CN102286446B - 一种用于玉米芯废渣转化制备单糖的复合酶 - Google Patents

一种用于玉米芯废渣转化制备单糖的复合酶 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于玉米芯废渣转化制备单糖的复合酶，其包含：纤维素酶10～48FPU/g底物，果胶酶0～17.2IU/g底物，表面活性剂0～1％(v/v)。本发明利用不同来源纤维素酶的复配及其与表面活性剂的协同作用，降低了生产中的用酶成本，大大提高了玉米芯废渣的糖化率，高达74.8％。

Description

一种用于玉米芯废渣转化制备单糖的复合酶
技术领域
本发明涉及一种用于玉米芯废渣转化制备单糖的复合酶，属于生物工程中的木质纤维原料酶解技术领域。
背景技术
纤维素和半纤维素可以水解生成葡萄糖和木糖，被称为糖平台化合物，是生物化工的基础原料。农业废弃物如玉米秸秆，玉米芯和甘蔗渣等生物质原料通过纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶等生物酶酶解，能够得到一系列的单糖和低聚糖等高附加值的产品。
木质纤维素原料是自然界最丰富的生物质原料，主要由纤维素，半纤维素和木质素构成，分别占干重的45％，30％和25％左右。其中，纤维素是由数千至上万个β-D-(+)葡萄糖单元通过β-1，4糖苷键结合而成的线形葡聚糖链，具有紧密的周期性晶格分子束结构，分子大小为6000-12000个残基。半纤维素是木质纤维素中非纤维素的碳水化合物，是一种具有高度分支结构的不均一多聚糖，主要为木糖基，尤其在农林废弃木质纤维资源中的含量十分丰富。
近年来对于生物质材料的利用成为研究热点，目前利用的途径主要有通过稀酸法或水解把半纤维素制备成木糖或者低聚木糖，如CN01131171，低聚木糖的制备，它是采用碱溶液，酸溶液和木聚糖酶联合处理的方式生产低聚木糖；如CN96105693，由玉米芯提取木糖的工艺的改进工艺，它是采用稀酸法提取木糖。上述方法都是对生物质原料的单一利用，浪费了资源。此外，利用生物质材料的途径还包括通过稀酸水解法或酶水解法将纤维素水解成葡萄糖，如CN1629321，利用秸秆植物提取制乙醇用葡萄糖和/或木糖的方法；CN200910090506，一种将玉米芯废渣或糖醛渣高效糖化的方法；CN 200810023479，蒸汽爆破木质纤维素可溶性低聚糖同步酶解制取单糖的方法，等等。这些方法虽然能够达到较高的糖化率，但是通过蒸汽爆破和纤维素酶多种处理方式，耗能较大，生产成本较高。CN200610131965，利用玉米芯加工残渣发酵生产纤维素酒精的方法，它是利用玉米芯废渣为原料，纤维素酶的生产和酒精的发酵同时进行的方法提高玉米芯废渣的利用率，但是纤维素酶的发酵具有不确定性，发酵的纤维素酶酶活偏低。
本发明是以降低生产成本，扩大生物质利用范围为目的，以工业副产物玉米芯废渣为原材料，通过几种纤维素酶之间的对比及复配，纤维素酶与表面活性剂之间的协同复配等方法，得到一种用于玉米芯废渣转化制备单糖的复合酶，可显著降低酶的配方成本，大大提高玉米芯废渣的糖化率，提高玉米芯的价值。
三.发明内容
本发明的目的是针对酸化处理过的玉米芯废渣的糖类组成特点，根据不同来源的纤维素酶酶系以及表面活性剂的协同作用机理，提供一种用于玉米芯废渣转化制备单糖的复合酶，扩大生物质利用范围。
本发明提供了一种用于玉米芯废渣转化制备单糖的复合酶，该复合酶由纤维素酶与果胶酶和/或表面活性剂组成。
