CN102277659B - 一种水稳定性γ-聚谷氨酸纳米纤维的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种水稳定性γ-聚谷氨酸纳米纤维的制备方法，包括：(1)配制质量百分比浓度为5～10％的三氟乙酸水溶液，将γ-聚谷氨酸溶解于三氟乙酸溶液中并搅拌6～8h，即得γ-聚谷氨酸溶液；(2)利用静电纺丝对上述γ-聚谷氨酸溶液进行纺丝，即得γ-聚谷氨酸纳米纤维；(3)将上述γ-聚谷氨酸纳米纤维和EDC溶于甲醇中，室温下反应3～5h；反应完毕后，加入胱胺二盐酸盐并反应48～72h；反应结束后漂洗，冷冻干燥，即得具有良好水稳定性的γ-聚谷氨酸纳米纤维。本发明过程操作简便，工艺条件温和，原材料易得，制备的γ-聚谷氨酸纳米纤维生物相容性好，在组织工程支架领域具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于γ-聚谷氨酸纳米纤维的制备领域，特别涉及一种水稳定性γ-聚谷氨酸纳米纤维的制备方法。
背景技术
静电纺(electrostatic spinning)是指利用静电场力使带电聚合物溶液或熔体在静电场中射流并牵伸，形成微纳米尺寸纤维的新型纺丝方法。静电纺丝技术具有一系列的优点：首先，用静电纺丝技术制得的纤维直径范围一般在纳米到微米之间，远小于用常规方法制得的纤维直径，且所得纤维具有孔隙率高、比表面积大、纤维精细程度与均一度高等优点。这些用传统纺丝方法所无法获得的优良特性，赋予了静电纺纤维广泛的应用前景。其次，静电纺丝过程简单、快速、高效，设备易于操作，可用于制备复杂、免缝合支架，而且易于控制纤维的化学组分和物理性能。
γ-PGA(γ-聚谷氨酸)是由微生物合成的一种细胞外天然高分子聚合物材料，它是由L-谷氨酸的α-氨基(α-amino)和γ-羧基(γ-carboxyl)之间通过脱水缩合作用所构成的同聚酰胺，分子量通常在100kDa到1000kDa之间。在适宜条件下，γ-PGA可以被生物体内广泛存在的γ-谷氨酰转肽酶催化降解，产物为无害的谷氨酸。Prodhomme等人试验分析了γ-PGA的潜在毒性，结果表明：给试验鼠静脉注射1mg的γ-PGA，实验鼠未出现毒性反应，并证明γ-PGA具有良好的生物可降解性，可以作为一种安全的生物医用材料。此外，在γ-PGA分子链中存在大量游离的活性α-羧基，使得γ-PGA在中性pH条件下表面带负电荷，因而具有优良的水溶性和较强的吸附性。γ-PGA具有的这些优良特性赋予自身及其相关衍生物在环保、食品、医药、化妆品等诸多相关领域广泛的应用前景。
原则上，只要可以在特定溶剂中溶解的高分子均可通过静电纺丝技术制备出纤维。但截止目前为止，关于静电纺制备γ-PGA纳米纤维方面的相关文献较少。Ko等人将γ-PGA(分子量为800kDa)与聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)通过不同比例混合(溶剂为三氟乙酸)，选取布洛芬(Ibu)为抗炎药物，制备了γ-PGA、γ-PGA/PLGA、PLGA、γ-PGA-Ibu、γ-PGA/PLGA-Ibu、PLGA-Ibu等一系列纳米纤维膜，并用六亚甲二异氰酸酯溶液对上述纳米纤维膜进行交联，提高纤维的水稳定性。动物试验结果表明γ-PGA-Ibu能有效的促进术后创口愈合，且防止术后组织的粘连，降低创口的感染。Yoshida等人报道了用TFA作为纺丝液的溶剂，成功制备了静电纺γ-PGA纳米纤维，并通过胱胺二盐酸盐对制备的γ-PGA纳米纤维进行交联，得到了在生理条件下可以稳定存在的γ-PGA-SS纳米纤维无纺布，但此报道中使用的溶剂为纯TFA，具有强烈的刺激性，操作不当容易对操作者及环境带来不利影响，且该报道并未通过控制纺丝液的组成来实现对γ-PGA纳米纤维尺寸的控制。