CN102344936B - 控制植物衰老程序性细胞死亡的方法 - Google Patents

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Abstract

通过将编码衰老诱导性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶、衰老诱导性elF-5A或二者的基因或基因片段以反义方向整合入植物基因组，可在所述植物中实现调节程序性细胞死亡(包括衰老)表达。鉴定编码衰老诱导性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶和衰老诱导性elF-5A的植物基因，在转基因植物中单独或组合使用每种所述核苷酸序列减缓衰老。

Description

控制植物衰老程序性细胞死亡的方法
本申请是以下申请的分案申请：申请日：2001年11月29日；申请号：01822314.1(PCT/US01/44505)；发明名称：同上。
本申请是2000年11月29日提交的序列号为09/725,019的PCT，该申请是1999年7月6日提交的序列号09/348,675和2000年6月19日提交的序列号09/597,771的继续部分申请。
发明领域
本发明涉及编码具衰老诱导性表达的植物多肽的多核苷酸。本发明还涉及含反义方向所述多核苷酸的转基因植物以及控制植物程序性细胞死亡(包括衰老)的方法。更具体地说，本发明涉及衰老诱导性植物脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因和衰老诱导性elF-5A基因，它们的表达受程序性细胞死亡(包括衰老)发生诱导，植物脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因和elF-5A基因单独或组合用于控制植物程序性细胞死亡和衰老。
背景技术
衰老在植物生命中属于生物发育末期。衰老预示着死亡，并在各个阶段的生物组织中发生，包括全株、器官、花和果实、组织以及个体细胞。
衰老的发生可由不同因素引起，既有外部的，也有内部的。衰老在植物或植物组织(例如果实、花和叶)生命中是一个复杂的高度受控的发育阶段。衰老导致细胞膜和大分子协调裂解，代谢物随后转移至植株的其它部分。
除了正常植物发育过程中发生的程序性衰老以外，细胞和组织死亡以及随后的代谢物再转移为对外部环境因素的同步反应。外部因素诱导衰老过早开始，也称作坏死或凋亡，这些因素包括环境压力，例如温度、干旱、日照或营养供应差以及病原体攻击。暴露在环境压力下的植物组织还产生乙烯，通常称为应激乙烯(Buchanan-Wollaston，V.，1997，J.Exp.Botany，48：181-199；Wright，M.，1974，Plant，120：63-69)。已知乙烯引起某些植物衰老。
衰老不是一个被动过程，而是一个涉及特定基因协同表达的主动受控过程。在衰老过程中，总RNA水平降低，许多基因的表达关闭(Bate等，1991，J.Exper.Botany，42，801-11；Hensel等，1993，The PlantCell，5，553-64)。但是，越来越多的证据表明衰老过程取决于核基因从头转录。例如，mRNA和蛋白合成以及去核的抑制剂阻断衰老。体外翻译实验使用衰老叶和绿色叶的mRNA进行分子研究，结果显示衰老阶段的叶蛋白产物图谱改变(Thomas等，1992，J.Plant Physiol.，139，403-12)。使用差异筛选和扣除杂交技术，已经由一系列不同植物(既包括单子叶植物，也包括双子叶植物，例如拟南芥(Arabidopsis)、玉米、黄瓜、芦笋、番茄、水稻和马铃薯)中鉴定出许多代表衰老诱导基因的cDNA克隆。衰老过程中特异性表达基因的确定是衰老发生需要从头转录的强有力证据。
衰老过程中发生的事件似乎高度协调，以在坏死和死亡发生前最大程度利用细胞组分。为调节该过程，一定在特定信号感知和基因表达级联诱导之间发生了复杂相互作用。编码衰老相关蛋白的基因表达可能通过普通激活蛋白调节，而这些激活蛋白又由激素信号直接或间接活化。几乎不知道有关该过程初始信号转导或随后协调所涉及的机制。
协调基因表达需要涉及转录和翻译的因子，包括起始因子。已经分离并特征鉴定出各种生物(包括植物)的转录起始因子基因。真核生物翻译起始因子5A(elF-5A)是约17KDa大小的必需蛋白因子，它参与真核生物细胞蛋白合成的起始。其特征在于存在8-羟-2，7，10-三氨基癸酸[N-(4-氨基-2-羟丁基)赖氨酸]，它是一个独特的修饰氨基酸，已知仅存在于elF-5A中。通过将多聚胺亚精胺的丁氨基基团转移至elF-5A的特定赖氨酸残基的侧链氨基基团并羟基化，翻译后形成8-羟-2，7，10-三氨基癸酸。elF-5A的活化包括将亚精胺的丁氨基残基转移至elF-5A的赖氨酸，形成8-羟-2，7，10-三氨基癸酸并活化elF-5A。在真核生物中，脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶(DHS)介导elF-5A中8-羟-2，7，10-三氨基癸酸的翻译后合成。相应的DHS基因还没有在植物中鉴定出来，但已知植物elF-5A含有8-羟-2，7，10-三氨基癸酸。已经用甲硫氨酰基嘌呤霉素测定证明，8-羟-2，7，10-三氨基癸酸修饰对体外elF-5A活性必须的。
8-羟-2，7，10-三氨基癸酸仅存在于elF-5A中，并可见于所有真核生物、某些古生菌(似乎与真核生物相关)中，但真细菌中没有。而且，elF-5A的氨基酸序列高度保守，特别是在8-羟-2，7，10-三氨基癸酸残基周围的区域，提示elF-5A及其活化蛋白脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶在真核生物细胞生理学中基本上执行重要步骤(Joe等，JBC，270：22386-22392，1995)。已经由人、苜蓿、粘菌、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、烟草和酵母中克隆出elF-5A。原来根据其分离自兔网状细胞裂解物核糖体及其刺激甲硫氨酰基嘌呤霉素合成的体外活性将其鉴定为一般翻译起始因子。但是，更多的近期数据表明，elF-5A不是总体蛋白合成的翻译起始因子，而是用于促进mRNA群特定亚群的翻译。例如，采用动物细胞和酵母的实验强有力地证明，elF-5A的一种或多种同种型在介导参与细胞增殖的mRNA亚群翻译方面起必不可少的作用。elF-5A在酵母中存在两种同种型，如果两种基因都是沉默的，则细胞不能分裂(Park等，Biol.Signals，6：115-123，1997)。同样，激活elF-5A的酵母脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶表达沉默阻止细胞分裂。实际上，已经开发出脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶抑制剂，它们可能对治疗高增殖病很重要(Wolff等，JBC，272：15865-15871，1997)。其它研究表明，elF-5A的另一个同种型对HIV-1复制中的Rev功能或HTLV V复制中的Rex功能是必须的(Park等，Biol.Signals，6：115-123，1997)。在烟草中还存在至少两种表达的elF-5A基因。基因特异性探针表明，尽管它们在所有检测的组织中都表达，但每种基因都具有不同的表达图谱，推测调节特定转录物的翻译(Chamot等，Nuc.Acids Res.，20：625-669，1992)。
已经由大鼠睾丸、HeLa细胞、粗糙脉孢菌和酵母中纯化出脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶。脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶的氨基酸序列高度保守，不同物种的该酶共同拥有相似的物理和催化特性，并表现出与异源elF-5A前体的物种交叉反应性(Park等，6 Biol.Signals，6：115-123，1997)。
植物多聚胺涉及各种各样的生理作用，包括成花诱导、胚胎发生、病原体抗性、细胞生长、分化和分裂(Evans等，1989，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，40，235-269；和Galston等，1990，Plant Physiol.，94，406-10)。已经表明，elF-5A是中间体，多聚胺通过elF-5A发挥其作用(Chamot等，1992，Nuc.Acids Res.，20(4)，665-69)。
已经鉴定出两种编码烟草elF-5A同种型的基因(NelF-5A1和NelF-5A2)(Chamot等，1992，Nuc.Acids Res.，20(4)，665-69)。研究显示两种基因非常相似。但是，它们显示出不同的表达图谱。一种基因似乎在mRNA水平上组成型表达，而另一种基因的表达图谱与有或没有光合活性相关。根据基因结构和基因组DNA作图，提示在烟草中存在一个NelF-5A基因的多基因家族。有可能存在调节衰老/坏死特异性mRNA转录物亚群翻译的elF-5A同种型。
目前，没有广为适用的方法控制由内部或外部因素(例如环境压力)引起的程序性细胞死亡(包括衰老)的发生。因此，开发应用于所有类型植物并在衰老一系列事件中的最早期阶段有效的衰老调节技术令人感兴趣。
发明内容
本发明基于发现和克隆了编码番茄衰老诱导性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶(DHS)的全长cDNA克隆以及拟南芥叶和香石竹花瓣全长衰老诱导性DHS cDNA克隆。本文公开了核苷酸序列和对应的氨基酸序列。
本发明还部分基于编码番茄、拟南芥和香石竹衰老诱导性elF-5A基因的全长cDNA克隆的发现和克隆。本文公开了每种elF-5A cDNA克隆的核苷酸序列和对应的氨基酸序列。
本发明提供一种遗传修饰植物以控制衰老(或年龄相关性衰老，或环境压力诱导性衰老)发生的方法。将本发明的衰老诱导性DHS核苷酸序列、其片段或这些片段的组合反向导入植物细胞，以抑制内源衰老诱导性DHS基因表达，由此降低内源衰老诱导性DHS蛋白的水平，并降低和/或预防elF-5A的活化以及随后的介导衰老的基因表达。
在本发明的另一方面，将本发明的衰老诱导性elF-5A核苷酸序列、其片段或这些片段的组合反向导入植物细胞，以抑制内源衰老诱导性elF-5A基因的表达，由此降低内源衰老诱导性elF-5A蛋白的水平，并降低和/或预防随后的介导衰老的基因表达。或者，DHS序列和elF-5A序列可一起用于降低内源DHS和elF-5A蛋白的水平。
再另一方面，本发明涉及一种遗传修饰植物的方法，该方法通过将组合的本发明衰老诱导性elF-5A核苷酸序列和本发明衰老诱导性DHS核苷酸序列反向导入植物细胞，以抑制内源衰老诱导性elF-5A基因和衰老诱导性DHS基因表达，由此降低内源衰老诱导性DHS蛋白的水平，并降低和/或预防elF-5A活化以及随后的介导衰老的基因表达，从而控制衰老(或年龄相关性衰老，或环境压力诱导性衰老)的发生。
再另一方面，本发明涉及一种遗传修饰植物的方法，该方法通过将组合的本发明衰老诱导性elF-5A核苷酸序列和/或本发明衰老诱导性DHS核苷酸序列反向导入植物细胞，以抑制内源衰老诱导性elF-5A基因和/或衰老诱导性DHS基因表达，由此降低内源衰老诱导性DHS蛋白的水平，和/或降低和/或预防elF-5A活化以及随后的介导衰老的基因表达，从而增加对生理疾病(例如但不限于蒂腐病)的抗性。在一个特别优选的方面，反向引入内源衰老诱导性DHS的3′末端。
使用本发明的方法产生转基因植株并监测生长、发育以及自然或过早诱发的衰老。由于衰老诱导性DHS水平、衰老诱导性elF-5A水平降低或二者水平都降低，使植株或植株分离部分(例如插条、花、蔬菜、果实、种子或叶)表现出长寿或长储存期(例如花期延长、水果或蔬菜变质减少、重量增加、种子产量增加、对生理疾病(例如蒂腐病)的抗性增加、种子衰老减轻和/或叶变黄减轻)，选择这样的植株或植株分离部分作为具有改进特性的目的产物，所述改进特性包括在运输和储存过程中叶变黄减少、花瓣脱落减少、果实和蔬菜变质减少。繁殖这些优质植株。同样，选择表现出对环境压力抗性增加(例如降低对低温(冷冻)、干旱、感染等的敏感性和/或增加对病原体和/或生理疾病的抗性)的植株作为优质产物。
一方面，本发明涉及编码衰老诱导性DHS的分离DNA分子或其功能衍生物，其中所述DNA分子或其功能衍生物与SEQ ID NO：1杂交。在本发明该方面的一个实施方案中，所述分离DNA分子具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，即与SEQ ID NO：1 100％互补(序列同一)。
本发明还涉及编码衰老诱导性DHS的分离DNA分子或其功能衍生物，其中所述DNA分子或其功能衍生物与SEQ ID NO：9杂交。在本发明该方面的一个实施方案中，所述分离DNA分子具有SEQ IDNO：9的核苷酸序列，即与SEQ ID NO：9 100％互补(序列同一)。
本发明还涉及编码衰老诱导性elF-5A的分离DNA分子或其功能衍生物，其中所述DNA分子或其功能衍生物与SEQ ID NO：11、SEQID NO：13或SEQ ID NO：15杂交。在本发明该方面的一个实施方案中，所述分离DNA分子具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQID NO：15的核苷酸序列，即与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15 100％互补(序列同一)。
在本发明的另一个实施方案中，提供由上文所述的DNA分子编码的分离蛋白或其功能衍生物。一种优选的蛋白具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或是其功能衍生物。另一个优选蛋白具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列，或是其功能衍生物。本发明的其它优选蛋白具有SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
本文还提供编码RNA分子的反义寡核苷酸或多核苷酸，所述RNA分子与上文描述的DNA分子的RNA转录物的对应部分互补，其中所述寡核苷酸或多核苷酸与所述RNA转录物杂交，使得内源衰老诱导性DHS的表达改变。在本发明该方面的另一个实施方案中，所述反义寡核苷酸或多核苷酸是一种RNA分子，它与上文描述的DNA分子的RNA转录物的对应部分杂交，使得内源衰老诱导性elF-5A的表达改变。所述反义寡核苷酸或多核苷酸可为全长，或者优选具有约6-100个核苷酸。
所述反义寡核苷酸或多核苷酸可与编码衰老诱导性DHS的DNA分子的一条链的对应部分大致互补，其中所述编码衰老诱导性DHS的DNA分子与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9或其组合杂交，或者与编码衰老诱导性DHS的DNA分子编码的RNA序列的至少对应部分大致互补。在本发明的一个实施方案中，所述反义寡核苷酸或多核苷酸与核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9或其组合的一条链的对应部分大致互补，或与由SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9或其组合转录的RNA转录物的对应部分大致互补。在另一个实施方案中，所述反义寡核苷酸与编码衰老诱导性DHS的DNA分子的一条链的5′非编码部分或3′部分的对应部分大致互补，其中所述DNA分子与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：9或其组合杂交。
另一方面，所述反义寡核苷酸或多核苷酸可与编码衰老诱导性elF-5A的DNA分子的一条链的对应部分大致互补，其中所述编码衰老诱导性elF-5A的DNA分子与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或其任意组合杂交，或者与由SEQ ID NO：11、SEQID NO：13或SEQ ID NO：15转录的RNA序列的至少对应部分大致互补。在本发明的一个实施方案中，所述反义寡核苷酸或多核苷酸与核苷酸序列SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或其组合的一条链的对应部分大致互补，或者编码的RNA转录物与由编码衰老诱导性elF-5A的DNA分子编码的RNA序列的对应部分大致互补。在另一个实施方案中，所述反义寡核苷酸与编码衰老诱导性elF-5A的DNA分子的一条链的5′非编码区或3′区的对应部分大致互补，其中所述DNA分子与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15或其组合杂交。
本发明进一步涉及转化植物细胞的载体，该载体包括：
(a)与(1)编码衰老诱导性DHS的DNA分子的一条链的对应部分，其中所述编码衰老诱导性DHS的DNA分子与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：9杂交，或(2)由编码衰老诱导性DHS的DNA分子编码的RNA序列的对应部分大致互补的反义寡核苷酸或多核苷酸；和
(b)与所述反义寡核苷酸或多核苷酸有效连接使得所述反义寡核苷酸或多核苷酸在其转化的植物细胞中表达的调节序列。
本发明进一步涉及转化植物细胞的载体，该载体包括：
(a)与(1)编码衰老诱导性elF-5A的DNA分子的一条链的对应部分，其中所述编码衰老诱导性elF-5A的DNA分子与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15杂交或(2)由编码衰老诱导性elF-5A的DNA分子编码的RNA序列的对应部分大致互补的反义寡核苷酸或多核苷酸；和
(b)与所述反义寡核苷酸或多核苷酸有效连接使得所述反义寡核苷酸或多核苷酸在其转化的植物细胞中表达的调节序列。
所述调节序列包括在转化植物细胞中有功能的启动子，该启动子可为诱导型或组成型。所述调节序列可选包括多腺苷酸化信号。
本发明还提供用上述载体或载体组合转化的植物细胞、由所述细胞产生的秧苗或成熟植株，或所述秧苗或成熟植株的植株部分。
本发明进一步涉及一种生产与未修饰植株相比具有降低水平的衰老诱导性DHS、衰老诱导性elF-5A或二者都降低的植株的方法，该方法包括：
(1)用上述载体或载体组合转化植株；
(2)让植株生长至至少秧苗期；
(3)测定转化植株或秧苗的衰老诱导性DHS活性和/或elF-5A活性的改变和/或衰老的改变和/或环境压力诱导性衰老的改变和/或病原体诱导性衰老和/或乙烯诱导性衰老的改变；和
(4)选择并培育与非转化植株相比衰老诱导性DHS活性改变和/或elF-5A活性降低和/或衰老改变和/或环境压力诱导性衰老改变和/或病原体诱导性衰老改变和/或乙烯诱导性衰老改变的植株。
如上所述生产的植株或子代、杂种、克隆或植株部分优选衰老诱导性DHS表达降低、衰老诱导性elF-5A活性降低或二者均降低以及延迟衰老和/或延迟压力诱导性衰老和/或病原体诱导性衰老和/或乙烯诱导性衰老。
本发明还涉及抑制植物细胞内源衰老诱导性DHS表达的方法，所述方法包括：
(1)将载体整合入植物基因组，所述载体包含：
(A)与(i)编码内源衰老诱导性DHS的DNA分子的一条链的至少一部分，其中所述编码内源衰老诱导性DHS的DNA分子与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：9杂交，或(ii)由内源衰老诱导性DHS基因编码的RNA序列的至少一部分互补的反义寡核苷酸或多核苷酸；和
(B)与所述反义寡核苷酸或多核苷酸有效连接使所述反义寡核苷酸或多核苷酸表达的调节序列；和
(2)培育所述植株，由此转录所述反义寡核苷酸或多核苷酸，转录物结合所述内源RNA，由此抑制所述衰老诱导性DHS基因的表达。
本发明还涉及抑制植物细胞内源衰老诱导性elF-5A表达的方法，所述方法包括：
(1)将载体整合入植物基因组，所述载体包含：
(A)与(i)编码内源衰老诱导性elF-5A的DNA分子的一条链的对应部分，其中所述编码内源衰老诱导性elF-5A的DNA分子与SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17或其组合杂交，或(ii)由内源衰老诱导性elF-5A基因编码的RNA序列的至少一部分互补的反义寡核苷酸或多核苷酸；和
(b)与所述反义寡核苷酸或多核苷酸有效连接使所述反义寡核苷酸或多核苷酸表达的调节序列；和
(2)培育所述植株，由此转录所述反义寡核苷酸或多核苷酸，转录物结合所述内源RNA，由此抑制所述衰老诱导性elF-5A基因的表达。
附图说明
图1图示了衰老诱导性番茄叶DHS cDNA序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)以及由番茄叶cDNA文库获得的衍生氨基酸序列(SEQID NO：2)。
图2A图示了拟南芥DHS基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)，该序列通过对比番茄DHS序列和拟南芥基因库(http://genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/)中未确定的基因组序列获得。氨基酸序列之间的间隙代表内含子。图2B图示了衍生的拟南芥DHS氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。图2C图示了由PCR获得的600个碱基对的衰老诱导性拟南芥DHS cDNA的核苷酸序列。图2D图示了衰老诱导性DHS cDNA片段的衍生氨基酸序列。
图3是衍生的全长番茄叶衰老诱导性DHS氨基酸序列(SEQ IDNO：2)和衍生的全长拟南芥衰老诱导性DHS氨基酸序列与人、酵母、真菌和古生菌DHS蛋白序列的对比。黑框表示3或4个序列中相同的氨基酸。
图4是番茄DHS cDNA的限制性图谱。
图5是由番茄叶分离的基因组DNA的DNA印迹，用32P-dCTP标记的全长番茄衰老诱导性DHS cDNA探测。
图6是由不同发育阶段番茄花分离的RNA的RNA印迹。图6A是总RNA的溴化乙锭染色凝胶。每个泳道包含10μg RNA。图6B是用32P-dCTP标记的全长番茄衰老诱导性DHS cDNA探测的RNA印迹的放射自显影。
图7是由不同成熟期的番茄果实分离的RNA的RNA印迹，用32P-dCTP标记的全长番茄衰老诱导性DHS cDNA探测。每个泳道包含10μg RNA。
图8是分离自用2M山梨糖醇处理6小时进行干旱应激的番茄叶的RNA的RNA印迹。每条泳道包含10μg RNA。用32P-dCTP标记的全长番茄衰老诱导性DHS cDNA探测所述印迹。
图9是由暴露于冷冻温度的番茄叶分离的RNA的RNA印迹。图9A是总RNA的溴化乙锭染色凝胶。每条泳道包含10μg RNA。图9B是用32P-dCTP标记的全长番茄衰老诱导性DHS cDNA探测的RNA印迹的放射自显影。图9C显示根据叶渗出物电导率检测的对应渗漏数据。
图10是不包含PolyA尾和5′末端非编码区的香石竹DHS全长(1384个碱基对)cDNA克隆核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。在核苷酸序列下方显示衍生的氨基酸序列(373个氨基酸)(SEQ ID NO：10)。
图11是衰老的拟南芥叶的总RNA的RNA印迹，用32P-dCTP标记的全长拟南芥衰老诱导性DHS cDNA探测。放射自显影在顶部，下方是溴化乙锭染色凝胶。
图12是由不同时期香石竹花花瓣分离的总RNA的RNA印迹。所述印迹用32P-dCTP标记的全长香石竹衰老诱导性DHS cDNA探测。放射自显影在顶部，下方是溴化乙锭染色凝胶。
图13是番茄果实衰老诱导性elF-5A基因的核苷酸序列(顶部)(SEQ ID NO：11)和衍生的氨基酸序列(底部)(SEQ ID NO：12)。
图14是香石竹衰老诱导性elF-5A基因的核苷酸序列(顶部)(SEQID NO：13)和衍生的氨基酸序列(底部)(SEQ ID NO：14)。
图15是拟南芥衰老诱导性elF-5A基因的核苷酸序列(顶部)(SEQID NO：15)和衍生的氨基酸序列(底部)(SEQ ID NO：16)。
图16是由不同发育阶段拟南芥植株叶分离的总RNA的RNA印迹。所述印迹用32P-dCTP标记的全长拟南芥衰老诱导性DHS cDNA和全长衰老诱导性elF-5A探测。放射自显影在顶部，下方是溴化乙锭染色凝胶。
图17是由花端着色(BK)发育期、坚熟期(RF)发育期和软熟期(RS)发育期的番茄果实分离的总RNA的RNA印迹。所述印迹用32P-dCTP标记的全长衰老诱导性DHS cDNA和全长衰老诱导性elF-5A探测。软熟期果实中的DHS和elF-5A同时上调，与成熟果实一致。放射自显影在顶部，下方是溴化乙锭染色凝胶。
图18是由用山梨糖醇处理以诱导干旱压力的番茄叶分离的总RNA的RNA印迹。C是对照；S为山梨糖醇处理。所述印迹用32P-dCTP标记的全长衰老诱导性DHS cDNA和全长衰老诱导性elF-5A探测。elF-5A和DHS在干旱压力作用下都上调。放射自显影在顶部，下方是溴化乙锭染色凝胶。
图19是由番茄植株的花芽和开放衰老花分离的总RNA的RNA印迹。所述印迹用32P-dCTP标记的全长衰老诱导性DHS cDNA和全长衰老诱导性elF-5A探测。DHS和elF-5A在开放花/衰老花中都上调。放射自显影在顶部，下方是溴化乙锭染色凝胶。
图20是由冷损伤番茄叶分离的总RNA的RNA印迹。所述印迹用32P-dCTP标记的全长衰老诱导性DHS cDNA和全长衰老诱导性elF-5A探测。在复温过程中冷损伤的发展使elF-5A和DHS都上调。放射自显影在顶部，下方是溴化乙锭染色凝胶。
图21是3.1周龄拟南芥野生型植株(左)和以反义方向表达衰老DHS基因3′末端(图36显示的序列)的转基因植株的照片，照片显示转基因植株的叶增大。
图22是4.6周龄拟南芥野生型植株(左)和以反义方向表达衰老DHS基因3′末端(图36显示的序列)的转基因植株的照片，照片显示转基因植株的叶增大。
图23是5.6周龄拟南芥野生型植株(左)和以反义方向表达衰老DHS基因3′末端(图36显示的序列)的转基因植株的照片，照片显示转基因植株的叶增大。
图24是6.1周龄拟南芥野生型植株(左)和以反义方向表达衰老DHS基因3′末端(图36显示的序列)的转基因植株的照片，照片显示转基因植株增大。
图25显示3个以反义方向表达衰老诱导性DHS基因的T1转基因拟南芥植物系的种子产量增加。种子产量表示为种子量。野生型植株显示的标准误差为n＝30。
图26是以反义方向表达衰老DHS基因3′末端(图36显示的序列)的转基因番茄植株(左)和野生型植株(右)的照片，照片显示转基因植株的叶增大和植株增大。该照片摄自秧苗转移至土壤后的第18天。
图27是以反义方向表达衰老DHS基因3′末端(图36显示的序列)的转基因番茄植株(左)和野生型植株(右)的照片，照片显示转基因植株的叶增大和植株增大。该照片摄自秧苗转移至土壤后的第32天。
图28-35是野生型(顶图)和以反义方向表达全长衰老DHS基因的转基因植株(底图)的番茄果实照片。在花端着色发育期收获果实，并在培育室中熟化。收获后的天数在每张图的左上角标明。
图36是以反义方向用于转化植株的拟南芥衰老诱导性DHS基因3′末端的核苷酸序列(SEQ ID NO：30)(顶部)和衍生的氨基酸序列(底部)。
图37是以反义方向用于转化植株的番茄衰老诱导性DHS基因3′末端的核苷酸序列(SEQ ID NO：31)(顶部)和衍生的氨基酸序列(底部)。
图38是用于分离全长拟南芥基因的600个碱基对的拟南芥衰老诱导性DHS探针的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)(顶部)和衍生的氨基酸序列(底部)。
图39是用于分离全长香石竹基因的483个碱基对的香石竹衰老诱导性DHS探针的核苷酸序列(SEQ ID NO：27)(顶部)和衍生的氨基酸序列(底部)。
图40(a)和(b)是以反义方向表达衰老DHS基因3′末端(图37显示的序列)的转基因番茄植株的番茄果实(右)和野生型植株的番茄果实(左)的照片。当野生型果实出现蒂腐病时转基因果实没有出现蒂腐病。
具体实施方式
提供改变植物细胞中衰老诱导性DHS基因、衰老诱导性elF-5A基因或二者的表达的方法和组合物。植物中衰老诱导性DHS和衰老诱导性elF-5A的表达单独或组合改变导致衰老延迟发生，并改善对环境压力和病原体的抗性，因此延长了植物保存期和/或生长期。
使用分离自冷冻损伤番茄叶的RNA作为模板，通过逆转录酶介导的聚合酶链反应(RT-PCR)分离编码具有衰老诱导性表达的番茄DHS基因的全长cDNA序列，并使用RT-PCR产物筛选冷冻损伤、山梨糖醇处理的番茄叶cDNA文库。使用对应于分离番茄叶cDNA序列以及全长番茄叶cDNA的选定区域的多核苷酸探针测定环境应激(冷冻)番茄叶、(脱水)山梨糖醇处理的番茄叶、成熟番茄果实和衰老番茄花中DHS基因编码mRNA的存在与否。
使用衰老拟南芥叶cDNA文库作为模板，使用根据拟南芥DHS基因组克隆设计的引物生产聚合酶链反应(PCR)产物。拟南芥核苷酸序列与衰老诱导性番茄DHS的对应序列具有73％的核苷酸序列同一性和81％的氨基酸序列同一性。
使用RT-PCR分离本发明的衰老诱导性番茄DHS基因。用于分离番茄DHS基因的上游引物是一个有24个核苷酸的引物：5′AG TCTAGA AGG TGC TCG TCC TGA T 3′(SEQ ID NO：3)；下游引物包含34个核苷酸：5′G ACT GCA GTC GAC ATC GAT(T)15 3′(SEQ IDNO：4)。使用100pmol所述下游引物，使用标准RT-PCR分离cDNA的第一链。所述第一链然后在同时使用上游和下游引物的RT-PCR中用作模板。在琼脂糖凝胶上分离RT-PCR产物，结果揭示存在三个不同的条带，大小范围为1.5kb至600bp。分别使用上游和下游引物中存在的XbaI和SalI克隆位点将三个片段亚克隆入质粒载体pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems，LaJolla，CA)并测序。将所述片段的序列与GeneBank数据库中存在的序列进行对比。结果显示1.5kb和1kb的片段是番茄DHS序列。600bp片段还与人、酵母和脉孢菌DHS序列排比。
使用600bp RT-PCR片段筛选番茄(栽培品种Match F1杂种)cDNA文库，制备该文库的RNA得自用2M山梨糖醇处理6小时诱发脱水的番茄叶。使用λZapTM(Stratagene Cloning Systems，LaJolla，CA)cDNA文库试剂盒构建所述cDNA文库。获得三个相同的对应于衰老诱导性DHS基因的阳性全长cDNA克隆并对其测序。衰老诱导性DHScDNA克隆的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1。所述cDNA克隆编码一个381个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：2)，其计算分子量为42.1KDa。
鉴于所述基因在发育和应激的番茄花、果实和叶中的表达模式，该基因与衰老有关。
比对番茄DHS cDNA序列和拟南芥基因组库(http://genome-www.stanford.edu/Arabidopsis)中未鉴定的基因组序列。结果显示为与未鉴定的拟南芥基因组序列(AB107060)的排对。排比信息用于鉴定拟南芥序列中的可读框，由此获得其推测的氨基酸序列。获得的比对拟南芥DHS基因的核苷酸和氨基酸序列分别命名为SEQID NO.5(图2A)和SEQ ID NO.6。
基于鉴定的拟南芥DHS序列的短区产生两种引物：引物1，5′GGTGGTGTTGAGGAAGATC  3′(SEQ ID NO.7)和引物2，5′GGGTGCACGCCCTGATGAAGC 3′(SEQ ID NO.8)。拟南芥衰老叶cDNA文库在标准PCR中用作两种引物的模板。分离600bp PCR产物并测序，结果显示与基因组DHS序列的相应片段具有相同的序列。
全长衰老诱导性番茄DHS cDNA克隆还用于分离全长衰老诱导性拟南芥和香石竹DHS cDNA克隆。使用全长番茄DHS cDNA克隆作为探针分别筛选衰老拟南芥叶cDNA文库和衰老香石竹花瓣cDNA文库，由此分离拟南芥和香石竹DHS cDNA克隆。然后对由所述cDNA文库获得的cDNA克隆进行测序。以此方式分离的拟南芥全长cDNA克隆的核苷酸序列与通过和番茄cDNA序列比对鉴定为编码拟南芥DHS的拟南芥基因组序列编码区相同。(图2A，SEQ ID NO：5)。全长香石竹花瓣衰老诱导性DHS克隆的核苷酸序列以及衍生的氨基酸序列示于图10(分别为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10)。
因此，本发明的编码番茄、香石竹和拟南芥DHS的cDNA序列可用作探针，以相似的方式以分离其它植物的DHS基因，然后可用该基因改变转基因植物的衰老。
衰老诱导性DHS基因似乎是DHS基因家族的一员。使用由杂交植株提取的基因组DNA进行番茄叶DNA的基因组DNA印迹分析。用各种识别DHS基因编码区中单个位点或不识别DHS基因可读框内任何位点的限制酶切所述DNA。番茄DHS的限制图谱示于图4。
用32P-dCTP标记的全长番茄DHS cDNA探测限制酶消化的番茄叶基因组DNA。高严格条件下的杂交揭示，所述全长cDNA探针与每种限制酶消化的DNA样品的2-3种限制性片段杂交。特别值得注意的是，当用XbaI和EcoRI(它们在DHS可读框中具有限制性位点(图4))消化番茄叶基因组DNA时，在DNA印迹中检测到2个以上的限制性片段(图5)。栽培品种Mateh F1(一种杂交品种)和纯系UCT5的基因组DNA产生相同的限制片段图谱。这些结果提示在番茄植株中存在2个或多个DHS基因同种型。如图3所示，DHS基因在种间高度保守，所以可预期任意物种的同种型之间具有显著量的保守序列。
用全长番茄cDNA探测番茄花总RNA的RNA印迹，结果显示在番茄花中显著诱导衰老诱导性DHS基因表达，但在芽中几乎检测不到表达(图6)。各个发育期番茄果实的DHS表达的RNA印迹分析表明，DHS基因在花端着色果实和粉红果实中以低水平表达，而在红(成熟)番茄果实中DHS表达显著增强(图7)。
RNA印迹分析还显示，环境压力条件(例如脱水(图8)和冷冻(图9))诱导衰老诱导性DHS基因。用2M山梨糖醇处理诱导脱水的番茄叶显示，与未处理叶相比，在脱水叶中诱导DHS表达(图8)。暴露于低温并恢复至室温的植株显示，诱导的衰老诱导性DHS基因表达与冷冻损伤综合症的发展(例如渗漏)一致(图9)。番茄植株和各种植物组织(例如叶、果实和花)中的基因表达总图谱显示，本发明的DHS基因涉及这些植物和植物组织的衰老发生。
用拟南芥的叶衰老发生和香石竹花瓣衰老发生观察到诱导DHS基因表达方面的相似结果。分离自各个年龄植株的拟南芥叶总RNA的RNA印迹分析显示，衰老诱导性DHS基因的表达在早期(5周龄植株)不明显，但在约6周时开始出现。第7周时显著诱导DHS基因的表达。RNA印迹分析表明，拟南芥DHS基因随植株株龄显著增强(图11)。
RNA印迹分析还显示，DHS基因在开花植物(例如香石竹)中受到相似调节(图12)。分离自各个年龄香石竹花瓣的总RNA的RNA印迹分析显示，在具有年龄诱导性衰老症状(例如花瓣内卷，这是衰老的第一个形态表现)的花瓣中显著诱导香石竹DHS表达，但在紧结花芽中的表达低得多。香石竹花花瓣刚刚开始打开时的DHS表达明显比紧结芽期的花高，完全打开的花瓣也显示出增强的DHS表达。
因此，预期通过基本抑制或改变植物组织中衰老诱导性DHS基因的表达，可以延迟衰败和腐烂，增加易腐烂果实、花和蔬菜的保存期，可使植物及其组织更耐受压力和抵抗病原体。这可通过生产转基因植物实现，在所述转基因植物中DHS cDNA或其寡核苷酸片段以反义构型在果实、花、叶和蔬菜中表达，优选使用组成型启动子如CaMV35S启动子，或使用组织特异性或衰老/压力诱导性启动子。
另一个参与诱导植物衰老相关性形态改变的基因elF-5A本文也已经分离和测序，同DHS一样，elF-5A可用于改变植物的衰老和衰老相关性过程，优选将其以反义方向导入植株中。由成熟番茄果实、衰老拟南芥叶和衰老香石竹花cDNA文库的每一个中分离全长衰老诱导性elF-5A cDNA克隆。每种全长克隆的核苷酸序列和衍生氨基酸序列示于图13(番茄衰老诱导性elF-5A)、14(香石竹衰老诱导性elF-5A)和15(拟南芥衰老诱导性elF-5A)。这些cDNA克隆每一种的核苷酸序列还示于SEQ ID NO：11(番茄)(图13)、SEQ ID NO：13(香石竹)(图14)和SEQ ID NO：15(拟南芥)(图15)。每种所述基因的衍生氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：12(图13)、SEQ ID NO：14(图14)和SEQ IDNO：16(图15)。
和本文描述的DHS基因序列一样，本发明的elF-5A序列可用于分离其它植物的elF-5A基因。分离的elF-5A序列可用于改变植物的衰老和衰老相关性过程。可根据物种之间至少约70％的序列相似性，使用本领域已知的方法分离植物的elF-5A序列。
在植物衰老过程中出现elF-5A和DHS的平行诱导。RNA印迹分析显示，elF-5A在同时发生天然和压力诱导性衰老时与DHS同时上调(图16至20)。例如，分离自各个年龄拟南芥植株叶的总RNA的RNA印迹分析显示，从植物中叶明显衰老时开始，诱导elF-5A表达，表达随衰老发展显著增强。在结果植物(例如番茄)中，elF-5A和DHS在软熟果实中平行上调，与果实变软和腐烂的发生一致(图17)。
RNA印迹分析还显示，植物在环境压力(例如干旱(图18)和冷冻损伤(图20))作用下elF-5A和DHS平行上调。同样，在开花植物中，开放的花中的elF-5A和DHS平行上调，两种基因的表达持续增强，直至开花的后期。
克隆的衰老诱导性DHS基因及其片段，或克隆的衰老诱导性elF-5A基因或其片段，或elF-5A和DHS序列的组合，当在组成型启动子(例如玄参花叶病毒35S启动子、花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S、双35S启动子或MAS启动子)控制下以反方向(反义)导入时，可用于遗传修饰植物并改变修饰植物的衰老。选自与番茄、拟南芥或香石竹衰老诱导性DHS基因或衰老诱导性elF-5A基因具有足够序列同一性的其它植物的反义序列可用于实现相似的遗传修饰。遗传修饰的一个结果是降低内源可翻译衰老诱导性DHS编码mRNA、elF-5A编码mRNA或二者的量。因此，植物细胞中产生的衰老诱导性DHS和/或衰老诱导性elF-5A量减少，由此降低活性elF-5A的量，这又降低了衰老诱导蛋白(包括衰老诱导性脂肪酶、衰老诱导性蛋白酶和衰老诱导性核酸酶)的翻译。因此抑制或延迟衰老，因为衰老发生需要从头蛋白合成。
例如，用在双35S启动子调控下以反义方向表达拟南芥衰老诱导性DHS基因(SEQ ID NO：26)(图38)的全长序列或3′区的载体转化拟南芥植株，转化的拟南芥植株显示生物量增加，例如与对照植株相比叶较大以及整个生长阶段的植株生长总体较高，并且叶衰老延迟，如图21至24所示。
随着转化植株种子产量的增加，还观察到在转基因拟南芥植株中以反义方向表达拟南芥衰老诱导性DHS基因的全长序列或3′区带来了衰老诱导性DHS基因表达降低的效果。表达拟南芥衰老诱导性DHS基因反义3′非编码区的拟南芥植物系生产的种子高达野生型植株的6倍(图25)。
在双35S启动子控制下，用番茄衰老诱导性DHS基因(SEQ IDNO.27)的3′末端以反义方向转化番茄植株获得相似的结果。与对照(非转化)番茄植株相比，用所述基因的3′末端以反义方向转化的植株显示叶增大和植株大小增加(图26和27)。
与野生型植株相比，用全长番茄衰老诱导性DHS以反义方向转化的番茄植株生产的果实软化和腐烂延迟(图28-35)。因此，本发明的方法和序列可用于延迟果实软化和腐烂，并增加植株生物量和种子产量，并且通常延迟植物的衰老。
在双35S启动子控制下，用表达番茄衰老诱导性DHS基因(SEQID NO：31)(图37)的3′区的载体以反义方向转化番茄植株的番茄果实，与对照植株相比，转化植株的番茄果实表现出对蒂腐病(一种生理疾病)的抗性增加，如图40所示。
本发明的分离核苷酸序列可用于分离其它植物或生物的大致互补的DHS和/或elF-5A核苷酸序列。这些序列可再用于转化植物，由此以和使用本文所示分离核苷酸序列相同的方式改变转化植物的衰老。
用DHS、elF-5A、其片段或其组合转化植物获得的遗传修饰可使植物中的衰老诱导性DHS、elF-5A或二者的水平产生长久的改变，并通过自体繁殖或其它繁殖程序在后代植株中传递。遗传改变的植株用于生产新的植物种或植物系，其中所述改变在代与代之间稳定传递。本发明首次提供可用于在大范围的不同植物中实现稳定的衰老遗传修饰的合适DNA序列。
为鉴定和分离衰老诱导性DHS基因和elF-5A基因，通常使用本领域众所周知的常规方法进行质粒DNA制备、限制酶消化、DNA的琼脂糖凝胶电泳、蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳、PCR、RT-PCR、DNA印迹、RNA印迹、DNA连接和细菌转化。参见例如Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，NY，1989。核酸杂交技术由Sambrook公开(同上)。
本文使用的术语“植物”是指全株、植物部分、植物细胞或植物细胞组。可用于本发明方法的植物类型没有限制，包括例如乙烯敏感植物和乙烯不敏感植物；结果植物，例如杏、苹果、橙子、香蕉、柚子、梨、番茄、草莓、鳄梨等；蔬菜，例如胡萝卜、豌豆、莴苣、甘蓝、芜菁、马铃薯、花椰菜、芦笋等；花，例如香石竹、玫瑰、菊花等；农作物和森林物种，例如玉米、水稻、大豆、苜蓿等；一般来说，包括可接受并表达本发明DNA分子的任何植物。可以包括各种倍性水平的植物，包括单倍体、二倍体、四倍体和多倍体。所述植物或者可以为单子叶植物，或者可以为双子叶植物。
本文将转基因植物定义为以某种方式遗传修饰的植物，包括但不限于将异源或同源衰老诱导性DHS DNA或所述DHS DNA的修饰DNA或某一部分掺入到其基因组中的植物。或者，本发明的转基因植物在其基因组中可掺入异源或同源衰老诱导性elF-5A DNA或所述elF-5A DNA的修饰DNA或某一部分。本发明的转基因植物在其基因组中可掺入异源或同源衰老诱导性DHS和elF-5A DNA或所述DNA的修饰DNA或某一部分或序列组合。改变的遗传物质可编码蛋白，包含调节序列或控制序列，或者可以为反义序列或包括反义序列，或编码与植物的内源衰老诱导性DHS或elF-5A DNA或其mRNA序列或其部分反义的反义RNA。本文将“转基因”或“转基因序列”定义为已掺入到转基因植物中的外部基因或部分序列。
本文使用的术语“杂交”一般用于指在适宜的严格条件下的核酸杂交，这对本领域技术人员来说是非常容易的，严格条件取决于探针序列和靶序列的性质。杂交和清洗条件是本领域众所周知的，根据需要的严格性通过改变温育时间、温度和/或溶液离子强度很容易实现条件的调整。参见例如Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989。要杂交序列的长度，特别是探针的长度、核酸的相对GC-含量以及允许错配的量，决定了条件的选择。当需要在互补程度较小的链之间部分杂交时优选低严格条件。当需要完全或接近完全互补时，优选高严格条件。对于典型的高严格条件，杂交溶液包含6X S.S.C.、0.01M EDTA、1X Denhardt溶液和0.5％ SDS。对于克隆DNA的片段，以约68℃进行3-4小时的杂交，对于全真核生物DNA，需要约12至约16小时。对于较低严格条件，杂交温度降至约42℃，在双链体解链温度(TM)之下。已知TM是G-C含量和双链体长度以及溶液离子强度的函数。
本文使用的术语“大致序列同一性”或“大致同源性”用于指一个核苷酸序列或氨基酸序列与另一个核苷酸或氨基酸序列具有大致的结构或功能等同性。具有大致序列同一性或大致同源性的序列之间的任何结构或功能差异将是最小的：即它们不影响所述序列按目的应用所示起作用的能力。差异可能缘于例如不同物种之间密码子选择的固有变化。如果两个或多个不同序列之间具有显著量的序列重叠或相似，或者如果不同序列具有相似的物理特性(即使所述序列在长度或结构上有差异)，则认为结构差异最小。这样的结构包括例如在限定条件下杂交的能力，或在蛋白情况下的免疫交叉反应性、相似酶活性等。这些特征的每一个都可由专业技术人员按照本领域已知方法轻易测定。
另外，如果两个核苷酸序列之间具有至少约70％、更优选80％、最优选约90％的序列相似性，则两个核苷酸序列“大致互补”。如果两个氨基酸序列在多肽的活性部位之间具有至少50％、优选70％相似性，则两个氨基酸序列大致互补。
本文使用的短语与DNA或RNA分子的“对应部分杂交”是指杂交分子(例如寡核苷酸、多核苷酸或任何核苷酸序列(有义或反义方向))在合适的条件下识别并杂交另一个核酸分子的序列，该序列具有与其大约相同的大小和足够的序列相似性，以实现杂交。例如，得自番茄DHS 3′编码区或非编码区的100个核苷酸长度的反义分子分别识别并杂交香石竹DHS基因或任何其它植物DHS基因3′编码区或非编码区核苷酸序列的大约100个核苷酸的部分，只要两个序列之间具有约70％或更高的序列相似性。应当理解的是，“对应部分”的大小允许在杂交中出现一定的错配，使得“对应部分”可比与其杂交的分子更小或更大，例如大或小20-30％，优选大或小不超过约12-15％。
术语核酸(或多核苷酸或寡核苷酸)的“功能衍生物”在本文用于指编码衰老诱导性DHS或衰老诱导性elF-5A的基因或核苷酸序列的片段、变异体、同源物或类似物。一种功能衍生物可保留衰老诱导性DHS或elF-5A编码DNA的至少功能部分，该部分提供其按照本发明的用途。这样的功能可包括在低严格条件下与天然番茄、拟南芥或香石竹衰老诱导性DHS或elF-5A或另一种植物的编码衰老诱导性DHS或elF-5A的大致同源DNA或其mRNA转录物杂交的能力，或以反义方向抑制植物衰老诱导性DHS或elF-5A mRNA等转录和/或翻译的能力。
所述基因或DNA序列的“片段”是指所述分子的任何亚单位，例如较短的多核苷酸或寡核苷酸。“变异体”是指与完整基因或其片段基本相似的分子，例如具有1个或多个取代核苷酸但保留与特定基因杂交的能力或编码与天然DNA杂交的mRNA转录物的能力的核苷酸取代变异体。“同源物”是指不同植物属或物种的片段或变异序列。“类似物”是指与完整分子、其变异体或片段大致相似或起它们的作用的非天然分子。
基因(例如衰老诱导性DHS基因或衰老诱导性elF-5A基因)的“改变表达”或“修饰表达”是指通过其以某种方式改变所述基因正常表达(例如发生在未修饰的结果植物、开花植物或其它植物中的表达)的任何过程或结果。按照本发明的设想，基因表达改变完全或部分降低了衰老诱导性DHS基因或衰老诱导性elF-5A基因或二者的表达，但还可以包括表达时间的改变，或另一种状态，在该状态中衰老诱导性DHS基因或衰老诱导性elF-5A基因或二者的表达与在未修饰植物或栽培品种中最可能天然发生的表达不同。优选的改变是与未修饰植物相比，导致修饰植物中衰老诱导性DHS的产生、衰老诱导性elF-5A的产生或这二者降低。
在按照本发明生产遗传改变植物时，优选根据目标特性选择个体秧苗或植株，一般是衰老诱导性DHS表达或产生降低，或者衰老诱导性elF-5A表达降低，或二者都降低。例如可通过观测转基因植物衰老的延迟或减轻测定衰老诱导性DHS和衰老诱导性elF-5A的表达。还可以用已知测定法与对照(正常、非转基因)植株相比，定量转基因植物中DHS和/或elF-5A的活性。
为表达新插入的基因或DNA序列以生产其编码蛋白，或在反义DNA情况下为转录新插入的基因或DNA序列以获得反义RNA分子，在所述基因或DNA序列的合适位置和方向应存在合适的调节元件。调节区可包括启动子、5′-非翻译前导序列和3′-多聚腺苷酸序列以及增强子和其它调节序列。
与衰老诱导性DHS基因联合用于产生所述基因的有义或反义转录物的启动子调节元件一般包括任何植物启动子，更具体地说包括组成型启动子，例如玄参花叶病毒35S启动子、花椰菜花叶病毒启动子、CaMV35S启动子或MAS启动子；或组织特异性或衰老诱导性启动子，例如香石竹花瓣GST1启动子或拟南芥SAG12启动子(参见例如J.C.Palaqui等，Plant Physiol.，112：1447-1456(1996)；Morton等，MolecularBreeding，1：123-132(1995)；Fobert等，Plant Journal，6：567-577(1994)；和Gan等，Plant Physiol.，113：313(1997)，通过引用结合到本文中)。用于本发明的启动子优选是组成型启动子，最优选使用双35S启动子。
可使用常规表达系统测试用于本发明的启动子的表达水平，例如通过检测报告基因产物的水平，例如所述启动子/报告基因导入其中的转基因植物的叶、花、果实或其它组织提取物中的蛋白或mRNA。
本发明提供与番茄衰老诱导性DHS、香石竹衰老诱导性DHS、拟南芥衰老诱导性DHS编码基因互补的反义寡核苷酸和多核苷酸，或者与在低至高严格条件下与番茄、香石竹或拟南芥衰老诱导性DHS基因杂交的另一种植物的基因或基因片段互补的反义寡核苷酸和多核苷酸。本发明还提供与番茄衰老诱导性elF-5A、香石竹衰老诱导性elF-5A、拟南芥衰老诱导性elF-5A编码基因互补的反义寡核苷酸和多核苷酸，或者与在低至高严格条件下与番茄、香石竹或拟南芥衰老诱导性elF-5A基因杂交的另一种植物的基因或基因片段互补的反义寡核苷酸和多核苷酸。这样的反义寡核苷酸应当至少长约6个核苷酸，以提供最小的杂交特异性，并可与编码衰老诱导性基因或其部分的DNA或mRNA的一条链互补，或者与参与调节衰老诱导性DHS或elF-5A基因表达的基因组DNA的侧翼序列互补。所述反义寡核苷酸可大至100个核苷酸或以上，并可在长度上延伸至并超过其反义全编码序列。所述反义寡核苷酸可为单链或双链的DNA或RNA，或其嵌合混合物或衍生物或修饰形式。
反义寡核苷酸的作用可导致细胞中衰老诱导性DHS表达、衰老诱导性elF-5A表达或二者的改变，主要是抑制。关于反义的综述参见：Alberts等，Molecular Biology of the Cell，第2版，Garland Publishing，Inc.New York，New York，1989(尤其是195-196页，通过引用结合到本文中)。
所述反义寡核苷酸可与衰老诱导性DHS或elF-5A基因的任意对应部分互补。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸长度可在6-100个核苷酸之间，并可与例如衰老诱导性DHS或elF-5A序列的5′非编码区或3′末端中的序列互补。已知主要与5′非编码区序列互补的反义寡核苷酸为转录因子编码基因表达的有效抑制剂。Branch，M.A.，Molec.Cell Biol.，13：4284-4290(1993)。
优选的反义寡核苷酸与衰老诱导性DHS或衰老诱导性elF-5A的编码mRNA的一部分互补，所述mRNA部分的大小大约和所述反义寡核苷酸相同。例如，预期将编码衰老诱导性DHS或elF-5A的全长cDNA克隆以反义方向引入到植物中会导致衰老诱导性DHS和/或elF-5A基因表达成功改变。而且，如图21-35所示，引入靶向衰老诱导性DHS基因或衰老诱导性elF-5A基因或二者的特定部分的部分序列可具等同效果。
本发明需要的最小同源性是足以获得足够的互补性，以识别特异性靶RNA或DNA，并抑制或降低其翻译或功能，同时不影响其它RNA或DNA分子的功能和其它基因的表达。尽管本发明的反义寡核苷酸包含与衰老诱导性DHS基因或衰老诱导性elF-5A基因的RNA转录物的对应部分互补的序列，但并不需要绝对互补，尽管优选这样。杂交能力可能取决于反义寡核苷酸长度和互补度。一般来说，杂交的核酸越长，其可能包含的与衰老诱导性DHS靶序列的碱基错配就越多，但仍形成稳定双链体。本领域技术人员可使用标准方法确定容许的错配度，以测定例如杂交复合体的解链温度。
可通过转录外源导入的核酸序列胞内产生所述反义RNA寡核苷酸。所述反义分子可通过用载体转化或转染或感染传递至细胞，所述载体例如为将反义衰老诱导性DHS序列编码DNA掺入其中的质粒或病毒，其中所述DHS序列与合适的调节元件(包括启动子)有效连接。在细胞中表达外源DNA序列，产生衰老诱导性DHS基因的反义RNA。
载体可以优选是质粒，或者可以是病毒或本领域已知在植物细胞或细菌细胞中复制和表达其上编码的基因的其它载体。所述载体变为染色体整合形式，使得其可以转录，以产生需要的反义衰老诱导性DHS RNA。这样的质粒或病毒载体可通过本领域标准的重组DNA技术方法构建。例如，所述载体可以是含在原核宿主中有功能的复制系统和本发明的反义寡核苷酸或多核苷酸的质粒载体。或者，所述载体可以是含在农杆菌(Agrobacterium)中有功能的复制系统和本发明的反义寡核苷酸或多核苷酸的质粒载体。能够在农杆菌中复制的质粒本领域众所周知。参见Miki等，将外源DNA导入植物的方法，Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology，B.R.Glick和J.E.Thompson主编，CRC Press(1993)，67-83页。
按以下的方式将番茄DHS基因以反义方向克隆入质粒载体。使用pCD质粒克隆番茄DHS基因，pCD质粒构建自pUC18骨架，并包含花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，其后有多个克隆位点和章鱼碱合酶终止序列。利用XhoI和ScaI限制位点将全长番茄DHS基因以反义方向亚克隆入pCD质粒，由此构建pCd-DHS(反义)质粒。
寡核苷酸优选长度为约6至约100个核苷酸，并与衰老诱导性DHS或衰老诱导性elF-5A基因的靶序列互补，这些寡核苷酸可通过重组核苷酸技术制备，或可由例如单核苷酸或较短的寡核苷酸合成。自动化合成仪可用于化学合成本发明的寡核苷酸和多核苷酸。构建本发明重组核苷酸分子的方法公开于Sambrook等，载于：MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，NY，(1989)，该文献通过引用整体结合到本文中。可使用本领域众所周知的方法制备编码与衰老诱导性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶序列互补的反义RNA的寡核苷酸。上述方法详见Maniatis，T.等，Molecular mechanisms in the Control of Gene expression，Nierlich等主编，Acad.Press，N.Y.(1976)。
在本发明的一个替代性实施方案中，抑制内源植物衰老诱导性DHS、衰老诱导性elF-5A或二者的表达是通过过表达引入到植物细胞中的外源衰老诱导性DHS或elF-5A基因或基因片段或二者而共同抑制的结果。在本发明的该实施方案中，以本文描述的用于反义分子的相似方式，将编码衰老诱导性DHS、衰老诱导性elF-5A或二者的载体以有义方向引入到细胞中。衰老诱导性DHS或衰老诱导性elF-5A最好有效连接至强组成型启动子，例如玄参花叶病毒启动子或CaMV35S启动子或双35S启动子。
在本发明的另一个实施方案中，通过使用核酶实现对内源植物衰老诱导性DHS、衰老诱导性elF-5A或二者表达的抑制。核酶是具有序列特异性内切核酸酶活性的RNA分子。一个实例是切割靶RNA中UH(其中H是A、C或U残基)识别位点的锤头核酶，它包含使核酶的催化结构域定向于底物RNA的靶位点的碱基配对区。核酶是高度靶特异性的，并可用来使多基因家族的一个成员失活，或靶向相关mRNA的保守区。(参见Merlo等，The Plant Cell，10：1603-1621，1998)。可通过用载体(例如质粒或病毒)转化、转染或感染将所述核酶分子传递至细胞，其中掺入到载体中的核酶有效连接至合适的调节元件(包括启动子)。这样的核酶构建物包含碱基配对臂，配对臂使构建物定向于衰老诱导性DHS mRNA或衰老诱导性elF-5A mRNA的切割位点，导致切割DHS或elF-5A mRNA，并抑制衰老诱导性DHS和/或elF-5A表达。
可使用本领域已知的任何植物转化方法通过DNA转化制备按照本发明产生的转基因植物。植物转化方法包括用根癌农杆菌直接共培养植物、组织或细胞，或直接感染(Miki等，Meth.in Plant Mol.Biol.AndBiotechnology，(1993)，67-88页)；基因直接转移入原生质体或原生质吸收(Paszkowski等，EMBO J.，12：2717(1984))；电穿孔(Fromm等，Nature，319：719(1986))；微粒轰击(Klein等，BioTechnology，6：559-563(1988))；注射入秧苗和植株的分生组织(De LaPena等，Nature，325：274-276(1987))；注射入培养细胞和组织的原生质(Reich等，BioTechnology，4：1001-1004(1986))。
一般由转化过程获得完整植株。植株由原生质体、愈伤组织、组织部分或外植体等再生。植物部分得自其中衰老诱导性DHS、衰老诱导性elF-5A或二者表达改变的再生植株，例如叶、花、果实、种子等包括在本文使用的“植物”定义中。再生植株的子代、变异体和突变体也包括在“植物”定义中。
优选通过重组技术，可选地组合化学合成方法，生产番茄、香石竹或拟南芥衰老诱导性DHS蛋白或其功能衍生物以及番茄、香石竹或拟南芥衰老诱导性elF-5A蛋白或其功能衍生物。在本发明的一个实施方案中，衰老诱导性DHS表达为功能蛋白，优选包含与麦芽糖结合蛋白融合的衰老诱导性DHS。
本文描述的衰老诱导性DHS或衰老诱导性elF-5A蛋白的“功能衍生物”分别是衰老诱导性DHS或衰老诱导性elF-5A的片段、变异体、类似物或化学衍生物，它们分别保留了至少部分的衰老诱导性DHS或衰老诱导性elF-5A活性或与衰老诱导性DHS或衰老诱导性elF-5A特异性抗体的免疫交叉反应性。衰老诱导性DHS或衰老诱导性elF-5A蛋白片段是指所述分子的任何亚单位。变异体肽可使用例如本领域众所周知的方法通过直接化学合成制备。衰老诱导性DHS或衰老诱导性elF-5A类似物是指与完整蛋白或其片段大致相似的非天然蛋白。衰老诱导性DHS或衰老诱导性elF-5A的化学衍生物包含通常不是所述肽或肽片段的一部分的其它化学部分。可通过使肽的靶氨基酸残基与能够和选定的侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应，将修饰引入所述肽或其片段中。
可通过培养用本发明的核苷酸序列(以有义方向)转化的细胞、使细胞合成所述蛋白，然后由培养基或细胞提取物中分离或者为游离蛋白或者为融合蛋白(取决于使用的克隆方法)的蛋白，生产本发明的衰老诱导性DHS或衰老诱导性elF-5A蛋白或肽。或者，可用无细胞系统生产所述蛋白。Ranu等，Meth.Enzymol.，60：459-484(1979)。
现在已经有了本发明的一般性描述，通过参阅以下的实施例更容易理解本发明，提供所述实施例仅为了阐述，无意限制本发明。
实施例1
信使RNA(mRNA)分离
由各种发育阶段的番茄花和番茄果实以及叶(未处理或冷冻或山梨糖醇处理后)分离总RNA。简单地说，在液氮中研磨组织(5g)。将研磨粉末与30ml胍盐缓冲液(4M异硫氰酸胍，2.5mM NaOAc pH8.5，0.8％β-巯基乙醇)混合。混合物通过4层粗棉布过滤，并以10,000Xg于4℃离心30分钟。然后以26,000Xg对上清液进行氯化铯密度梯度离心20小时。沉淀RNA用75％乙醇清洗，重悬浮在600μl DEPC-处理的水中，并用0.75ml 95％乙醇和30μl 3M NaOAc于-70℃沉淀RNA。在1.2％变性甲醛琼脂糖凝胶上分离10μg RNA，并转移至尼龙膜。使用随机引物32P-dCTP标记的全长DHS cDNA(SEQ ID NO：1)于42℃过夜探测膜。然后用含0.1％ SDS的1X SSC于室温清洗膜1次，一次15分钟，并用含0.1％ SDS的0.2X SSC于65℃清洗膜3次，每次15分钟。于-70℃使膜对X-射线胶片过夜曝光。
使用得自Promega的PolyA+片段mRNA分离系统由总RNA分离PolyA+ mRNA。PolyA+ mRNA用作cDNA合成的模板，合成使用得自Stratagene(La Jolla，Calif.)的ZAP
Figure BSA00000586194100301
cDNA合成系统。
番茄叶cDNA文库筛选
使用分离自Match F1杂种番茄叶(已接触2M山梨糖醇6小时)的mRNA制备cDNA文库，将该文库稀释至大约5×106PFU/ml。使用32P-标记的600bp RT-PCR片段筛选cDNA文库。切除3个阳性cDNA克隆，并使用生产商说明书中的方法将其再环化入(Stratagene)噬菌粒中。将全长cDNA插入到pBK-CMV载体中。
质粒DNA分离、DNA测序
使用Sambrook等(同上)描述的碱裂解法分离质粒DNA。使用双脱氧测序法对全长阳性cDNA克隆测序。Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467。使用BLAST搜索(GenBank，Bethesda，MD)汇编和分析可读框，并使用BCM搜索引擎：产生多序列比对图的多元比对法(参见F.Corpet，Nuc.Acids Res.，16：10881-10890，(1987))实现5个最同源蛋白和编码基因衍生氨基酸序列的比对。通过MultiFinder鉴定存在于导出氨基酸序列中的功能基序。
番茄RNA的RNA印迹杂交
在1％变性甲醛琼脂糖凝胶上分离10μg总RNA，并固定在尼龙膜上，其中所述总RNA分离自不同阶段(芽和开花以及完全开放或干枯的衰老花瓣)的番茄花、番茄叶以及不同成熟阶段的番茄果实(花端着色果，即红色低于10％的绿果；粉红果，即整个果实是橙色或粉红色；以及红果，或软或硬)。使用随机引物试剂盒(BoehringerMannheim)，使用32P-dCTP标记的全长番茄cDNA探测滤膜(7×107cpm)。用1X SSC、0.1％ SDS于室温清洗滤膜1次，并用0.2X SSC、0.1％ SDS于65℃清洗滤膜3次。干燥滤膜并于-70℃使滤膜对X-射线胶片过夜曝光。结果示于图6、7、8和9。
拟南芥RNA的RNA印迹杂交
如上在1％变性甲醛琼脂糖凝胶上分离总RNA，并固定在尼龙膜上，其中所述总RNA得自5周龄(泳道1)、6周龄(泳道2)和7周龄(泳道3)的拟南芥植株叶。使用随机引物试剂盒(Boehringer Mannheim)，用32P-dCTP标记的全长拟南芥衰老诱导性DHS cDNA探测滤膜(7×107cpm)。用1X SSC、0.1％ SDS于室温清洗滤膜1次，并用0.2X SSC、0.1％ SDS于65℃清洗滤膜3次。干燥滤膜并于-70℃使滤膜对X-射线胶片过夜曝光。结果示于图11。
香石竹RNA的RNA印迹杂交
如上分离各个花发育阶段(即紧结芽花(泳道1)、开始开花(泳道2)、完全开花(泳道3)、花瓣内卷的花(泳道4))的香石竹植株花瓣的总RNA，将其在1％变性甲醛琼脂糖凝胶上分离，并固定在尼龙膜上。使用随机引物试剂盒(Boehringer Mannheim)用32P-dCTP标记全长香石竹衰老诱导性DHS cDNA，用该cDNA探测滤膜(7×107cpm)。用1XSSC、0.1％ SDS于室温清洗滤膜1次，并用0.2X SSC、0.1％ SDS于65℃清洗滤膜3次。干燥滤膜，并于-70℃对X射线胶片过夜曝光。结果示于图12。
实施例2
山梨糖醇诱导番茄衰老诱导性DHS基因
在密封箱中用2M山梨糖醇处理番茄叶6小时。如下由山梨糖醇处理的叶中提取RNA。
在液氮中研磨叶(5g)。将研磨粉末与30ml胍盐缓冲液(4M异硫氰酸胍，2.5mM NaOAc pH 8.5，0.8％β-巯基乙醇)混合。混合物通过4层粗棉布过滤，并以10,000Xg于4℃离心30分钟。然后以26,000Xg对上清液进行氯化铯密度梯度离心20小时。沉淀RNA用75％乙醇清洗，重悬浮在600μl DEPC-处理的水中，并用0.75ml 95％乙醇和30μl3M NaOAc于-70℃沉淀RNA。在1.2％变性甲醛琼脂糖凝胶上分离10μg RNA，并转移至尼龙膜。使用随机引物32P-dCTP标记的全长DHScDNA(SEQ ID NO：1)于42℃过夜探测膜。然后用含0.1％ SDS的1XSSC于室温清洗膜1次，一次15分钟，并用含0.1％ SDS的0.2X SSC于65℃清洗膜3次，每次15分钟。于-70℃使膜对X-射线胶片过夜曝光。
结果示于图8。由图可见，山梨糖醇诱导叶中的DHS转录。
实施例3
诱导衰老花中的番茄DHS基因
收获番茄植株中的紧结花芽和开放衰老花，并如实施例2分离RNA。在1.2％变性甲醛琼脂糖凝胶上分离10μg RNA，并转移至尼龙膜。使用随机引物32P-dCTP标记的全长DHS cDNA(SEQ ID NO：1)于42℃过夜探测膜。然后用含0.1％ SDS的1X SSC于室温清洗膜1次，15分钟，并用含0.1％ SDS的0.2X SSC于65℃清洗膜3次，每次15分钟。于-70℃使膜对X-射线胶片过夜曝光。
结果示于图6。由图可见，诱导衰老花中的DHS转录。
实施例4
诱导成熟果实中的番茄DHS基因
如实施例2分离花端着色果、粉红果和熟果的RNA。在1.2％变性甲醛琼脂糖凝胶上分离10μg RNA，并转移至尼龙膜。使用随机引物32P-dCTP标记的全长DHS cDNA(SEQ ID NO：1)(图1)于42℃过夜探测膜。然后用含0.1％ SDS的1X SSC于室温清洗膜1次，15分钟，然后用含0.1％ SDS的0.2X SSC于65℃清洗膜3次，每次15分钟。于-70℃使膜对X-射线胶片过夜曝光。
结果示于图7。由图可见，刚好在导致腐败的衰老发生之前的成熟红果中的DHS转录最强。
实施例5
通过冷冻诱导番茄衰老诱导性DHS基因
在培育箱中使盆中的番茄植株(7-8周龄)处于6℃达2天、3天或6天。光周期设定为8小时黑暗和16小时光照。通过将植株移回到温室使植株复温。在由温室移出后立即收获未复温的植株。如下提取叶中的RNA。
在液氮中研磨叶(5g)。将研磨粉末与30ml胍盐缓冲液(4M异硫氰酸胍、2.5mM NaOAc pH 8.5、0.8％β-巯基乙醇)混合。混合物通过4层粗棉布过滤，并以10,000Xg于4℃离心30分钟。然后以26,000Xg对上清液进行20小时的氯化铯密度梯度离心。沉淀RNA用75％乙醇清洗，重悬浮在600μl DEPC-处理的水中，并用0.75ml 95％乙醇和30μl 3M NaOAc于-70℃沉淀RNA。在1.2％变性甲醛琼脂糖凝胶上分离10μg RNA，并转移至尼龙膜。使用随机引物32P-dCTP标记的全长DHS cDNA(SEQ ID NO：1)于42℃过夜探测膜。然后用含0.1％ SDS的1X SSC于室温清洗膜1次，15分钟，并用含0.1％ SDS的0.2X SSC于65℃清洗膜3次，每次15分钟。于-70℃使膜对X-射线胶片过夜曝光。
结果示于图9。由图可见，通过暴露于冷冻温度并随后复温，诱导叶中的DHS转录，转录增强与根据膜渗漏检测的冷冻损伤相关。
实施例6
使用基于未鉴定的拟南芥基因组序列的引物产生拟南芥PCR产物
使用一对设计自拟南芥基因组序列的寡核苷酸引物，通过PCR由拟南芥cDNA模板产生部分长度的衰老诱导性DHS序列。5′引物是一个19聚体，序列为5′-GGTGGTGT5TGAGGAAGATC(SEQ ID NO：7)；3′引物是一个20聚体，序列为：GGTGCACGCCCTGATGAAGC-3′(SEQ ID NO：8)。使用扩展高保真PCR系统(Boehringer Mannheim)，以拟南芥衰老叶cDNA文库作为模板，如下进行聚合酶链反应。
反应组分：
Figure BSA00000586194100341
反应参数：
94℃，3分钟
94℃/1分钟、58℃/1分钟、72℃/2分钟，45个循环
72℃、15分钟
实施例7
分离基因组DNA和DNA印迹分析
通过在液氮中将10g番茄叶组织研磨成精细粉末，由番茄叶中提取基因组DNA。将37.5ml含25ml匀浆缓冲液[100mM Tris-HCl pH8.0、100mm EDTA、250mM NaCl、1％十二烷基肌氨酸钠、1％2-巯基乙醇、10μg/ml RNA酶和12.5ml苯酚]的混合物预温至60℃，将其加入到研磨组织中。振摇所述混合物15分钟。将另外的12.5ml氯仿/异戊醇(24∶1)加入到混合物中，再振摇15分钟。离心混合物，用25ml苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)和氯仿/异戊醇(24∶1)再提取水相。通过用15ml异丙醇于室温沉淀回收核酸。将沉淀物重悬浮在1ml水中。
如下对基因组DNA进行限制酶消化：在400μl总反应体积中使10μg基因组DNA、40μl 10X反应缓冲液和100U限制酶(XbaI、EcoRI、EcoRV或HindIII)反应5-6小时。然后苯酚提取混合物，并进行乙醇沉淀。在0.8％琼脂糖凝胶上以15V对消化的DNA进行大约15小时的琼脂糖凝胶电泳。在温和搅拌下将凝胶浸没在变性缓冲液[87.66g NaCl和20g NaOH/L]中30分钟，用蒸馏水清洗，并在温和搅拌下浸没在中性缓冲液[87.66g NaCl和60.55g tris-HCl pH 7.5/L]中30分钟。通过毛细管印迹将所述DNA转移至Hybond-N+尼龙膜。
使用1×106cpm/ml的32P-dCTP标记的全长DHS cDNA或DHScDNA克隆的3′非编码区，于42℃进行过夜杂交。用含50％甲酰胺、6X SSC、5X Denhardt溶液、0.1％ SDS和100mg/ml变性鲑精DNA的缓冲液进行预杂交和杂交。膜预杂交2-3小时；杂交过夜进行。
杂交完成后，用2X SSC和0.1％ SDS于室温清洗膜，然后用2XSSC和0.1％ SDS清洗15分钟，再用0.2X SSC和0.1％ SDS清洗15分钟。然后于-80℃使膜对X射线胶片过夜曝光。结果示于图5。
实施例8
分离拟南芥的衰老诱导性elF-5A基因
使用拟南芥衰老叶cDNA文库作为模板，通过PCR获得在拟南芥叶中表达的衰老诱导性elF-5A基因的全长cDNA克隆。首先，使用和载体T7引物<AATACGACTCACTATAG>(SEQ ID NO：18)配对的简并上游引物<AAARRYCGMCCYTGCAAGGT>(SEQ ID NO：17)以及和载体T3引物<ATTAACCCTCACTAAAG>(SEQ ID NO：20)配对的简并下游引物<TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC>(SEQ ID NO：19)，制备对应于所述基因5′-和3′-末端的PCR产物。将所述PCR产物亚克隆入pBluescript进行测序。然后使用与3′-特异性引物<AGAAGAAGTATAAAAACCATC>(SEQ ID NO：22)配对的5′特异性引物<CTGTTACCAAAAAATCTGTACC>(SEQ ID NO：21)获得全长cDNA，并将其亚克隆入pBluescript进行测序。
实施例9
分离番茄果实的衰老诱导性elF-5A基因
使用番茄果实cDNA文库作为模板，通过PCR获得在番茄果实中表达的衰老诱导性elF-5A基因的全长cDNA克隆。首先，使用和载体T7引物(SEQ ID NO：18)配对的简并上游引物(SEQ ID NO：17)以及和载体T3引物(SEQ ID NO：20)配对的简并下游引物(SEQ ID NO：19)，制备对应于所述基因5′-和3′-末端的PCR产物。将所述PCR产物亚克隆入pBluescript进行测序。然后使用与载体T7引物(SEQ IDNO：18)配对的5′特异性引物<AAAGAATCCTAGAGAGAGAAAGG>(SEQ ID NO：23)获得全长cDNA，并将其亚克隆入pBluescript进行测序。
实施例10
分离香石竹的衰老诱导性elF-5A基因
使用香石竹衰老花cDNA文库作为模板，通过PCR获得在香石竹花中表达的衰老诱导性elF-5A基因的全长cDNA克隆。首先，使用和载体T7引物(SEQ ID NO：18)配对的简并上游引物(SEQ ID NO：17)以及和载体T3引物(SEQ ID NO：20)配对的简并下游引物(SEQ IDNO：19)，制备对应于所述基因5′-和3′-末端的PCR产物。将所述PCR产物亚克隆入pBluescript进行测序。然后使用与3′特异性引物<ACCAAAACCTGTGTTATAACTCC>(SEQ ID NO：25)配对的5′特异性引物<TTTTACATCAATCGAAAA>(SEQ ID NO：24)获得全长cDNA，并将其亚克隆入pBluescript进行测序。
实施例11
分离拟南芥的衰老诱导性DHS基因
通过筛选拟南芥衰老叶cDNA文库获得在拟南芥叶中表达的衰老诱导性DHS基因的全长cDNA克隆。用于筛选的探针序列(SEQ IDNO：26)示于图38。使用衰老叶cDNA文库作为模板，使用设计自GenBank中未鉴定的基因组序列(AB017060)的引物，通过PCR获得所述探针。将PCR产物亚克隆入pBluescript进行测序。
实施例12
分离香石竹的衰老诱导性DHS基因
通过筛选香石竹衰老花瓣cDNA文库获得在香石竹花瓣中表达的衰老诱导性DHS基因的全长cDNA克隆。用于筛选的探针序列(SEQID NO：27)示于图39。使用衰老花瓣cDNA文库作为模板，使用简并引物(上游：5′TTG ARG AAG ATY CAT MAA RTG CCT 3′(SEQ IDNO：28)；下游：5′CCA TCA AAY TCY TGK GCR GTG TT 3′(SEQ IDNO：29))，通过PCR获得所述探针。将PCR产物亚克隆入pBluescript进行测序。
实施例13
用拟南芥DHS全长序列或3′区以反义方向转化拟南芥
用双元载体pKYLX71转化农杆菌，pKYLX71包含全长衰老诱导性拟南芥DHS cDNA序列或DHS基因的3′末端(SEQ ID NO：30)(图36)，它们在双35S启动子调节下都以反义构型表达。通过真空浸润用转化的农杆菌转化拟南芥植株，并在氨苄青霉素上选择获得的T0植株转化种子。
图21-24是转化拟南芥植株的照片，照片显示DHS基因或其3′末端以反义方向在转化植株中表达导致生物量增加，例如叶较大和植株大小增加。图25表明转基因拟南芥植株种子产量增加。
实施例14
用番茄DHS的全长序列或3′区以反义方向转化番茄植株
用双元载体pKYLX71转化农杆菌，pKYLX71包含全长衰老诱导性番茄DHS cDNA序列或DHS基因的3′末端(SEQ ID NO：31)(图37)，它们在双35S启动子调节下都以反义构型表达。用这些农杆菌转化番茄叶外植体，通过标准组织培养方法生产和选定转化的愈伤组织和秧苗。在温室条件下将转化的秧苗培育至生产成熟果实的T1植株。
图26-35是照片，显示衰老诱导性番茄DHS基因在转化植株中表达降低导致生物量增加，例如如同转化拟南芥植株一样可见叶和植株较大，以及番茄果实的软化和腐烂延迟。
实施例15
用番茄DHS的3′区以反义方向转化番茄植株
用双元载体pKYLX71转化农杆菌，pKYLX71包含在双35S启动子调节下以反义构型表达的DHS基因3′末端(图37)。用这些农杆菌转化番茄叶外植体，通过标准组织培养方法生产和选定转化的愈伤组织和秧苗。在温室条件下将转化的秧苗培育成生产成熟果实的T1植株。
在约33％的对照植株果实发生蒂腐病的情况下，这些DHS表达降低的转基因植株的果实完全没有蒂腐病病。蒂腐病是一种由使果实底部(花蒂)衰老和腐败的营养压力引起的生理疾病。图40(a)和40(b)是照片，显示了对照果实表现出蒂腐病，而转基因果实没有蒂腐病。
结果表明，降低DHS表达防止发生由生理疾病引起的组织和细胞死亡。
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Claims (3)

1.一种控制番茄植物中程序性细胞死亡的方法，所述方法包括：
(1)使一种载体整合入所述植物基因组，所述载体包含：
(A)反义核苷酸序列，其：(i)与SEQ ID NO：31表示的内源衰老诱导性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因的3′末端核苷酸序列完全互补；或(ii)与由SEQ ID NO：31表示的内源衰老诱导性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因3′末端核苷酸序列编码的RNA序列完全互补；
(B)调节序列，该调节序列与所述反义核苷酸序列有效连接使得表达所述反义寡核苷酸序列；和
(2)培育所述植株，由此转录所述反义核苷酸序列并使之结合所述由SEQ ID NO：31表示的内源衰老诱导性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因3′末端核苷酸序列编码的RNA序列，因而抑制所述衰老诱导性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因表达。
2.权利要求1的方法，其中所述程序性细胞死亡的控制导致蒂腐病的控制改善。
3.一种生产番茄植物的方法，其中所述植物衍生自衰老诱导性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶表达受到抑制或降低的细胞，其中所述细胞通过以下步骤获得：
(1)使一种载体整合入所述细胞基因组，所述载体包含：
(A)反义核苷酸序列，其：(i)与SEQ ID NO：31表示的内源衰老诱导性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因的3′末端核苷酸序列完全互补；或(ii)与由SEQ ID NO：31表示的内源衰老诱导性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因3′末端核苷酸序列编码的RNA序列完全互补；
(B)调节序列，该调节序列与所述反义核苷酸序列有效连接使得表达所述反义寡核苷酸序列；和
(2)培养所述细胞，由此转录所述反义核苷酸序列并使之结合所述由SEQ ID NO：31表示的内源衰老诱导性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因3′末端核苷酸序列编码的RNA序列，因而抑制所述衰老诱导性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因表达。
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