在本发明的一个实施方案中，所述复合酶由纤维素酶与果胶酶组成。
在本发明的一个实施方案中，所述复合酶由纤维素酶与表面活性剂组成。
在本发明的一个实施方案中，所述复合酶由纤维素酶、果胶酶与表面活性剂组成。
在本发明的一个实施方案中，所述表面活性剂为BASF F-OLB。
本发明中，上述各组分含量为：纤维素酶：10～48FPU/g底物；果胶酶：0～17.2IU/g底物；表面活性剂0～1％(v/v)。
在本发明的一个优选实施方案中，所述复合酶包括：纤维素酶48FPU/g底物和果胶酶17.2IU/g底物。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述复合酶包括：纤维素酶24FPU/g底物和1％(v/v)的表面活性剂。
在在本发明的最优选实施方案中，所述复合酶包括：纤维素酶24FPU/g底物，果胶酶17.2IU/g底物和1％(v/v)的表面活性剂。
在本发明的具体实施方案中，所述纤维素酶为上海康地恩生物科技有限公司产品新纤L-10，所述果胶酶为青岛康地恩生物科技有限公司产品KDN果胶酶F01。
另一方面，本发明还提供了一种用玉米芯废渣转化制备单糖的方法，该方法包括下列骤：
(a)干燥玉米芯废渣，得到绝干玉米芯废渣；
(b)绝干玉米芯废渣的粉碎和筛分；
(c)用权利要求1所述复合酶酶促消化经过粉碎筛分的玉米芯废渣。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(a)干燥玉米芯废渣的具体操作为：将玉米芯废渣置于玻璃培养皿中，放置105℃烘箱中烘干至恒重，得到绝干玉米芯废渣。
在本发明的一个实施方案中，其中所述步骤(b)绝干玉米芯废渣的粉碎和筛分的具体操作为：用高速粉碎机粉碎1.1中得到的绝干玉米芯废渣，然后用25目筛子筛分，保证原料的均一性。
在本发明的一个实施方案中，其中所述步骤(c)用权利要求1所述复合酶酶促消化经过粉碎筛分的玉米芯废渣的具体操作为：将经粉碎筛分的绝干玉米芯废渣置于三角瓶中，按固液比1∶15(m/v)加入pH 4.8的磷酸-柠檬酸缓冲液摇匀，然后加入权利要求1所述复合酶，震荡反应。其中复合酶中各组分用量为：纤维素酶10～48FPU/g绝干底物，果胶酶0～17.2IU/g绝干底物，表面活性剂0～1％(v/v)。
在本发明的一个优选实施方案中，复合酶中各组分用量为：纤维素酶48FPU/g底物和果胶酶17.2IU/g底物。
在本发明的另一个优选实施方案中，复合酶中各组分用量为：纤维素酶24FPU/g底物和1％(v/v)的表面活性剂。
在在本发明的最优选实施方案中，复合酶中各组分用量为：纤维素酶24FPU/g底物，果胶酶17.2IU/g底物和1％(v/v)的表面活性剂。
另一方面，本发明还提供了本发明所述复合酶在酶解非粮生物质制备单糖中的用途。
在本发明中，所述非粮生物质选自秸秆生物质、玉米芯和甘蔗渣等。
本发明的优点：
本发明利用不同来源纤维素酶的复配及其与表面活性剂的协同作用，降低了生产中的用酶成本，大大提高了玉米芯废渣的糖化率，高达74.8％。
除另有说明外，本申请中的所有科技术语的都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本申请中描述类似或等同的方法及材料都可用于实施或检验本发明，但是下文仍还是对合适的方法和材料进行了描述。本申请中引用的全部出版物、专利申请、专利及其他参考文献其全部内容在此引入作为参考。如有抵触，包括定义，以本申请为准。
