CN102277389A - 一种浮萍发酵生产燃料乙醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种浮萍发酵生产燃料乙醇的方法。主要工艺过程包括原料烘干后粉碎，与水混匀，对混合物进行超声波预处理，再加入α-淀粉酶灭菌冷却后加入预处理酶和糖化酶进行预处理和糖化，在无菌条件下加入预备好的酿酒酵母种子液和混合维生素液，放入摇床进行发酵。本发明利用一种非粮、水生植物浮萍来生产燃料乙醇；通过对浮萍进行预处理提高发酵后乙醇浓度，预处理工艺简单，成本低廉，无污染物产生，发酵时间短、效率高。

Description

一种浮萍发酵生产燃料乙醇的方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种浮萍发酵生产燃料乙醇的方法。
背景技术
能源是人类社会生存和发展的根本。由于传统化石能源如煤炭，石油，天然气等不可再生资源的日益枯竭，以及减排温室气体保护环境，确保人类社会可持续发展的迫切需要，大力发展可再生的生物质能源产业已成为缓解当前能源和环境危机的必然选择。
燃料乙醇是生物质能源产业方面发展最快，规模最大的一种生物燃料，具有生产技术较为成熟、生产原料来源广泛等特点。在燃油中加入适量的燃料乙醇，可使尾气中一氧化碳和碳氢化合物的含量分别下降30.8％和13.4％。
目前，以木质纤维素资源为原料的第二代燃料乙醇是世界各国的研究热点，也是未来燃料乙醇发展的趋势。但由于其原料本身的性质，必须首先对木质纤维素原料进行预处理才能有效将其利用。目前对木质纤维素类原料的预处理方式主要有：物理法、化学法、物理化学法和生物法。这些方法各有特点但它们的缺点也很明显：如物理法设备复杂，成本高昂；化学法对环境污染大，成本较高；物理化学法设备成本高，糖得率较低；生物法处理周期长，降解能力待提高。另外再加上相关酶的生产成本高；酵母对半纤维素的主要酶解产物五碳糖的利用率低下等问题，使得木质纤维素燃料乙醇迟迟未能实现产业化。
水生植物浮萍是世界上最小的开花植物，它属单子叶植物纲，天南星目，浮萍科，全世界分布广泛，共有5属38种，我国有4属12种。浮萍具有淀粉含量高、生长速度快、易于培养、材料成本低、不占用耕地、不与人争粮等优点，是一种极具潜力的用于燃料乙醇生产的原料。利用浮萍生产燃料乙醇的生产具有如下独特优势：1.浮萍的淀粉含量高，可达其干重的40％，Jay J Cheng报道浮萍淀粉年产量可达28t/hm2，而玉米淀粉年产量仅为5t/hm2，相对于木质纤维素原料，淀粉质原料只需经过简单的处理工艺便可用于乙醇发酵；2.浮萍繁殖速度很快，约2～7天可繁殖一代，高于任何一种高等植物，G.Oron等报道浮萍生长速率达到0.1～0.35g(干重)/g(干重)·d，年产量高达55t/hm2(干重)，玉米为4.9t/hm2，浮萍生长期长，在大多数温带至热带地区均可全年生长；3.浮萍中蛋白质含量高达30％以上，Bhanthumnavin和McGarry报告浮萍中蛋白质年产量可高达2000kg/hm2，而大豆、大米和玉米蛋白质年产量分别为300、70和180kg/hm2，Cully and Epps报道浮萍磷含量为13～29g/kg(干重)，使浮萍用于燃料乙醇的生产时不需要添加外源的氮和磷，有利于降低生产成本；4.浮萍组织中氮磷含量较高，能在多种富含营养的污水中生长，TKN、TP去除率可达77％，在处理污水时能产生大量生物质供燃料乙醇生产。开发浮萍作为燃料乙醇生产的原料，符合国家对生物燃料原料“不与人争粮，不与粮争地”的指导要求，在改善能源生产和消费结构，保护生态环境，推进社会经济发展等方面有重要现实意义。
目前以浮萍为原料发酵生产乙醇的报道很少、相关研究还不够深入，国内未见相关报道，国外以浮萍为原料的乙醇发酵通常没有预处理工艺，如Jay J.Cheng等报道通过淀粉酶、支链淀粉酶和糖化酶的酶解以及酵母的发酵，没有预处理工艺，得到的乙醇为0.26g/g浮萍干物质，未提到发酵后乙醇的浓度以及发酵效率这两个重要指标。而由于浮萍成份及结构的特殊性，若将浮萍直接用于发酵会存在发酵后乙醇浓度低，发酵效率不高，原料利用率差等问题。因此，有必要开发一种高效、安全的预处理技术对浮萍进行预处理，进而提高浮萍发酵后的乙醇浓度，提高发酵效率及原料的利用率，促进浮萍在燃料乙醇产业上的应用。
