CN102271684A - 敏化多药耐受细胞的材料和方法 - Google Patents
敏化多药耐受细胞的材料和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102271684A CN102271684A CN2009801503819A CN200980150381A CN102271684A CN 102271684 A CN102271684 A CN 102271684A CN 2009801503819 A CN2009801503819 A CN 2009801503819A CN 200980150381 A CN200980150381 A CN 200980150381A CN 102271684 A CN102271684 A CN 102271684A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- abcg2
- cell
- chemical compound
- mitoxantrone
- inhibitor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 239000000463 material Substances 0.000 title abstract description 6
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 title abstract description 3
- 108010090306 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 claims abstract description 262
- 102000013013 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 claims abstract description 262
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 93
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 34
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 88
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 claims description 88
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 38
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 32
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 29
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 claims description 13
- 229930195573 Amycin Natural products 0.000 claims description 13
- 229940123780 DNA topoisomerase I inhibitor Drugs 0.000 claims description 11
- 239000000365 Topoisomerase I Inhibitor Substances 0.000 claims description 11
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000003817 anthracycline antibiotic agent Substances 0.000 claims description 7
- VSJKWCGYPAHWDS-FQEVSTJZSA-N camptothecin Chemical group C1=CC=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 VSJKWCGYPAHWDS-FQEVSTJZSA-N 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical group C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 229960000303 topotecan Drugs 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 61
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 43
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 28
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 14
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 abstract description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract description 2
- 208000016691 refractory malignant neoplasm Diseases 0.000 abstract 2
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 abstract 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 abstract 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 137
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 112
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 42
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 34
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 34
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 23
- 230000008859 change Effects 0.000 description 18
- 0 CNCCCC* Chemical compound CNCCCC* 0.000 description 16
- 102100021339 Multidrug resistance-associated protein 1 Human genes 0.000 description 16
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 16
- 101000969812 Homo sapiens Multidrug resistance-associated protein 1 Proteins 0.000 description 15
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 15
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 15
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 14
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 102100033350 ATP-dependent translocase ABCB1 Human genes 0.000 description 12
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 12
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 12
- IOJUPLGTWVMSFF-UHFFFAOYSA-N benzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC=NC2=C1 IOJUPLGTWVMSFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 12
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 12
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 9
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FZERHIULMFGESH-UHFFFAOYSA-N N-phenylacetamide Chemical compound CC(=O)NC1=CC=CC=C1 FZERHIULMFGESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 6
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 description 5
