CN102296066A - 靶向csnk2a2抗ev71、乙脑及流感病毒寡核苷酸的结构和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种反义寡核苷酸药物的结构和用途。具体说是发现靶向酪蛋白激酶2，α原肽，同时具有抗肠道病毒71型、乙型脑炎病毒及流感病毒的反义寡核苷酸的结构以及这些反义寡核苷酸在制备治疗EV71、乙脑病毒及流感病毒感染及其相关性疾病的药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种靶向酪蛋白激酶2，α原肽(CSNK2A2，casein kinase 2，alpha prime polypeptide)治疗EV71(肠道病毒71型)病毒(Human enterovirus 71)。感染的反义寡核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列、结构及其治疗药物。
背景技术
病毒性疾病感染危害严重，尤其是EV71病毒、脑炎病毒、流感病毒。EV71为目前肠病毒群中最晚发现的病毒，其感染性强且致病率高，尤其是神经系统方面的并发症。其它同属于肠病毒群之病毒尚包括小儿麻痹病毒(Polioviruses；具3种型别)、柯萨奇病毒(Coxsackieviruses；A型具23种型别、B型具6种型别)、伊科病毒(Echoviruses；具31种型别)及肠病毒(Enteroviruses 68～72型)。肠道病毒71型(英文名为：Human enterovirus 71)。简称EV71。1957年，新西兰首次爆发大规模疫情并报道。1958年，首次分离出柯萨奇病毒(Coxsackieviruses)。1959年，有了手足口病(hand-foot and mouth disease；HFMD)的命名。人类肠病毒71型于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的。人是肠道病毒唯一的传染来源，人群对肠道病毒EV71普遍易感，感染后可获得免疫力。由于不同病原型别感染后抗体缺乏交叉保护力，因此，人群可反复感染发病。而且，该病易于传播，容易发生流行，预防控制难度大。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利等国家相继暴发以中枢神经系统疾病为主要临床特征的EV71型手足口病流行，并导致较高的病死率和致残率。1997年以来，EV71感染为主的手足口病在马来西亚、中国台湾、新加坡等地大规模暴发流行。1998年中国台湾发生迄今最大的一次主要为EV71型手足口病流行，共报告129106例手足口病或疱疹性咽峡炎病例，其中重症患1405例，死亡78例。中国内地自1981年在上海始见本病，此后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北及广东等十几个省市均有EV71型手足口病的发生和流行。特别值得注意的是近年来本病流行有蔓延增多趋势。2008年3月10日至5月31日短短时间内安徽阜阳共报告手足口病7470例，共发现111例重症病例，其中死亡23例，病死率0.31％。目前肠病毒感染除了小儿麻痹病毒有疫苗外，其余肠病毒感染并无特殊治疗药物，故临床上对无并发症患者之治疗只能采取支持性疗法，而对有并发症的患者也只能对症治疗，采取一些降颅压、降温、辅助抗病毒等的治疗。目前为止抗EV71病毒的治疗药物只有利巴韦林等广谱抗病毒药物， 但抗病毒疗效一般。所以，有效的预防和控制EV71病毒的方法已成当务之急。因此研究特异性高、毒副作用小的新型抗EV71病毒的药物对治疗与预防手足口病具有重要的现实意义。
流行性乙型脑炎是亚洲一种最常见的经虫媒传播的人畜共患的病毒性脑炎，据统计，乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)每年至少造成至少50000例临床病例，其中多数为十岁以下儿童，导致约10000人死亡，有15000人左右留有神经精神性后遗症。但是目前还没有针对乙脑的特异性治疗方法，接种疫苗仍是唯一最重要的控制措施，目前临床尚无特效的治疗药物。
