CN102319254B

CN102319254B - 5-碘代杀菌核素在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN102319254B
Application number: CN 201110203608
Authority: CN
Inventors: 李保界; 张辛; 贾德永; 刘慧娟; 贺林
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2011-07-20
Filing date: 2011-07-20
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2031-07-20
Also published as: CN102319254A

Abstract

本发明公开一种化合物5-碘代杀菌核素在制备抗肿瘤药物中的应用。5-碘代杀菌核素通过激活抑癌基因p53进而抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡，来达到抗肿瘤的目的。作为化疗的药物经实验室研究和动物实验表现出显著的抗肿瘤效果。

Description

5-碘代杀菌核素在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及5-碘代杀菌核素（5-Iodotubercidin）在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤是一类多基因改变、多阶段发生、多因素参与的复杂性疾病。全世界每年有1000万人患癌症，并有600万人死于癌症。在中国每年约有190万人患癌症，并有150万人死于癌症。癌症死亡率居城镇居民死因的首位(顾东风等《新英格兰医学杂志》2005)。

目前已知的104种肿瘤中有56种恶性肿瘤都是因为抑癌基因p53发生突变引起的。抑癌基因p53 在正常情况下表达水平低且不稳定，当DNA损伤时（由核辐射等引起），细胞核内的抑癌基因p53 水平会急速升高并激活，抑癌基因p53作为转录调节因子，激活p21WAF1/cip1(CDK激酶的抑制因子)的表达，p21能够同时与CyclinD-CDK4/6和 CyclinE-CDK2 复合物结合，抑制它们的激酶活性，诱发G1/S 阻滞，同时过量表达的抑癌基因p53及其下游效应蛋白 GADD45的转录活化能抑制 Cdc2/CyclinB复合物发挥功能，使细胞阻滞在G2/M 期，从而修复损伤 DNA 。否则受损伤的DNA继续随细胞分裂传代到下一代细胞中，可能导致肿瘤的形成。当 DNA 损伤无法修复时，抑癌基因p53能够诱导下游许多促细胞凋亡蛋白的表达，如 BAX、PUMA、Apaf-1等，诱导细胞发生凋亡。根据对激活抑癌基因p53以及对细胞损伤作用的原理，许多抗肿瘤药物相继研发出来，其中“今又生”（由腺病毒载体DNA和人抑癌基因p53基因重组，形成有活性的腺病毒颗粒）于1998年国家药监局（SFDA）批准进入临床试验，到2004年1月20日正式获批上市。

目前，作为肿瘤三大治疗手段之一的化疗具有不可替代的功效。临床上普遍使用的化疗药物大多能引起DNA的损伤，激活抑癌基因p53进而抑制细胞分裂或导致细胞死亡。化疗药物包括一些核苷酸类似物的化合物，可抑制DNA合成与修复，激活抑癌基因p53，进而对癌细胞表现出强大的杀伤力，它们同时也是DNA合成反应中某些酶的抑制剂。

核苷酸结构类似物(他滨类药物)已成熟应用于临床治疗中，2005年我国重点城市样本医院用药以最小统计单位计算，抗代谢类已占全部抗肿瘤用药的30％，用药金额为2.66亿元，吉西他滨、卡培他滨、替加氟、阿糖胞苷、氟达拉滨是居于前5位的药物，占据了这类药物的87.40％，而“他滨类”药物占据了66.40％。推算国内总体市场上，他滨类药物已达到14.8亿元的规模，进一步显示出该类药物在临床中的重要作用。如氟达拉滨（Fluorodarabine），其代谢产物可以通过抑制核糖核酸还原酶、DNA聚合酶、DNA引物酶和DNA连接酶的活性进而抑制DNA的合成，也可部分抑制RNA聚合酶Ⅱ的活性从而减少蛋白的合成。还有著名的细胞周期特异性抗肿瘤药—吉西他滨(Gemcitabine)：主要杀伤处于S期（DNA合成）的细胞，同时也阻断细胞增殖由G1向S期过渡的进程。在细胞内由核苷激酶代谢成有活性的二磷酸核苷（dFdCDP）和三磷酸核苷（dFdCTP）。吉西他滨除了抑制核糖核苷酸还原酶外，三磷酸吉西他滨可与dCTP竞争性结合到DNA上，使得一个核苷酸掺入到合成过程的DNA链上，从而阻止DNA的进一步合成。

蛋白激酶与恶性肿瘤关系密切，蛋白激酶过度活跃是导致某些肿瘤的病因，所以蛋白激酶抑制剂的开发是抗肿瘤药物的研究热点之一。例如受体酪氨酸激酶的ErbB家族，在很多肿瘤中都有表达。喹唑啉类是一类EGFR酪氨酸激酶抑制物，通过可逆性竞争受体上ATP结合位点抑制EGFR激酶活性。近年来,2种喹唑啉类衍生物：ZD1839（吉非替尼 Gefitinib）和OSI774（埃罗替尼Erlotinib）已被FDA批准上市。类似的激酶抑制剂还有很多，如凡德他尼 (Vandetanib)是一种合成的苯胺喹唑啉化合物，可同时作用于肿瘤细胞的EGFR、VEGFR和RET酪氨酸激酶，还可选择性的抑制其他的酪氨酸激酶，以及丝氨酸/苏氨酸激酶。

