_i分别为细胞接近零电位时细胞外和细胞内的荧光强度值。依据上述分析，在计及非电势依赖性染料结合量的情况下，细胞静息膜电位测量的工作方程为：

$V_m=-2.303\frac{\mathrm{RT}}{\mathrm{zF}}\log \frac{{\left[F\right]}_i}{[{F]}_o}f---\left(4\right)$

在37℃(绝对温度310K)时，把常数值代入上式，则有

$V_m=-61.5\log \frac{{\left[F\right]}_i}{[{F]}_o}f---\left(5\right)$

结合公式(1)、(4)、(5)，则有

$\frac{{\left[K^{+}\right]}_i}{{\left[K^{+}\right]}_o}=\frac{{\left[F\right]}_i}{{\left[F\right]}_o}f---\left(6\right)$

该式可变换为

$\frac{{\left[K^{+}\right]}_i}{f}\·\frac{1}{{\left[K^{+}\right]}_o}=\frac{{\left[F\right]}_i}{{\left[F\right]}_o}---\left(7\right)$

上式中，[K⁺]_o(或1/[K⁺]_o)及[F]_i/[F]_o已知或可测量。由此可知在实验条件下，对于给定的梯度胞外钾离子浓度，依据细胞内外TMRM荧光强度比值可以求出一个胞内钾离子浓度和非电势依赖性结合量相结合的校正因子[K⁺]_i/f。

对于偏离Nernst钾电极特性的细胞，细胞的钾电极特性由Goldman方程给出。由于Cl^-对细胞膜电位的贡献较少，Goldman方程可简化为

$V_m=-61.5\log \frac{P_K{\left[K^{+}\right]}_i+P_{\mathrm{Na}}{\left[{\mathrm{Na}}^{+}\right]}_i}{P_K{\left[K^{+}\right]}_o+P_{\mathrm{Na}}{\left[{\mathrm{Na}}^{+}\right]}_o}---\left(8\right)$

这里P_K、P_Na分别为钾、钠离子的跨膜通透性。在式(8)中，定义表观钠/钾通透性比为：P_Na/K＝P_Na/P_K，式(8)可简写为：

$V_m=-61.5\log \frac{{\left[K^{+}\right]}_i+P_{\mathrm{Na}/K}{\left[{\mathrm{Na}}^{+}\right]}_i}{{\left[K^{+}\right]}_o+P_{\mathrm{Na}/K}{\left[{\mathrm{Na}}^{+}\right]}_o}---\left(9\right)$

结合公式(5)、(9)，可得：

$\frac{{\left[F\right]}_i}{{\left[F\right]}_o}\·f=\frac{{\left[K^{+}\right]}_i+P_{\mathrm{Na}/K}\·{\left[{\mathrm{Na}}^{+}\right]}_i}{{\left[K^{+}\right]}_o+P_{\mathrm{Na}/K}\·{\left[{\mathrm{Na}}^{+}\right]}_o}---\left(10\right)$

该式可变换为：

$\frac{{\left[F\right]}_i}{{\left[F\right]}_o}=\frac{{\left[K^{+}\right]}_i/f+{\left[{\mathrm{Na}}^{+}\right]}_i\·P_{\mathrm{Na}/K}/f}{{\left[K^{+}\right]}_o+P_{\mathrm{Na}/K}{\left[{\mathrm{Na}}^{+}\right]}_o}---\left(11\right)$

公示(11)中，[K⁺]_o、[F]_i/[F]_o、[Na⁺]_o及[Na⁺]_i已知或可测量，[K⁺]_i/f可在Nernst钾电极特性条件下由式(7)求出。由此可知在实验条件下，对于给定的梯度胞外钾离子浓度，依据细胞内外TMRM荧光强度比值可以求出未知变量P_Na/K、f以及胞内钾离子浓度[K⁺]_i。

二 实验步骤

实验步骤分两步进行：

①平均胞内钾离子浓度[K⁺]_i、染料非电势依赖性结合相对量(非电势依赖性结合系数)f及表观钠/钾通透性比P_Na/K值的标定：Nernst钾电极特性细胞系采用缬氨霉素处理获得，C17.2神经干细胞用约1μM的缬氨霉素作用后，钾离子通透性大大增强，可被认为具有Nernst钾电极响应特性。把TMRM染色后的细胞置于各种离子浓度已知的含一系列钾离子浓度梯度的缓冲液中，以激光共聚焦显微系统获得对应于不同钾离子浓度的[F]_i/[F]_o平均值。据公式(7)，以

对1/[K⁺]_o作图，可以求出[K⁺]_i/f的群体平均值。进一步，以未经缬氨霉素处理的细胞(普通钾电极特性细胞)为研究对象，采用Na⁺荧光染料CoroNa Green结合激光共聚焦显微技术评价细胞内钠离子浓度[Na⁺]_i的群体平均值。另取以未经缬氨霉素处理的细胞(待测的普通钾电极特性细胞)为研究对象，用TMRM染色后的细胞置于各种离子浓度已知的含一系列钾离子浓度梯度的缓冲液中，以激光共聚焦显微系统获得对应于不同钾离子浓度的[F]_i/[F]_o平均值。通过不同钾浓度梯度下的[F]_i/[F]_o平均值。依据公式(11)采用非线性迭代拟合法分别求出P_Na/K、f和胞内钾离子浓度[K⁺]_i群体平均值。

②对f值与该归纳方法的评价：依据群体非电势依赖性结合量值f、胞内钠离子浓度[Na⁺]_i以及胞内钾离子浓度[K⁺]_i，可以计算单个细胞的表观钠/钾通透性比P_Na/K，得到P_Na/K值均值及方差。对同一样本，前述步骤①计算的P_Na/K值的群体平均值与据于单个细胞计算的P的算术平均值应该一致。并可通过求出的f值和[K⁺]_i，进一步计算细胞的静息电位值并以膜片钳技术验证细胞的钾电极特性。

实施例2  细胞钾电极特性的测量与评价

一 神经干细胞胞内钠离子浓度的测定

细胞内液的Na⁺相对含量和浓度较低，可用Na⁺荧光染料来测定。常用的Na⁺荧光染料有SFBI、Sodium Green等，本实施例中应用的钠离子染料为CoroNa^TM Green(Invitrogen，美国。Cat No.：C36676)。

实验原理：本实施例中用18μM的莫能菌素对细胞通透后，细胞内外的钠离子将平衡。在设定外部Na⁺浓度的条件下，对细胞加载CoroNa Green，可以测量不同的Na⁺浓度对应的荧光强度，作出标准曲线。在相同的条件下，对正常的细胞(未加莫能菌素)使用相同浓度的CoroNa Green对Na⁺染色，便可以得到正常细胞的胞内Na⁺荧光强度值。因此，胞内钠离子荧光强度代入标准曲线方程，可以直接计算胞内钠离子浓度。

1 实验方法和步骤

①梯度Na⁺浓度的HBS缓冲液的配制。Na⁺浓度梯度拟设置为0，20，60，80，115，130mM。各种浓度配制50ml。为保持渗透压不变，对应K⁺浓度分别为135，115，75，55，20，5mM。其他成份为氯化钙：2mM，氯化镁：2mM，葡萄糖：25mM，HEPES：20mM。置于-20℃冰箱保存。

②CoroNa Green工作液的配制。

1)CoroNa Green 850μM母液的配制。在暗室用分析纯乙醇溶解1管CoroNaGreen粉末至100μL于500μL EP管中。充分混匀，即为850μM母液，-20℃避光保存。

2)CoroNa Green工作液配制。取各钾浓度梯度的HBS的溶液各5ml，用微量移液器加入5μL CoroNa Green母液，充分混均，得到0.9μM CoroNa Green的工作液。

③莫能菌素母液和工作液的配制

1)莫能菌素母液的配制。

a)取莫能菌素(碧云天生物技术研究所，江苏)包装瓶，置于离心机中，1500rpm离心15min；

b)准确称取25mg莫能菌素。用分析纯乙醇溶解至2ml，配制成18mM的母液，-20℃保存。

2)莫能菌素工作液的配制。取5μL莫能菌素母液，加入到5ml含CoroNaGreen的Na⁺浓度梯度中HBS标号为0mM Na的血清瓶，配制成18μM莫能菌素工作液。

④细胞培养：细胞C17.2神经干细胞细胞爬片。

⑤取接种两天的细胞，在相差显微镜下观察，取细胞生长状态较好，密度适中(约80％铺满瓶底)的细胞作为实验样本，并多取至少两皿细胞备用。

⑥在超净工作台中，用眼科摄小心地从培养皿中取出长有细胞的玻片，使含细胞面朝上安装入共聚焦专用培养皿中，拧紧螺丝。用不含染料的0mM Na⁺的HBS轻轻冲洗细胞，然后加入含有莫能菌素和CoroNa Green的0mM Na⁺的HBS。用普通35mm培养皿盖盖住已安装细胞的装置，Para film封口胶封口。置于激光共聚焦(LSM 510 META，ZEISS，Germany)37℃热台上孵育40min。

⑦激光共聚焦拍照。

1)激光共聚焦主要参数设置如下：Scan Mode：Plane，Multi track，12bit；Size：1024*1024

Objective：Plan-neofluar 40×/1.3 oil DIC；Beam Splitters：MBS：HFT 488；Wavelength：488nm，100％；Filters：CH3：505-550。

2)将培养皿置于激光共聚焦显微镜载物台上，拍照，命名并保存。

3)换液。弃去原有液体，加入1ml下(高)一梯度Na⁺HBS，孵育20min.拍照。

4)换液，孵育，拍照并保存。类似步骤3)，直到换到最后一个梯度。

⑧图像分析。从激光共聚焦图像数据库导出图片，格式为tif。用Carl Zaiss专用荧光分析软件AXIOVISION REL.4.8对图像进行分析，得出各浓度下的荧光读数如表1示：

表1 Na⁺荧光标定数据。

荧光强度以灰阶读数表示。取多细胞平均荧光强度±标准差。n为样本细胞数目。

以细胞内钠离子的荧光强度对设定浓度作图，得图1，图1的标定曲线显示，在0-80mM Na⁺，Na⁺荧光强度与其浓度之间有明显的线性相关关系。图1中存在的截距表示，该染料在胞内存在非特异性结合和一定的测量误差。但是在相同的染料浓度和测量条件下，正常待测细胞亦有相同的非特异性结合，因此作为系统误差的组成部分在计算时可以抵消掉，并不影响测量结果。

⑨胞内钠离子浓度的测量。

1)用与钠离子标定同样的方法，配制一定Na⁺浓度梯度的HBS缓冲液。该梯度设置为0，20，60，80，115，130mM.(说明：因为细胞内部Na⁺相对较低，一般不超过50mM，因此标定时钠浓度范围设得太宽意义不大；而测量细胞电位和钾电极特性时细胞外钠浓度可能很高，因此此步骤Na⁺浓度梯度范围与标定时不同)

2)在梯度Na⁺的HBS中，使染料CoroNa Green的终浓度与标定浓度相同(0.9μM)。

3)在激光共聚焦找到细胞，固定视野，染色、孵育、拍照、换液、拍照与标定的实验方法同，但未加莫能菌素。

4)由于细胞在室外时间过长，加之钠钾偏离正常生理浓度，130mMNa⁺时细胞形态发生改变，故其生理状态已经发生了相应改变，因而未然参与测量计算。

用⑧方法分析得到数据如表2

表2  正常C17.2神经干细胞胞内钠离子荧光强度值(以荧光灰阶读数表示)。

结果与分析

表2数据显示，在胞外Na⁺为0mM和20mM时，胞内钠离子荧光强度较其它三组低。这是因为CoroNa Green这种染料在细胞内外存在动态平衡：CoroNaGreen通过一开始绑定在其上的Acetoxymethyl(AM)ester快速通过细胞膜，经胞内酯酶降解后解离出CoroNa Green，使之能与胞内Na⁺结合而可激发荧光；同时CoroNa Green自身具有一定的脂溶性，能少量通过细胞膜渗透到胞外。根据文献报道和前期试验经验，染色后孵育40min时胞内CoroNa Green达到稳定值，由于在胞外Na⁺为0mM和20mM时，胞外K⁺达到135mM和115mM，这与正常生理状态下的胞外K⁺浓度差异巨大，在孵育的40min时间里将影响胞内酯酶的活性，从而使胞内CoroNa Green浓度低于其它组的稳定值，影响钠离子荧光强度值。因此我们选取胞外Na⁺为60mM、80mM和115mM组的荧光值用于计算，求得其荧光强度的平均值为33.62±1.94。代入图1标准曲线方程，计算得胞内Na⁺浓度约为20.2mM。与预期值基本相符。该结果证实了，由于细胞膜上的钠钾依赖式ATP酶的存在，细胞有保持低钠浓度的能力。在本实施示例中，当细胞外钾离子浓度在一定范围内变化致使胞外钠超过约20mM时，胞内钠离子浓度稳定在约20.2mM。可以认为胞内钠离子浓度为常量，即20.2mM。

二 [K⁺]_i/f值的测量

缬氨霉素是一种由12个氨基酸残基组成的环形肽，为脂溶性抗生素，分子量1111.4。将缬氨霉素插入脂质体后，通过环的疏水面与脂双层相连，极性的内部能精确的固定K⁺，然后在内侧移动通过脂双层；在另一侧将K⁺释放到细胞内。缬氨霉素可以使K⁺的扩散速度增大10⁵倍。但是它不能有效地提高Na⁺的扩散速度。

1 方法和步骤：

①缬氨霉素母液配制。用乙醇配制10mM的缬氨霉素母液：准确称量10mg缬氨霉素，置于1mL的EP管中，用分析纯乙醇溶解至1ml，-20℃保存。

②制备C17.2神经干细胞细胞爬片。

③梯度K⁺浓度溶液HBS(HEPES buffered saline)配制。配方为：K⁺浓度梯度设置为5，7.5，15，55，80，130mM。为保持胞外溶液渗透压不变，用氯化胆碱置换K⁺，即分别为130，127.5，120，80，55，0mM。其它成份为HEPES：20mM，MgCl₂：1mM，CaCl₂：2mM，葡萄糖：25mM。以上各成份均用三蒸水溶解，配制50mL，-20℃保存备用。使用时充分溶解。

④含500nM的TMRM的梯度K⁺浓度溶液HBS配制。取10μLTMRM母液，分别加入步骤②中各梯度溶液10mL，充分混匀。

⑤1μM缬氨霉素工作液的配制。取上步(步骤④)中的标号为5mMK⁺的HBS(含TMRM)，加入1μL缬氨霉素母液，振荡，使充分混匀。

⑥细胞用缬氨霉素处理、染色。

⑦显微照相。

2)将细胞装置置于激光共聚焦显微镜载物台上，孵育40min，在镜下找到细胞密度适中、细胞状态较好的视野，固定视野，调好焦距，拍照命名并保存。

3)用移液器吸走原缓冲液(尽量吸取，但要注意不能碰触玻璃底面，否则将难以取回原视野)，加入下一K⁺梯度HBS，孵育20min，拍照命名并保存。以此类推，直至到最后一梯度。实验结束，拍一张不含荧光的水的照片，以便在计算时扣除本底荧光强度。

⑧数据分析。从激光共聚焦图像数据库导出图片，细胞内外荧光强度比[F]_i/[F]_o如表3所示：

结果分析：

从激光共聚焦图像数据库导出图片(如图2所示)，导出格式为tif。用CarlZaiss专用荧光分析软件AXIOVISION REL.4.8对图片进行分析，得出数据如表3所示：

表3  缬氨霉素处理的细胞荧光强度分析。

从表3数据可以看出细胞在越来越强的去极化刺激下，内外荧光强度比逐渐减弱。但到130mM K⁺时荧光突然增强，不是正常的生理变化。有可能细胞形态发生改变(长时间外置细胞可能变圆或漂起)，或是换液时不小心触动装置，导致焦距改变而拍了细胞其他层面。因而，不能参与计算。除去130mM K⁺时的细胞荧光强度数据，据实施例1“一理论分析”部分公式(7)以细胞内外荧光强度比[F]_i/[F]_o对胞外钾离子浓度倒数1/[K⁺]_o作图，如图3经最小二乘法线性拟合得到细胞内K⁺浓度与非特异结合系数的比值[K⁺]_i/f＝187.13mM。

三、染料非电势依赖性结合系数f与正常C17.2神经干细胞(未经缬氨霉素处理)膜钠钾通透性比值P_Na/K值

①细胞接种与培养方法同上。

②梯度K⁺浓度的HBS的配制。K⁺梯度设置为：10，50，100，130mM，为保持渗透压不变，相应Na⁺梯度设为125，85，35，5mM.其他成份浓度同“梯度K⁺浓度溶液HBS配制”。(在未经缬氨霉素处理的待测细胞，由于5mM K⁺梯度孵育时需要40min左右才能使TMRM达到平衡，而过长的时间将影响后续实验组中细胞的活力，而使结果产生偏差，所以我们在正常组实验中取消了5mMK⁺梯度。)

③激光共聚焦实验同上。

④数据分析：如表4所示

表4  正常细胞在梯度K⁺缓冲液中的胞内外荧光强度比值

应用Matlab数学分析软件，应用最小二乘法非线性迭代运算将实施例1中的公式(11)编程，将求出的胞内钠浓度[Na⁺]_i、[K⁺]_i/f和表4中已知自变量代入，运行。得基于群体平均内外荧光强度比的拟合结果f＝0.51，P_Na/K＝0.48.同时求出[K⁺]_i＝95.44mM。

单个细胞P_Na/K值的计算：

取上述所选细胞，单个计算表观钠钾通透性比，运算，得结果表5

表5  单个细胞的P_Na/K值计算结果

结果显示：单个细胞的表观钠钾通透性比值为P_Na/K＝0.49±0.04，与群体P_Na/K值(0.48)相比较相差很小。

根据上述非线性迭代拟合所得的群体细胞非电势依赖性染料结合系数值计算的Nernst细胞(表3)的膜电位与胞外钾离子浓度的依赖关系(Nernst钾电极响应曲线)如图4左。根据上述非线性迭代拟合所得的群体细胞非电势依赖性染料结合系数值计算的非Nernst细胞(表4)的膜电位与胞外钾离子浓度的依赖关系(非Nernst钾电极响应曲线)如图4右。

上述结果表明该神经干细胞即使在扩增条件下也明显偏离了Nernst钾电极特性，对钠离子的通透性较高，已有较多的钠通道电流分化和表达。这是有关这一细胞功能特性的一个重发现。

实施例3  膜片钳技术对细胞钾电极特性的评价及对电势荧光染料法的验证

一、材料和试剂

两性霉素B(国产)，胰酶-EDTA(Hyclone，Cat.No.：SH70042.01)，电极内外液为含K⁺135mM的HBS(不含Na⁺)；

仪器：EPC-10单通道膜片钳(HEKA Electronic，German)及相关附件

二、试验步骤

1 细胞培养和接种方法同实施例2，0.125％胰酶-EDTA消化，在倒置相差显微镜下观察，细胞隆起而未完全变圆，弃胰酶。以含K⁺5mM的HBS冲洗培养皿，并浸浴细胞。分两组进行试验，缬氨霉素组和正常组(处理方法同实施例2)。

2 以穿孔膜片钳的方法，电极尖端预吸入30μg/ml的两性霉素B，再灌注电极内液。在镜下找到形态较好的细胞，全细胞模式G欧以上封接，电流钳记录细胞膜电位。

3 每组试验通过在初始浓度的HBS基础上(1ml)滴加一定量的K⁺135mMHBS调整其[K⁺]_o到相应的浓度值。每个浓度记录相应V_m值。

三、结果

表6  缬氨霉素处理的细胞膜电位对胞外钾离子浓度的典型钾电极响应

表7  正常细胞(未经缬氨霉素处理)在梯度K⁺缓冲液中的典型钾电极响应

上述结果作图后(如图5所示)表明膜片钳技术所测得的细胞静息膜电位值与本发明所测得的细胞静息膜电位数值基本一致，证实了本发明载测量静息膜电位时的可靠性以及本发明对非电势依赖性性染料结合系数标定的有效性。不仅如此，膜片钳技术也证实了本发明有关正常C17.2神经干细胞偏离Nernst钾电极特性，以及该细胞Nernst钾电极特性可以通过缬氨霉素通透处理和无钠离子溶液悬浮予以建立的结论。

应当指出，作为实施示例，本发明选择C17.2神经干细胞进行细胞静息膜电位及细胞钾电极特性的评价，不能理解为本发明实施的限制。有关的技术人员应当理解，本发明的实施方法可以完全或略做修改后用于其他细胞的膜电位和钾电极特性测量和评价。这不应该影响有关专利权利的保护。

实施例4材料三维结构条件下的细胞钾电极特性评价

一、材料三维结构的制备

本发明设计了一种三维微小凹图式结构用于考察材料三维结构条件下的细胞钾电极特性。微小凹直径为80μm，通道宽度为40μm，深度为100μm，微小凹结构的结构纵横比大于1，符合材料三维结构的几何特征(图6)。应当指出，本发明所采用的三维微小凹图式结构仅为一种评价材料三维结构条件下细胞钾电极特性的示例，并不影响本专利对其他三维结构构型中细胞钾电极特性评价的权利保护。

石英铬掩模由中国科学院微电子所制版加工。紫外光光刻及硅主模的加工由中国电子科技公司第二十四所协作完成。主模采用硅片(P<100>，电阻率7-13，北京有研半导体材料股份有限公司)进行加工。硅表面先后经氧化、阳性光刻胶涂层、光掩模图式到光刻胶涂层的紫外光光刻显影、氢氟酸湿法腐蚀SiO₂薄层、BOSCH工艺干法硅蚀刻、光刻胶涂层的去除加工成硅主模(凸型)。将PDMS(Sylgard 184，Dow Corning，USA)预聚体与固化剂按10∶1(质量比)混合，经真空除气后灌注于硅主模表面。样本经再次真空除气后放入50℃烘箱加热3h。样本经冷却后剥离硅主模即得到PDMS三维微小凹图式结构(如图6所示)。

制备的PDMS三维微结构厚度约为2mm，将其切割成1cm×1cm的方片备用。

二、细胞三维培养

将生长良好处于对数期的C17.2神经干细胞(融合度约80％)用0.25％胰酶-EDTA消化后，以约2×10⁵/ml的密度接种于置于一次性塑料塑料培养皿的PDMS三维结构上。加入添加10％FBS的DMEM/F12培养基(GIBCO，美国)，置于37℃，5％CO₂培养箱培养。

取接种两天的细胞，在相差显微镜下观察，取细胞生长状态较好，在微小凹中已经形成三维化生长的细胞作为实验样本(如图7所示)，并多取至少两皿细胞备用。

三、三维环境中钾电极特性的评价

以下钾电极特性的评价方法同实施例2。

钾电极特性的评价(细胞表观钠钾通透性比值P_Na/K的测量)

步骤：

1 含500nM的TMRM梯度K⁺浓度HBS缓冲液的配制。配制K⁺的浓度梯度分别为10，50，100，130mM，为保持细胞等渗，相应的Na⁺浓度分别设定为125，85，35，5mM，其他成份的含量同二维平面下测量的设置。取500μM的TMRM母液，稀释到以上各梯度K⁺溶液中，使染料终浓度为500nM.

2 将生长有细胞的微结构置于35mm培养皿，加入含染料的10mMK⁺的HBS，37℃下使染料充分平衡(约20min)。

3 激光共聚焦实验略(同实施例2)。

4 数据分析：如表8所示。

表8三维培养条件下细胞在梯度K+缓冲液中的胞内外荧光强度比值

应用Matlab数学分析软件，应用最小二乘法非线性迭代运算将实施例1公式(11)编程，将已求出的胞内钠浓度[Na⁺]_i、[K⁺]_i/f值和表9中已知自变量代入，运行。得拟合结果f＝0.15，P_Na/K＝0.35.

4 三维培养条件下单个细胞P_Na/K值的计算：取上述所选细胞，单个计算表观钠钾通透性比，运算，得结果表9。

表9三维培养条件下单个细胞的P值计算结果

结果显示：三维培养条件下单个细胞的表观钠钾通透性比值为P_Na/K＝0.36±0.08(n＝4)，(基于群体平均内外荧光强度比计算的P_Na/K值为0.35)，与平面培养的正常组细胞的表观钠钾通透性比值P_Na/K＝0.49±0.04(n＝4)(群体P值为0.48)相比，三维P_Na/K值显著小于二维P_Na/K值(p＜0.05，t检验)

上述结果表明，与实施例2中平面条件下培养的细胞一样，在三维结构条件下C17.2神经干细胞在扩增条件下也明显偏离了Nernst钾电极特性，对钠离子的通透性较高，已有较多的钠通道电流分化和表达。细胞钠通道尤其是电压依从式电流是神经干细胞向成熟神经干细胞分化的重要标志。三维微结构条件下神经干细胞表观钠钾通透性比值P_Na/K较之二维条件下明显降低，提示三维微结构可能有利于细胞保持神经干细胞的干细胞特性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.基于能斯特电势荧光染料的细胞钾电极特性的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A 建立具有能斯特钾电极特性的细胞

用钾离子载体对细胞进行处理，得具有能斯特钾电极特性的细胞；

B 对细胞内平均钾离子浓度与染料非电势依赖性结合系数的比值的计算

将步骤A所述具有能斯特钾电极特性的细胞浸浴在设定的梯度钾离子浓度，即[K⁺]_o的溶液中，用能斯特电势荧光染料染色并平衡，用荧光显微技术对染色平衡后的细胞在同一参数条件下拍照、图像分析，求得细胞内外荧光强度比值[F]_i/[F]_o，将已知的各组[K⁺]_o和[F]_i/[F]_o值代入公式

中，进行线性拟合，求得具有能斯特钾电极特性的细胞胞内平均钾离子浓度与染料非电势依赖性结合系数的比值，即[K⁺]_i/f；

C 胞内钠离子的检测

用钠离子载体对细胞通透使细胞内外的钠离子平衡，让细胞浸浴在预先设定的梯度钠离子浓度[Na⁺]_o的缓冲液中，对细胞加载Na⁺荧光染料并平衡，拍照，对图像进行分析，得到不同的[Na⁺]_o浓度所对应的荧光强度读数，以细胞内钠离子的荧光强度对设定浓度作图，对其进行线性拟合求得标准曲线方程；在相同的条件下，另取未使用用钠离子载体处理的细胞使用相同浓度的Na⁺荧光染料染色，拍照，对图像进行分析，得出对应的荧光强度读数，以胞内钠离子荧光强度代入上述标准曲线方程，可以直接计算胞内钠离子浓度；

D 非电势依赖性染料结合系数的标定及待测细胞钾电极特性评价值的获得

将待测钾电极特性的细胞浸浴在设定的梯度钾离子浓度的溶液中，该溶液是以不同浓度钾离子依次置换钠离子的等渗盐溶液，其中钾离子浓度与钠离子浓度之和为依据等渗条件设定的常量；用能斯特电势荧光染料分别染色并平衡，用荧光显微技术对染色平衡后的细胞在同一参数条件下拍照、图像分析，求得细胞内外荧光强度比值[F]_i/[F]_o；将上述所得各浓度梯度下对应的[F]_i/[F]_o比值、步骤B所得[K⁺]_i/f值以及步骤C所得的[Na⁺]_i值代入公式 $\frac{{\left[F\right]}_i}{{\left[F\right]}_o}=\frac{{\left[K^{+}\right]}_i/f+{\left[{\mathrm{Na}}^{+}\right]}_i\&CenterDot;P_{\mathrm{Na}/K}/f}{{\left[K^{+}\right]}_o+P_{\mathrm{Na}/K}{\left[{\mathrm{Na}}^{+}\right]}_o}$ 中，取得的数据采用非线性迭代拟合法求出染料非电势依赖性结合系数f、胞内钾离子浓度[K⁺]_i和细胞表观钠/钾通透性比值P_Na/K值；

所述步骤B和步骤C的进行无时间上的先后区分，[F]_i、[F]_o分别为胞内、外荧光强度，[K⁺]_o为胞外钾离子浓度，[K⁺]_i为胞内钾离子浓度，f为非电势依赖性染料结合系数，[Na⁺]_o为胞外钠离子浓度，[Na⁺]_i为胞内钠离子浓度。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤A中，钾离子载体为缬氨霉素。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤B中，能斯特电势荧光染料为四甲基罗丹明甲酯染料或其它依据能斯特平衡原理进行细胞膜电位测量的电势荧光染料。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤B中，细胞浸浴的梯度钾离子浓度溶液为无钠离子的盐溶液，钾离子浓度梯度由有机阳离子置换钾离子获得。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤B中，根据梯度钾离子浓度条件下的细胞内外荧光强度比值首先计算出细胞内钾离子平均浓度[K⁺]_i与染料非电势依赖性结合系数f的比值[K⁺]_i/f。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤C中，在对细胞进行钠离子荧光染料染色的同时，使用梯度钠离子浓度溶液浸浴经钠离子载体通透的细胞进行标定，获取钠离子浓度与荧光强度的标准曲线方程。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤D中，采用梯度钾离子浓度的盐溶液平衡浸浴待测细胞，其中平衡盐溶液中钠离子浓度高于步骤C中所测胞内钠离子浓度的数据点不少于三个。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤D中，采用最小二乘法非线性迭代拟合法求出染料非电势依赖性结合系数f、胞内钾离子浓度[K⁺]_i和细胞表观钠/钾通透性比值P_Na/K值。

9.权利要求1-8任一项所述的检测方法在细胞离子通道功能表达或功能分化的非侵入性评价中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的检测方法在材料三维结构条件下对神经干细胞离子通道功能表达或功能分化的非侵入性评价中的应用。

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