流感病毒感染可引起急性呼吸道传染病。该病潜伏期短，传染性强，传播迅速。甲型流感威胁最大，且易发生变异，易引起暴发流行。1918年至1920年，著名的″西班牙流感″在全球范围内造成了2000万-4000万人死亡。此后，1957甲型流感病毒(H2N2)所致的″亚洲流感″、1968由甲型流感病毒(H3N2)所致的″香港流感″、1977年由甲型流感病毒(H1N1)所致的″俄罗斯流感″、1997年以来出现的高致病性禽流感病毒(AIV，avian influenza virus)，以及2009年出现的甲型流感病毒感染，都严重威胁了人们的健康和正常生活。流感作为急性呼吸道传染病严重威胁着人们的健康，对于儿童、老年人、其它慢性病患者等高危人群尤其严重，而且也已成为社会劳动力损失、医疗负担加重乃至社会不安定的主要原因之一。由于流感病毒变异，常规疫苗不能有效预防流感的发生和流行。过去用于治疗流感的两种较低廉的抗病毒药物三环癸胺(amantadine)和金刚乙胺(remantadine)对人体内流感病毒几乎不起作用，且耐药较为普遍。新近上市的神经氨酸酶抑制剂(例如：达菲和帕纳米韦)虽效果较好，但随着临床广泛应用，耐药毒株分离的报道也相继出现。目前仍缺乏可靠的方法对流感的发生和流行进行有效的控制，有效的预防和控制流感病毒的方法已成当务之急。
根据以上分析，研究特异性高、毒副作用小的新型抗EV71病毒、乙脑病毒及流感病毒感染的药物对治疗与预防这些病毒感染及其相关性疾病具有重要现实意义。
病毒是一种严格的细胞内寄生物。病毒感染致病涉及病毒与机体两个复杂生物系统及其二者间的相互作用。一方面，宿主表现出对病毒感染的主动限制；另一方面，病毒会主动地通过对宿主细胞的生物大分子进行修饰，以使宿主细胞为它的复制、转录等提供必需的细胞机器。在短时间内不影响细胞存活且能为宿主细胞所能容忍的前提下，增强抗病毒信号或者阻断病毒复制所需的宿主细胞因子可以有效的抗病毒以及降低耐药毒株产生的频率。
经研究已经证实，酪蛋白激酶2，α原肽(CSNK2A2)是抗肿瘤药物的重要靶点之一。CSNK2A2表达过多可以促使凋亡的发生，抑制CSNK2A2的表达可以减少细胞的凋亡。目前，有报道发现CSNK2A2抑制剂有影响雄性生殖细胞的功能和抗白血病的作用，但还没有抗EV71病毒、乙脑病毒及流感病毒感染的报道。EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及流感病毒 感染都能够引起细胞病变凋亡，抑制CSNK2A2的表达可以减少细胞的凋亡，因此，设想研究出抑制CSNK2A2蛋白表达的核酸药物可能具有抗EV71病毒、乙脑病毒及流感病毒感染的作用，从而对EV71病毒、乙脑病毒及流感病毒等感染相关疾病的治疗起到良好的效果。
核酸药物是一类全新的基因靶向创新药物，长期以来一直是国际研究的热点，特别是近几年小核酸的发现进一步将核酸药物的研究推向一个前所未有的发展高潮。
反义寡核苷酸是一类经过人工合成的寡核苷酸片段，长度多为15～30个核苷酸。通过碱基互补的原理，干扰相关基因的转录和翻译，或者整个基因组的复制，其优点在于其理论上的高度靶特异性，是一种理想的具有精确选择性的基因靶向治疗药物。由于反义寡核苷酸作用的高度特异性，因此被认为是极具潜力的抗肿瘤和抗病毒新药。国外已有一些著名制药企业已将反义药物作为其新药研究开发的重点方向之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向CSNK2A2阻断EV71病毒、乙脑病毒及流感病毒复制、抑制这些病毒致病的寡核苷酸序列、结构及其药物。
本研究的内容是结合抗EV71的人的基因表达谱(表达谱编号GSE16358)和HPRD(人蛋白相互作用网络)，利用子网辨识的方法设计了一个含100多个节点的核心子网，然后选择拓扑上的重要节点筛选出基因CSNK2A2。利用网上服务器Soligo设计了5条针对CSNK2A2的反义寡核苷酸，从设计的这5条20个碱基长度的反义寡核苷酸序列中进行初步筛选。结果显示CSNK2A2-3抑制病毒所致细胞病变作用最佳。在RD细胞系中以CSNK2A2-3为代表进一步评价了抑制EV71病毒复制和致细胞病变的特性。而且，对CSNK2A2-3抑制乙脑病毒及流感病毒感染的作用评价结果显示CSNK2A2-3也能剂量依赖且序列特异性地抑制乙脑病毒及流感病毒的致细胞病变作用，提示CSNK2A2-3也可发展成为治疗乙脑病毒或流感病毒的新型药物。
表1 反义寡核苷酸的分子设计
根据本发明，针对CSNK2A2的反义寡核苷酸能特异性抑制EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及流感病毒的感染复制，有可能成为治疗及预防EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及流感病毒感染相关疾病的新型生物工程药物。