在另外一篇报道中，Lee等人在聚乙二醇和曲拉通X-10的辅助下，通过静电纺制备出了γ-PGA(分子量为2000kDa)纳米纤维，但此报道并没有通过适当的方法对制得的γ-PGA纳米纤维进行交联，因而无法获得水稳定性的γ-PGA纳米纤维。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种水稳定性γ-聚谷氨酸纳米纤维的制备方法，该方法过程操作简便，工艺条件温和，原材料易得，制备的γ-PGA纳米纤维生物相容性好，在组织工程支架领域具有潜在的应用价值。
本发明的一种水稳定性γ-聚谷氨酸纳米纤维的制备方法，包括：
(1)配制质量百分比浓度为5～10％的三氟乙酸水溶液，将γ-聚谷氨酸溶解于三氟乙酸溶液中并搅拌6～8h，即得γ-聚谷氨酸溶液；
(2)利用静电纺丝对上述γ-聚谷氨酸溶液进行纺丝，即得γ-聚谷氨酸纳米纤维；
(3)将上述γ-聚谷氨酸纳米纤维和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)按摩尔比1∶5～1∶10溶于甲醇中，室温下反应3～5h；反应完毕后，加入与γ-聚谷氨酸摩尔比为5∶1～10∶1的胱胺二盐酸盐并反应48～72h；反应结束后漂洗，冷冻干燥，即得具有良好水稳定性的γ-聚谷氨酸纳米纤维。
所述步骤(1)中的三氟乙酸水溶液质量百分比浓度为5％、8％或10％。
所述步骤(1)中的γ-聚谷氨酸的分子量为1000kDa。
所述步骤(1)中的γ-聚谷氨酸溶液的质量百分比浓度为16％。
所述步骤(2)中的静电纺丝工艺参数为纺丝电压32kV，接收距离40cm，流速0.3mL/h，湿度不高于40％，纺丝针头为内径1.07mm、外径1.47mm的不锈钢针头。
进行步骤(3)前先将收集有γ-聚谷氨酸纳米纤维的铝箔真空干燥20～24h，然后在无水乙醇中将纤维从铝箔上剥离。
所述步骤(3)中的γ-聚谷氨酸纳米纤维与甲醇质量体积比为1～3mg∶1mL。
所述步骤(3)中的漂洗次数为3-5次，每次漂洗5～10分钟。
用MTT比色法评价水稳定性良好的γ-PGA纳米纤维的生物相容性，分析不同培养时间条件下L929细胞在γ-PGA纳米纤维表面的粘附和增殖情况，评价γ-PGA纳米纤维对细胞粘附和增殖的影响。SEM观察培养8h以及3d以后的细胞形貌，进一步评价γ-PGA纳米纤维的生物相容性。
本发明使用扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶变换红外光谱(FITR)、MTT比色法等分析测试手段验证本发明方法的可行性。
本发明涉及了四个基本原理：
(1)利用静电纺丝技术制备γ-PGA纳米纤维；
(2)通过调节纺丝液中TFA的浓度，实现对γ-PGA纳米纤维尺寸的可控制备；
(3)利用胱胺二盐酸氨基与γ-PGA羧基的交联反应，制备水稳定性γ-PGA纳米纤维；
(4)γ-PGA纳米纤维巨大的比表面积，其独特的三维网状结构能够促进细胞的粘附和增殖。
有益效果
本发明通过改变纺丝液中溶剂TFA的浓度，实现对得到的γ-PGA纳米纤维的直径的控制，过程操作简便，工艺条件温和，原材料易得，制备的γ-PGA纳米纤维生物相容性好，在组织工程支架领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明中γ-PGA纳米纤维表面羧基与胱胺二盐酸盐交联反应的方程式；
图2为本发明制备的交联前的γ-PGA纳米纤维的SEM图片及其直径分布图，纺丝液溶剂分别为：5％TFA，8％TFA和10％TFA；(a)、(b)、(c)为SEM图片；(d)、(e)、(f)为直径分布图；