发明内容
本发明的目的是为解决浮萍发酵后乙醇浓度较低，发酵效率不高，原料利用不充分的缺点，通过对浮萍进行简单预处理后快速发酵生成乙醇，提高乙醇浓度和发酵效率，降低生产成本。
本发明的目的是通过如下措施来达到：
1、将新鲜浮萍全株置于60℃烘干后粉碎过60目筛；
2、将浮萍干粉与水按照1∶3～1∶6(质量比)混匀制成浮萍发酵培养基；
3、将浮萍发酵培养基置于超声波发生器，以频率22 kHz，功率范围为400～700W的超声波对其进行超声处理，时间100～200s，以冰水浴对培养基进行降温；
4、将超声处理后的浮萍发酵培养基升温至95℃保持5min，按100～200μl/100g浮萍发酵培养基的比例加入α-淀粉酶液化10min，碘检呈红棕色，完成液化，冷却后补足蒸发的水份至初始料水比；
5、将液化后的浮萍发酵培养基于115℃灭菌20min，冷却至50℃，无菌条件按150～200μl/100g浮萍发酵培养基的比例分别加入预处理酶和糖化酶，于50℃，180～220rpm同时进行预处理和糖化过程2h，将预处理后的浮萍发酵培养基于无菌条件下向每100g浮萍发酵培养基中接入10ml酵母种子液和1ml混合维生素液，置于摇床，180～220rpm，30℃发酵11～14h。或将灭菌后的浮萍发酵培养基冷却至30℃，无菌条件下加入预处理酶和糖化酶，同时接入酵母种子液和混合维生素液，180～220rpm振荡，同步进行预处理、糖化和发酵；
所述浮萍采自四川省成都市邛崃回龙镇；
所述加入的α-淀粉酶，标准酶活力为90KNU/ml(KNU为诺维信液化酶的专有单位)，酶活定义：37℃、pH 5.6时，每小时水解5.26g淀粉的酶量为1KNU；
所述加入的预处理酶为β-葡聚糖，酶标准酶活＞1×105u/ml(酶活定义：1ml酶液于50℃，pH 4.5条件下，1min催化β-葡聚糖水解生成1ug葡萄糖为一个β-葡聚糖酶活力单位)；
所述加入的糖化酶Suhong GAII，标准酶活力为500AGU/ml，酶活定义：在25℃，pH4.3标准条件下，每分钟水解1mmol麦芽糖所需的酶量为1AGU；
所述的酵母种子液是用以下方法培养获得的，培养基成分为：葡萄糖100g/L，酵母粉8.5g/L，硫酸铵1.3g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.06g/L，115℃灭菌20min，无菌条件下从YEPD斜面接入一环酿酒酵母，30℃，150rpm，14h后作为酵母种子液，此时菌液稀释十倍后OD620为1.0～1.1。或者取0.25g安琪酵母干粉于无菌条件下加到50ml 2％(w/v)无菌葡萄糖液中置于摇床150rpm，37℃复水15min，然后于30℃，150rpm活化至酵母菌液稀释十倍后OD620为1.0～1.1。
所述的浮萍发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于：混合维生素液成分为：肌醇0.85g/L，VB1 0.35g/L，VB6 0.004g/L，烟酸0.004g/L，对氨基苯甲酸0.007g/L，生物素24μg/L，泛酸3.5ml/L。
发酵结束后取样测定发酵醪中乙醇浓度，最终乙醇浓度可达3.17％(w/w)，发酵时间小于14h，发酵效率达到90％以上。
本发明提供了一种浮萍发酵生产燃料乙醇的预处理方法，与木质纤维素原料用于燃料乙醇生产时需要进行复杂的预处理工艺相比，浮萍的预处理工艺在常温下进行，简单可行，耗时短，成本低廉，无污染物产生，预处理后的浮萍发酵可达到3.17％(w/w)的乙醇浓度，相对于预处理前提高了33.2％，是目前所报道的基于浮萍原料生产燃料乙醇所达到的最高浓度，较木质纤维素燃料乙醇的预处理工艺有明显优势。
具体实施方式
以下所给出的实施例是为进一步说明本发明的基本原理和主要技术特征，并非对本发明的技术方案进行限制。本行业的技术人员应了解，本发明不受以下实施例的限制，对本发明中的技术方案进行的任何修改或局部替换，以及各种变化和改进，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，均应涵盖在本发明的保护范围中。