根据本发明，与人CSNK2A2基因的mRNA互补结合的寡核苷酸能有效的抑制EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及流感病毒并保护细胞使其免于EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及流感病毒所致细胞病变，是一种特异性高、毒副作用小的新型抗EV71病毒、登革病毒、乙脑病毒及流感病毒的潜在药物。
根据本发明，反义寡核苷酸的长度与其细胞通透性，与靶序列结合亲和性及作用特异性等因素相关，CSNK2A2-3的长度根据实验确定，本发明包含了与CSNK2A2-3具有60％及其以上连续相同序列的任何长度寡核苷酸。
根据本发明，为增强反义寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及组织靶向性等，本发明包含了CSNK2A2-3的硫代修饰。
根据本发明，反义寡核苷酸的长度与其细胞通透性，与靶序列结合亲和性及作用特异性等因素相关，CSNK2A2-3的长度根据实验确定，本发明包含了与CSNK2A2-3具有60％及其 以上连续相同序列的任何长度寡核苷酸。
根据本发明，为了进一步验证CSNK2A2-3的特异性效果，本发明包含了CSNK2A2-3序列的3’端及5’端的脂肪链修饰。
根据本发明，本发明的寡核苷酸可按本领域已知方法配成药物制剂。
根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适宜的剂量给药。
本发明的实施对严重危害人类健康的EV71病毒、乙脑病毒及流感病毒感染的治疗具有重要的社会效益和经济效益。
附图说明：
图1 CSNK2A2反义寡核苷酸序列抑制EV71病毒所致细胞病变
图2 CSNK2A2-3剂量依赖性的抑制EV71病毒致细胞病变作用
图3 利巴韦林剂量依赖性的抑制EV71病毒引起的细胞病变
图4 CSNK2A2-3剂量依赖性的抑制EV71病毒对细胞的毒性作用
图5 CSNK2A2-3反义寡核苷酸序列抑制EV71病毒的特异性验证
图6 脂肪链修饰后的CSNK2A2-3剂量依赖地抑制EV71病毒引起细胞病变
图7 不同碱基长度的CSNK2A2-3抑制EV71病毒所致的细胞病变
图8 CSNK2A2-3剂量依赖性地抑制EV71病毒的RNA
图9 CSNK2A2-3、CSNK2A2-3-16C、CSNK2A2-3-18A、CSNK2A2-3-18B、CSNK2A2-3-18C剂量依赖性地抑制EV71病毒的致细胞病变作用
图10 CSNK2A2-3剂量依赖性地抑制乙脑病毒的致细胞病变作用
图11 CSNK2A2-3对BHK21细胞的毒性作用
图12 CSNK2A2-3剂量依赖性地抑制流感病毒的致细胞病变作用
图13 CSNK2A2-3对A549细胞的毒性作用
具体实施方式
实施例一：
本实施例主要说明靶向人CSNK2A2基因抗EV71病毒反义寡核苷酸的设计、合成和筛选。
材料与方法
1.反义寡核苷酸CSNK2A2-3的设计和合成
结合抗EV71的人的基因表达谱(表达谱编号GSE16358)和HPRD(人蛋白相互作用网络)，利用子网辨识的方法设计了一个含100多个节点的核心子网，然后选择拓扑上的重要节点筛选出基因CSNK2A2。所有寡核苷酸均采用8909型自动DNA合成仪合成全硫代修饰的反义寡核苷酸。合成完毕浓氨水55℃切割并脱保护15小时后，经Micro PureⅡ反相纯化柱(Oligo Prep OP120，SAVANT)纯化，紫外定量后真空干燥，-20℃保存备用。
2.RD细胞、病毒和对照药物
病毒通过感染RD细胞进行扩增繁殖，然后混匀、分装并储存在-70℃备用。使用的病毒株为国际株EV71。RD细胞培养液为含10％胎牛血清的DMEM(GIBCO)培养液。病毒感染和细胞病变测定时使用含2％胎牛血清的维持液。阳性对照药物为利巴韦林注射液。
3.反义寡核苷酸的筛选
RD细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO)中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，以8000～10000个细胞/孔将细胞接种至96孔细胞培养板中，次日75～80％长满。用DMEM稀释CSNK2A2-1～5至μM。将长满75～80％RD细胞的含10％胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO)的96孔板换成含2％胎牛血清的维持液备用。分别把CSNK2A2-1～5五条反义寡核苷酸序列以4μM的浓度加入96孔板内，每个序列设三个副孔，并设立病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒稀释液3.3μl，37℃培养2d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，并以如下公式计算药物的病毒抑制率：[(OD试验-OD病毒)/(OD细胞-OD病毒)]×100。重复试验二次，计算平均值以筛选出最佳的反义寡核苷酸以进一步评价。