基于上述原理，发明人对80种激酶抑制剂和33种蛋白磷酸酶抑制剂进行研究，研究发现，其中的5-Iodotubercidin具有显著抑制肿瘤细胞繁殖的作用，5-Iodotubercidin的化学结构式如Ⅰ所示，为他滨类药物的结构类似物（如Ⅱ所示的氟达拉滨的化学结构式），其作用机制可能与以下因素有关：5-Iodotubercidin具有激活抑癌基因p53的作用。并且研究已证实5-Iodotubercidin是MAPK ERK2(Ki=530nM)的竞争性抑制剂，同时也是腺苷激酶（Ki=30nM），酪蛋白激酶I，PKA以及胰岛素受体激酶（IC50=0.4-28mM）的抑制剂。目前为止，关于5-Iodotubercidin可抑制肿瘤生长的研究，国内外尚未见报道。

发明内容

本发明目的是提供5-Iodotubercidin在制药中的新用途。

本发明提出了5-Iodotubercidin在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的应用是利用5-Iodotubercidin能抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡，来达到抗肿瘤的目的，因此，本发明的5-Iodotubercidin在制备抗肿瘤药物中的应用，具体是指5-Iodotubercidin在制备肿瘤细胞生长的抑制剂和肿瘤细胞凋亡的诱导剂中的应用。

本发明的优点在于5-Iodotubercidin能具有激活抑癌基因p53的作用，抑癌基因p53被激活后能抑制细胞分裂或导致细胞死亡，所以其应用于抗肿瘤药物是具备理论基础的。

附图说明（本发明中的照片都是激光共聚焦显微镜照片。放大倍数均为：63倍油镜放大8倍效果图）图1为Western blot实验不同浓度5-Iodotubercidin处理的电泳图；

图2为Western blot实验5-Iodotubercidin不同处理时间的电泳图；

图3 5-Iodotubercidin进行细胞损伤后免疫荧光检验；

图4 5-Iodotubercidin处理24小时对细胞周期的影响；

图5 5-Iodotubercidin处理24小时对细胞周期的影响；

图6为5-Iodotubercidin作用于不同细胞、不同细胞状态的效果图；

图7 5-Iodotubercidin对裸鼠肿瘤大小的影响。

具体实施方式

下面通过实验证明本发明的5-Iodotubercidin具有的技术效果。

一、5-Iodotubercidin进行细胞损伤的Western blot检验

实验材料和方法

主要实验材料：

细胞株HCT116，HCT116(p53-/-)，细胞株MEF(WT)，MEF(ATM-/-)，MEF(P53-/-)，MEF(原代细胞)，5-Iodotubercidin购自sigma公司，胎牛血清购自Hyclone公司，无水乙醇为国药分析纯。

实验方法：

1、无水乙醇溶解5-Iodotubercidin，配成储液浓度1mM。

2、取相应的MEF(WT)、 MEF(ATM-/-)、 HCT116的细胞接种到六孔板中，每孔加入2ml含10%胎牛血清的DMEM培养基。

3、用无水乙醇分别配制25μM、50μM、100μM、250μM 的5-Iodotubercidin溶液。

4、待细胞稳定生长到约占培养皿面积70-80%时，进行加药处理。

步骤如下：

A、按照1：100稀释加入到2ml培养基中的5-Iodotubercidin溶液，使5-Iodotubercidin终浓度分别达到 0.25, 0.5, 1, 2.5μM，同时设定乙醇对照组（加入培养液和同样体积的乙醇），培养8h后，弃去培养基，用预冷的PBS清洗细胞2遍后用RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白，上样进行Western blot分析，如图1。

B、加100μM （1:100稀释，终浓度为1μM）5-Iodotubercidin 20μl到2ml培养基中分别处理8h, 4h,2h ,1h,0h。提取蛋白，上样进行Western blot分析p-ATM、ATM、 p-chk2、chk2 and p-p53(ser15)、p53蛋白的表达丰度，如图2。

实验结果显示：5-Iodotubercidin可激活DNA损伤应激反应中起关键作用的ATM-Chk2-抑癌基因p53通路，进而激活抑癌基因p53，随着药物浓度逐渐增大会达到一个最大表达量，然后表达量下降。相应的p-ATM，p-chk2也有类似的表达情况，说明5-Iodotubercidin对ATM磷酸化水平有刺激作用。

二、5-Iodotubercidin进行细胞损伤的免疫荧光检验

主要实验材料：

细胞株HCT116，HCT116(p53-/-)，细胞株MEF(WT)，MEF(ATM-/-)，MEF(P53-/-)，5-Iodotubercidin购自sigma公司，胎牛血清购自Hyclone公司，无水乙醇为国药分析纯。

实验方法：

1、取相应MEF(WT)、 HCT116(WT)的细胞接种到已铺有无菌盖玻片的十二孔板中，每孔加入1ml含10%胎牛血清的DMEM培养基。

2、用无水乙醇配制100μM 5-Iodotubercidin溶液。

3、待细胞稳定生长到约占培养皿面积70-80%时，在1ml培养基中按照1：100加药处理8h（以相同体积的无水乙醇作为阴性对照，以hydroxyurea（HU）或1μM doxorubicin处理作为阳性对照）。

4、对细胞爬片进行免疫组化染色，用激光共聚焦显微镜检测细胞损伤的特异蛋白H2AX，TOPBP1，p-ATM。

实验结果显示：5-Iodotubercidin可以在HCT116以及MEFs中诱导H2AX、p-ATM、TopBP1阳性的核内焦点（Foci），Foci染色部位代表DNA损伤位点，表明5-Iodotubercidin可损伤DNA。在咖啡因（可抑制ATM以及ATM家族成员）的作用下，5-Iodotubercidin不能激活p-ATM，同时也不能激活H2AX以及TopBp1。

三、5-Iodotubercidin对细胞周期的影响

主要实验材料：

实验方法：

将处于对数生长期的细胞MEF(WT)、MEF(P53-/-)、HCT116、HCT116(P53-/-)按每孔103-104的数量范围接种于96孔板中（3个复孔），每孔加入细胞悬液100μl，待细胞贴壁后加入不同浓度的5-Iodotubercidin使其终浓度分别为（0.25,0.5,1,2.5μM）, 培养24h后加入10μl Wst-1检测液，继续培养培养4h，使用酶标仪在440nm波长下测定96孔板，测定不同浓度药物处理的细胞的吸光度值。

实验结果显示：5-Iodotubercidin随着浓度的增大，在24h的作用时间下，G2/M期并没有发生太大的改变，维持相对恒定的比例，S期随着浓度增大相应的细胞数变多，表明其进入G2期受到抑制，但超过一定时间，细胞周期控制失效，G2/M期细胞增多，如图4、5。可知5-Iodotubercidin能抑制肿瘤细胞的繁殖。

四、5-Iodotubercidin对细胞凋亡的影响

主要实验材料：

实验方法：

将处于对数生长期的细胞MEF(WT)、MEF(P53-/-)、HCT116、HCT116(P53-/-)按每孔10³-10⁴的数量范围接种于96孔板中（3个复孔），每孔加入细胞悬液100μl，待细胞贴壁后加入不同浓度的5-Iodotubercidin使其终浓度分别为（0.25,0.5,1,2.5μM）, 培养24h后加入10μl Wst-1检测液，继续培养培养4h，使用酶标仪在440nm波长下测定96孔板，测定不同浓度药物处理的细胞的吸光度值。

实验结果显示：在血清饥饿和细胞种植过满的情况下，5-Iodotubercidin无法进行细胞损伤，不能杀死细胞，作用效果与抑癌基因p53基因缺失一样，说明5-Iodotubercidin通过抑癌基因p53作用于肿瘤细胞，从而诱导肿瘤细胞凋亡。

五、5-Iodotubercidin对裸鼠肿瘤大小的影响

主要实验材料：

4周龄的雄性裸鼠，购自上海斯莱克公司。

实验方法：

在饲养期间稳定生长2周后进行肿瘤细胞接种。分别将200μl含有约10⁶个HCT116，HCT116(P53-/-)接种于裸鼠大腿背面左右两侧皮下。饲养12天后将其分为2组，阴性对照组3只，5-Iodotubercidin组5只分别饲养在两个鼠笼中，阴性对照组注射含有与加药浓度相同含量乙醇的生理盐水，加药组注射2.5mg/kg，0.625mg/kg的5-Iodotubercin溶液，按照公式肿瘤体积=1/2长轴×短轴×短轴计算肿瘤体积。每天测量组内各鼠的肿瘤大小，取平均值做折线图。

实验结果显示：低剂量的5-Iodotubercidin(0.625mg/kg)可以控制肿瘤的增长速度，抑癌基因p53的缺失降低药物效果，但在高剂量注射5-Iodotubercidin（2.5mg/kg）可以明显杀死肿瘤细胞，同时抑癌基因p53缺失的细胞中，5-Iodotubercidin的效能降低，如图7。可知，5-Iodotubercidin通过激活抑癌基因p53 从而抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡。

本项研究发现，5-Iodotubercidin是一个强有力的遗传毒性（genotoxic）物质，在细胞中可引起DNA损伤，激活DNA损伤应激反应中起关键作用的ATM-Chk2-抑癌基因p53通路，引起依赖于抑癌基因p53的肿瘤细胞凋亡，以及细胞周期停滞于S期及G2/M期。5-Iodotubercidin具有体内抑制肿瘤生长的功能，可以开发为癌症化疗药物。

以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。

Claims

1.5-碘代杀菌核素在制备抗大肠癌药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物是大肠癌细胞生长的抑制剂。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物是大肠癌细胞凋亡的诱导剂。