- -1 amino-1,3-benzothiazole-2-yl Chemical group 0.000 description 5
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 239000003005 anticarcinogenic agent Substances 0.000 description 4
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 206010052804 Drug tolerance Diseases 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000762 chronic effect Toxicity 0.000 description 3
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N protoneodioscin Natural products O(C[C@@H](CC[C@]1(O)[C@H](C)[C@@H]2[C@]3(C)[C@H]([C@H]4[C@@H]([C@]5(C)C(=CC4)C[C@@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@H](CO)O4)CC5)CC3)C[C@@H]2O1)C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 description 3
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 3
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 125000002490 anilino group Chemical group [H]N(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N c1nc2ccccc2[nH]1 Chemical compound c1nc2ccccc2[nH]1 HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- HOBCFUWDNJPFHB-UHFFFAOYSA-N indolizine Chemical compound C1=CC=CN2C=CC=C21 HOBCFUWDNJPFHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 150000003053 piperidines Chemical class 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000003107 structure activity relationship analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 2
- 125000004646 sulfenyl group Chemical group S(*)* 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100028162 ATP-binding cassette sub-family C member 3 Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100022595 Broad substrate specificity ATP-binding cassette transporter ABCG2 Human genes 0.000 description 1
- LNWWQYYLZVZXKS-UHFFFAOYSA-N CC(N1CCCC1)=O Chemical compound CC(N1CCCC1)=O LNWWQYYLZVZXKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DLRJIFUOBPOJNS-UHFFFAOYSA-N CCOc1ccccc1 Chemical compound CCOc1ccccc1 DLRJIFUOBPOJNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N CN1CCOCC1 Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABNDSIADBYDJEH-UHFFFAOYSA-N CNC1C=CC=CC1 Chemical compound CNC1C=CC=CC1 ABNDSIADBYDJEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NAZDVUBIEPVUKE-UHFFFAOYSA-N COc(cc1N)ccc1OC Chemical compound COc(cc1N)ccc1OC NAZDVUBIEPVUKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101000986633 Homo sapiens ATP-binding cassette sub-family C member 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000823298 Homo sapiens Broad substrate specificity ATP-binding cassette transporter ABCG2 Proteins 0.000 description 1
- 241000222065 Lycoperdon Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- DGPQPAMQIBTOIT-UHFFFAOYSA-N O=CNCC1OCCC1 Chemical compound O=CNCC1OCCC1 DGPQPAMQIBTOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RAZUCHVCRRKTKX-UHFFFAOYSA-N O=CNCc1ccc[o]1 Chemical compound O=CNCc1ccc[o]1 RAZUCHVCRRKTKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N O=Cc1ccccc1 Chemical compound O=Cc1ccccc1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical class C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000768494 Polymorphum Species 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 229940079156 Proteasome inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 206010037211 Psychomotor hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 238000010818 SYBR green PCR Master Mix Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- RGHILYZRVFRRNK-UHFFFAOYSA-N anthracene-1,2-dione Chemical compound C1=CC=C2C=C(C(C(=O)C=C3)=O)C3=CC2=C1 RGHILYZRVFRRNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N anthraquinone Natural products CCC(=O)c1c(O)c2C(=O)C3C(C=CC=C3O)C(=O)c2cc1CC(=O)OC PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004056 anthraquinones Chemical class 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000031 ethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])N([H])[*] 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 229940088013 hycamtin Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010045758 lysosomal proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 108010066052 multidrug resistance-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 1