对照例1-2和实施例1-4所使用的酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CCTCC M206111；实施例5为安琪酵母股份有限公司生产的酿酒高活性干酵母。
对照例1
取20g浮萍干粉放入250ml三角瓶，加入80ml水混匀制成发酵培养基，将培养基置于95℃保温5min，然后加入200μlα-淀粉酶，保温10min进行液化，液化完成并冷却后补足蒸发水分，115℃灭菌20min。冷却后于无菌条件下加入150μl糖化酶，50℃，220rpm糖化2h，然后向每100g发酵培养基中接入10ml酵母种子液和1ml混合维生素液，然后置于摇床200rpm，30℃发酵13h后利用气相色谱测得乙醇浓度为2.09％(w/w)，发酵效率为70.5％。
对照例2
取25g浮萍干粉放入250ml三角瓶，加入75ml水混匀制成发酵培养基，将培养基置于95℃保温5min，然后加入200μl α-淀粉酶，保温10min进行液化，液化完成并冷却后补足蒸发水分，115℃灭菌20min。冷却后于无菌条件下加入200μl糖化酶，50℃，220rpm糖化2h，然后向每100g发酵培养基中接入10ml酵母种子液和1ml混合维生素液，置于摇床，220rpm，30℃发酵14h后利用气相色谱测得乙醇浓度为2.38％(w/w)，发酵效率为64.2％。
实施例1
取14.29g浮萍干粉放入250ml三角瓶，加入85.71ml水混匀制成发酵培养基，将培养基置于超声波发生器，功率400W，100s进行预处理，用冰水浴冷却反应体系，然后将培养基置于95℃保温5min，加入100μl α-淀粉酶，保温10min进行液化，液化完成并冷却后补足蒸发水分至初始料水比，115℃灭菌20min。冷却至50℃后无菌条件下分别加入150μl预处理酶和糖化酶，50℃ 200rpm预处理2h，然后向每100g发酵培养基中接入10ml酵母种子液和1ml混合维生素液，置于摇床180rpm，30℃发酵11h后利用气相色谱测得乙醇浓度可达1.95％(w/w)，发酵效率达94.0％。
实施例2
取16.67g浮萍干粉放入250ml三角瓶，加入83.33ml水混匀制成发酵培养基，将培养基置于超声波发生器，功率500W，130s进行预处理，用冰水浴冷却反应体系，然后将培养基置于95℃保温5min，加入150μl α-淀粉酶，保温10min进行液化，液化完成并冷却后补足蒸发水分至初始料水比，115℃灭菌20min。冷却至50℃后无菌条件下分别加入150μl预处理酶和糖化酶，50℃ 220rpm预处理2h，然后向每100g发酵培养基中接入10ml酵母种子液和1ml混合维生素液，置于摇床180rpm，30℃发酵12h后利用气相色谱测得乙醇浓度可达2.13％(w/w)，发酵效率达92.5％。
实施例3
取20g浮萍干粉放入250ml三角瓶，加入80ml水混匀制成发酵培养基，将培养基置于超声波发生器，功率600W，160s进行预处理，用冰水浴冷却反应体系，然后将培养基置于95℃保温5min，加入200μlα-淀粉酶，保温10min进行液化，液化完成并冷却后补足蒸发水分至初始料水比，115℃灭菌20min。冷却至50℃后无菌条件下分别加入150μl预处理酶和糖化酶，50℃ 220rpm预处理2h，然后向每100g发酵培养基中接入10ml酵母种子液和1ml混合维生素液，置于摇床200rpm，30℃发酵13h后利用气相色谱测得乙醇浓度可达2.40％(w/w)，发酵效率为91.2％。
实施例4
取25g浮萍干粉放入250ml三角瓶，加入75ml水混匀制成发酵培养基，将培养基置于超声波发生器，功率700W，200s进行预处理，用冰水浴冷却反应体系，然后将培养基置于95℃保温5min，加入200μl α-淀粉酶，保温10min进行液化，液化完成并冷却后补足蒸发水分，115℃灭菌20min。冷却至30℃后无菌条件下分别加入200μl预处理酶和糖化酶，再向每100g发酵培养基中接入10ml酵母种子液和1ml混合维生素液，置于摇床220rpm，30℃发酵13.5h后利用气相色谱测得乙醇浓度可达3.17％(w/w)，此时发酵效率为90.4％。
实施例5