4.CSNK2A2-3抑制EV71病毒致细胞病变剂量依赖作用
参照实施例一将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75～80％长满。将长满75～80％的RD细胞换成含2％胎牛血清的维持液备用。把CSNK2A2-3分别设立0.125、0.25、0.5、1.0、2.0μM五个浓度梯度，每个序列浓度设三个副孔，并设立病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒稀释液3.3μl，37℃培养2d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。
5.利巴韦林抑制EV71病毒致细胞病变剂量依赖作用
参照实施例一将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75～80％长满。把利巴韦林注射液分别设立20、40、100、200、400μM五个浓度梯度，每个浓度设三个副孔，并设立病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒稀释液3.3μl，37℃培养2d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。
6.CSNK2A2-3对细胞的药物毒性作用
将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75～80％长满。将长满75～80％的RD细胞换成含2％胎牛血清的维持液备用。把CSNK2A2-3分别设立1、2.5、5、10、20μM五个浓度梯度，每个浓度设立三个副孔，并设立RD细胞阴性对照组，37℃培养2d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，观察CSNK2A2-3对细胞的影响。
结果
1.用4μM的浓度对CSNK2A2-1～5进行初步抗EV71的致细胞病变作用筛选，结果如图1所示，CSNK2A2-3序列的抗EV71的致细胞病变作用比较明显，抑制率达到98.52％±3.2％。
2.如图3所示，CSNK2A2-3抑制EV71病毒致细胞病变剂量依赖作用筛选显示其可剂量依赖性的抑制EV71病毒的致细胞病变作用，并计算了其IC50为0.102μM。
3.把CSNK2A2-3分别设立1、2.5、5、10、20μM五个浓度梯度进行药物毒性试验，浓度达到20μM时CSNK2A2-3对细胞没有明显的毒性影响，如图2所示。
4.比较利巴韦林与CSNK2A2-3抑制EV71病毒致细胞病变剂量依赖作用，发现CSNK2A2-3抑制EV71病毒致细胞病变剂量依赖作用明显比利巴韦林效果好，利巴韦林在4000μM时抑制率才达到42.93％，而CSNK2A2-3在4μM时抑制率就超过90％，如图4所示。
结论
CSNK2A2可以作为抗EV71病毒宿主靶标，靶向CSNK2A2的反义寡核苷酸药物具有体外抗EV71病毒引起的细胞病变和抑制EV71病毒的复制作用。
实施例二：
本实施例主要说明经过设计CSNK2A2-3的正义和随机验证CSNK2A2-3的抗EV71病毒的特异性。
1.CSNK2A2-3正义链和随机链的设计与合成
正义链直接经过与CSNK2A2-3的反义寡核苷酸反义序列的碱基互补得出，其随机链是利用DNA随机蛋白等的设计软件SMS2(The Sequence Manipulation Suite 2)设计出来的，并通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达。
2.CSNK2A2-3抗EV71病毒的特异性验证