下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而决不构成对本发明的限制。本领域技术人员应该理解的是，在不违背本发明的精神和原则的前提下，对本发明进行改动得到的技术方案都将落入本发明的权利要求范围内。
实施例
材料和方法
本发明实施例中使用的玉米芯废渣购自山东龙力生物科技有限公司。
本发明实施例中使用的纤维素酶为上海康地恩生物科技有限公司产品：新纤L-10。
本发明实施例中使用的果胶酶为青岛康地恩生物科技有限公司产品：KDN果胶酶F01。
本发明实施例中使用的表面活性剂BASF F-OLB购自巴斯福股份公司。
本发明实施例中使用的纤维素酶滤纸酶活的测定方法采用轻工业部的测定方法(QB2583-2005)。
本发明实施例中使用的糖化率计算公式为：
糖化率(％)＝酶解后得到的葡萄糖的含量(mg/g木质纤维原料)÷总的葡萄糖含量(mg/g木质纤维原料)×100％
实施例1玉米芯废渣的处理及葡萄糖总量的测定
1.1玉米芯废渣的干燥
称取10克的玉米芯废渣于已经平衡称重的玻璃培养皿中，放置105℃烘箱中烘干至恒重，得到绝干玉米芯废渣。
1.2绝干玉米芯废渣的粉碎筛分
使用高速粉碎机粉碎1.1中得到的绝干玉米芯废渣，然后用25目筛子筛分，保证原料的均一性。
1.3两步酸法测定玉米芯废渣的葡萄糖总量
称取1.2中经过粉碎筛分的绝干玉米芯废渣300mg±0.1mg置于已经称重的密封管中，做好标记；加入3ml±0.01ml的72％浓硫酸，用聚氟四烯棒旋转混匀1min；密封管放置30℃水浴锅中1h，中间搅拌5-10min；加入84±0.04ml的无菌水稀释至4％稀酸，混匀，把管放入安全容器架上，121℃，高压蒸汽水解1h，取出，自然冷却。从酸化液中取出20ml到50ml的烧瓶中，用碳酸钙中和样品，使pH达到5.0-6.0，避免超过6.0，用生物传感仪测定葡萄糖总量，结果为638mg/g绝干底物。
实施例2纤维素酶的酶活对糖化率的影响
称取三份实施例1中经过粉碎筛分的绝干玉米芯废渣，各2克，分别置于150ml三角瓶中，按照固液比1∶15(m/v)各加入pH 4.8的磷酸-柠檬酸缓冲液30ml，摇匀，分别加入10FPU/g绝干底物，24FPU/g绝干底物，48FPU/g绝干底物的纤维素酶，120rpm震荡反应48h，5000rpm离心10min分离除去不溶物，取上清液，用生物质传感仪测定葡萄糖含量，计算糖化率，分别为22％，25％，46％。
结果表明纤维素酶酶活为48FPU/g绝干底物时，玉米芯废渣的糖化率最高。
实施例3表面活性剂与纤维素酶协同作用对玉米芯废渣糖化率的影响
称取三份实施例1中经过粉碎筛分的绝干玉米芯废渣，各2克，分别置于150ml三角瓶中，按照固液比1∶15(m/v)各加入pH 4.8的磷酸-柠檬酸缓冲液30ml，摇匀，然后各加入24FPU/g绝干底物纤维素酶，摇匀，分别加入0％(v/v)，0.5％(v/v)和1％(v/v)的表面活性剂BASF F-OLB(购自巴斯福股份公司)，120rpm震荡反应48h，5000rpm离心10min分离除去不溶物，取上清液，用生物质传感仪测定葡萄糖含量，糖化率分别为25％，42％，45％。
结果表明：表面活性剂BASF F-OLB对纤维素酶有较明显的促进作用。
实施例4果胶酶与纤维素酶协同作用对玉米芯废渣糖化率的影响
称取三份实施例1中经过粉碎筛分的绝干玉米芯废渣，各2克，分别置于150ml三角瓶中，按照固液比1∶15(m/v)各加入pH 4.8的磷酸-柠檬酸缓冲液30ml，摇匀，其中第一个三角瓶中只加入48FPU/g绝干底物纤维素酶，第二个三角瓶中只加入17.2IU/g绝干底物果胶酶，第三个三角瓶中加入48FPU/g绝干底物纤维素酶和17.2IU/g绝干底物果胶酶，120rpm震荡反应48h，5000rpm离心10min分离除去不溶物，取上清液，用生物质传感仪测定葡萄糖含量，糖化率分别为46％，2.6％，53％。
结果表明：果胶酶与纤维素酶之间有明显的协同作用，酶促效果优于等量纤维素酶或果胶酶单独使用的效果。
实施例5果胶酶、表面活性剂与纤维素酶协同作用对玉米芯废渣糖化率的影响
称取三份实施例1中经过粉碎筛分的绝干玉米芯废渣，各2克，分别置于150ml三角瓶中，按照固液比1∶15(m/v)各加入pH 4.8的磷酸-柠檬酸缓冲液30ml，摇匀，其中第一个三角瓶中只加入48FPU/g绝干底物纤维素酶，第二个三角瓶中加入24FPU/g绝干底物纤维素酶和1％(v/v)的表面活性剂BASF F-OLB，第三个三角瓶中加入24FPU/g绝干底物纤维素酶，17.2IU/g绝干底物果胶酶和1％(v/v)的表面活性剂BASF F-OLB，120rpm震荡反应48h，5000rpm离心10min分离除去不溶物，取上清液，用生物质传感仪测定葡萄糖含量，糖化率分别为46％，45％，74.8％。
结果表明：果胶酶、表面活性剂与纤维素酶协同作用比2倍酶活的纤维素酶的酶解效果还要好，能大大提高玉米芯废渣糖化率，降低了用酶成本。

Claims (1)

1.一种用于玉米芯废渣转化制备单糖的复合酶， 其由纤维素酶添加表面活性剂BASF F-OLB或者添加果胶酶和表面活性剂BASF F-OLB组合组成。
2. 如权利要求1所述复合酶，其中各组分及用量为：纤维素酶 10～48 FPU/g底物，果胶酶 0～17.2 IU/g底物，表面活性剂的体积百分比为0.5～1%。
3. 如权利要求2所述复合酶，其中各组分及用量为：纤维素酶24 FPU/g底物，果胶酶17.2 IU/g底物，表面活性剂的体积百分比为1%。
4. 一种用玉米芯废渣转化制备单糖的方法，该方法包括下列步骤：
（a）干燥玉米芯废渣，得到绝干玉米芯废渣；
（b）绝干玉米芯废渣的粉碎和筛分；
（c）用权利要求1至3中任一项所述复合酶酶促消化经过粉碎筛分的玉米芯废渣。
5. 如权利要求4所述方法，其中所述步骤（a）干燥玉米芯废渣的具体操作为：将玉米芯废渣置于玻璃培养皿中，放置105℃烘箱中烘干至恒重，得到绝干玉米芯废渣；其中所述步骤（b）绝干玉米芯废渣的粉碎和筛分的具体操作为：用高速粉碎机粉碎步骤（a）中得到的绝干玉米芯废渣，然后用25目筛子筛分，保证原料的均一性；其中所述步骤（c）用所述复合酶酶促消化经过粉碎筛分的玉米芯废渣的具体操作为：将经粉碎筛分的绝干玉米芯废渣置于三角瓶中，按固液比1:15（m/v）加入pH 4.8的磷酸-柠檬酸缓冲液摇匀，然后加入所述复合酶，震荡反应。
6. 权利要求4或5所述方法，其中所述复合酶中的各组分及用量为：纤维素酶 10～48 FPU/g绝干底物，果胶酶0～17.2 IU/g绝干底物，表面活性剂的体积百分比为0.5～1%。
7. 权利要求1至3中任一项所述复合酶在酶解非粮生物质制备单糖中的用途。
8. 如权利要求7所述的用途，其中所述非粮生物质选自秸秆生物质、玉米芯和甘蔗渣。
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