取25g浮萍干粉放入250ml三角瓶，加入75ml水混匀制成发酵培养基，将培养基置于超声波发生器，功率700W，200s进行预处理，用冰水浴冷却反应体系，然后将培养基置于95℃保温5min，加入200μl α-淀粉酶，保温10min进行液化，液化完成并冷却后补足蒸发水分，115℃灭菌20min。冷却至30℃后无菌条件下分别加入200μl预处理酶和糖化酶，再向每100g发酵培养基中接入10ml安琪酵母种子液和1ml混合维生素液，置于摇床220rpm，30℃发酵13.5h后利用气相色谱测得乙醇浓度为2.67％，发酵效率为74.1％。

Claims (9)

1.一种浮萍发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a：将新鲜浮萍全株置于60℃烘干后粉碎过60目筛；
b：将浮萍干粉与水混匀制成浮萍发酵培养基，放入超声波发生器对其进行预处理，同时利用冰水浴对反应体系降温；
c：将超声波处理后的浮萍发酵培养基升温至95℃保持5min，加入α-淀粉酶进行液化，液化完成后补足蒸发的水份；
d：将液化后的浮萍发酵培养基于115℃灭菌20min，冷却至50℃，无菌条件加入预处理酶和糖化酶，于50℃，180～220rpm进行培养基的预处理和糖化2小时，在无菌条件下向每100g浮萍发酵培养基中接入10ml酵母种子液和1ml混合维生素液，置于摇床，180～220rpm，30℃发酵11～14h；或将灭菌后的浮萍发酵培养基冷却至30℃，无菌条件下加入预处理酶和糖化酶，同时接入酵母种子液和混合维生素液，180～220rpm振荡，同步进行预处理、糖化和发酵。
2.根据权利要求1所述的浮萍发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于：浮萍干粉与水按质量比1∶3～1∶6混匀制成浮萍发酵培养基。
3.根据权利要求1所述的浮萍发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于：超声波预处理时所使用的超声波频率为22kHz，功率为400～700W，时间为100～200s。
4.根据权利要求1所述的浮萍发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于：加入的α-淀粉酶量为100～200μl/100g浮萍发酵培养基，碘检呈红棕色时完成液化。
5.根据权利要求1所述的浮萍发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于：加入的糖化酶量为150～200μl/100g浮萍发酵培养基。
6.根据权利要求1所述的浮萍发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于：加入的预处理酶是β-葡聚糖酶。
7.根据权利要求6所述的浮萍发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于：加入的预处理酶量为150～200μl/100g浮萍发酵培养基。
8.根据权利要求1所述的浮萍发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于：所述的酵母种子液是用以下方法培养获得的，培养基成分为：葡萄糖100g/L，酵母粉8.5g/L，硫酸铵1.3g/L，硫酸镁0.1g/L，氯化钙0.06g/L，115℃灭菌20min，无菌条件下从YEPD斜面接入一环酿酒酵母，30℃，150rpm，14h后作为酵母种子液，此时菌液稀释十倍后OD620为1.0～1.1，或者取0.25g酵母干粉于无菌条件下加到50ml 2％(w/v)无菌葡萄糖液中置于摇床150rpm，37℃复水15min，然后于30℃，150rpm活化至酵母菌液稀释十倍后OD620为1.0～1.1。
9.根据权利要求1所述的浮萍发酵生产燃料乙醇的方法，其特征在于：混合维生素液成分为：肌醇0.85g/L，VB1 0.35g/L，VB6 0.004g/L，烟酸0.004g/L，对氨基苯甲酸0.007g/L，生物素24μg/L，泛酸3.5ml/L。
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