CN102341500A - 用于处理细胞的装置和方法 - Google Patents

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CN102341500A CN2010800106754A CN201080010675A CN102341500A CN 102341500 A CN102341500 A CN 102341500A CN 2010800106754 A CN2010800106754 A CN 2010800106754A CN 201080010675 A CN201080010675 A CN 201080010675A CN 102341500 A CN102341500 A CN 102341500A
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Abstract

本发明涉及一种用于处理物体中生物细胞的装置，所述装置包含：单缠绕线圈元件；与所述单缠绕线圈元件连接的电发生器，所述单缠绕物被设置为基本位于所述物体周围；其中所述电发生器被设置以向所述单缠绕线圈元件中放电，使得所述单缠绕线圈元件通过磁感应在所述单缠绕线圈元件中产生短持续时间的脉冲电磁场，所述电磁场的场强度高至足以——当在操作中所述物体被置于所述单缠绕线圈元件中时——影响优选增加所述物体中包含的生物细胞的细胞膜和/或细胞内膜的通透性。

Description

用于处理细胞的装置和方法
本发明涉及用于处理物体中生物细胞的装置和方法。
脉冲电磁场处理是一种借助强外部电磁场的短脉冲影响生物细胞的方式。在脉冲电磁场处理中，将两个电极置于包含生物细胞的介质中。然后，将所述脉冲电磁场施加于所述介质。依赖于场强度和脉冲形状(包括脉冲的持续时间和陡度)，所施加的电磁场可以影响细胞的膜和/或细胞内结构。更特别地，可能出现被称为电穿孔的过程，这意味着所述细胞膜和/或所述细胞内膜的通透性因为施加于所述介质的电磁场而增加。
当电穿孔出现在细胞膜处时，所述细胞膜中的蛋白质通道可能开启，导致离子浓度变化。这种离子浓度的变化可能导致细胞应激。当所施加的电磁场强度使得跨所述细胞膜的电压大约是临界阈值(例如1伏特的阈值)并且持续时间相对短时，所述细胞将自我恢复。该效应可用于例如将材料(例如基因或药物)局部送递至所述细胞中。施加可导致更高跨细胞膜电压的更高电磁场强度，以及/或者施加更长持续时间的场脉冲反而可能造成不可逆的细胞损伤，并且甚至可以最终导致细胞死亡。该效应可以用于处理食物，例如用于果汁的低温巴氏杀菌，或者在例如癌症的疾病治疗中用于诱导凋亡，即编程性细胞死亡。
用于影响介质中生物细胞的细胞膜的临界阈值可以不同，但一般总计约1伏特。如果所述细胞的典型大小是约10μm，那么外部施加的电场强度应为1kV/cm的数量级。这是非常高的场强度，实际上难以在待处理的生物细胞中产生足够强度的电场。
此外，由于电极将被置于所述介质内部以能够在其中生成脉冲电磁场，所述介质的生物细胞应首先在与所述电极接触的同时被处理，并且仅当所述细胞处理被完成后才可以被置于物体中，即可以被包装在容器、盒子、包装物等中。这可相当大地降低所述处理操作的效率。
使用电极产生脉冲电磁场的另一缺点是，所述电极可能随时间而遭腐蚀，这意味着受腐蚀的电极材料最终可能终止于待处理的介质中。同时，在电极处或周围可能发生电化学反应。这样的反应可以导致不利的反应残留物。如果所述介质包括供人消费的食品，则这可能引起不能接受的健康风险。
本发明的一个目标是提供一种用于处理物体中生物细胞的方法和装置，其中现有技术的上述缺点和/或其他缺点中的至少一项被消除或者至少被减少。
本发明的实施方案的更具体目标是提供一种这样的方法和装置，即其中能够以快速且有效的方式处理物体中的生物细胞。