图3为本发明中与胱胺二盐酸盐交联72h并经PBS缓冲液浸泡一周后γ-PGA纳米纤维的SEM图片及其直径分布图，纺丝液溶剂分别为：5％TFA，8％TFA和10％TFA；(a)、(b)、(c)为SEM图片；(d)、(e)、(f)为直径分布图；
图4为本发明制备的γ-PGA纳米纤维与胱胺二盐酸(a)交联前与(b)，(c)和(d)交联后的FTIR图谱，纺丝液溶剂分别为：(a)5％TFA，(b)8％TFA和(c)10％TFA；
图5为γ-PGA纳米纤维的对小鼠成纤维细胞黏附和增殖的细胞活力测试结果；
图6为小鼠成纤维细胞在(a)盖玻片，(b)γ-PGA纳米纤维表面粘附8h后的SEM图片，其中(c)为图(b)的放大图；
图7为小鼠成纤维细胞在(a)盖玻片，(b)γ-PGA纳米纤维表面增殖3d后的SEM图片，其中(c)为图(b)的放大图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
各取0.8克γ-PGA粉末，分别溶于5％，8％和10％的TFA水溶液中，磁力搅拌8h使γ-PGA粉末充分溶解，配制成质量百分比浓度为16％的三种γ-PGA溶液，于4℃冰箱中保存备用。纺丝时，分别将上述三种纺丝液注入注射泵，静电纺丝工艺参数为纺丝电压32kV，接收距离40cm，流速0.3mL/h，湿度不高于40％，纺丝针头为17号不锈钢针头(内径为1.07mm，外径1.47mm)。将收集有上述三种不同纳米纤维的铝箔置于真空干燥器中干燥24h，然后将上述铝箔剪成合适大小并置于无水乙醇中将纤维从铝箔上剥离。SEM观察显示(如图2所示)，上述所得纤维形貌规则、表面规整，纤维直径分别为255±53nm，431±108nm和603±109nm。
实施例2
称取上述三种不同纳米纤维各50mg，分别浸入25mL无水甲醇中。各称取750mg EDC活化剂，并将之溶解在上述25mL无水甲醇中活化γ-PGA聚合物链上的羧基，活化时间为3h，活化条件为室温下摇床震荡。然后，各加入872mg胱胺二盐酸盐，同样于室温下摇床中反应72h。反应结束后，将纤维取出并用去离子水洗涤次数为3次，每次洗涤时间为5分钟。冷冻干燥，即得到具有良好水稳定性的γ-PGA纳米纤维。为评价与胱胺二盐酸盐交联后γ-PGA纳米纤维的水溶性，各取少许交联后的纤维置于PBS缓冲液中浸泡7d，通过SEM观察浸泡7d之后的纤维形貌，结果显示7d之后纤维形貌未受破坏(如图3)，仅纤维直径有了稍微增加，原因可能在于交联过程中纤维发生了一定程度的溶胀。SEM的结果直观地说明了通过胱胺二盐酸盐的交联，γ-PGA纳米纤维获得了良好的水稳定性。
实施例3
选取直径为274±51nm的γ-PGA纳米纤维，将之裁剪成2cm×2cm小块，铺展在直径1.8cm的盖玻片上并置于24孔细胞培养板中。对铺在盖玻片上的纤维进行紫外线杀菌并用DMEM高糖培养基浸泡12h，然后每孔补充400μL培养基并接种2×104个L929细胞。每块培养板设置不同的培养时间(1，3，5和7天和1，2，4和8小时，共8块培养板)。在每个培养时间结束后，向培养孔中加入40μL MTT，继续培养4h，使活细胞与MTT完全作用生成MTT甲瓒晶体。弃去每孔中的培养基，补加400μL DMSO，将MTT甲瓒晶体完全溶解并记录570nm处的OD值，分析不同培养时间下，细胞在γ-PGA纳米纤维表面的粘附或增殖情况，评价γ-PGA纳米纤维对细胞粘附和增殖的影响。结果如图5所示，L929细胞在纤维表面的粘附和增殖活力随着培养时间的增加而递增，说明γ-PGA纳米纤维不会影响L929细胞在其表面的正常粘附和增殖。此外，通过比较第1、8小时的细胞粘附以及第1、5天细胞的增殖可以发现，L929细胞在水稳定性γ-PGA纳米纤维表面的粘附和增殖情况与盖玻片相比具有显著性差异(*p＜0.05，**p＜0.01)，这说明本发明制备的水稳定性γ-PGA纳米纤维具有良好的生物相容性。