- DXASQZJWWGZNSF-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylmethanamine;sulfur trioxide Chemical group CN(C)C.O=S(=O)=O DXASQZJWWGZNSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000003207 proteasome inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012755 real-time RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
- A61K31/425—Thiazoles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了敏化表达ABCG2和ATP结合转运蛋白超家族的相关蛋白质成员的多药耐受癌细胞的材料和方法,在一些类型的多药耐受癌细胞中发现ATP结合转运蛋白超家族介导药物外排。一系列化合物(包括(N-(4-氯代苯基)-2-[(6-{[4,6-二(4-吗啉基)-1,3,5-三嗪-2-基]氨基}-1,3-苯并噻唑-2-基)硫基]乙酰胺))特异性抑制ABCG2并可用于提高一种或更多种有效抗癌药的生物利用度,使某些广泛使用的化学治疗试剂可用于治疗多药耐受癌症。还可将这些化合物与作为ABCG2和相关蛋白质之底物的化学治疗药物联合用于处理目前未被鉴定为多药耐受的癌细胞。此外,这些化合物表现出对ABCG2和相关蛋白质的细胞间降解的加速。其在影响多药耐受癌细胞系所表达的ABCG2之活性的水平下对动物无毒性。
Description
优先权声明
本申请要求于2008年10月24日提交的美国临时专利申请No.61/108,161的优先权,其通过整体引用并入本文。
政府权利声明
本发明的部分成果在美国国立卫生院(NIH)的政府资助(基金号CA120221)下取得。美国政府享有本发明的一些权利。
发明领域
本公开内容涉及通过提供降低多种ATP结合盒(ATP bindingcassette,ABC)转运蛋白活性的化合物使多药耐受癌细胞对多种化学治疗试剂敏化的材料和方法。
背景技术
多药耐受(multidrug resistance,MDR)是成功治疗癌症的主要难题。已有观点认为ABC(ATP结合盒)转运蛋白超家族中某些成员的过表达是MDR的原因。该家族的一个成员是ABCG2,认为其存在于细胞中并以8-12个亚基的同寡聚物发挥功能(1-3)。还认为ABCG2在保护癌症干细胞不受化学治疗药物作用而导致药物耐受和癌症化学治疗失败中发挥作用。ABCG2的抗癌药物底物包括但不限于这样的常用抗癌药物,例如以商品名阿霉素(Adriamycin)出售的多柔比星(doxorubicin)(8S,10S)-10-(4-氨基-5-羟基-6-甲基-四氢-2H-吡喃-2-基氧)-6,8,11-三羟基-8-(2-羟基乙酰基)-1-甲氧基-7,8,9,10-四氢并四苯-5,12-二酮);米托蒽醌(1,4-二羟基-5,8-双[2-(2-羟乙基氨基)乙基氨基]-蒽-9,10-二酮);和以商品名和美新(Hycamtin)出售的拓扑替康((S)-10-[(二甲基氨基)甲基]-4-乙基-4,9-二羟基-1H-吡喃并[3′,4′:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮一盐酸盐)。确实,近期临床研究表明ABCG2在成人和儿童白血病两者中的过表达与该疾病预后差有极大相关性4。ABCG2活性的敲除似乎对患该病症小鼠的发育、生物化学和生活没有明显的不利影响。因此,只要抑制剂对ABCG2特异,则抑制或降低ABCG2的活性不太可能导致任何严重的副作用。这使ABCG2成为开发用于更好地治疗药物耐受癌症的化学敏化剂的理想靶标。
与公知的导致药物耐受的ABC转运蛋白(如ABCB1(MDR1/Pgp)和ABCC1(MRP1))相比,ABCG2的发现相对较晚,因此,很少有ABCG2特异性抑制剂的报道。了解最透彻的ABCG2特异性抑制剂之一是由烟曲霉(Aspergillus fumigatus)分泌的强真菌毒素烟曲霉毒素C(FTC)。但是,FTC的神经毒性限制了其治疗潜力。已开发的与FTC相比显示更低毒性的FTC类似物包括诸如Kol32和Kol43的化合物5;本发明人不知晓表明这些分子功效的任何临床试验。ABCG2的其它抑制剂也有报道6,7。但这些试剂中的一些(如GF 120918)由于对ABCB1和/或ABCC1的作用而显示出特异性的缺乏8,9。很显然,需要更特异的ABCG2抑制剂来更好地治疗药物耐受性癌症。本发明的方面旨在满足上述需求。
发明简述
本文公开了使多药耐受癌细胞对化学治疗药物敏化的化合物和方法。一些方法包括以下步骤:获得有效抑制ABCG2的化合物;获得为ABCG2或类似转运蛋白之底物的化学治疗药物,其中所述药物在无高ABCG2活性时表现出杀细胞能力;和将所述化合物和所述药物应用于MDR细胞,其中所述细胞表达ABCG2。在一些实施方案中,ABCG2抑制剂可表现出混合型抑制剂动力学,而在一些实施方案中,所述化合物可加速ABCG2的溶酶体依赖性降解。在一些实施方案中,所述化合物包含下式的与三嗪(traizine)环骨架相连的苯并噻唑:
其中,R1选自:
R2选自
在另一些实施方案中,所述用于敏化MDR细胞的化合物具有如下结构:
本发明一些方面包括用于克服癌症化学治疗中多药耐受的方法,其包括如下步骤:提供抑制ABCG2的化合物或其可药用盐,其中所述化合物包含如下的与三嗪环骨架相连的苯并噻唑:
获得化学治疗试剂,其中所述试剂被ABCG2转运蛋白转运;以及将所述化合物和所述试剂与多药耐受癌细胞接触,其中所述细胞表达ABCG2。在一些实施方案中,所述抑制ABCG2的化合物为PZ-39。在另一些实施方案中,所述抑制ABCG2的化合物为PZ-38。在一些实施方案中,所用ABCG2抑制剂的量在45nM或更少的数量级上。在一些实施方案中,所述化学治疗试剂为蒽环类抗生素,在一些实施方案中所述蒽环类抗生素为阿霉素。
在另一些实施方案中,所述化学治疗试剂为蒽二酮类(anthracenedione),在一些实施方案中所述蒽二酮类为米托蒽醌。在另一些实施方案中,所述化学治疗试剂为拓扑异构酶I抑制剂,在一些实施方案中所述拓扑异构酶I抑制剂为拓扑替康,而在另一些实施方案中所述拓扑异构酶I抑制剂为喜树碱。
本发明的另一些方面包括降低细胞中ABCG2水平的方法,其包括如下步骤:提供降低细胞中ABCG2水平的化合物,其中所述化合物或其可药用盐选自如下化合物组:
并将所述化合物与细胞接触,其中所述细胞表达ABCG2。在一些实施方案中,所述抑制ABCG2的化合物为PZ-39,而在另一些实施方案中,所述抑制ABCG2的化合物为PZ-38。在一些实施方案中,所用ABCG2抑制剂的量在45nM或更少的数量级上。
本发明的又一方面包括治疗患者的方法,其包括如下步骤:提供抑制ABCG2的化合物,其中所述化合物或其可药用盐选自如下化合物组:
提供至少一种化学治疗试剂或其可药用盐,其中所述试剂是ABCG2的底物;向患者施用治疗有效量的至少一种所述化合物和至少一种所述化学治疗试剂。
另一些实施方案包括治疗患者、抑制ABCG2和ABCG2样蛋白质和/或处理多药耐受细胞系的方法,其包括如下步骤:提供抑制ABCG2的化合物,其中所述化合物或其可药用盐选自如下化合物组:
提供至少一种化学治疗试剂或其可药用盐,其中所述试剂为ABCG2的底物;向患者施用治疗有效量的至少一种所述化合物和至少一种所述化学治疗试剂。
在一些实施方案中,所述抑制ABCG2的化合物为PZ-39,而在另一些实施方案中,所述抑制ABCG2的化合物为PZ-38。在一些实施方案中,施用给患者的ABCG2抑制剂的量在45nM或更少的数量级上。在一些实施方案中,所述化学治疗试剂为蒽环类抗生素。在一些实施方案中其为阿霉素。在另一些实施方案中化学治疗试剂为蒽二酮类。在一些实施方案中所述蒽二酮类为米托蒽醌。在另一些实施方案中,所述化学治疗试剂为拓扑异构酶I抑制剂。在一些实施方案中所述拓扑异构酶I抑制剂为拓扑替康或喜树碱。在一些实施方案中施用给患者约45μg ml-1或更少的数量级的剂量以降低ABCG2活性。
另一些实施方案包括使用本文公开的任何化合物及其类似物和衍生物来处理、诊断、和/或研究多药耐受细胞以及参与赋予多种细胞(包括癌细胞)药物耐受性的蛋白质(如ABCG2和类似蛋白质)。
在一些实施方案中,联合使用多种化学治疗试剂和多种药物外排抑制剂(包括本文公开及暗指的那些)以治疗患者、研究和/或诊断疾病或正常细胞生理。可与本文公开的ABCG2抑制剂联合使用的化学治疗试剂可按照本领域已知的现行剂量指南相一致的水平施用给患者,或在一些情况下也可以更低水平施用。多种实施方案还包括可用于治疗患者或进行多种测试的多种化学治疗试剂和ABCG2抑制剂的可药用盐的使用。所有本文公开的化合物、其类似物和多种治疗性化合物(包括化学治疗药物)还可如本领域已知的那样与多种载体、防腐剂、增溶剂、赋形剂等共同形成制剂。
参照如下非限制性方案、式、图、画和描述,可更好地理解本发明的这些及其它特征、方面和优势。
附图简述
图1.PZ-39(N-(4-氯代苯基)-2-[(6-{[4,6-二(4-吗啉基)-1,3,5-三嗪-2-基]氨基}-1,3-苯并噻唑-2-基)硫基]乙酰胺)的化学结构;该分子包含与三嗪环骨架相连的苯并噻唑。
图2A.柱状图阐释DMSO(对照)、PZ-39或FTC对MCF7细胞(空白条)或其药物耐受性亚细胞系MCF7/AdVp3000(黑色条)胞内米托蒽醌累积的影响。
图2B.柱状图阐释DMSO(对照)、PZ-39或FTC对HEK 293vac细胞(空白条)或以载体或ABCG2转染的HEK 293细胞(黑色条)胞内米托蒽醌累积的影响。
图2C.曲线图显示用多种水平PZ-39所处理的ABCG2转染HEK 293细胞中累积的被标记米托蒽醌水平。
图2D.曲线图显示用多种水平FTC所处理的ABCG2转染的HEK 293细胞中累积的被标记米托蒽醌水平。
图3A.HEK293/ABCG2细胞的存活百分比相对于PZ-39的μg ml-1的曲线图。细胞用(+)或不用(-)0.1μM(IC10)米托蒽醌处理。