参照实施例一将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75～80％长满。将长满75～80％RD细胞的含10％胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO)的96孔板换成含2％胎牛血清的维持液备用。把CSNK2A2-3、CSNK2A2-3S(正义)、CSNK2A2-3R(随机)分别设立0.125、0.25、0.5、1.0、2.0μM五个浓度梯度，每个序列浓度设三个副孔，并设立病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒稀释液3.3μl，37℃培养2d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。
结果
细胞实验验证结果显示(图5)：CSNK2A2-3可剂量依赖性地抑制EV71的致细胞病变作用，而作为对照的CSNK2A2-3S和CSNK2A2-3R对EV71的致细胞病变作用无显著影响。体外具有很好的抗EV71病毒的功效，并且特异性很强。
结论
CSNK2A2-3能够序列特异性地抑制EV71的致细胞病变作用。
实施例三
本实施例主要说明CSNK2A2-3可以剂量依赖性地抑制EV71病毒的RNA
材料和方法
CSNK2A2-3抑制EV71病毒RNA的剂量依赖性作用
将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75～80％长满。将长满75～80％的RD细胞换成含2％胎牛血清的维持液，并加入不同浓度的CSNK2A2-3。CSNK2A2-3分别设立0.25、0.5、1.0、2.0μM四个浓度梯度，每个序列浓度设三个副孔，并设立病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒稀释液3.3μl，37℃培养2d。2d后收集培养液上清，利用病毒RNA提取试剂盒(TIANGEN产品)提取病毒RNA，进行荧光定量PCR检测。
结果
CSNK2A2-3剂量依赖性的抑制EV71致细胞病变作用，利用荧光定量PCR检测病毒RNA结果如图6所示，CSNK2A2-3在0.5、1.0、2.0μM三个浓度时抑制率分别达到了97.35％、97.86％、98.52％。
结论
CSNK2A2-3可以剂量依赖性的抑制EV71病毒RNA的表达。
实施例四
本实施例主要说明经过脂肪链修饰的CSNK2A2-3在体外RD细胞水平抑制EV71致细胞病变活性的研究。
材料与方法
脂肪链修饰后的CSNK2A2-3抑制EV71病毒复制的剂量依赖作用
参照实施例一将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75～80％长满。将长满75～80％的RD细胞换成含2％胎牛血清的维持液备用。把CSNK2A2-3与CSNK2A2-3-ZF(脂肪链修饰)分别设立0.25、0.5、1.0、2.0μM四个浓度梯度，每个序列浓度设三个副孔，并设立病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒稀释液3.3μl，37℃培养2d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。
结果
CSNK2A2-3-ZF抑制EV71病毒致细胞病变检测结果如图7所示，CSNK2A2-3-ZF能够抑制EV71病毒的致细胞病变作用，在1μM时对EV71病毒的致细胞病变作用抑制率为55.33％。
结论
脂肪链修饰后的CSNK2A2-3可在一定程度上抑制EV71病毒的致细胞病变作用。
实施例五
本实施例主要说明不同长度反义寡核苷酸CSNK2A2-3抗EV71病毒效果。
1.不同长度的CSNK2A2-3序列对EV71病毒致细胞病变的抑制作用检测
参考人CSNK2A2基因的mRNA序列，将CSNK2A2-3序列进行两端增加或减少碱基，使序列为22、18、16、14个碱基。通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列 均具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达。参照实施例一进行寡核苷酸合成、硫代修饰、纯化、干燥和存储。
参照实施例一将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75～80％长满。将长满75～80％的RD细胞换成含2％胎牛血清的维持液备用。把每条序列以2uM进行筛选，每个序列浓度设三个副孔，并设立CSNK2A2-3原序列对照组、病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒稀释液3.3μl，37℃培养2d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。