本发明的实施方案的更具体目标是提供一种这样的方法和装置，即其中可以处理存在于所述物体内部的生物细胞而无需将一个或多个电极置于上述物体中。
根据本发明的第一方面，一种用于处理物体中生物细胞的装置，所述装置包括：
-单缠绕线圈元件；
-与所述单缠绕线圈元件连接的电发生器(electrical generator)，所述单缠绕物被设置为基本上位于所述物体周围；
其中所述电发生器被设置以向所述单缠绕线圈元件中放电，使得所述单缠绕线圈元件通过磁感应在所述单缠绕线圈元件中产生短持续时间的脉冲电磁场，当在操作中所述物体被置于所述单缠绕线圈元件中时，所述电磁场的场强度高至足以影响所述物体中包含的生物细胞的细胞膜和/或细胞内膜，优选增加其通透性。所述装置可以是无电极的，因此不存在与使用电极有关的缺点。此外，通过将所述物体置于所述线圈元件的单缠绕物内部，可以在所述物体中不存在任何电元件例如电极的情况下处理所述物体中的生物细胞。因此可以避免产生电磁场的装置和所述生物细胞之间的接触。此外，由于所述电磁场是借助短持续时间的磁场诱导的，具有至少1kV/cm(用于影响细胞膜)或至少10kV/cm(用于影响细胞内膜)的所需场强度的电场可以在相对短的时间内实现。细胞内发生的任何电穿孔可用于不同目的，例如用于将药物导入所述细胞。为了生成对所述细胞膜和/或所述细胞内膜产生所需效应而需要的短持续时间高强度电磁场，可使用单缠绕线圈元件。使用单缠绕线圈元件和/或同轴设置电路，所述线圈元件和电路的自感可以保持相对较低，这意味着可以在所述线圈元件中实现短上升时间的电流。在该实施方案中，可以容易地实现数十纳亨或更小的自感。
在一个实施方案中，将所述电磁场无电极地施加于所述物体中的生物细胞。可消除由于电极腐蚀造成的污染风险，该污染风险对于食品来说可导致不能接受的健康风险。
在又一实施方案中，所述单缠绕线圈元件具有基本上圆形或卵形的横截面。该形状使得可产生这样的电磁场模式，即其适合用于影响所述生物细胞的细胞膜和/或细胞内膜，优选增加其通透性。
在一个实施方案中，所述单缠绕线圈元件基本上是圆柱状，并且限定了一个接收空间，所述接受空间的大小使得所述包含生物细胞的物体可以被可移除地放置。当所述线圈元件被放置在所述包含生物细胞的物体的周围或者所述物体被置于所述单缠绕线圈元件的接收空间内部时，施加所述电磁场。所述单缠绕物的圆柱形状可使得所述物体中的整个内含物均遭受由所述单缠绕线圈元件产生的高电磁场的处理。
在一个实施方案中，所述单缠绕线圈元件限定了一个接收空间，所述接受空间的大小使得所述物体可通过所述单缠绕物。所述包含生物细胞的物体可以移动通过所述线圈元件的固定单缠绕物，从而遭受所述电磁场的处理。在另一个实施方案中，所述线圈元件能够以这样的方式移动，即所述单缠绕物沿着一个或多个包含生物细胞的静止物体移动，所述静止物体通过由所述单缠绕线圈元件限定的接收空间。在甚至又一实施方案中，所述线圈元件包含多个单缠绕物，例如排列成一维、二维或三维阵列。同时，一个或多个物体可以通过所述各个单缠绕物的接收空间，并且/或者所述单缠绕物可以沿所述一个或多个物体移动。
在一个实施方案中，所述单缠绕线圈元件被设置成使得所述物体可以被同中心地放置于所述线圈元件中。这可以使得所述物体中包含的生物细胞遭受相对均匀的电磁场的处理，所述电磁场的场强度足以影响所述细胞膜和/或所述细胞内膜。
在一个实施方案中，所述单缠绕线圈被设置成在所述细胞和所述单缠绕线圈之间不接触的情况下影响所述物体中的生物细胞。所述单缠绕线圈和所述待处理的细胞之间不存在物理接触，可避免应用电极以产生并施加电磁场的装置的上述缺陷。
在一个实施方案中，所述电发生器包含这样的电容器，即其被布置以在所述单缠绕线圈元件内部生成至少10kV/cm的电场强度。至少该值的电场强度是影响所述细胞的细胞内膜所需要的。
在一个实施方案中，所述单缠绕线圈元件的缠绕物包含两个末端，所述两个末端之间限定了一个间隙。所述间隙的宽度很大程度上决定所述电磁场的模式，以及其影响所述物体中生物细胞的细胞膜和/或细胞内膜的能力，所述物体是置于由所述单缠绕线圈限定的接收空间内部。
在一个实施方案中，所述电发生器包含电源、电容器和开关元件，所述开关元件被设置用于在第一阶段使所述电容器充电并且在第二阶段使所述电容器放电，以在所述单缠绕线圈元件中提供短持续时间的大电流。
在一个实施方案中，所述开关元件包含被设置成在预定放电电压下击穿的多间隙火花隙开关，优选二间隙火花隙开关。
在一个实施方案中，所述电流上升时间是10ns或更小，优选6ns或更小，所述电流的变化速率(dI/dt)为至少100A/ns，优选至少150A/ns，所述电流脉冲的幅度为约500-2000A，并且/或者包含所述单缠绕线圈元件的电路的自感为数十纳亨。
所述开关元件可由被设置成在预定放电电压下击穿的多间隙火花隙开关(优选二间隙火花隙开关)形成。所述电路可以被同轴地设置，使得所述自感保持在最小。这些实施方案使得有可能实现所述电磁场的相对短的持续时间。更具体地，所述单缠绕线圈元件中的电流上升时间可以是10ns或更小，优选6ns或更小。而且，所述电流的变化速率(dI/dt)为至少100A/ns，优选至少150A/ns，导致所述单缠绕线圈元件中电流脉冲的幅度为约500-2000A。在本发明的实施方案中，所述脉冲的总持续时间是约数百纳秒，优选300ns。
在一个实施方案中，所述发生器至少部分地被布置在外壳中，并且被加压至预定的高压值，优选至少约8bar的压力。所述电路可以被同轴地设置并保持尽可能小，以保持所述电路的低自感。为了减小所述装置的大小，更特别是减小所述元件(例如多个火花隙开关)之间的相互距离，所述发生器可以至少部分地被布置在外壳中。然后，将所述外壳加压至预定的高压值，例如至少约8bar的压力。
根据另一个方面，提供了所述装置和包含生物细胞的物体的组合体，所述物体被布置在所述单缠绕线圈元件中。所述物体可以是包含所述生物细胞的组织和任何固体物。在另一些实施方案中，所述物体是用于支持包含所述生物细胞的介质的支持物(holder)，例如食品。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于处理物体中生物细胞的方法，所述方法包括：
-将所述物体放置在与电发生器连接的单缠绕线圈元件的单缠绕物内部；
-使所述电发生器放电至所述单缠绕线圈元件中，以通过所述单缠绕线圈元件中的磁感应产生短持续时间的脉冲电磁场，其中所述电磁场强度高至足以影响所述物体中包含的生物细胞细胞膜和/或细胞内膜，优选高至足以增加所述细胞膜和/或细胞内膜的通透性。
优选地，所述方法适合用于增加所述生物细胞的细胞生长速率，以及/或者增加所述生物细胞的代谢活性。有利地，所述生物细胞可以保持在包含它们的介质中。无需将它们转移至适合用于常规电穿孔的另一介质中。
在一个实施方案中，所述方法包括在所述物体中产生电场，所述电场足够高，优选在所述单缠绕线圈元件内部具有至少1kV/cm的电场强度，以影响所述物体中包含的生物细胞，优选增加它们的细胞膜和/或细胞内膜的通透性。
在一个实施方案中，所述方法包括在第一阶段使电容器充电，在第二阶段使所述电容器放电，以在所述单缠绕线圈元件中提供短持续时间的大电流。
在又一实施方案中，所述方法包括增加所述生物细胞的细胞生长速率，和/或增加所述生物细胞的代谢活性。
根据本发明的另一方面，提供了一种方法，所述方法包括将脉冲电磁场施加于所述生物细胞，所述电磁场的场强度高至足以影响所述物体中包含的生物细胞的细胞膜和/或细胞内膜，优选增加其通透性，其中将所述场施加于所述细胞的持续时间保持在最小处理时间和最大处理时间之间，选择所述处理时间以增加所述生物细胞的细胞生长速率。可以使用一个或多个前述的单缠绕线圈施加所述脉冲电磁场。然而，所述方法还涵盖其中所述电磁场以不同方式施加的实施方案，所述不同方式例如但不限于通过使用电极、平行板、天线或类似的电磁场发生装置。
本发明的进一步的优点、特征和细节根据以下对有效实施方案的描述将会清晰。所述描述中参照了附图。
图1示出本发明的实施方案的总体设计。
图2示出对所述图的实施方案的更详细视图，所述图的实施方案包括置于所述单缠绕线圈内部的物体。
图3是由图1和2的单缠绕线圈产生的电场的图示。
图4和5是使用本发明的实施方案进行的实验的图示。
图6是在处理后第3天时MC3T3细胞数量的图示。
图7是在处理后第3和7天时MC3T3细胞的代谢活性的图示。
图8的透视原理图显示具有接收空间的单缠绕线圈的实施方案，其中布置包含生物细胞的支持物。
在许多应用中利用将生物细胞暴露于脉冲电磁场。通常的实施是使用彼此相对布置以形成电磁场的两个或多个含传导材料的电极。使用电极将生物细胞暴露于脉冲电磁场的实例可见于用于巴氏杀菌(PEF)、转染和微箝(micro clamping)、凋亡诱导(nsPEF、sm/i-PEF、HISDEP、UPSET)的设备等。
通常而言，所述生物细胞被暴露于强外部电磁场的短脉冲。该强电磁场由置于包含所述生物细胞的介质中的两个或多个电极生成。然后，将所述脉冲电磁场施加于所述介质。依赖于场强度和脉冲形状(包括脉冲的持续时间和陡度)，所施加的电磁场可影响所述生物细胞的细胞膜以及/或者所述细胞内膜和/或结构，并且可导致可逆的或不可逆的作用。在本发明的上下文中，术语细胞间和细胞内可互换使用。施加跨所述细胞膜的低电磁场强度(例如每厘米数伏特，例如20V/cm)可引起所述细胞膜中电压依赖型通道开启，引起离子浓度变化。这种离子浓度的变化可导致细胞应激。施加跨所述细胞膜的高电磁场强度(例如每厘米数千伏特，例如1kV/cm)可引起所述细胞膜的通透性增加。所述细胞需要数秒至数小时以从这种通透性增加恢复(可逆击穿)，或者可能发生细胞死亡(不可逆击穿)。包括应用外部电磁场的处理可引起所述细胞膜通透性的短暂增加，这可用于转染和微箝。这样的处理还可引起永久的不可逆效应，这可用于处理食物，例如用于低温巴氏杀菌。
使用电极有数个缺点：
-它是一项侵入性技术，因为所述电极需要直接接触所述包含生物细胞的介质；
-它包含污染风险；并且
-它需要在处理所述物体中的生物细胞之前和/或之后的另外步骤，例如以至少降低电击穿的可能性。
由于电极被置于所述介质内部以能够在其中产生所述脉冲电磁场，所述介质的生物细胞应首先在与所述电极接触的同时被处理，并且仅当所述细胞处理被完成后才可以被置于物体中，即可以被包装在容器、盒子、包装物等中。这可相当大地降低所述处理操作的效率。
使用电极产生脉冲电磁场的一个公知缺点是，所述电极可能随时间而遭腐蚀，这意味着受腐蚀的电极材料最终可能终止于待处理的介质中。同时，在电极处或周围可能发生电化学反应。这样的反应可以导致不利的反应残留物。如果所述介质包括例如供人消费的食品，则该污染风险可引起不能接受的健康风险。
通常不能选择涂敷或遮盖所述电极以至少降低上述缺点，这是因为所述涂敷或遮盖将会减弱通过所述包含例如所述待处理生物细胞的介质的电磁场。为了减少所述腐蚀效应，有时使用贵金属。然而，这不会减少其他缺点。
此外，使用电极经常需要另外的步骤，例如将所述细胞暂时放置在包含所述电极的特殊环境(例如电穿孔试管)中。所需要的另外步骤的又一实例是，洗涤细胞并将它们放入无盐介质中，以至少降低电击穿的可能性。在处理后，通常必须将所述细胞放回它们的初始环境和/或介质中。
生物细胞可以分成两种类型，真核细胞和原核细胞。这两种细胞类型之间的重要差异是，原核生物细胞缺少细胞核和细胞器。这意味着DNA游离地漂浮在所述细胞中。这两种细胞类型均都被膜包围，包含DNA(其包含制备例如核糖体和RNA的指令)、细胞质和核糖体。核糖体根据信使RNA中保持的模版组建蛋白质。细菌和古生物是原核生物类型。原核细胞的大小通常为0.5μm至2μm。动物、植物和真菌是真核生物类型。这些细胞具有细胞核——容纳遗传物质的膜包围的细胞器——以及也由膜包围的其他细胞器。两种重要的细胞器是内质网和线粒体。内质网提供细胞中的转运，并因此例如可以在肝中将毒物解毒。线粒体实际上是生活在真核生物内部的细菌(原核生物)，并且包含自己的DNA以复制其自身。它的功能是降解营养物，并从而产生能量。真核生物的细胞大小通常为2μm至10μm。
细胞膜在电穿孔中起到主要作用，并且得到更详细地解释。如前所述，所有细胞都被膜包围。所述膜保护所述细胞的内部，并调节物质的通过。所述膜的主要结构是脂双层。脂溶性物质、氧和二氧化碳能够流过该层。所述膜还包含帮助水溶性物质、葡萄糖和氨基酸通过的其他蛋白。这些蛋白通道中的一些在跨所述细胞膜电压有变化时开启或关闭。这些通道被称为电压门控离子通道。因此，当施加外部电场时，这些蛋白通道开启并引起离子浓度的变化。
对于真核生物，细胞器也由膜(细胞内膜)围成。所述细胞内膜也可能受到外部施加的电磁场影响。
如以前所提及的，在电穿孔过程中，所述膜的通透性增加。当将外部电磁场施加于所述生物细胞时发生电穿孔。依赖于例如所述膜的充电时间，在所述细胞膜或所述细胞内膜处发生电穿孔。当所述电磁场不是太高(使得跨所述膜的电压大约为1伏特的临界阈值)并且持续时间相对短时，所述细胞将自我恢复。电穿孔可以应用于例如基因转运和药物送递。施加更高电磁场强度、更高跨细胞膜电压以及/或者更长持续时间可造成不可逆的细胞损伤，以及最终的细胞死亡。
一般而言，影响所述细胞膜需要至少1伏特的电压。由于真核细胞的大小是约10μm，跨所述细胞膜的外部电场应为约1kV/cm的数量级。影响所述细胞的细胞内膜所需的膜电压被发现与影响所述细胞膜所需的电压是同一数量级，因此是约1V。然而，细胞内结构的大小与所述细胞大小相比小大约10倍。这意味着所述电场强度应该是至少约10kV/cm。
图1示出一种实施方案的电路图，所述电路用于产生影响存在于物体中的介质(例如乳品盒中的乳)中的生物细胞所需的脉冲电磁场。该电路1包含串联的电源2(例如电压电源)、电阻器4、开关元件5和单缠绕线圈6，以及任选的阻尼电阻器12。与电源2并联布置的电容器3。此外还显示元件8，其表示电路1的自感。可任选地增加电阻器12，以更加增加通过所述单缠绕线圈的电流的上升时间。
在一个实施方案中，所述开关元件由多个火花隙开关组成。多个火花隙开关通常包括由多个间隙分开的传导电极的布置。当施加合适的电压时，可以形成火花，导致所述电极之间的介质(例如空气)电离，并降低所述开关的电阻。然后，电流流过直至所述电离空气的通路断开或者所述电流降低至最小电流值以下。
参照图2，单缠绕线圈6包含基本环形的缠绕物10。平行于所述单缠绕线圈6的轴方向11地(例如与所述缠绕物同中心地)放置包含待处理的生物细胞的物体(O)。它可以证明，本发明实施方案的单缠绕线圈6产生的电场(如图3中场线16所表示的)可以被认为是旋转场(由场线14表示)和固定场(由场线15表示)的叠加。从下文图4，可以使所述电场在接近于单缠绕线圈6的空隙19处特别强。
图8示出根据本发明的单缠绕线圈6的实施方案。在该实施方案中，所述单缠绕线圈基本是圆柱状，更特别是马蹄铁形。在一个位置处，所述圆柱壁被间隙19中断。在所述间隙19的两侧，线圈元件6包含用于连接所述多个火花隙开关的引线的末端25、26。
所述线圈元件限定接收空间24，其中可以将物体例如支持物或容器23布置于其中，例如通过将所述支持物或容器向下移动至空间24。在处理所述生物细胞后，通过向下或向上移动所述容器或支持物，可以将包含所述生物细胞的支持物或容器22(或者更通常是所述物体)从所述接收空间移出。在整个操作过程中，不需要使所述容器或支持物与单缠绕线圈6相接触。
在另一个实施方案中，所述生物细胞被布置在延伸通过所述接收空间的管状物、通道或类似通路内部。所述生物细胞沿所述通路转运。在转运过程中，它们遭受由单缠绕线圈6产生的高电磁场的处理。所述细胞转运可能会以批量样的方式进行，但也考虑到沿一个或多个连续单缠绕线圈6的连续细胞流。
在操作中，电压源2对电容器3充电，引起电压升高，直至多火花隙开关5的火花隙点燃。所述火花隙开关可以被看作是由指定电压关闭的开关。该电压依赖于所述电极的相互距离(间隙)和所述电极之间的介质压力。较大距离和/或较高(空气)压力将引起较高的击穿电压。当火花隙5点燃时，电容器3放电至所述单缠绕线圈6中，在其中产生脉冲形状的电流信号。单缠绕线圈6中的电流产生短且强的磁场，在所述物体中(O)中诱导非常强的电场。
所述电路布置的自感(一般约50-150nH)与通过所述电路的电流的上升时间有关(并因此与所述物体内部形成的电场强度有关)。所述单缠绕线圈本身的电感相当低，例如在1-5nH的数量级。
通过单缠绕线圈6的上升电流可产生电场。所述电场强度主要取决于通过单缠绕线圈6的电流的上升时间和幅度。在通过所述电路的电流的上升时间小于10ns(优选6ns或更小)并且通过所述电路的电流的幅度超过1000A的情况下，所述物体(O)中的电场强度可能会变得大于10kV/cm。该电场强至足以影响所述物体(O)中存在的细胞。如果所述物体是装有某种量乳的乳品盒，则所施加的电场可能足以以这样的方式影响所述细胞，所述方式即可进行对所述乳的低温巴氏杀菌。
进行了一系列试验来确定对物体的生物细胞施加具有以上指明的电流上升时间的电磁场的效应。所述试验在源自原代小鼠胚胎成纤维细胞并通过3T3方案培养的3T3细胞上进行。3T3是“3天转移，接种物3×105个细胞”的缩写。成纤维细胞是哺乳动物细胞(真核动物型)，并且是结缔组织的重要部分。它们可制造结缔组织的结构纤维和基质，并在伤口愈合中起作用。将所述3T3细胞培养，然后转移至孔板，并且在培养2-3天后对所述细胞计数并将其转移至Eppendorf管中进行测试。进行所谓的剂量响应试验，其中确定了不同处理时间的效应。所使用的处理时间是1、2、3、4、5、10和15分钟，(在所述特定的测量设置中)对应于约400和6000之间的脉冲。在这些试验过程中，所述脉冲源以每秒7个脉冲工作，具有约1200A的峰值电流和约6ns的上升时间。在处理后，将所述未处理的细胞和处理的细胞都放回培养箱中，并且在该孵育过程中定期进行检查。
在从0(即根本没有处理)至最长15分钟的不同处理时间后，确定了来自同一样品的细胞数目。如所预计的，所述细胞数目在10和15分钟的处理时间时表现出了降低。然而，所述试验还显示所述细胞数目在2、4和5分钟的处理时间时出乎意料地升高，而不是降低。
很明显，所述细胞受到了所述脉冲电磁场的影响。进行了剂量实验，在处理后，每天通过NucleoCounter计数所述细胞。NucleoCounter是一种检测结合于细胞核的荧光信号的系统，这是本领域技术人员已知的。该计数步骤的结果显示于图4和5中。
图4是所述细胞计数作为处理时间的函数的图示，处理时间从0分钟(即根本没有处理，在对照样品中)至15分钟，孵育时间为0、24和48小时。图5是类似的图示，显示0-15分钟的处理时间以及72-144小时的孵育时间后的细胞计数。结果显示，细胞生长在3和4分钟的处理时间后增加，并且细胞生长在约10和15分钟的处理时间后降低。因此，依赖于处理时间，观察到了对所述细胞生长的显著效应。对于约2-5分钟的处理时间，与对照样品相比，细胞生长似乎增加。对于更长处理时间(即10-15分钟的处理时间)，与对照样品相比，所述细胞生长降低。
为了测试所述装置是否能够影响成骨细胞的生长速率，本发明人开始用MC3T3-E1细胞测试所述装置。
将MC3T3E-I细胞暴露于所诱导的脉冲电磁场(纳秒脉冲持续时间和7Hz的频率)，维持数分钟。选择不同的处理时间来寻找最佳的生长加速。在处理后，将它们以10000个细胞/cm2的密度铺板(n＝3)，通过细胞计数测量所述细胞的生长速率(n＝3)，并且经Alamar Blue测量所述代谢活性(n＝3)。
在第3天，计数细胞数目并测量它们的代谢活性。如图6中所示，遭受所述装置处理的细胞生长显著快于所述对照细胞(0分钟)。这些结果得到了所述细胞代谢活性的数据的支持，如图7中所示。在所述处理的细胞中，它们的活性在第3和7天后都显著增加。通过显微观察，所述处理细胞和对照细胞显示出类似的形态(数据未显示)。
研究另外两个细胞系——HeLa细胞和人角化细胞，看它们在遭受电磁场处理后是否也显示增强的细胞生长。事实上，发现这些细胞也显示出生长增强。下表总结了与对照相比的生长比率的结果。生长比率＞1表示生长增加，而生长比率＜1表示生长降低。
表1 细胞生长增加
  细胞类型  生长比率＞1  生长比率＜1
  HeLa   2-5分钟   5+分钟
  角化细胞   3-6分钟   6+分钟
  3T3   1.5-6分钟   6+分钟
  MC3T3-E1   2-5分钟   N/A
生长比率定义为在暴露后数小时(例如24、48、72、144)，所述处理样品中计数的细胞数目除以未处理样品(对照组)中计数的细胞数目。
角化细胞的代谢活性(经Alamar Blue测量的)被测定，并且这还显示在遭受所述电磁场处理后代谢活性增加。
表2 代谢活性增强
  细胞类型  代谢比率＞1
  角化细胞  3-4分钟
  MC3T3-E1  2-4分钟
代谢比率定义为在暴露后第3天和第7天，所述处理样品中细胞的代谢活性除以未处理样品(对照组)中细胞的代谢活性。
在本发明的上下文中，生长比率增加或代谢活性增加是指，所述处理的细胞与未处理细胞相比的比率大于1。可认为，这些效应一般能够出现在所有细胞类型中，特别是哺乳动物细胞类型中。
很明显，细胞生长增加和代谢活性增加在细胞本身的大量生产中是有利的，特别是在使用细胞生产生物活性化合物(例如蛋白质、抗体等)的方法中。
因此，本发明还涉及一种处理生物细胞的方法，所述方法包括将脉冲电磁场施用于所述生物细胞，所述电磁场的场强度高至足以影响所述生物细胞的细胞膜和/或细胞内膜，其中施用所述场至所述细胞的持续时间保持在最小处理时间和最大处理时间之间，选择所述处理时间以增加所述生物细胞的细胞生长速率和/或代谢活性。
在一个实施方案中，影响所述生物细胞的电场高至足以增加所述生物细胞的细胞膜和/或细胞内膜的通透性。
在一个实施方案中，所述场强度通过小于10ns(优选小于6ns)的电流升高时间产生，并且所述电流脉冲的幅度为至少900A，优选至少1000A。
在一个实施方案中，所述电场强度为约5-15kV/cm，优选8-12kV/cm，更优选约10kV/cm，所述最小处理时间优选超过约1分钟，优选小于约10分钟。
优选地，所述处理时间为约2分钟至约9、或约8、约7或约6分钟。优选地，所述处理时间是约2分钟至约5分钟。
虽然本发明已经参考其具体实施方案而被描述，但是应理解，本发明不限于这些实施方案，并且在不偏离本发明的情况下，可以对本文描述的系统和方法进行变化和修饰。所要求的权利由随附的权利要求书限定。

Claims (19)

1.一种用于处理物体中生物细胞的装置，所述装置包含：
-单缠绕线圈元件；
-与所述单缠绕线圈元件连接的电发生器，所述单缠绕物被设置为基本位于所述物体周围；
其中所述电发生器被设置以向所述单缠绕线圈元件中放电，以使得所述单缠绕线圈元件通过磁感应在所述单缠绕线圈元件中产生短持续时间的脉冲电磁场，当在操作中所述物体被置于所述单缠绕线圈元件中时，所述电磁场的场强度高至足以影响所述物体中包含的生物细胞的细胞膜和/或细胞内膜，优选增加其通透性。
2.权利要求1的装置，其中所述电磁场被无电极地施加于所述物体中的生物细胞。
3.权利要求1或2的装置，其中所述单缠绕线圈元件具有基本上圆形或卵形的横截面。
4.权利要求1、2或3的装置，其中所述单缠绕线圈元件基本上是圆柱状，并且限定了一个接收空间，所述接受空间的大小使得所述包含生物细胞的物体可以被可移除地放置。
5.前述权利要求中任一项的装置，其中所述单缠绕线圈元件限定了一个接收空间，所述接受空间的大小使得所述物体可通过所述单缠绕物。
6.前述权利要求中任一项的装置，其中所述单缠绕线圈元件被设置成使得所述物体可以被同中心地放置于所述线圈元件中。
7.前述权利要求中任一项的装置，其中所述单缠绕线圈被设置成在所述细胞和所述单缠绕线圈之间不接触的情况下影响所述物体中的生物细胞。
8.前述权利要求中任一项的装置，其中所述电发生器包含电容器，所述电容器被布置以在所述单缠绕线圈元件内部生成至少10kV/cm的电场强度。
9.前述权利要求中任一项的装置，其中所述单缠绕线圈元件的缠绕物包含两个末端，所述两个末端之间限定了一个间隙。
10.前述权利要求中任一项的装置，其中所述电发生器包含电源、电容器和开关元件，所述开关元件被设置以用于在第一阶段使所述电容器充电并且在第二阶段使所述电容器放电，以在所述单缠绕线圈元件中提供短持续时间的大电流。
11.权利要求10的装置，其中所述开关元件包含被设置成在预定放电电压下击穿的多间隙火花隙开关，优选二间隙火花隙开关。
12.前述权利要求中任一项的装置，其中所述电流上升时间是10ns或更小，优选6ns或更小，所述电流的变化速率(dI/dt)为至少100A/ns，优选至少150A/ns，所述电流脉冲的幅度为约500-2000A，并且/或者包含所述单缠绕线圈元件的电路的自感为数十纳亨。
13.前述权利要求中任一项的装置，其中所述发生器至少部分地被布置在一个外壳中，并且被加压至预定的高压值，优选至少约8bar的压力。
14.前述权利要求中任一项的装置和包含生物细胞的物体的组合体，所述物体被布置在所述单缠绕线圈元件中，所述物体优选是用于支持包含所述生物细胞的介质的支持物，例如食品。
15.一种用于处理物体中生物细胞的方法，所述方法包括：
-将所述物体放置在与电发生器连接的单缠绕线圈元件的单缠绕物内部；
-使所述电发生器向所述单缠绕线圈元件中放电，以通过所述单缠绕线圈元件中的磁感应产生短持续时间的脉冲电磁场，其中所述电磁场强度高至足以影响所述物体中包含的生物细胞的细胞膜和/或细胞内膜，优选高至足以增加所述细胞膜和/或细胞内膜的通透性。
16.权利要求15的方法，包括在所述物体中产生电场，所述电场足够高，优选在所述单缠绕线圈元件内部具有至少1kV/cm的电场强度，以影响所述物体中包含的生物细胞，优选增加它们的细胞膜和/或细胞内膜的通透性。
17.权利要求15或16的方法，包括在第一阶段包括使电容器充电和在第二阶段使所述电容器放电，以在所述单缠绕线圈元件中提供短持续时间的大电流。
18.权利要求15-17任一项的方法，用于：
-增加所述生物细胞的细胞生长速率，和/或
-增加所述生物细胞的代谢活性。
19.处理生物细胞的方法，优选权利要求15-18中任一项的方法，所述方法包括将脉冲电磁场施加于所述生物细胞，所述电磁场的场强度高至足以影响所述物体中包含的生物细胞的细胞膜和/或细胞内膜，优选增加其通透性，其中将所述场施加于所述细胞的持续时间保持在最小处理时间和最大处理时间之间，选择所述处理时间以增加所述生物细胞的细胞生长速率。
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