图3B.HEK293/ABCG2细胞的存活百分比相对于FTC的μg ml-1的曲线图。细胞用(+)或不用(-)0.1μM(IC10)米托蒽醌处理。
图3C.在不存在和存在50、200和500nm PZ-39时所测定的HEK293/ABCG2细胞存活百分比相对于米托蒽醌之nM的曲线图。
图3D.在不存在和存在50、200和500nm FTC时所测定的HEK293/ABCG2细胞存活百分比相对于米托蒽醌之nM的曲线图。图3A、3B、3C和3D中数据代表四次独立试验。
图3E.在溶于DMSO(载剂)的阿霉素、喜树碱或米托蒽醌的存在下,用DMSO(白色)、200nM FTC(灰色)或200nM PZ-39(黑色)处理药物选择性MCF7/AdVp3000细胞的敏化指数柱状图。
图4A.Lineweaver-Burk图显示作为A7P浓度函数的不同量的PZ-39对外翻囊泡(inside-out vesicle)(由HEK293/ABCG2细胞制得)上ABCG2介导米托蒽醌摄取的抑制作用。
图4B.Lineweaver-Burk图阐释在不同ATP浓度下测定0或3μMPZ-39对ABCG2介导的米托蒽醌摄取的作用。
图5A.Western印迹分析显示将HEK293/ABCG2细胞暴露在对照(DMSO载体)或3.3μM PZ-39中对ABCG2(上行)或GAPDH(下行)稳态水平的影响。
图5B.Western印迹分析显示将HEK293/ABCG2细胞暴露在对照(DMSO)或3.3μM PZ-39中对ABCG2(上行)稳态水平的影响;暴露于PZ-39之前细胞用环己酰亚胺(CHX)(5μg/ml)处理。
图5C.用CHX/DMSO(对照)或CHX/PZ-39处理后不同时间测定的ABCG2相对水平曲线图。所示数据为采用Scion Imaging通过Western印迹分析测定ABCG2水平的四次试验的平均值±标准差。
图5D.曲线图阐释不同化合物对HEK293/ABCG2细胞表达的ABCG2构象的影响,细胞不使用(细线)或使用(粗线)DMSO载剂(上图)、10μM PZ-39(中图)或10μM FTC(下图)处理。
图5E.Western印迹阐释10μM FTC对用FTC处理对照时间、24、48或72小时的HEK293/ABCG2细胞内ABCG2表达(上行)的影响,下行显示样品中GAPDH的水平。
图5F.Western印迹阐释在HEK293/ABCG2细胞中测定的3μMPZ-39(顶图)、10nM巴弗洛霉素A1(第二图)、PZ-39和巴弗洛霉素A1两者(第三图)以及3μM PZ-39加2μM MG-132(底图)对ABCG2水平(各图中上行)的影响。
图6A.表格显示分子(如PZ-39)的核心结构和多种取代基。
图6B.柱状图阐释HEK293/ABCG2细胞中米托蒽醌(MX)的累积倍数,将其作为3μM多种PZ-39衍生物以及FTC和DMSO载剂(D.C.)的存在的函数进行测定。所显示数据为三次重复试验的平均值±标准差。本图使用图6A中的命名,例如D5=PZ-39。
图6C.柱状图显示HEK293/ABCG2细胞(空白条)或HEK293/ABCG2细胞(黑色条)的敏化指数。
图6D.Western印迹分析阐释3μM C6(顶部)、3μM C8(第二)、E2(第三)、3μM PZ-39(第四)或DMSO载剂(底部)对HEK293/ABCG2细胞中ABCG2水平的影响。
图6E.曲线图阐释不使用(细线)或使用(粗线)C6(顶图)、C8(第二图)、E2(第三图)、PZ-39(第四图)或DMSO(底图)处理HEK293/ABCG2对ABCG2构象的影响。
图7.Western印迹显示PZ-39对ABCG2寡聚化的影响。将用Myc-和HA-标记的ABCG2共转染的HEK293细胞暴露于DMSO(右侧)或3.3μM PZ-39(左侧)中6小时;将细胞裂解物用抗Myc或抗HA的单克隆抗体进行免疫共沉淀,随后用抗HA和抗Myc抗体为探针进行Western印迹分析。
图8.柱状图阐释DMSO载剂(空白条)或PZ-39(填充条)对MCF7/AdVp3000细胞(图A)或HEK293/ABCG2细胞(图B)中ABCG2mRNA水平的影响。
图9A.曲线图阐释用3μM PZ-39处理细胞30分钟对细胞间阿霉素累积的影响,所用细胞为用BC19转染的过表达ABCB1的MCF7细胞(上图)或过表达ABCC1的HEK293/ABCC1细胞(下图)。
图9B.Western印迹显示ABCB1(右侧,上方条带)或GAPDH(下方条带)或ABCC1(左侧,上方条带)或GAPDH(下方条带)的表达。
图10.PZ-38和PZ-39化学结构的比较。
图11A.柱状图显示HEK293/VEC细胞(空白条)或ABCG2转染的HEK293细胞(填充条)中米托蒽醌的累积(以占对照的百分比表示);测定在暴露于如下各条件的细胞中进行:DMSO、3μM FTC或3.8μMPZ-38。
图11B.柱状图阐释MCF7细胞(空白条)或MCF7/AdVp3000细胞(填充条)中米托蒽醌的累积(以占对照的百分比表示)。测定在暴露于如下各条件的细胞中进行:DMSO、3μM FTC或3.8μM PZ-38。
图12A.曲线图阐释存在(细线)或不存在(阴影)不同浓度的PZ-38时,MCF7/AdVp3000细胞中PZ-38(左侧图)或FTC(右侧图)对米托蒽醌累积的浓度依赖效应。实线表示对照细胞MCF7细胞中的米托蒽醌累积。
图12B.曲线图阐释存在(细线)或不存在(阴影)不同浓度的PZ-38时,HEK293/ABCG2细胞中PZ-38(左侧图)或FTC(右侧图)对米托蒽醌累积的浓度依赖效应。实线表示对照细胞HEK293细胞中的米托蒽醌累积。
图13A.曲线图阐释变化PZ-38浓度对HEK293/ABCG2细胞存活百分比的作用。所述细胞不使用(■)或使用0.1μM米托蒽醌处理(IC10,▲)。
图13B.曲线图阐释变化MX浓度对HEK293/ABCG2存活百分比的作用,使用不同浓度的PZ-38(▲,50nM;●,200nM;Y,500nM)或载剂(0.1%DMSO,■)进行测定。数据代表四次独立试验。
图14.Western印迹阐释随着时间变化,DMSO(左侧图)或PZ-38(右侧图)对HEK293细胞中人ABCG2水平的影响。HEK293/ABCG2细胞用3.8μM PZ-38或DMSO对照处理,在暴露于PZ-38后0、2、24、48或72小时时收集,GAPDH用作上样对照。
图15.从用致死量的化合物C8处理的小鼠中收集的组织样本的显微照片。
图16.从用C-8处理的小鼠中收集的组织样本的显微照片。
表1.PZ-39敏化HEK293/ABCG2细胞药物耐受性的功效指数:a)MX=100nM米托蒽醌,其导致-10%的生长抑制(IC10);b)功效指数=不存在与存在低浓度(<IC10)抗癌药米托蒽醌时抑制剂IC50的比值;c)PZ-39在所用浓度范围内无可测得的细胞毒性,并且估计其IC50值大于FTC的~25μM。
表2:HEK293/ABCG2细胞中PZ-39的敏化指数:a)SI=敏化指数,由存在抑制剂时米托蒽醌的IC50除以存在DMSO载剂时米托蒽醌的IC50而确定。
发明详述
尽管本公开内容的概念在本文的附图及本文的描述中进行了详细说明和描述,认为这种说明和描述是性质是示例性而非限定性的,应理解只展示和说明了说明性的实施方案,并且在本公开内容精神范围内的所有变更和修改应受到保护。
本文所用术语“对象”或“患者”意为需要进行治疗的人或动物。该对象可患有疾病或病症或有发生疾病或病症的风险。
术语疾病的“治疗”包括:(1)预防疾病,即,使对象疾病的临床症状不出现,所述对象可能或已经暴露于疾病或可导致该疾病的病症,或是有患疾病倾向但尚未体验到或表现出疾病症状;(2)抑制疾病,即中止或减缓疾病或其任何临床症状的发展;或(3)缓解疾病,即,使疾病或其任何临床症状减退。
词语“治疗有效量”是指能降低给定疾病的严重性和/或频率的本发明化合物的量。降低给定疾病的严重性和/或频率包括中止或逆转所述疾病,以及延缓疾病的进展。
与一种或多种其它治疗剂“联合”施用包括将多种治疗性化合物同时或伴随施用和以任意顺序依次施用。
本文所用“有效剂量”或“治疗有效剂量或量”是指以单一剂量、多剂量或部分剂量提供时,提供化合物的治疗有效量的量。因此,本发明活性化合物的有效剂量包括少于、等于或多于化合物有效量的量;例如,需要两个或更多个单位剂量(如片剂、胶囊等)来施用化合物有效量的药物组合物,或通过施用部分组合物来施用化合物有效量的多剂量药物组合物(如粉剂、液体等)。
或者,需要两个或更多个单位剂量(如片剂、胶囊等)来施用有效量的钙受体活性化合物的药物组合物可在一个或更多个时间段以低于有效量施用(如一天施用一次,和一天施用两次),例如确定个体对象的有效剂量,使个体对象对潜在副作用脱敏,允许有效的剂量再调整或除尽向个体对象施用的一种或更多种其它治疗等。
除非另外指明,术语“约”是指加或减20%,例如,“约1.0”涵盖0.8至1.2的数值范围。
本文所用一些缩略词包括以下几个:ABC,ATP-结合盒;MDR,多药耐受;MX,米托蒽醌;HA,血凝素;SRB,磺酰罗丹明B;PMSF,苯甲基磺酰氟;DMSO,二甲基亚砜;PBS,磷酸盐缓冲液;FTC,烟曲霉毒素C,并如全文中所指出的。
本文公开的本发明的一些方面包括人ABCG2的一种强抑制剂,本文中称为PZ-39。该化合物具有治疗效用,因为其可用于使药物耐受癌症对多种化学治疗药物敏化。示例性化合物PZ-39包含与三嗪环骨架相连的苯并噻唑,其无任何特定的过度活性。PZ-39似乎以两种方式发挥作用:(1)对ABCG2药物转运功能的混合型抑制,和(2)加速ABCG2的溶酶体依赖性降解。单独的PZ-39并不显示过度的细胞毒性;其值约在IC50>25μM的数量级上。然而,PZ-39是过表达ABCG2蛋白的多药耐受癌细胞的非常强效敏化剂。此外,PZ-39核心结构中某些功能基的取代显示出对核心分子功效的增强,这表明核心部分是开发其它ABCG2及相关蛋白质有效抑制剂的合适模板。