2.CSNK2A2-3-16C、CSNK2A2-3-18A、CSNK2A2-3-18B、CSNK2A2-3-18C对EV71病毒致细胞病变作用的剂量依赖关系检测
参照实施例一将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75～80％长满。将长满75～80％的RD细胞换成含2％胎牛血清的维持液备用。将1中筛选出的较好的序列CSNK2A2-3-16C、CSNK2A2-3-18A、CSNK2A2-3-18B、CSNK2A2-3-18C分别设立0.25、0.5、1.0、2.0μM四个浓度梯度，每个序列浓度设三个副孔，并设立CSNK2A2-3原序列对照组、病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒稀释液3.3μl，37℃培养2d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。
结果
1.不同长度的CSNK2A2-3序列对EV71病毒致细胞病变的抑制作用检测
CSNK2A2-3不同长度的序列抑制EV71病毒致细胞病变检测结果得出，如图8所示，以2uM进行筛选时，CSNK2A2-3-16C、CSNK2A2-3-18A、CSNK2A2-3-18B、CSNK2A2-3-18C四条序列抑制EV71病毒致细胞病变效果较CSNK2A2-3原序列效果好，进一步进行浓度梯度筛选，筛选出一条抑制EV71病毒致细胞病变效果最好的序列。
3.CSNK2A2-3-16C、CSNK2A2-3-18A、CSNK2A2-3-18B、CSNK2A2-3-18C对EV71病毒致细胞病变作用的剂量依赖关系检测
将CSNK2A2-3-16C、CSNK2A2-3-18A、CSNK2A2-3-18B、CSNK2A2-3-18C分别设立0.25、0.5、1.0、2.0μM四个浓度梯度进行剂量依赖性筛选，如图9所示，抑制EV71病毒致细胞病变效果总体比较CSNK2A2-3原序列效果最好。
结论
CSNK2A2-3抑制EV71病毒的致细胞病变作用效果最好。
实施例六
本实施例主要说明反义寡核苷酸CSNK2A2-3在体外BHK21细胞水平抗乙脑病毒(Japanase Encephalitis b virus)的效果以及CSNK2A2-3对BHK21细胞的药物毒性作用
1.CSNK2A2-3抑制乙脑病毒致细胞病变剂量依赖作用
将BHK21细胞铺板96孔细胞培养板，次日等细胞长至80％-90％。将长满80％-90％的BHK21细胞换成含2％胎牛血清的维持液，并加入不同浓度的CSNK2A2-3。CSNK2A2-3设立0.125、0.25、0.5、1.0、2.0μM五个浓度梯度，每个序列浓度设三个副孔，并设立病毒阳性对照组和BHK细胞阴性对照组、CSNK2A2-3正义序列(CSNK2A2-3S)2.0μM对照，CSNK2A2-3随机序列(CSNK2A2-3R)2.0μM对照。。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的乙脑的病毒2μl，37℃培养3.5d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。
2.CSNK2A2-3对BHK21细胞的药物毒性作用
将BHK21细胞铺96孔细胞培养板，次日80～90％长满。将长满80～90％的BHK21细胞换成含2％胎牛血清的维持液备用。把CSNK2A2-3分别设立1、2.5、5、10、20μM五个浓度梯度，每个浓度设立三个副孔，并设立BHK21细胞阴性对照组，37℃培养3d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，观察CSNK2A2-3对细胞的影响。
结果
1.CSNK2A2-3剂量依赖性地抑制乙脑病毒致细胞病变作用。CSNK2A2-3在BHK细胞中对脑炎病毒致细胞病变的抑制作用检测结果如图10所示，CSNK2A2-3可剂量依赖性地抑制脑炎病毒致BHK细胞病变的作用，在2μM时对乙脑病毒致细胞病变作用的抑制率为82.28％。
2.把CSNK2A2-3分别设立1、2.5、5、10、20μM五个浓度梯度进行药物毒性试验，浓度达到20μM时CSNK2A2-3对细胞没有明显的毒性影响，如图11所示。
结论
CSNK2A2-3可抑制乙脑病毒的致细胞病变作用，而且对BHK21细胞没有明显的毒性作用。
实施例七
本实施例主要说明CSNK2A2-3剂量依赖性地抑制流感病毒的致细胞病变作用以及其对A549细胞的药物毒性作用
材料与方法
1.CSNK2A2-3抑制流感病毒致细胞病变剂量依赖作用
参照实施例一将A549细胞铺板96孔细胞培养板，次日70～80％长满。将长满70～80％的A549细胞换成含0.25％胎牛血清的维持液备用。把CSNK2A2-3设立0.125、0.25、0.5、1.0、2.0μM五个浓度梯度，每个序列浓度设三个副孔，并设立病毒阳性对照组和A549细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0.1ml的EV71的病毒液1μl，37℃培养2d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。
2.CSNK2A2-3对A549细胞的药物毒性作用
将A549细胞铺96孔细胞培养板，次日70～80％长满。将长满70～80％的A549细胞换成含0.25％胎牛血清的维持液备用。把CSNK2A2-3分别设立1、2.5、5、10、20μM五个浓度梯度，每个浓度设立三个副孔，并设立A549细胞阴性对照组，37℃培养2d。利用Cell Counting Kit-8(DoJinDo产品)方法在酶标仪(BIO-RAD产品，型号：Model 680)上测定细胞病变程度(以OD450表示)，观察CSNK2A2-3对细胞的影响。
结果
1.CSNK2A2-3剂量依赖性地抑制流感病毒致细胞病变作用。CSNK2A2-3在A549细胞中对流感病毒致细胞病变的抑制作用检测结果，如图12所示，CSNK2A2-3可剂量依赖性地抑制流感病毒致A549细胞病变的作用，在1μM时对流感病毒致细胞病变作用的抑制率为％。
2.把CSNK2A2-3分别设立1、2.5、5、10、20μM五个浓度梯度进行药物毒性试验，浓度达到20μM时CSNK2A2-3对细胞没有明显的毒性影响，如图13所示。
结论
CSNK2A2-3可抑制流感病毒的致细胞病变作用，而且对A549细胞没有明显的毒性作用。
Claims (8)
1.与CSNK2A2 mRNA互补的寡核苷酸，分布在5’非编码区、编码区和3’非编码区，其长度是10-30个碱基。
2.根据权利要求1所述寡核苷酸，其特征是所述的反义寡核苷酸序列结构选自下列之一：
1)ACTCTCTCATTGTTGGTGAT
2)TTCCACCACGAAGGTTCTCC
3)GTGTCTTTGACACGGGGTCC
4)GTGGATCTAGGTCTATGTGA
5)TCGGAAGTGAGGTTTGATAT
6)AAGGACCCCGTGTCAAAGACAC
7)AGGACCCCGTGTCAAAGACACC
8)GTCTTTGACACGGGGTCC
9)GTGTCTTTGACACGGGGT
10)TGTCTTTGACACGGGGTC
11)GTGTCTTTGACACGGG
12)CTTTGACACGGGGTCC
13)GTCTTTGACACGGGGT
14)TGTCTTTGACACGGGG
15)TCTTTGACACGGGGTC
16)GTGTCTTTGACACG
17)TTGACACGGGGTCC
18)TCTTTGACACGGGG
19)GTCTTTGACACGGG
20)CTTTGACACGGGGT
21)TGTCTTTGACACGG
22)TTTGACACGGGGTC
3.根据权利要求2所述的寡核苷酸，其特征是所述的反义寡核苷酸序列结构选自下列之一：
1)GTGTCTTTGACACGGGGTCC
2)GTCTTTGACACGGGGTCC
3)GTGTCTTTGACACGGGGT
4)TGTCTTTGACACGGGGTC
5)GTCTTTGACACGGGGT
4.根据权利要求2所述的寡核苷酸，其特征是所述的反义寡核苷酸序列结构如下：
GTGTCTTTGACACGGGGTCC。
5.根据权利要3所述的寡核苷酸，其特征为所述的反义寡核苷酸包含了与
GTGTCTTTGACACGGGGTCC具有60％及其以上连续相同序列的任何长度寡核苷酸。
6.根据权利要求1-5所述寡核苷酸，其特征是该反义寡核苷酸经过不同化学修饰。
7.根据权利要求6所述寡核苷酸，其化学修饰为硫代修饰、脂肪链修饰。
8.权利要求1-7中所述的任一寡核苷酸或其组合在制备治疗和预防EV71病毒、乙脑病毒及流感病毒感染及其相关性疾病的药物中的应用。
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