将培养8h和3d的小鼠成纤维细胞用PBS缓冲溶液洗涤3遍，并用2.5％的戊二醛溶液固定2h。然后，将上述固定的成纤维细胞用梯度酒精(30％、50％、70％、80％、90％、95％和100％)依次进行脱水处理。干燥后，通过SEM观察γ-PGA纳米纤维表面的细胞形貌，结果分别如图6和图7所示。从图6和图7可以看出，与对照组(载玻片)相比，小鼠成纤维细胞可以很好地在γ-PGA纳米纤维表面粘附并增殖，从放大图片中可以清楚看到细胞通过伪足粘附在γ-PGA纳米纤维表面，这说明γ-PGA纳米纤维具有良好的生物相容性，并可以与细胞构建纤维/细胞整合的三维支架结构，在组织工程支架领域具有潜在应用价值。
Claims (8)
1.一种水稳定性γ-聚谷氨酸纳米纤维的制备方法，包括：
(1)配制质量百分比浓度为5～10％的三氟乙酸水溶液，将γ-聚谷氨酸溶解于三氟乙酸溶液中并搅拌6～8h，即得γ-聚谷氨酸溶液；
(2)利用静电纺丝对上述γ-聚谷氨酸溶液进行纺丝，即得γ-聚谷氨酸纳米纤维；
(3)将上述γ-聚谷氨酸纳米纤维和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按摩尔比1∶5～1∶10溶于甲醇中，室温下反应3～5h；反应完毕后，加入与γ-聚谷氨酸摩尔比为5∶1～10∶1的胱胺二盐酸盐并反应48～72h；反应结束后漂洗，冷冻干燥，即得具有良好水稳定性的γ-聚谷氨酸纳米纤维。
2.根据权利要求1所述的一种水稳定性γ-聚谷氨酸纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的三氟乙酸水溶液质量百分比浓度为5％、8％或10％。
3.根据权利要求1所述的一种水稳定性γ-聚谷氨酸纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的γ-聚谷氨酸的分子量为1000kDa。
4.根据权利要求1所述的一种水稳定性γ-聚谷氨酸纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的γ-聚谷氨酸溶液的质量百分比浓度为16％。
5.根据权利要求1所述的一种水稳定性γ-聚谷氨酸纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的静电纺丝工艺参数为纺丝电压32kV，接收距离40cm，流速0.3mL/h，湿度不高于40％，纺丝针头为内径1.07mm、外径1.47mm的不锈钢针头。
6.根据权利要求1所述的一种水稳定性γ-聚谷氨酸纳米纤维的制备方法，其特征在于：进行步骤(3)前先将收集有γ-聚谷氨酸纳米纤维的铝箔真空干燥20～24h，然后在无水乙醇中将纤维从铝箔上剥离。
7.根据权利要求1所述的一种水稳定性γ-聚谷氨酸纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的γ-聚谷氨酸纳米纤维与甲醇质量体积比为1～3mg∶1mL。
8.根据权利要求1所述的一种水稳定性γ-聚谷氨酸纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的漂洗次数为3-5次，每次漂洗5～10分钟。
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