ABCG2抑制剂(如PZ-39和PZ-39样化合物)比许多目前用于抑制ABCG2的化合物具有更好的治疗谱。例如,PZ-39是比FTC强效得多的ABCG2抑制剂。在药物累积测定中,3.3μM的PZ-39对ABCG2的抑制效果与10μM的FTC一样。在细胞存活测试中,500μM PZ-39能以约0.04的指数敏化ABCG2介导的米托蒽醌耐受,而同样浓度的FTC的敏化指数仅为约0.26,约小7倍。PZ-39在体外也具有非常低的内在细胞毒性(>25μM),其功效指数也比FTC的好得多,分别为1923和76。PZ-39的治疗指数窗口相对较宽。因此,PZ-39是理想的化学敏化剂,因为其自身表现出非常低的毒性。除了其抑制ABCG2活性的能力外,PZ-39还显示出对ABCG2的溶酶体依赖性降解的加速。这第二种作用方式非常出人意料,并且其极大地增强了PZ-39作为ABCG2活性降低物的功效。该机制还可帮助“回收”细胞中的PZ-39,因而增加其在细胞中的有效浓度,并进一步增强其作为多药耐受抑制剂的功效。
PZ-39表现出的两种作用方式使其成为极有前景的ABCG2抑制剂。在其降低和/或抑制ABCG2活性的第一种方式中,PZ-39在药物摄取测定中表现出混合型抑制。该特性的一个非限制性解释为PZ-39可与ABCG2直接相互作用,尽管其似乎未与米托蒽醌或ATP的结合直接竞争。在其第二种作用方式中,PZ-39表现出对细胞中ABCG2利用度的降低。PZ-39显示出对ABCG2的溶酶体降解的加速,其证据为暴露于PZ-39的细胞中ABCG2蛋白水平的极大降低。该完全出乎意料的第二种活性方式的一个非限制性解释为PZ-39的结合导致ABCG2的构象变化,其随后将ABCG2靶向溶酶体以被降解。有趣的发现是,已报道FTC的结合导致ABCG2的构象变化,但没有FTC加速ABCG2降解的报道。假设PZ-39通过诱导蛋白质构象变化来加速ABCG2的降解,则该发现提示PZ-39和FTC诱导的构象变化可能不同。已发现半胱氨酸突变ABCG2的降解通过蛋白酶体发生,而野生型ABCG2的正常降解通过溶酶体发生,后者半衰期为37小时。还报道激动剂诱导的β2-肾上腺素受体降解通过溶酶体进行,可能是通过增强胞吞作用进行。对这些数据的一个可能解释(以解释而非限定的方式给出)是PZ-39对ABCG2的结合加速胞吞作用和细胞表面运输(trafficking),因而将ABCG2导入溶酶体以进行降解。
本文还公开了某些包含多种功能基的PZ-39衍生物的测试结果,所述功能型基团在对一系列29种衍生化合物在一些形式的化学治疗中使药物耐受细胞对处理敏化的能力的结构活性关系分析中被鉴定。如图6A所示,这些衍生物具有包含与三嗪环骨架相连的苯并噻唑的相同骨架、两个相同的R1基团和一个R2基团。该组中最具活性的衍生物显示的ABCG2抑制与PZ-39在大约相同的数量级上。通常,4’和6’位上的R1取代具有如下的功效顺序:苯氨>吗啉>哌啶≈吡咯烷。R2上的取代也显著影响功效,其顺序如下:N-叔丁基乙酰胺≈N-苯乙酰胺>N-呋喃乙酰胺>乙酸。R1位为苯氨基团并且R2位为N-叔丁基乙酰胺的化合物可能进一步提高核心化合物的抑制活性。
本文还公开了也抑制ABCG2的第二化合物,称为PZ-38。可使用PZ-38使多药耐受细胞对化学治疗化合物敏化。PZ-38抑制ABCG2介导的米托蒽醌转运。如图11A和11B中所示,在ABCG2-转染的HEK293细胞(A)和药物耐受的MCF7/AdVp3000细胞(B)中,PZ-38抑制ABCG2介导的药物外排,其效果好于单独使用DMSO,类似于ABCG2抑制剂FTC。所显示的数据为三次独立试验的平均值±标准差。但是,在这些试验中,在不表达ABCG2的对照MCF7和载体转染的HEK293细胞中,PZ-38对药物累积无可测效应,这些结果的一个可能解释为PZ-38对ABCG2特异。应注意,3.8μM PZ-38与3μM FTC具有大约相同的作用,这表明PZ-38可能仅与FTC一样强,或者也许比FTC稍弱。
材料与方法
材料。抗ABCG2的单克隆抗体BXP-21、抗Myc和抗HA抗体分别获取自ID Labs、Cell Signaling和Roche。生物素辍合的5D3抗体和藻红蛋白-链亲合素辍合物获取自eBiosciences。所有电泳试剂、蛋白浓度测定试剂盒、预制聚丙烯酰胺梯度凝胶和聚偏二氟乙烯膜购自Bio-Rad。FTC、阿霉素、米托蒽醌、DTT、磺酰罗丹明B(SRB)和Triton X-100来自Sigma。Protein-G PLUS-琼脂糖和SYBR Green PCR Master Mix分别来自Santa Cruz Biotechnology和Applied Biosystems。LipofectAMINE Plus和G418购自Invitrogen。细胞培养基IMEM、DMEM和[3H]米托蒽醌分别购自BioSource International、Media Tech.和Moravek Biochemical。PZ-39及其所有衍生物购自SPECS(Wakefield,RI,USA)。所有其它化学物均为分子生物学级别,购自Sigma或Fisher Scientific。
细胞培养、裂解和膜制备。如前所述培养人乳腺癌细胞系MCF7及其衍生系BC19和MCF7/AdVp3000、HEK293/ABCC1、HEK293/载体、HEK293/ABCG2。如之前所述进行裂解物制备。细胞膜以与之前所述完全相同的方式制备(J Biol Chem 279,19781-9(2004);J Biol Chem 277,44268-77(2002);Cell Physiol Biochem 8,246-60(1998)和Cancer Res 66,3248-55(2006)),将最终获得的膜重悬于STBS(250mM蔗糖、150mMNaCl、10mM Tris/HCl,pH7.5)中。
Western印迹、免疫沉淀和流式细胞术。药物累积的Western印迹、免疫沉淀和流式细胞术分析完全按照之前所述进行(J Biol Chem 279,19781-9(2004);Cancer Res 67,4373-81(2007))。
为确定ABCG2降解的机制,先用10nM巴佛洛霉素A1或2μMMG132处理HEK293/ABCG2细胞24小时,然后另用3μM PZ39处理不同时间。随后收集细胞裂解物进行ABCG2的Western印迹分析。为确定ABCG2的半衰期,用10μg/ml环己酰亚胺或3μM PZ-39或两者一起处理培养的HEK293/ABCG2细胞不同时间,然后收集细胞裂解物进行ABCG2表达的Western印迹分析。为确定抑制剂处理后抗体5D3染色的变化,将HEK293/ABCG2细胞与10μM PZ-39、C6、C8、E2或FTC在37℃下一起孵育30分钟,随后加入生物素辍合的5D3抗体(1∶100稀释)并孵育2小时。然后,清洗细胞3次,与藻红蛋白-链亲合素一起孵育30分钟,随后清洗3次并进行流式细胞术分析。
实时RT-PCR和细胞毒性测定。RNA提取和实时RT-PCR按照之前所述进行(Cancer Res 66,3248-55(2006))。ABCG2引物序列为5′-GGCTTTCTACCTGCACGAAAACCAGTTGAG-3’(正向)SEQ.ID.No.1和5′-ATGGCGTTGAGACCAG-3’(反向)SEQ.ID.No 2。GAPDH引物序列为:5’-AAGGACTCATGACCACAGTCCAT-3’(正向)SEQ.ID.No 3和5’-CCATCACGCCACAGTTTCC-3’(反向)SEQ.ID.No 4。用抑制剂处理的相对ABCG2RNA水平(2ΔCT)以对照(具有0.1%的DMSO)的百分比表示,其中ΔCT(阈值循环)=(CTABCG2-CTGAPDH)。
细胞毒性按照之前所述(Cancer Res 66,3248-55(2006))用磺酰罗丹明B(SRB)比色测定确定。通过在不存在或存在不同浓度抑制剂时将细胞暴露于一定范围浓度的抗癌药(例如米托蒽醌)中来确定化合物抑制剂对药物耐受的作用。抑制剂的功效和敏化指数的计算如下:
功效指数=IC50(抑制剂)/IC50(抑制剂+药物)
敏化指数=IC50(药物+抑制剂)/IC50(药物)
药物转运动力学分析。利用膜泡的药物摄取测定按照我们之前所述方式进行(J Biol Chem 277,44268-77(2002)),采用[3H]米托蒽醌作为ABCG2的底物。用不同浓度[3H]米托蒽醌、ATP和PZ-39存在时产生的数据生成Lineweaver-Burk图来进行动力学分析。动力学常数Km、Vmax和Ki用如前所述方法计算,例如,参见Cancer Res 65,1541-6(2005)及其中参考文献。
实施例
化合物PZ-39对米托蒽醌累积的作用。通过对Specs的小分子化合物文库的不同类型代表物的理性筛选来寻找ABCG2介导的药物外排的潜在抑制剂,本发明人鉴定得到在过表达ABCG2的MCF7/AdVp3000细胞中显著逆转米托蒽醌累积的化合物(N-(4-氯代苯基)-2-[(6-{[4,6-二(4-吗啉基)-1,3,5-三嗪-2-基]氨基}-1,3-苯并噻唑-2-基)硫基]乙酰胺),其具有与三嗪环骨架相连的苯并噻唑,(下文中称为PZ-39,见图1)。如图2A中所示,PZ-39增强MCF7/AdVp3000中米托蒽醌的累积,但对不产生ABCG2的敏感型亲本MCF7细胞不起作用,这表明ABCG2介导的药物外排被抑制。由于MCF7/AdVp3000细胞除ABCG2外还过表达其它ABC转运蛋白(如ABCC3),PZ-39可能抑制除ABCG2外的ABC转运蛋白,导致米托蒽醌累积增加。为直接检测PZ-39是否抑制ABCG2,用ABCG2转染的稳定HEK293(HEK293/ABCG2)细胞进行了类似研究。如图2B中所示,用PZ-39预孵育细胞增强了HEK293/ABCG2细胞内米托蒽醌的累积,但仅用载体转染的对照细胞中没有该作用。因此,PZ-39可能抑制ABCG2介导的米托蒽醌外排。图2A和2B还显示3.3μM的PZ-39与10μM已知的ABCG2特异性抑制剂FTC所达到的作用水平相当,这表明PZ-39可比FTC强~3倍。这些数据是三次独立试验的平均值±标准差(与DMSO载剂比较,*P<0.05,**P<0.01)。
