CN102351436A - 一种光响应性聚合物自组装膜对蛋白质控制吸附的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种光响应性聚合物自组装膜对蛋白质控制吸附的方法，特别是涉及在平滑或具有纳米结构的粗糙表面上通过层层自组装的方法，本发明的偶氮苯光响应性自组装膜由聚阳离子和聚阴离子组成，所述的聚阳离子是聚二烯丙基二甲基氯化铵；所述的聚阴离子由偶氮苯聚合物和二氧化硅纳米小球组成；可控吸附的蛋白质为牛血清蛋白，细胞色素C，溶菌酶，胰岛素等。本发明中采用层层自组装的方法组装膜，该膜具有良好的机械和化学稳定性，薄膜的组成和厚度可以控制。用二氧化硅纳米小球改变其表面的粗糙度，提高其表面的浸润性；用偶氮苯聚合物的光致异构化改变其表面的极性，达到对蛋白质分子的不同吸附。

Description

一种光响应性聚合物自组装膜对蛋白质控制吸附的方法
技术领域
本发明涉及一种光响应性聚合物自组装膜的制备以及对蛋白质控制吸附的方法，特别是涉及在平滑或具有纳米结构的粗糙表面上通过层层自组装的方法， 制备光响应性薄膜，并调控蛋白质的吸附及解吸附。
背景技术
偶氮苯化合物是指分子结构中含有偶氮基团的化合物。偶氮苯化合物存在反式和顺式两种异构体，反式构型是较稳定的结构。在紫外光照射下，反式构型转变为顺式构型；在可见光照射或热的作用下，顺式构型转变为反式构型，偶氮苯结构相互转变过程是可逆的。在光致异构化的过程中，伴随着偶氮苯偶极矩、以及极性的可逆变化，从而可以引起偶氮苯化合物表面浸润性的可逆变化。
制备功能高分子薄膜是发挥其功能性和实现其应用价值的重要手段。层层自组装的方法具有操作灵活，设备简单，薄膜的形状、厚度可以精确控制，并且组装的薄膜具有良好的机械和化学稳定性。因此，层层自组装的方法已成为制备功能高分子薄膜的普遍方法，在纳米颗粒、碳纳米管、聚合物胶束以及人造分子领域有重要的应用价值。聚电解质自组装是层层自组装中的一部分，利用带相反电荷的聚电解质（聚阳离子和聚阴离子）间的相互作用，来实现聚电解质的自组装。
蛋白质吸附是材料与蛋白质接触所引起的一种反应，决定着细胞、血小板的黏附行为，从而决定着材料的生物相容性。蛋白质吸附行为研究具有巨大的科学价值和应用前景，已引起国内外科研工作者广泛关注。一方面，预防、降低由于蛋白质吸附造成的生物污染及生物薄膜，是船舶制造、生物制药、食品加工等产业密切关注的问题；另一方面，在医疗移植材料如骨骼、牙齿、皮肤或组织的移植过程中，又要求所选择的蛋白质具有优异的黏附性能，才能保证移植物与肌体有良好的生物相容性，并最大程度的恢复移植物的生理功能。
蛋白质吸附与浸润性关系：
蛋白质的吸附行为与接触表面的化学结构密切相关。Whitesides等在金表面通过分子自组装技术制备了寡聚乙二醇分子与烷烃分子复合的单层膜，发现按一定比例复合的分子膜在室温及37°C下对蛋白质的吸附性能不同：37°C下比在室温下能吸附更多的蛋白质分子。Grunze等发现这种吸附性能的温度依赖性与表面浸润性变化相一致，温度高于32°C时分子具有疏水结构，温度低于32°C时分子具有亲水结构。Benhabbour等在树枝状分子
表面修饰了聚乙二醇PEG，研究了PEG分子量与树枝状分子代数对蛋白质分子吸附能力的影响，发现疏水性强的表面能吸附更多的蛋白质分子。由于胰岛素蛋白质分子的疏水片段与高分子Teflon的强疏水表面的相互吸引作用，可使蛋白质分子在高分子表面形成强烈吸附。除了材料表面的化学组成，其表面的纳米拓扑结构也会影响蛋白质的吸附行为。纳米拓扑结构影响因素在近几年才受到科研工作者的关注。材料表面的粗糙度、弯曲表面的曲面曲率、表面的特定几何形状如凹凸结构、金字塔形结构都会对蛋白质的吸附产生影响。如Rechendorff等研究发现，增大表面粗糙度可大大提高蛋白质的吸附量。在特殊功能分子表面，赋予其一定的纳米拓扑结构，必将对蛋白质的吸附性能产生重要影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有光响应的偶氮苯聚合物自组装膜，并且该自组装膜可以通过光场的变化调控对蛋白质的吸附以及解吸附：在紫外光照射下蛋白质从自组装膜解吸附、脱落；在可见光照射下蛋白质重新吸附于自组装膜上。且所制备的自组装膜具有良好的机械和化学稳定性，薄膜的组成和厚度可以控制等诸多优点。
 
本发明的光响应性偶氮苯聚合物自组装膜有聚阳离子和聚阴离子组成，所述的聚阳离子是聚二烯丙基二甲基氯化铵；所诉的聚阴离子由偶氮苯聚合物或二氧化硅纳米小球组成。将组装完的自组装膜浸入到蛋白质溶液中，以达到对蛋白质吸附的调控，所述蛋白质为牛血清蛋白，细胞色素C，溶菌酶或胰岛素。 
 
本发明的技术方案是：一种光响应性聚合物自组装膜对蛋白质控制吸附的方法，具体包括以下步骤：
1.将基片在浓度为98%的浓硫酸和浓度为30%的H2O2以体积比为2:1混合溶液中浸泡2小时，然后用超纯净水反复清洗，接着再将基片浸入H2O/H2O2/浓氨水的混合溶液中浸泡2小时，最后，取出基片反复清洗，用N2吹干，备用；其中，H2O/H2O2/浓氨水的体积比为5:4:2；
2.将经过步骤1处理的基片首先浸入pH为5～7、浓度为100～1000mg /500mL聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液中5～30分钟，取出浸入去离子水中浸泡1-5分钟；取出并吹干；接着再浸入pH为5～7的聚阴离子溶液中5～30分钟，取出浸入去离子水中浸泡1-5分钟；取出并吹干；反复进行上述过程得到多层的偶氮苯光响应性自组装膜，备用；
3. 对蛋白质进行吸附：
将步骤2制备得到的多层偶氮苯光响应性自组装膜浸入到pH为5～7的蛋白质溶液中5～60分钟，然后取出用超纯净水反复清洗并吹干，蛋白质溶液吸附到多层自组装膜表面；
4. 对蛋白质进行解吸附：
将步骤2制备得到的多层自组装膜先用强度为5～100mW/cm2的紫外光照射5-30分钟，再浸入牛血清蛋白溶液中5～60分钟，然后取出用超纯净水反复清洗并吹干,蛋白质很少吸附到多层自组装膜表面。
进一步，所述的聚阴离子溶液为浓度为10～100 mg /100mL的偶氮苯聚合物的水溶液或二氧化硅纳米小球的水溶液。
进一步，所述的蛋白质溶液为浓度为1～100mg/100ml的牛血清蛋白，细胞色素C，溶菌酶或胰岛素的水溶液。
进一步，所述基片为包括石英片、玻璃片或硅片。
本发明具有以下特点： 
1.本发明中采用层层自组装的方法组装膜，该膜具有良好的机械和化学稳定性，薄膜的组成和厚度可以控制。
2.组装膜中的偶氮苯聚合物具有顺-反两种异构体，通过紫外光和可见光照射，实现了在反式结构和顺式结构的可逆转化，从而实现对蛋白质的吸附及解吸附。
3.自组装膜中的二氧化硅纳米小球带负电荷，可以通过静电吸附均匀的组装到膜上，形成具有表面粗糙度的组装膜，提高了膜表面的浸润性。
                               
附图说明
图1：本发明实施例1的偶氮苯自组装膜紫外-可见吸收光谱示意图。
图2: 本发明实施例1中水滴在紫外光照射前的偶氮苯自组装膜表面的微观形貌照片示意图。
图3：本发明实施例1中水滴在紫外光照射后的偶氮苯自组装膜表面的微观形貌照片示意图。
图4：本发明实施例1中偶氮苯自组装膜表面在2um范围内的原子力显微镜照片示意图。图5：本发明实施例1中偶氮苯自组装膜表面在1um范围内的原子力显微镜照片示意图。
图6：本发明实施例1中偶氮苯自组装膜吸附牛血清蛋白的荧光光谱示意图。
图7： 本发明实施例1中偶氮苯自组装膜吸附牛血清蛋白的2um范围的原子力显微镜照片示意图。
图8： 本发明实施例1中偶氮苯自组装膜吸附牛血清蛋白的1um范围的原子力显微镜照片示意图。
图9：本发明实施例1中偶氮苯自组装膜吸附牛血清蛋白的1um范围的三维原子力显微镜照片示意图。
图10：本发明实施例1中偶氮苯自组装膜经过紫外光照射后吸附牛血清蛋白的5um范围的原子力显微镜照片示意图。
图11：本发明实施例1中偶氮苯自组装膜经过紫外光照射后吸附牛血清蛋白的2um范围的原子力显微镜照片示意图。
图12：本发明实施例1中偶氮苯自组装膜经过紫外光照射后吸附牛血清蛋白的2um范围的三维原子力显微镜照片；
图13：本发明实施例2中偶氮苯自组装膜（偶氮苯单层膜）吸附牛血清蛋白的荧光光谱示意图。
图14： 本发明实施例2中偶氮苯自组装膜（偶氮苯单层膜）吸附牛血清蛋白的2um范围的原子力显微镜照片示意图。
图15： 本发明实施例2中偶氮苯自组装膜（偶氮苯单层膜）吸附牛血清蛋白的5um范围的原子力显微镜照片示意图。
图16：本发明实施例2中偶氮苯自组装膜（偶氮苯单层膜）经过紫外光照射后吸附牛血清蛋白的2um范围的原子力显微镜照片示意图。
图17：本发明实施例2中偶氮苯自组装膜（偶氮苯单层膜）经过紫外光照射后吸附牛血清蛋白的5um范围的原子力显微镜照片示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步阐述，而不是要以此对本发明进行限制。
实施例1：
1.将基片在浓度为98%的浓硫酸和浓度为30%的H2O2以体积比为2:1混合溶液中浸泡2小时，然后用超纯净水反复清洗，接着再将基片浸入H2O/H2O2/浓氨水的混合溶液中浸泡2小时，最后，取出基片反复清洗，用N2吹干，备用；其中，H2O/H2O2/浓氨水的体积比为5:4:2；
2.（1）将经过处理过的石英片先浸入pH为5、浓度为100 mg/500mL聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液中10分钟，取出浸入去离子水中浸泡2分钟；取出并吹干，浸入浓度为10mg /100mL的偶氮苯聚合物的水溶液中浸泡10分钟，取出浸入去离子水中浸泡2分钟，取出并吹干。用紫外—可见光谱仪测定膜的紫外吸收曲线。反复进行五次上述过程得到五层组装膜。
2）将上述含五层膜的石英片再次浸入pH为5、浓度为100mg /500mL聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液中浸泡10分钟，取出浸入去离子水中浸泡2分钟；取出并吹干，再次浸入浓度为10mg /100mL的二氧化硅水溶液中浸泡10分钟，取出浸入去离子水中浸泡2分钟，取出并吹干。用紫外—可见光谱仪测定膜的紫外吸收曲线。反复进行十次上述过程得到十五层组装膜。
3）将上述含十五层膜的石英片浸入pH为5、浓度为100 mg/500mL聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液中浸泡10分钟，取出浸入去离子水中浸泡2分钟；取出并吹干，浸入浓度为10mg /100mL的偶氮苯聚合物的水溶液中浸泡10分钟，取出浸入去离子水中浸泡2分钟，取出并吹干。用紫外—可见光谱仪测定膜的紫外吸收曲线。如此得到多层偶氮苯光响应性自组装膜。
4）将上述多层偶氮苯光响应性自组装膜浸入50mg/100ml的牛血清蛋白的水溶液中30分钟，取出浸入去离子水中浸泡2分钟，取出并吹干。
5）将上述偶氮苯光响应性自组装膜用强度为11mW/cm2的紫外光照射5分钟，然后浸入50mg/100ml的牛血清蛋白的水溶液中30分钟，取出浸入去离子水中浸泡2分钟，取出并吹干。
偶氮苯光响应性自组装膜的紫外-可见吸收光谱如图1所示，制备的偶氮苯自组装膜具有规整的机构。紫外光照射前后，水滴在其表面的微观形貌照片如图 2 和图3所示，接触角分别为103°和86°。偶氮苯自组装膜的原子力显微镜照片如图4和图5所示，图4为2um范围的原子力显微镜照片；图5为图4放大的原子力显微镜照片，自组装膜具有规整的结构。 
偶氮苯光响应性自组装膜吸附牛血清蛋白后的荧光光谱如图6所示。图6A为偶氮苯光响应性自组装膜紫外光照射前吸附牛血清蛋白的荧光光谱；图6B为偶氮苯光响应性自组装膜经过强度为10mW/cm2的紫外光照射后吸附牛血清蛋白的荧光光谱。偶氮苯自组装膜吸附牛血清蛋白的原子力显微镜照片如图7、8、9所示，图7为2um范围的原子力显微镜照片；图8为图7放大的原子力显微镜照片；图9为1um范围的三维原子力显微镜照片。
偶氮苯自组装膜经过强度为10mW/cm2的紫外光照射后吸附牛血清蛋白的原子力显微镜照片如图10、11、12所示，图10为5um范围的原子力显微镜照片；图11为图10放大的原子力显微镜照片；图12为2um范围的三维原子力显微镜照片。
 
实施例2：
    1）将经过处理过的玻璃片先浸入pH为6、浓度为600mg /500mL聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液中10分钟，取出浸入去离子水中浸泡3分钟；取出并吹干，浸入浓度为55mg /100mL的偶氮苯聚合物的水溶液中浸泡10分钟，取出浸入去离子水中浸泡3分钟，取出并吹干。用紫外—可见光谱仪测定膜的紫外吸收曲线。
2）将上述偶氮苯光响应性自组装膜浸入浓度为50mg/100ml的牛血清蛋白的水溶液中15分钟，取出浸入去离子水中浸泡3分钟，取出并吹干。
3）将上述偶氮苯光响应性自组装膜用强度为5mW/cm2的紫外光照射15分钟，然后浸入50mg/100ml的牛血清蛋白的水溶液中30分钟，取出浸入去离子水中浸泡3分钟，取出并吹干。
偶氮苯光响应性自组装膜（偶氮苯单层膜）吸附牛血清蛋白后的荧光光谱如图13所示。图13A为偶氮苯光光响应性单层膜紫外光照射前吸附牛血清蛋白的荧光光谱；图13B为偶氮苯光响应性单层膜经过强度为5mW/cm2的紫外光照射后吸附牛血清蛋白的荧光光谱。
偶氮苯自组装膜（偶氮苯单层膜）吸附牛血清蛋白的原子力显微镜照片如图14和15所示，图14为2um范围的原子力显微镜照片；图15为图14放大的原子力显微镜照片。 
偶氮苯自组装膜（偶氮苯单层膜）经过强度为5mW/cm2的紫外光照射后吸附牛血清蛋白的原子力显微镜照片如图16和17所示，图16为2um范围的原子力显微镜照片；图17为图16放大的原子力显微镜照片。 
 
实施例3：
1）将经过处理过的硅片先浸入pH为7、浓度为1000mg /500mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液中25分钟，取出浸入去离子水中浸泡4分钟；取出并吹干，浸入浓度为75mg /100mL的偶氮苯聚合物的水溶液中浸泡25分钟，取出浸入去离子水中浸泡4分钟，取出并吹干。用紫外—可见光谱仪测定膜的紫外吸收曲线。反复进行五次上述过程得到五层组装膜。
2）将上述含五层膜的硅片再次浸入pH为7、浓度为1000mg /500mL聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液中浸泡25分钟，取出浸入去离子水中浸泡4分钟；取出并吹干，浸入浓度为75mg /100mL的二氧化硅水溶液中浸泡25分钟，取出浸入去离子水中浸泡4分钟，取出并吹干。用紫外—可见光谱仪测定膜的紫外吸收曲线。反复进行十次上述过程得到十五层组装膜。
3）将上述含十五层膜的硅片浸入pH为7、浓度为1000mg /500mL聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液25分钟，取出浸入去离子水中浸泡4分钟；取出并吹干，浸入浓度为75mg /100mL的偶氮苯聚合物的水溶液中浸泡25分钟，取出浸入去离子水中浸泡4分钟，取出并吹干。用紫外—可见光谱仪测定膜的紫外吸收曲线。如此得到偶氮苯光响应性自组装膜。
4）将上述偶氮苯光响应性自组装膜浸入浓度为100mg/100ml的溶菌酶中60分钟，取出浸入去离子水中浸泡4分钟，取出并吹干。
5）将上述偶氮苯光响应性自组装膜用强度为30mW/cm2的紫外光照射30分钟，然后浸入浓度为100mg/100ml的溶菌酶中60分钟，取出浸入去离子水中浸泡2分钟，取出并吹干。
 
实施例4：
1）将经过处理过的石英片先浸入pH为7、浓度为800mg /500mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液（PDAC）中浸泡5分钟，取出浸入去离子水中浸泡2分钟；取出并吹干，浸入浓度为80 mg /100mL的偶氮苯聚合物水溶液中浸泡5分钟，取出浸入去离子水中浸泡2分钟，取出并吹干。用紫外—可见光谱仪测定膜的紫外吸收曲线。反复进行五次上述过程得到五层组装膜。
2）将上述含五层膜的石英片浸入pH为7、浓度为800mg /500mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中浸泡5分钟，取出浸入去离子水中浸泡2分钟；取出并吹干，浸入浓度为80 mg /100mL的二氧化硅水溶液中浸泡5分钟，取出浸入去离子水中浸泡2分钟，取出并吹干。用紫外—可见光谱仪测定膜的紫外吸收曲线。反复进行十次上述过程得到十五层组装膜。
3）将上述含十五层膜的石英片浸入pH为7、浓度为800mg /500mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液中浸泡5分钟，取出浸入去离子水中浸泡2分钟；取出并吹干，浸入浓度为80 mg /100mL的偶氮苯聚合物水溶液中浸泡5分钟，取出浸入去离子水中浸泡2分钟，取出并吹干。用紫外—可见光谱仪测定膜的紫外吸收曲线。如此得到偶氮苯光响应性自组装膜。
4）将上述偶氮苯光响应性自组装膜浸入PH为6、浓度为80mg/100ml的细胞色素C的水溶液中45分钟，取出浸入去离子水中浸泡5分钟，取出并吹干。
5）将上述偶氮苯光响应性自组装膜用强度为60mW/cm2的紫外光照射10分钟后浸入PH为6、浓度为80mg/100ml的细胞色素C的水溶液中45分钟，取出浸入去离子水中浸泡5分钟，取出并吹干。
 
