CN102337333A - 检测水产品中四种常见致病菌的试剂盒及检测方法 - Google Patents

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翁思聪
朱军莉
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Abstract

本发明公开了一种检测水产品中四种常见致病菌的试剂盒，包括Mg2+、dNTP、Taq酶、PCRBuffer、引物、灭菌双蒸水。本发明还提供了检测水产品中四种常见致病菌的方法，包括样品增菌培养、提取菌液DNA、PCR扩增、将扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳进行检测等步骤。该方法在常规多重PCR检测技术上，对该检测方法从前增菌到PCR扩增等步骤进行了改良和优化，整合后的多重PCR快速检测试剂盒配置便捷，易于产业化生产，检测结果特异性强，灵敏度高。

Description

检测水产品中四种常见致病菌的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及一种可同时快速检测水产品中沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌(Shigellaspp.)、金黄色葡萄球菌(Vibrio.parahaemolyticus)和副溶血性弧菌(Staphylococcus aureus)的多重PCR试剂盒和改良型检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
近几年我国水产品消费量不断上升，而水产品在养殖、捕捞、储藏、加工、运输、销售等环节容易受到病原微生物的污染，因此病原微生物检测是水产品及其加工品卫生检测中的一项重要工作，其关系到消费者的健康及生命安全。其中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌被认为是重要的污染水产品的致病菌，已引起各个国家卫生检测部门的广泛重视。我国标准DB11/519-2008《生食水产品卫生要求》规定沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌等不得检出。严格的食品微生物检验是保障食品安全的重要环节。然而，传统检测方法检测时间长，一般检测周期在5-10天，检测程序繁琐，工作量大，很难适应现代化食品安全快速检测的需要，因此亟需建立一种操作简便、快速准确、灵敏度和特异性都较高的现代化检测方法。
分子生物学检测技术的发展为病原微生物快速检测提供了良好的技术平台，如基因探针、NASBA(核酸序列依赖性扩增法)、ATP生物发光法以及PCR等技术已逐渐被研究并完善以用于病原微生物的检测当中。其中多重PCR(multiplex-PCR)技术不同于传统PCR技术只能检测单一靶基因，其是通过在同一PCR反应体系里加入多对特征引物，同时扩增出多个目标核酸片段的PCR反应，可用于多种病原微生物的同时快速检测或鉴定。Germini等根据沙门氏菌的invA基因，单核细胞增生李斯特菌的prfA基因，大肠杆菌O157:H7的eaeA基因以及细菌的16S rRNA基因设计引物，应用多重PCR技术对全蛋液进行测定，特异性地检出上述菌种，灵敏度高，检测效果稳定。国内陈伟等对肉品中的沙门氏菌、志贺氏菌及大肠杆菌0157:H7三种致病菌建立了多重PCR检测体系，检测灵敏度可达1CFU/ml，可在24h内完成检测工作，并集成了快速检测试剂盒。然而，目前对水产品中常见的四种致病菌沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的同时共增菌方法及多重PCR快速检测试剂盒未有报道和公开。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于同时检测水产品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌四种常见致病菌的多重PCR快速检测试剂盒和检测方法，可以有效的节约检测时间，提高检测效率。
检测水产品中四种常见致病菌的试剂盒，包括Mg2+、dNTP、Taq酶、PCR Buffer、引物、灭菌双蒸水，其特征在于，所述引物由以下序列组成：
沙门氏菌引物上游序列：5’-GGT CGT CGT TGG GAC TGA TTG G-3’，下游序列：5’-CCG TGG CAT GTC TGA GCA CTT C-3’；
志贺氏菌引物上游序列：5’-GCT CGA AAC GGG CTG TGC TAA TG-3’，下游序列：5’-ACG GTA TCG GAA AGG CGG TCAA-3’；
金黄色葡萄球菌引物上游序列：5’-AAC GGC AAT ACG CAA AGA GG-3’、下游序列：5’-TAT ACG CTA AGC CAC GTC CAT A-3’；
副溶血性弧菌引物上游序列：5’-CTG ATA ACA ATG ACG CCT CTG CTA AT-3’，下游序列：5’-TCT GAT ACT CAC CAA TCT GAC GGA ACT-3’。
本发明根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、沙门氏菌的侵袭蛋白基因invA、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH、副溶血性弧菌的毒力表达调控基因toxR作为特征靶基因设计出4对特异性引物(见表1)各引物针对相应致病菌高度种内保守，种间特异基因或者毒力相关基因设计。扩增后片段长度大小各异，可通过电泳进行分开辨别。
表1四种目标菌的引物序列和扩增PCR产物大小
Figure BDA0000092230540000021
本发明还提供了一种于同时检测水产品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌四种常见致病菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
a)样品增菌培养：配制选择性增菌培养液，各组分的浓度为：缓冲蛋白胨水20g/L、鱼蛋白胨12g/L、胆盐3号3g/L、柠檬酸钠1.5g/L、氯化锂1g/L、亚碲酸钾1.2mg/L、氯化钠15g/L、葡萄糖2g/L、甘露醇1g/L、丙酮酸钠4g/L，调节pH值为7.8；取水产品样品加入选择性增菌培养液中，均质1分钟，于恒温振荡器中37℃，150rpm培养6h；
b)提取菌液DNA；
c)PCR扩增：使用权利要求1所述的试剂盒对菌液DNA进行扩增，扩增反应条件如下：采用冷启动，94℃预变性4min，变性94℃30s，退火58.1℃1min，延伸72℃1min，30个循环，终延伸72℃5min；
d)将扩增产物于2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
本发明在常规多重PCR检测技术上，对该检测方法从前增菌到PCR扩增等步骤进行了改良和优化，整合后的多重PCR快速检测试剂盒配置便捷，易于产业化生产，检测结果特异性强，灵敏度高，达10-100CFU/mL，可对水产品中存在的常见致病菌同时进行全面的检测、鉴定和分析。而且检测周期短，成本相对较低，可推广应用于水产品、畜产品等各方面食品领域的安全卫生检测中及分子流行病原学调查。
本发明在使用过程中涉及一种自主研发的新型共增菌培养液SSSV，其配方为：缓冲蛋白胨水20g/L，鱼蛋白胨12g/L，胆盐3号3g/L，柠檬酸钠1.5g/L，氯化锂1g/L，亚碲酸钾1.2mg/L，氯化钠15g/L，葡萄糖2g/L，甘露醇1g/L，丙酮酸钠4g/L，pH 7.8。
本发明步骤c中扩增反应体系优选为：反应体系共50μl，其中，Mg2+(25mmol/L)3.5μl，dNTP(各2.5mmol/L)4μl，Taq酶(5U/μl)0.6μl，PCRBuffer 5μl，引物(20μmol/L)沙门氏菌、副溶血性弧菌正反向各1.2μl，金黄色葡萄球菌、志贺氏菌正反向各1.6μl，DNA模板(A260/A280比值为1.8±0.1)各1μl，灭菌双蒸水补足。
采用冷启动，94℃预变性4min，变性94℃30s，退火58.1℃1min，延伸72℃1min，30个循环，终延伸72℃5min。
本发明还进行了反应的特异性验证和灵敏度检验。证明了引物设计的种间特异性和种内保守性，确保该反应能特异性检测出目标致病菌，而避免假阳性的出现；同时确认了该方法对志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的最低检测限为100CFU/mL及沙门氏菌和副溶血性弧菌的最低检测限为10CFU/mL。
本发明的检测水产品中四种常见致病菌的方法，具体可以采用以下步骤：
1.样品前处理和前增菌
1)选择性共增菌培养液按上述成分配方配制。2)水产样品取样25g，其中鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃；贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物或动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外科并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。3)取样后加入225mL灭菌的SSSV中，用均质拍打器均质1min，于恒温振荡器中37℃，150rpm培养6h。
2.菌液DNA提取
采用Biospin细菌DNA基因组抽提试剂盒，按说明书步骤要求进行快速提取。提取后紫外分光光度计测定模板DNA的浓度与纯度，(A260/A280比值为1.8±0.1)。
3.PCR扩增
从试剂盒中用移液器分别移取Mg2+(25mmol/L)3.5μl，dNT(各2.5mmol/L)4μl，Taq酶(5U/μl)0.6μl，PCRBuffer 5μl，引物(20μmol/L)沙门氏菌、副溶血性弧菌正反向各1.2μl，金黄色葡萄球菌、志贺氏菌正反向各1.6μl，DNA模板(A260/A280比值为1.8±0.1)各1μl至PCR eppendorf管中，灭菌双蒸水补足50μl，其中整个加样过程中始终保持冰浴状态下，振荡混匀后，放入PCR仪，设置如下参数进行扩增：94℃预变性4min，变性94℃30s，退火58.1℃1min，延伸72℃1min，30个循环，终延伸72℃5min。
4.扩增产物电泳检测
将扩增产物上样于2％琼脂糖凝胶电泳检测及通过凝胶成像系统与Marker进行比对分析结果。
附图说明
图1是使用本发明试剂盒及检测方法检测样品的电泳结果图。
具体实施方式
实施例1
本发明的检测水产品中四种常见致病菌的试剂盒，包括Mg2+、dNT、Taq酶、PCR Buffer、引物、灭菌双蒸水，其特征在于，所述引物由以下序列组成：
沙门氏菌引物上游序列：5’-GGT CGT CGT TGG GAC TGA TTG G-3’，下游序列：5’-CCG TGG CAT GTC TGA GCA CTT C-3’；
志贺氏菌引物上游序列：5’-GCT CGA AAC GGG CTG TGC TAA TG-3’，下游序列：5’-ACG GTA TCG GAA AGG CGG TCA A-3’；
金黄色葡萄球菌引物上游序列：5’-AAC GGC AAT ACG CAA AGA GG-3’、下游序列：5’-TAT ACG CTA AGC CAC GTC CAT A-3’；
副溶血性弧菌引物上游序列：5’-CTG ATA ACA ATG ACG CCT CTG CTA AT-3’，下游序列：5’-TCT GAT ACT CAC CAA TCT GAC GGA ACT-3’。
实施例2
本发明的检测水产品中四种常见致病菌的方法，采用以下步骤：
1.样品前处理和前增菌
1)样品增菌培养：配制选择性增菌培养液，各组分的浓度为：缓冲蛋白胨水20g/L、鱼蛋白胨12g/L、胆盐3号3g/L、柠檬酸钠1.5g/L、氯化锂1g/L、亚碲酸钾1.2mg/L、氯化钠15g/L、葡萄糖2g/L、甘露醇1g/L、丙酮酸钠4g/L，调节pH值为7.8。
2)水产样品取样25g，其中鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃；贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物或动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外科并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。3)取样后加入225mL灭菌的SSSV中，用均质拍打器均质1min，于恒温振荡器中37℃，150rpm培养6h。
2.菌液DNA提取
采用Biospin细菌DNA基因组抽提试剂盒，按说明书步骤要求进行快速提取。提取后紫外分光光度计测定模板DNA的浓度与纯度，(A260/A280比值为1.8±0.1)。
3.PCR扩增
从实施例1的试剂盒中用移液器分别移取Mg2+(25mmol/L)3.5μl，dNT(各2.5mmol/L)4μl，Taq酶(5U/μl)0.6μl，PCR Buffer 5μl，引物(20μmol/L)沙门氏菌、副溶血性弧菌正反向各1.2μl，金黄色葡萄球菌、志贺氏菌正反向各1.6μl，DNA模板(A260/A280比值为1.8±0.1)各1μl至PCR eppendorf管中，灭菌双蒸水补足50μl，其中整个加样过程中始终保持冰浴状态下，振荡混匀后，放入PCR仪，设置如下参数进行扩增：94℃预变性4min，变性94℃30s，退火58.1℃1min，延伸72℃1min，30个循环，终延伸72℃5min。
4.扩增产物电泳检测
将扩增产物上样于2％琼脂糖凝胶电泳检测及通过凝胶成像系统与Marker进行比对分析结果。
实施例3：人工污染虾仁、目鱼卷和鱼丸在冷藏过程中四种目标致病菌的检测。
将虾仁、目鱼卷、鱼丸样品浸泡于同时含有102CFU/mL四种目标菌的稀释菌液中1h后，取25g放入灭菌袋中，封口，分别于4℃和-20℃冰箱中贮藏。取冷冻10d和冷藏3d的虾仁、目鱼卷、鱼丸样品各25g，无菌操作切成块状，放入无菌袋中，加入225mL灭菌的SSSV(冲蛋白胨水20g/L，鱼蛋白胨12g/L，胆盐3号3g/L，柠檬酸钠1.5g/L，氯化锂1g/L，亚碲酸钾1.2mg/L，氯化钠15g/L，葡萄糖2g/L，甘露醇1g/L，丙酮酸钠4g/L，pH 7.8)中，培养6h后，使用Biospin细菌DNA基因组抽提试剂盒提取菌液中混合菌的DNA与1.5mL离心管中-20℃保存。
使用多重PCR快速检测试剂盒，分别按说明要求添加量(反应体系50μl，Mg2+(25mmol/L)3.5μl，dNT(各2.5mmol/L)4μl，Taq酶(5U/μl)0.6μl，PCRBuffer 5μl，引物(20μmol/L)沙门氏菌、副溶血性弧菌正反向各1.2μl，金黄色葡萄球菌、志贺氏菌正反向各1.6μl，DNA模板(A260/A280比值为1.8±0.1)各1μl，灭菌双蒸水补足)在冰浴中加入至PCR eppendorf管中，加样完毕，放入PCR仪中，按照说明参数设置PCR扩增反应条件(94℃预变性4min，变性94℃30s，退火58.1℃1min，延伸72℃1min，30个循环，终延伸72℃5min)，然后进行PCR扩增。
扩增完毕后将扩增产物上样于2％琼脂糖凝胶电泳检测及通过凝胶成像系统，获得预期的四个条带。
实施例4：市场常见各种水产的四种目标致病菌的检测。
同时称取若干整只鲜活南美白对虾、花蛤、三文鱼等20种样品各25g，无菌操作切成块状，放入无菌袋中，加入225mL灭菌SSSV(冲蛋白胨水20g/L，鱼蛋白胨12g/L，胆盐3号3g/L，柠檬酸钠1.5g/L，氯化锂1g/L，亚碲酸钾1.2mg/L，氯化钠15g/L，葡萄糖2g/L，甘露醇1g/L，丙酮酸钠4g/L，pH 7.8)中，培养6h后，使用Biospin细菌DNA基因组抽提试剂盒提取菌液中混合菌的DNA与1.5mL离心管中-20℃保存。
使用多重PCR快速检测试剂盒，分别按说明要求添加量(反应体系50μl，Mg2+(25mmol/L)3.5μl，dNT(各2.5mmol/L)4μl，Taq酶(5U/μl)0.6μl，PCRBuffer 5μl，引物(20μmol/L)沙门氏菌、副溶血性弧菌正反向各1.2μl，金黄色葡萄球菌、志贺氏菌正反向各1.6μl，DNA模板(A260/A280比值为1.8±0.1)各1μl，灭菌双蒸水补足)在冰浴中加入至PCR eppendorf管中，加样完毕，放入PCR仪中，按照说明参数设置PCR扩增反应条件(94℃预变性4min，变性94℃30s，退火58.1℃1min，延伸72℃1min，30个循环，终延伸72℃5min)，然后进行PCR扩增。
扩增完毕后将扩增产物上样于2％琼脂糖凝胶电泳检测及通过凝胶成像系统与Marker进行比对分析结果。电泳结果如图1。
电泳图泳道1-20分别代表不同水产品中四种目标致病菌的阴性和阳性结果，其中出现在549bp位置的为沙门氏菌，426bp位置处为金黄色葡萄球菌，348bp处为志贺氏菌，243bp处为副溶血性弧菌，泳道中有条带表示结果呈阳性，即存在该目标菌；若无条带出现，则表示结果呈阴性，即不存在该目标菌。
序 列 表
 
<110>  浙江工商大学
 
<120>  检测水产品中四种常见致病菌的试剂盒及检测方法
 
<130> 
 
<160>  8    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
ggtcgtcgtt gggactgatt gg                                 22
 
 
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
ccgtggcatg tctgagcact tc                                 22
 
 
<210>  3
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
gctcgaaacg ggctgtgcta atg                                23
 
 
<210>  4
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
acggtatcgg aaaggcggtc aa                                 22
 
 
<210>  5
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
ctgataacaa tgacgcctct gctaat                             26
 
 
<210>  6
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
tctgatactc accaatctga cggaact                            27
 
 
<210>  7
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  7
aacggcaata cgcaaagagg                                   20
 
 
<210>  8
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  8
tatacgctaa gccacgtcca ta                              22

Claims (2)

1.检测水产品中四种常见致病菌的试剂盒，包括Mg2+、dNTP、Taq酶、PCR Buffer、引物、灭菌双蒸水，其特征在于，所述引物由以下序列组成：
沙门氏菌引物上游序列：5’-GGTCGTCGT TGGGACTGATTGG-3’，下游序列：5’-CCGTGGCATGTCTGAGCACTTC-3’；
志贺氏菌引物上游序列：5’-GCTCGAAACGGGCTGTGCTAATG-3’，下游序列：5’-ACGGTATCGGAAAGGCGGTCA A-3’；
金黄色葡萄球菌引物上游序列：5’-AACGGCAATACGCAA AGAGG-3’、下游序列：5’-TATACGCTAAGCCACGTCCATA-3’；
副溶血性弧菌引物上游序列：5’-CTGATAACAATGACGCCTCTGCTA AT-3’，下游序列：5’-TCTGATACTCACCAATCTGACGGAACT-3’。
2.检测水产品中四种常见致病菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
a) 样品增菌培养：配制选择性增菌培养液，各组分的浓度为：缓冲蛋白胨水20 g/L、鱼蛋白胨12 g/L、胆盐3号3 g/L、柠檬酸钠1.5 g/L、氯化锂1 g/L、亚碲酸钾1.2 mg/L、氯化钠15 g/L、葡萄糖2 g/L、甘露醇1 g/L、丙酮酸钠4 g/L，调节pH值为 7.8；取水产品样品加入选择性增菌培养液中，均质1 分钟，于恒温振荡器中37 ℃，150 rpm培养6 h；
b) 提取菌液DNA；
c) PCR扩增：使用权利要求1所述的试剂盒对菌液DNA进行扩增，扩增反应条件如下：采用冷启动，94℃预变性4 min，变性94℃ 30 s，退火58.1℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，30个循环，终延伸72℃ 5 min；
d) 将扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
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