为进一步调查PZ-39对ABCG2的功效,用流式细胞术确定了PZ-39对HEK293/ABCG2细胞米托蒽醌累积的剂量效应作用。如图2C中所示,PZ-39以剂量依赖方式提高了细胞内的米托蒽醌水平。3.3μM时,PZ-39将HEK293/ABCG2的细胞内米托蒽醌水平完全恢复至对照细胞中的水平。在图2D中,另一方面,FTC仅在10μM水平时达到类似作用水平,这支持了PZ-39是比FTC更强的ABCG2抑制剂这一论点。
PZ-39对药物耐受的敏化。为调查PZ-39作为ABCG2介导之药物耐受的化学敏化剂的潜在用途,在不存在或存在0.1μM米托蒽醌(其自身产生~10%的细胞死亡)时,确定PZ-39对HEK293/ABCG2细胞药物响应的作用。在图3A和3B中,PZ-39未显示对HEK293/ABCG2的细胞毒性;其IC50在所用浓度范围内检测不到,而FTC的IC50为~25μM的数量级。敏化米托蒽醌耐受所需的PZ-39和FTC的IC50值分别为~13nM和~326nM。因此,估计PZ-39的功效指数约为>1923,而FTC的功效指数据估计为~76(表1)。
表1:PZ-39敏化HEK293/ABCG2细胞药物耐受的功效指数。
a.MX=100nM米托蒽醌,可产生~10%的生长抑制(IC10);
b.功效指数=不存在与存在低浓度(<IC10)抗癌药米托蒽醌时抑制剂IC50的比值。
c.PZ-39在所用浓度范围内无可测得的细胞毒性,并且估计其IC50值大于FTC的~25μM。
在图3C中,为进一步调查PZ-39对ABCG2的抑制活性,在存在三种不同浓度的PZ-39(50、200或500nM)或仅有载剂对照(0.1%DMSO,PZ-39浓度为0)时评估PZ-39对HEK293/ABCG2细胞米托蒽醌细胞毒性的影响。如图3C中所示,50nM的PZ-39以0.4的敏化指数显著降低了米托蒽醌的IC50(表2)。500nM时,PZ-39的敏化指数为0.04,而FTC在同样浓度下的敏化指数为0.26(见图3D和表2)。这些结果证明PZ-39是非常强的ABCG2抑制剂。
表2:HEK293/ABCG2细胞中PZ-39的敏化指数
a.SI=敏化指数,由存在抑制剂时米托蒽醌的IC50除以存在DMSO载剂时米托蒽醌的IC50而确定。
为调查PZ-39是否能逆转药物耐受癌细胞系中ABCG2介导的多药耐受,采用了药物选择性MCF7/AdVp3000细胞,并检测了ABCG2的另两种抗癌药底物,阿霉素和喜树碱((S)-4-乙基-4-羟基-1H-吡喃并[3′,4′:6,7]吲嗪[1,2-b]喹啉-3,14-(4H,12H)-二酮)。如图3E中所示,200nM的PZ-39极大地降低了MCF7/AdVp3000对阿霉素和喜树碱的耐受,类似于用米托蒽醌得到的结果。与之不同,与相同浓度使用的PZ-39相比,使用FTC的对照对所有三种药物均表现出更低的敏化作用。用SRB测定收集数据。用不存在或存在PZ-39和FTC时米托蒽醌的IC50计算敏化指数。所示数据为三次独立试验的平均值±标准差。
化合物PZ-39表现出两种作用方式。在图4中,为研究PZ-39抑制ABCG2介导药物转运的作用机制,先采用分离的外翻膜泡(获取自HEK293/ABCG2)研究PZ-39抑制的动力学。测定了存在不同浓度PZ-39时米托蒽醌摄取的变化。将外翻质膜泡用0.6、1.2和1.8μM[3H]米托蒽醌(A)或0.1、0.2、0.5、1和5mM ATP及0.6μM[3H]米托蒽醌孵育。如Lineweaver-Burk图(图4A)所示,通过将膜泡在37℃下暴露于3μMPZ-39中5分钟,然后测定米托蒽醌的摄取来收集数据。估计不存在PZ-39时米托蒽醌转运的Km和Vmax分别为2.3μM和455pmol/mg蛋白质。PZ-39存在时米托蒽醌转运的Km和Vmax值均表现出降低,估算其Ki为~0.52μM,这暗示混合型抑制。由于ABCG2引起的米托蒽醌转运和ATP水解与ATP摄取相关,我们以ATP为可变底物进行了另一项试验。在图4B中,PZ-39也改变了米托蒽醌转运的Km和Vmax。因此,PZ-39可通过混合型抑制来抑制米托蒽醌转运与ATP水解的关联过程。PZ-39与ABCG2的结合位点可能与米托蒽醌和ATP的不同。所示数据为三次独立试验的平均值±标准差。
在图5,为进一步检测PZ-39对ABCG2的作用机制,我们对用PZ-39处理的HEK293/ABCG2细胞中ABCG2的表达水平进行了Western印迹分析。如图5A中所示,ABCG2蛋白的稳态水平在用PZ-39处理1天后显著降低,其中在2小时时有少量下降。该发现表明PZ-39可能具有两种作用方式;抑制ABCG2活性(急性作用)和降低ABCG2水平(慢性作用)。这些ABCG2的结果与我们的发现一致,即PZ-39在药物累积测定(急性作用)中约比FTC强3倍,但在药物敏化测定(慢性效应)中比FCT强~7倍。
在图8中,为确定PZ-39对ABCG2表达的慢性作用是否发生在mRNA水平,我们对用PZ-39处理不同时间(最多为3天)的MCF7/AdVp3000和HEK293/ABCG2细胞进行了实时RT-PCR分析。两种细胞系中均未发现PZ-39处理后ABCG2 mRNA的显著变化。因此,PZ-39不太可能在ABCG2的mRNA水平上影响其表达。然后,检测了PZ-39与ABCG2的结合使ABCG2成为降解靶标的可能性。为检测这种可能性,将HEK293/ABCG2细胞用环己酰亚胺预处理,随后用PZ-39处理不同时间,以确定ABCG2的降解速率。如图5B所示,用PZ-39和环己酰亚胺联合处理的细胞中ABCG2的减少远比不用PZ-39处理的对照细胞中的快。在图5C中,估计在PZ-39存在时ABCG2的半衰期为~5小时,而其在对照中稳定,估计半衰期为~54小时。因此PZ-39可能加速ABCG2蛋白的降解。
PZ-39诱导ABCG2的构象变化及其在溶酶体中的降解。PZ-39引起的ABCG2加速降解可能是由于PZ-39与ABCG2的结合诱导其构象变化而使其成为降解靶标。为确定PZ-39的结合是否潜在地导致了ABCG2的构象变化,使用了单克隆抗体5D3。已报道在ABCG2抑制剂的存在下5D3更容易结合到ABCG2表面上,推测是由于抑制剂诱导的构象变化7,10。
在图5D中,通过用荧光标记的单克隆抗体5D3对蛋白质染色并进行流式细胞术分析来检测ABCG2的构象。向右偏移表明ABCG2构象的改变,其影响了5D3的结合。用载剂(DMSO)处理无影响(上图),而用FTC或PZ-39处理对ABCG2结构具有相当的作用。如图5D所示,PZ-39导致5D3染色的增强,这表明ABCG2可能因PZ-39结合产生构象变化。已知FTC是改变ABCG2构象的化合物,其也如预期增强了5D3的染色。不过,其未影响ABCG2的水平(图5E),这表明FTC和PZ-39引起的构象改变可能不一样。这些结果与其它数据(包括Western印迹研究)一致,这表明只有用PZ-39而不是FTC处理具有降低细胞中ABCG2水平的作用。
在图5F中,为进一步确定PZ-39诱导ABCG2降解的机制,我们采用了溶酶体蛋白质降解抑制剂巴佛洛霉素A1和蛋白酶体抑制剂MG-132。将细胞用3μM PZ-39(顶图)、10nM巴佛洛霉素A1(第二图)处理,10nM巴佛洛霉素A1与3μM PZ-39共同处理细胞抑制PZ-39诱导的ABCG2降解(第三图),而用2μM MG-132与巴佛洛霉素A1共同处理的细胞没有抑制(底图),这表明PZ-39诱导的ABCG2降解可能为溶酶体依赖性的。在细胞暴露之前(对照)、暴露之后24小时、48小时和72小时(第三图),以及暴露前、暴露后2小时、24小时和48小时(下图)取样。综上,可推论PZ-39的结合导致了ABCG2的构象变化,使其成为溶酶体降解靶标。
PZ-39类似物的结构活性关系分析。为调查PZ-39的功能基团,用多种化合物对PZ-39进行了结构活性关系(SAR)分析,所述化合物包含以图6A表中的命名物按所示的进行功能化的PZ-39核心结构。获得各带有一个或多个变更的共计29种PZ-39的衍生物。4′和6′位的R1基团与PZ-39相同,所有在三嗪环上带有R1取代的衍生物还具有R2修饰。检测这些衍生物及PZ-39(图6A中命名为D5)抑制ABCG2介导米托蒽醌累积减少的能力。功能基还以有利(粗箭头)或不利(细箭头)取代来表示;还显示了烟曲霉毒素C(FTC)的结构。表包括化合物的命名及其抑制MX从细胞外排能力的荧光强度,在表中以荧光强度显示,其与细胞螯合的荧光化合物MX量成比例。
在图6B中,曲线图阐释相同量的不同化合物(具有不同R1和R2基团取代的化合物)存在时细胞螯合的MX归一化量,所述化合物在药物转运测定中表现出与PZ-39相比或减少或增加的抑制活性。这些衍生物中的16种比FTC效果好,3种表现出与PZ-39(D5)相似的或更强的抑制活性。图6A还概述了对PZ-39活性有正向和负向影响的取代。简言之,R2位的N-叔丁基乙酰胺(C6)和N-苯乙酰胺(D9)取代对分子的抑制活性没有太大影响。而乙酸(C1)和N-呋喃乙酰胺(C5)的取代降低了分子的抑制活性。与化合物D9相比,其活性与PZ-39相似。R1位上包含吗啉取代的化合物A2表现出减弱的抑制活性(图6B)。类似地,R1位的哌啶取代减弱抑制活性(图6B)。R1位的苯胺基取代(E2)极大地增强了抑制活性(与化合物C4相比,图6B)。综上,R1取代对ABCG2抑制活性的影响顺序如下:苯胺>吗啉>哌啶≈吡咯烷,R2取代对ABCG2抑制活性的影响顺序如下:N-叔丁基乙酰胺≈N-苯乙酰胺>N-呋喃乙酰胺>乙酸。