实施例5：
1）将经过处理过的石英片先浸入pH为6、浓度为300mg /500mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液（PDAC）中浸泡30分钟，取出浸入去离子水中浸泡5分钟；取出并吹干，浸入浓度为25 mg /100mL的偶氮苯聚合物水溶液中浸泡30分钟，取出浸入去离子水中浸泡5分钟，取出并吹干。用紫外—可见光谱仪测定膜的紫外吸收曲线。反复进行五次上述过程得到五层组装膜。
2）将上述含五层膜的石英片浸入pH为6、浓度为300mg /500mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中浸泡30分钟，取出浸入去离子水中浸泡5分钟；取出并吹干，浸入浓度为25 mg /100mL的二氧化硅水溶液中浸泡30分钟，取出浸入去离子水中浸泡5分钟，取出并吹干。用紫外—可见光谱仪测定膜的紫外吸收曲线。反复进行十次上述过程得到十五层组装膜。
3）将上述含十五层膜的石英片浸入pH为6、浓度为300mg /500mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液中浸泡30分钟，取出浸入去离子水中浸泡5分钟；取出并吹干，浸入浓度为25 mg /100mL的偶氮苯聚合物水溶液中浸泡30分钟，取出浸入去离子水中浸泡5分钟，取出并吹干。用紫外—可见光谱仪测定膜的紫外吸收曲线。如此得到偶氮苯光响应性自组装膜。
4）将上述偶氮苯光响应性自组装膜浸入PH为6、浓度为10mg/100ml的胰岛素的水溶液中45分钟，取出浸入去离子水中浸泡5分钟，取出并吹干。
5）将上述偶氮苯光响应性自组装膜用强度为100mW/cm2的紫外光照射10分钟后浸入PH为6、浓度为10mg/100ml的胰岛素的水溶液中45分钟，取出浸入去离子水中浸泡5分钟，取出并吹干。

Claims (4)

1.一种光响应性聚合物自组装膜对蛋白质控制吸附的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）.将基片在浓度为98%的浓硫酸和浓度为30%的H2O2以体积比为2:1混合溶液中浸泡2小时，然后用超纯净水反复清洗，接着再将基片浸入H2O/H2O2/浓氨水的混合溶液中浸泡2小时，最后，取出基片反复清洗，用N2吹干，备用；其中，H2O/H2O2/浓氨水的体积比为5:4:2；
（2）.将经过步骤1处理的基片首先浸入pH为5～7、浓度为100～1000mg /500mL聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液中5～30分钟，取出浸入去离子水中浸泡1-5分钟；取出并吹干；接着再浸入pH为5～7的聚阴离子溶液中5～30分钟，取出浸入去离子水中浸泡1-5分钟；取出并吹干；反复进行上述过程得到多层的偶氮苯光响应性自组装膜，备用；
对蛋白质进行吸附：
将步骤2制备得到的多层偶氮苯光响应性自组装膜浸入到pH为5～7的蛋白质溶液中5～60分钟，然后取出用超纯净水反复清洗并吹干，蛋白质溶液吸附到多层自组装膜表面；
对蛋白质进行解吸附：
将步骤2制备得到的多层自组装膜先用强度为5～100mW/cm2的紫外光照射5-30分钟，再浸入pH为5-7的蛋白质溶液中5～60分钟，然后取出用超纯净水反复清洗并吹干,蛋白质很少吸附到多层自组装膜表面。
2.如权利要求 1 所述的光响应性聚合物自组装膜对蛋白质控制吸附的方法，其特征在于，所述的聚阴离子为浓度为10～100 mg /100mL的偶氮苯聚合物的水溶液或二氧化硅纳米小球的水溶液。
3.如权利要求 1 所述的光响应性聚合物自组装膜对蛋白质控制吸附的方法，其特征在于所述的蛋白质溶液为浓度为1～100mg/100ml的牛血清蛋白，细胞色素C，溶菌酶或胰岛素的水溶液。
4.根据权利要求1所述光响应性聚合物自组装膜对蛋白质控制吸附的方法，其特征在于，所述基片为包括石英片、玻璃片或硅片。
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