在图6C中,为进一步确定这些衍生物对ABCG2介导的药物耐受的作用,用HEK293/ABCG2细胞对3种所选类似化合物C6、C8和E2进行SRB测定,并将其与PZ-39的该试验效果比较。图6B中绘制的敏化值是通过用SRB测定检测米托蒽醌的IC50值来计算的。所示数据为四组独立试验的平均值±标准差。所有三种测试化合物在HEK293/ABCG2细胞中50nM水平上对米托蒽醌具有与PZ-39相似的敏化指数,而对HEK293/载体对照细胞没有影响。
在图6D中,为检测这些衍生物对ABCG2表达的长期作用,我们在分别用3μM C6、C8、E2或PZ-39或DMSO(对照)处理不同时间(最多3天)后进行了Western印迹分析。所有4种化合物均影响ABCG2水平。各图上行显示了ABCG2的水平,下行显示了GAPDH的水平;在暴露于所示化合物后0、2、24、48和72小时取样。所有3种测试PZ-39衍生物还导致了ABCG2的构象变化,这与PZ-39类似。因此,这些衍生物可能均通过与目前认为的PZ-39作用机制相似的方式发挥作用。
在图6E中,曲线图阐释3μM C6、或C8、或E2、或PZ-39或DMSO(对照)对ABCG2构象的影响。不用(细线)或使用(粗线)图中所示化合物处理HEK/ABCG2细胞,然后用单克隆抗体5D3染色并进行流式细胞术分析。
PZ-39对ABCG2寡聚化的影响。在图7中,由于认为ABCG2以同型二聚体或更高形式寡聚体发挥作用,因此检测PZ-39对ABCG2寡聚化的影响。为此,在用3.3μM PZ-39处理6小时后,将两种不同标记的ABCG2如前所述(Cancer Res 67,4373-81(2007))进行免疫共沉淀。然而没有发现PZ-39对ABCG2免疫共沉淀的影响,这些结果表明,PZ-39不影响ABCG2的寡聚化。
PZ-39对ABCB1或ABCC1介导的药物转运的影响。在图9A中,为调查PZ-39的特异性,检测3μM PZ-39对ABCB1和ABCC1介导的细胞内阿霉素累积减少的作用,所述检测使用经载体转染以过表达ABCB1(BC19)的MCF7细胞和过表达ABCC1的HEK293/ABCC1细胞。细胞用DMSO载剂或3.3μM PZ-39处理30分钟,而后确定细胞内阿霉素累积(A)或用DMSO载剂或3.3μM PZ-39处理3天。粗线代表经载体转染成为BC19的对照MCF7细胞或经载体转染成为HEK293/ABCC1的HEK293细胞。灰色区域和粗线分别代表以DMSO和PZ-39处理细胞得到的数值。发现PZ-39对ABCB1和ABCC1减少阿霉素累积的活性无影响(图9A)。
在图9B中,Western印迹表明PZ-39对ABCB1或ABCC1稳态水平无影响。在这些测定中用GAPDH作为蛋白质上样对照。在用PZ-39处理3天后测定细胞中这些蛋白质。这些结果与PZ-39对ABCG2特异或至少对其具有高选择性的结论一致。
PZ-38对米托蒽醌累积的浓度依赖作用。为进一步调查PZ-38对ABCG2的相对抑制功效,通过流式细胞术检测MCF7/AdVp3000细胞(上图)和HEK293/ABCG2细胞(下图)中PZ-38对累积的浓度依赖作用。在图9中,两种ABCG2过表达细胞系中PZ-38的加入以剂量依赖方式提高胞内米托蒽醌水平。与ABCG2阴性细胞(粗线)相比,两种ABCG2过表达细胞中无PZ-38时,米托蒽醌的累积均显著下降(阴影峰)。但是,浓度为10μM时,PZ-38不能完全恢复米托蒽醌的累积,这表明其作用效力比PZ-39或FTC低。
PZ-38对药物耐受的逆转。在图11A中,为确定PZ-38是否能使过表达ABCG2的细胞对抗癌药物敏化,我们检测了DMSO、3.0mM FTC或3.8mM PZ-38对ABCG2转染的HEK293(实心柱)或HEK293/载体对照细胞(空心柱)中MX累积的影响。在图11B中,为确定PZ-38是否能使过表达ABCG2的细胞对抗癌药物敏化,我们检测了DMSO、3.0mM FTC或3.8mM PZ-38对ABCG2转染的MCF7/AdVp3000(实心柱)或MCF7对照细胞(空心柱)中MX累积的影响。
在三种不同浓度PZ-38(50、200、500nM)以及仅有载剂(0.1%DMSO)存在时,检测ABCG2的活性。如图12B中所示,PZ-38以剂量依赖方式影响ABCG2介导的药物耐受。
在图13A中,为检测PZ-38对ABCG2功能的抑制活性,也评估了PZ-38对ABCG2转染细胞中米托蒽醌毒性的浓度依赖性作用。在不存在(■)或存在(▲)0.1μM米托蒽醌时(其单独产生少于10%的细胞生长抑制)检测HEK293/ABCG2细胞的存活。化合物PZ-38在浓度高至10μg/ml时无细胞毒性,但它可在此浓度下使细胞对米托蒽醌敏化。PZ-38敏化米托蒽醌耐受的IC50约为45nM。有意思的是,之前测定的FTC敏化米托蒽醌耐受的IC50为326nM,这表明PZ-38与PZ-39相似,在敏化药物耐受上比FTC更强。由于PZ-38在抑制ABCG2介导的药物外排方面不比FTC强,其在存活测定中增强的功效可能是由于对ABCG2稳定性的作用。在图13B中,我们还测定了采用不同浓度PZ-38时改变米托蒽醌浓度对细胞存活的影响。本图说明了改变托蒽醌浓度对HEK293/ABCG2细胞存活百分比的影响,用不同浓度PZ-38(▲,50nM;●,200nM;Y,500nM)或载剂(0.1%DMSO,■)进行测定。该数据代表了四组独立试验。
PZ38对人ABCG2、ABCB1和ABCC1表达水平的影响。在图14中,为确定PZ38是否也作用于ABCG2并以与PZ-39类似的作用方式使其在细胞内的降解,用PZ-38处理后对ABCG2进行Western印迹分析。在暴露于单独的DMSO(右侧)或DMSO加PZ-38(左侧)后0、2、24、48和72小时,对细胞取样并检测ABCG2(上方条带)和GAPDH(下方条带)。与用作对照的仅以DMSO处理的细胞相比,PZ-38处理后的ABCG2水平显著下降。考虑到PZ-39导致ABCG2的溶酶体依赖性降解,PZ-38可能对ABCG2有类似的作用机制。还发现PZ-38对ABCB1和ABCC1介导的药物外排没有影响(数据未显示),这表明PZ-38可能对ABCG2特异。
小鼠中某些ABCG2抑制剂引发急性毒性。为确定具有两种作用方式的新ABCG2抑制剂的急性毒性(致死剂量50,LD-50),测试化合物C8以确定其对小鼠的作用。简言之,以三种剂量(30mg/kg、10mg/kg或3mg/kg)之一的化合物对BALB/c小鼠施以单次腹膜内注射。对照动物以溶剂处理。注射化合物或只含载体的对照后一周内,一天两次观察小鼠的死亡率。结果显示,30mg/kg组8只小鼠中5只死亡,10mg/kg组7只小鼠中2只死亡,而3mg/kg组所有6只小鼠均存活。根据存活曲线,估计C8对BALB/c的LD-50为约22.5mg·kg-1。
通过组织病理学测试检测对C8诱导的组织损伤。在图15中,为进一步调查C8是否导致组织损伤,将化合物C8溶于配方1(formula number1)(购自Pharmatek Laboratories,San Diego,California,USA),并对BALB/c小鼠腹膜内注射30mg/kg致死剂量的C8。处理后第二天,从用二氧化碳实施安乐死的小鼠收集包括脑、心、肺、肝、脾、胃、肠、膀胱、肾和卵巢的组织,并立即固定在中性福尔马林缓冲液中。对于进行组织病理学测试,将石蜡包埋的脑、心、肝、肺或卵巢组织切片用苏木精和伊红(H&E)进行染色。组织病理学研究表明,与正常组织(图15-A行)相比,BALB/c小鼠经处理组织样本(图15-B行)没有病理学变化。
图16为C8诱导的、可能在从动物胃、肠、脾、肾或膀胱收集组织中发生的组织损伤的病理学研究的显微照片。对照(图16-A行)和C8处理(图16-B杭)的切片用H&E染色。在×10原始放大倍率下采集图像。与正常组织相比,注射C8的小鼠组织没有明显的病理学变化。
尽管已在附图及之前说明书中说明并描述了新技术,应认为其性质是说明性的而非限定性的,需理解的是,仅展示并描述了优选的实施方案,且所有在本新技术精神范围内的变更和修饰均需要得到保护。尽管本发明技术用具体实例、理论论据、数值和说明进行了阐释,决不应认为这些阐释与伴随的讨论为对技术的限制。所有专利、专利申请以及本申请中引用的原文、科学论文、出版物等参考通过整体引用并入本文。
参考文献
1.Xu,J.,Liu,Y.,Yang,Y.,Bates,S.& Zhang,J.T.Characterization of oligomerichuman half-ABC transporter ATP-binding cassette G2.J Biol Chern 279,19781-9(2004).
2.Xu,J.et al.Oligomerization domain of the multi drug resistance-associatedtransporter ABCG2 and its dominant inhibitory activity.Cancer Res 61,4373-81(2007).
3.McDevitt,CA.et al.Purification and 3D Structural Analysis of OligomericHuman Multidrug Transporter ABCG2.Structure 14,1623-32(2006).
4.Zhang,J.T.Biochemistry and pharmacology of the human multi drug resistancegene product,ABCG2.Zhong Nan Da Xue Xue Baa YiXue Ban 32,531-41(2007).
5.Allen,J.D.et al.Potent and specific inhibition of the breast cancer resistanceprotein multidrug transporter in vitro and in mouse intestine by a novel analogueof fumitremorgin C.MoI Cancer Ther 1,417-25(2002).
6.Henrich,CJ.et al.A high-throughput cell-based assay for inhibitors of ABCG2activity.J Biomol Screen 11,176-83(2006).
7.Henrich,CJ.et al.New inhibitors of ABCG2 identified by high-throughputscreening.MoI Cancer Ther 6,3271-8(2007).
8.Ahmed-Belkacern,A.et al.Inhibitors of cancer cell multi drug resistancemediated by breast cancer resistance protein(BCRP/ABCG2).Anticancer Drugs 17,239-43(2006).
9.Xu,1.,Peng,H.& Zhang,1.T.Human multidrug transporter ABCG2,a targetfor sensitizing drug resistance in cancer chemotherapy.Curr Med Chem14,689-701(2007).
10.Ozvegy-Laczka,C.et al.Function-dependent conformational changes of theABCG2 multi drug transporter modify its interaction with a monoclonal antibodyon the cell surface.J Bioi Chem 280,4219-27(2005).
Claims (26)
2.根据权利要求1的方法,其中所述抑制ABCG2的化合物为PZ-39。
3.根据权利要求1的方法,其中与所述细胞接触的PZ-39的量约为45nM或更少。
4.根据权利要求1的方法,其中所述抑制ABCG2的化合物为PZ-38。
5.根据权利要求1的方法,其中所述化学治疗试剂为蒽环类抗生素。
6.根据权利要求5的方法,其中所述蒽环类抗生素为阿霉素。
7.根据权利要求1的方法,其中所述化学治疗试剂为蒽二酮类。
8.根据权利要求7的方法,其中所述蒽二酮类为米托蒽醌。
9.根据权利要求1的方法,其中所述化学治疗试剂为拓扑异构酶I抑制剂。
10.根据权利要求9的方法,其中所述拓扑异构酶I抑制剂为拓扑替康。
11.根据权利要求9的方法,其中所述拓扑异构酶I抑制剂为喜树碱。
13.根据权利要求12的方法,其中所述抑制ABCG2的化合物为PZ-39。
14.根据权利要求13的方法,其中与所述细胞接触的PZ-39的量约为45nM或更少。
15.根据权利要求12的方法,其中所述抑制ABCG2的化合物为PZ-38。
17.根据权利要求16的方法,其中所述抑制ABCG2的化合物为PZ-39。
18.根据权利要求16的方法,其中所述抑制ABCG2的化合物为PZ-38。
19.根据权利要求16的方法,其中施用给所述患者的PZ-39的剂量约为45nM或更低。
20.根据权利要求16的方法,其中所述化学治疗试剂为蒽环类抗生素。
21.根据权利要求20的方法,其中所述蒽环类抗生素为阿霉素。
22.根据权利要求16的方法,其中所述化学治疗试剂为蒽二酮类。
23.根据权利要求22的方法,其中所述蒽二酮类为米托蒽醌。
24.根据权利要求16的方法,其中所述化学治疗试剂为拓扑异构酶I抑制剂。
25.根据权利要求24的方法,其中所述拓扑异构酶I抑制剂为拓扑替康。
26.根据权利要求24的方法,其中所述拓扑异构酶I抑制剂为喜树碱。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510459818.4A CN105213401B (zh) | 2008-10-24 | 2009-10-24 | 敏化多药耐受细胞的材料和方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10816108P | 2008-10-24 | 2008-10-24 | |
US61/108,161 | 2008-10-24 | ||
PCT/US2009/061980 WO2010048603A1 (en) | 2008-10-24 | 2009-10-24 | Materials and methods for sensitizing multidrug resistant cells |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510459818.4A Division CN105213401B (zh) | 2008-10-24 | 2009-10-24 | 敏化多药耐受细胞的材料和方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102271684A true CN102271684A (zh) | 2011-12-07 |
CN102271684B CN102271684B (zh) | 2016-01-13 |
Family
ID=42119712
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200980150381.9A Expired - Fee Related CN102271684B (zh) | 2008-10-24 | 2009-10-24 | 敏化多药耐受细胞的材料和方法 |
CN201510459818.4A Active CN105213401B (zh) | 2008-10-24 | 2009-10-24 | 敏化多药耐受细胞的材料和方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510459818.4A Active CN105213401B (zh) | 2008-10-24 | 2009-10-24 | 敏化多药耐受细胞的材料和方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8455252B2 (zh) |
CN (2) | CN102271684B (zh) |
WO (1) | WO2010048603A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103102314B (zh) * | 2012-01-12 | 2015-09-09 | 四川大学 | 苯并噻唑、苯并咪唑、苯并噁唑衍生物及其制备方法和用途 |
CN112076182B (zh) * | 2020-09-03 | 2022-10-21 | 中山大学 | Dna拓扑异构酶抑制剂在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染药物中的应用 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6943161B2 (en) | 1999-12-28 | 2005-09-13 | Pharmacopela Drug Discovery, Inc. | Pyrimidine and triazine kinase inhibitors |
-
2009
- 2009-10-24 CN CN200980150381.9A patent/CN102271684B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2009-10-24 CN CN201510459818.4A patent/CN105213401B/zh active Active
- 2009-10-24 WO PCT/US2009/061980 patent/WO2010048603A1/en active Application Filing
- 2009-10-24 US US13/125,530 patent/US8455252B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US8455252B2 (en) | 2013-06-04 |
CN105213401B (zh) | 2019-04-19 |
WO2010048603A8 (en) | 2010-06-24 |
CN102271684B (zh) | 2016-01-13 |
WO2010048603A1 (en) | 2010-04-29 |
US20110301108A1 (en) | 2011-12-08 |
CN105213401A (zh) | 2016-01-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kumar et al. | PLK‐1 targeted inhibitors and their potential against tumorigenesis | |
ES2375293T3 (es) | Selección de compuestos para tratamiento de enfermedad de alzheimer. | |
Brunden et al. | The characterization of microtubule-stabilizing drugs as possible therapeutic agents for Alzheimer's disease and related tauopathies | |
Brunden et al. | Microtubule-stabilizing agents as potential therapeutics for neurodegenerative disease | |
Jani et al. | PF-03814735, an orally bioavailable small molecule aurora kinase inhibitor for cancer therapy | |
Murugan et al. | Plk1-targeted small molecule inhibitors: molecular basis for their potency and specificity | |
US8673914B2 (en) | Use of phosphodiesterase inhibitors for treating multidrug resistance | |
JP7117797B2 (ja) | プラチナ薬剤の毒性の予防方法 | |
CN1980649A (zh) | 治疗免疫炎性疾病的方法和试药 | |
CN106715443A (zh) | Fl118母核化学结构平台产生用于治疗人类疾病的fl118衍生物的用途 | |
KR20190103154A (ko) | 암의 치료법을 위한 brd4 억제제 및 항폴레이트의 조합 | |
Kurata et al. | Characteristics of pemetrexed transport by renal basolateral organic anion transporter hOAT3 | |
KR20170123602A (ko) | 암의 병용 치료법 | |
Cuyàs et al. | Revisiting silibinin as a novobiocin-like Hsp90 C-terminal inhibitor: computational modeling and experimental validation | |
Kim et al. | Glucosamine is an effective chemo-sensitizer via transglutaminase 2 inhibition | |
Kaneko et al. | Potentiation of bleomycin in Jurkat cells by fungal pycnidione | |
He et al. | Clinically significant drug‐drug interaction between tacrolimus and fluconazole in stable renal transplant recipient and literature review. | |
Chiosis et al. | Discovery and development of purine-scaffold Hsp90 inhibitors | |
EP2723339A2 (en) | Compounds for treating peripheral neuropathies and other neurodegenerative disorders | |
CN102271684A (zh) | 敏化多药耐受细胞的材料和方法 | |
Castaneda et al. | Phase I and pharmacokinetic study of lonafarnib, SCH 66336, using a 2-week on, 2-week off schedule in patients with advanced solid tumors | |
Zhang et al. | SKLB-14b, a novel oral microtubule-destabilizing agent based on hydroxamic acid with potent anti-tumor and anti-multidrug resistance activities | |
Jeon et al. | Anticancer activity of indeno [1, 2-b]-pyridinol derivative as a new dna minor groove binding catalytic inhibitor of topoisomerase iiα | |
WO2015058185A1 (en) | Separase inhibitors and uses thereof | |
Kamal et al. | Future of drug discovery |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1164717 Country of ref document: HK |
|
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: WD Ref document number: 1164717 Country of ref document: HK |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160113 Termination date: 20181024 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |