CN102239248A - 同轴封装的细胞悬浮液和微组织 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了多个细胞在单个细长隔室中的同轴封装。通过这种封装，细胞被至少一种分隔材料层保护且保持紧密接触，这引起该封装细胞的较好的活力，并从而导致形成微组织的较高机会。公开了用于产生这种封装的细胞隔室的方法和设备，以及这种区室在细胞、组织治疗和组织工程中的医学应用。

Description

同轴封装的细胞悬浮液和微组织
发明领域
本发明涉及再生医学领域，尤其涉及细胞治疗和组织工程，并且本发明提供了用于细胞悬浮液的同轴封装和/或微组织的产生的设备和方法。并且，公开了同轴封装的细胞悬浮液、微组织和组织、以及它们的医学应用。
背景技术
再生医学是医学科学领域中新兴发展的学科。有众多方法和途径用于再生医学中。
细胞治疗基于细胞、尤其是干细胞向受损的组织区域的递送，以便恢复组织功能。
在组织工程中，利用支架和细胞使组织在体外生长。然后将工程组织植入患者，以便取代受损的或失去的组织。
细胞的处理和生长是这些应用中的关键因素。通常地，首先从适当的细胞源，即从患者(“自体的”)或从供体(异源的)收获细胞，并且使其随后经历几个不同步骤，直至最终将它们再次导入患者中，以取代或恢复受损的组织。尽管细胞治疗和组织工程在最近几年中有巨大的进展，但基本的和必需的步骤，例如细胞处理、支架中的细胞(内)生长、细胞分化、细胞递送和细胞保留仍然是成问题的，并且在再生医学成为临床相关之前需要进一步的改进。
特别地，在细胞治疗和组织工程领域中持续存在三个主要问题。首先，注射入患者的细胞需要在位于受损组织的区域中、例如损伤位点停留并保持存活。(干-)细胞治疗的基本原则是在损伤或疾病区域中导入(干-)细胞。被新导入的(干-)细胞具有生长、分裂和分化的能力，并且可以将具有与天然组织相同或相似结构和功能的新形成的组织重新住入(repopulate)受损位点。对发展中的细胞治疗的主要关注点在于下列事实，对于许多治疗，需要大量过量的细胞。通常地，只有1%的注射细胞得以递送和/或保留在目的区域中并在第一周存活。细胞是昂贵的，且难以大量获得(耗时的)。因此，需要含有这种注射细胞和防止它们从注射位点移出，同时允许这些细胞生长、复制和分化的手段。
其次，异质(微)组织、例如血管组织或神经组织的供应仍然是主要的挑战。
第三，体外工程组织目前仅可以具有相当有限的厚度(在约100 μm的范围内)。这是由于下列事实：在使这些组织生长时，不存在允许为工程组织的所有细胞供应例如营养物和氧的血管系统。因此，尤其是通过当前手段进行工程组织的最里面的细胞趋于相继死亡。
发明内容
本发明的目的是提供克服这些问题的手段。特别地，本发明的一个目的是提供允许多个细胞封装在一个同轴和细长的隔室(compartment)中的手段，其中封装的细胞可以彼此连通(communicate)以便增加它们的活力，并由于较容易形成细胞-细胞接触因而增加形成微组织的机会。因此，本发明的一个目的是提供同轴和细长的封装细胞悬浮液的产生方法，所述封装细胞悬浮液包含多个细胞，所述细胞具有彼此连通的可能性。
并且，本发明提供了使厚度为100 μm以上的组织从包含多个细胞的这种细长隔室生长的手段。这是由于下列事实：这种细长隔室可以被培养为纤维状微组织，其在进一步的步骤中可以被排列或堆叠，以便形成厚度增加的组织。这种组织也可以是异质组织，即，它们可以包含不同的细胞类型。
在本发明的一方面，提供了用于同轴挤出的喷嘴 8，其包括至少两个同轴圆筒，其中每个圆筒含有细胞悬浮液1、包含细胞信号分子的溶液或分隔材料3，其中含有细胞悬浮液的或含有包含信号分子的溶液的圆筒被含有分隔材料的圆筒分隔，并且其中最外面的圆筒含有分隔材料。
在本发明的进一步方面，提供了包含根据本发明的喷嘴的挤出机。
在本发明的更进一步方面，提供了根据本发明的喷嘴或挤出机用于产生包含被分隔材料层封装的细胞悬浮液的至少一个隔室的用途。
在本发明的进一步方面，提供了用于细胞悬浮液的封装和/或微组织的产生的方法，所述方法包括：同轴挤出至少一种细胞悬浮液、至少一种分隔材料和任选地至少一种包含细胞信号分子的溶液，其中细胞悬浮液或包含信号分子的溶液被分隔材料分隔，并且其中得到的最外面层由分隔材料组成。
在本发明的进一步方面，提供了可通过根据本发明方法获得的封装的细胞悬浮液或微组织。
在本发明的进一步方面，提供了用作药物的本发明的封装的细胞悬浮液或微组织。
在本发明的另一方面，提供了组织的产生方法，其包括堆叠至少两层根据本发明的微组织的步骤。
最后，提供了包含至少两个堆叠的根据本发明的或可通过本发明方法获得的微组织层的组织。
本发明目的的其他细节、特征、特性和优点在从属权利要求、附图和详述中进行公开。
附图说明
附图以示范性方式示出了本发明的优选实施方案。具体而言，
图1示出根据本发明的喷嘴8的截面，所述喷嘴8包含两个同轴圆筒。中央圆筒含有包含多个细胞2的细胞悬浮液1。外部圆筒含有分隔材料3。并且示出辐射源9和挤出产品的密封物或封口(closure or sealing)7。
图2：图2a和2b分别示出通过图1中显示的喷嘴挤出的产品(封装的细胞悬浮液)的垂直和水平截面，并且描绘了包含多个细胞2的细胞悬浮液1、形成外部保护层的分隔材料3和挤出产品的密封物或封口 7。
图3：图3a和3b示出随后的图2挤出产品，优选地，在该挤出产品培养之后的挤出产品。如可见的那样，图2中描绘的多个单独的细胞已被转变成微组织，其中细胞粘附于一个或多个分隔材料层。
图4示出根据本发明的喷嘴8的横截面，所述喷嘴8包含四个同轴圆筒。中央圆筒含有包含多个第一类型的细胞2的细胞悬浮液1，接着是包含分隔材料3的围绕圆筒和含有包含多个第二类型的细胞5的细胞悬浮液4的又一围绕圆筒。外部圆筒含有可与另一分隔材料3相同或不同的分隔材料6。并且示出了两个辐射源9和挤出产品的密封物或封口(7)。
图5：图5a和5b分别示出通过图4中显示的喷嘴挤出的产品的垂直和水平横截面，并且描绘了包含多个细胞 2和5的两种细胞悬浮液1和4、分隔材料3和6、以及挤出产品的密封物或封口 7。
图6：图6a和6b示出随后的图5挤出产品，优选地，在挤出产品的培养之后的挤出产品。如可见的那样，图5中描绘的多个单独的细胞已被转变成微组织，其中细胞粘附于一个或多个分隔材料层。在不同细胞类型被用作细胞2和5的情况下，由此提供异质微组织。
具体实施方式
本发明提供了允许包含多个细胞的细胞溶液同轴封装在单个细长隔室或多个连接的细长隔室中的手段。通过该封装，细胞受到至少一种分隔材料层的保护并且保持紧密接触。细胞间的这种接触令人惊异地引起封装细胞的较好活力且从而导致形成微组织的较高机会。
并且，本发明的封装的细胞悬浮液和/或由其发育的微组织可以用在细胞治疗和/或体内微组织递送应用中，因为封装的细胞和/或微组织会在注射位点/插入位点保留在患者中。在常规方法中，细胞悬浮液被简单地注射到例如损伤位点中，且细胞倾向于从该位点移出而不是分化成取代受侵害的先前组织的功能性组织。
因此，本发明提供了向需要的患者更可靠地递送细胞或微组织的手段，其中细胞保持存活且组织形成的机会增加。并且，细胞和/或一个或更多个发育的组织更有可能保持在患者体内的一个或更多个位置，例如，它们被注射入/插入的损伤位点。因此，功能性取代组织的形成机会被大大增加。
如果根据本发明使用的一种或更多种分隔材料是生物可降解的，则注射的/插入的细胞和/或微组织--在注射/插入患者中时和在给定时间之后--将不再被分隔材料封装，因为一种或更多种分隔材料将已被降解。因此，插入的/注射的细胞和/或一种或更多种微组织会发育成与患者身体无缝整合的功能性组织。
并且，本发明还提供了多于一种类型的细胞在同轴嵌套/堆叠的隔室中的封装。通过该手段可产生异质组织，所述异质组织在微组织递送应用中具有高价值，因为其可提供例如功能性血管组织或神经组织。
此外，本发明提供使至少一种细胞悬浮液在第一隔室中的封装，其与在第二隔室中封装的包含细胞信号分子的溶液相邻，所述第二隔室同轴地围绕第一隔室或被第一隔室同轴地围绕。通过该手段，对于例如细胞分化而言重要的细胞信号分子可以被可靠地供给细胞。
本发明另外提供了厚度为大于约100 μm的组织的产生。生产这种组织通常面临将细胞保持位于组织内的问题，因为还不存在血管系统。
本发明提供了产生这种组织的手段，其中本发明的微组织在彼此在顶部上堆叠，以便产生厚度≥ 100 μm、优选地 ≥ 1 cm和甚至更优选地 ≥ 2 cm的组织。本发明微组织的堆叠允许营养物被递送到发育中组织的所有细胞，即使不存在血管系统。在一个具体实施方案中，组织具有≥ 100 μm且≤ 5 cm的厚度。在另一具体实施方案中，组织具有≥ 300 μm且≤ 2 cm的厚度。在另一具体实施方案中，组织具有≥ 500 μm且≤ 1 cm的厚度。
在下文中，借助优选的实施方案和实施例对本发明进行说明，但优选的实施方案和实施例绝不应当被理解成限制本发明的范围。
定义
如本文所用的术语 “喷嘴(nozzle)”指适用于根据本发明的同轴挤出方法中的任何设备。挤出是用于产生固定截面轮廓的物体的过程，其中材料(例如分隔材料) 被推动或牵拉通过具有期望截面的模具。喷嘴的最小尺寸应当使得能够封装具有5-50 μm的典型尺寸的细胞。
在一个实施方案中，喷嘴的内径≥ 10 μm且≤ 1 cm。在另一实施方案中，内径 ≥ 250 μm且≤ 750 μm。在另一实施方案中，内径 ≥ 350 μm且≤ 550 μm。
如本文所用的术语“圆筒(cylinder)”指形成喷嘴的同轴堆叠的管。但是，为了简化的原因，术语“圆筒”也指在两个这种管之间形成的空间。作为实例，参见图1。此处，喷嘴8由两个同轴堆叠的管(显示为黑色)构成，这导致形成两个空间。所形成的第一和最里面的空间(显示为圆点化)包含细胞悬浮液1，而同轴围绕第一空间的第二空间(显示为阴影线化)包含分隔材料3。因此，例如，术语“最外面的圆筒”可指形成喷嘴的最外面的管(显示为黑色)，或者其可指在最里面的管和最外面的管之间形成的划阴影线的最外面的空间，并且其包含分隔材料3。
在一个实施方案中，构成含分隔材料的圆筒的两个连续同轴管之间的距离为≥ 100 nm且≤ 1 mm、≥ 300 nm且≤ 800 μm、≥ 500 nm且≤ 500 μm、或≥ 1 μm且≤ 200 μm。因此，从这种圆筒挤出的分隔材料层的厚度≥ 100 nm且≤ 1 mm、≥ 300 nm且≤ 800 μm、≥ 500 nm且≤ 500 μm、或≥ 1 μm且≤ 200 μm。
构成含细胞悬浮液的圆筒的两个连续同轴管之间的最小距离由挤出细胞的直径来控制。在进一步的实施方案中，构成这种含细胞悬浮液的圆筒的两个连续同轴管之间的距离为≥ 5 μm，优选地 ≥ 5 μm且≤ 5cm、≥ 10 μm且≤ 2cm、≥ 20 μm且≤ 1cm、≥ 30 μm且≤ 500 μm、≥ 40 μm且≤ 400 μm、≥ 50 μm且≤ 300 μm、≥ 100 μm且≤ 500 μm、或≥ 200 μm且≤ 400 μm。这些距离也应用于含有包含细胞信号分子的溶液的圆筒。因此，包含细胞信号分子的溶液层的厚度或从这种圆筒挤出的细胞悬浮液层的厚度为≥ 5 μm，优选地 ≥ 5 μm且≤ 5cm、≥ 10 μm且≤ 2cm、≥ 20 μm且≤ 1cm、≥ 30 μm且≤ 500 μm、≥ 40 μm且≤ 400 μm、≥ 50 μm且≤ 300 μm、≥ 100 μm且≤ 500 μm、或≥ 200 μm且≤ 400 μm。
在本发明的进一步的实施方案中，圆筒的壁厚度是至少≥ 20 μm且≤ 500 μm，优选地，至少≥ 30 μm且≤ 100 μm。
在进一步的实施方案中，每一同轴圆筒的长度是≥ 500 μm且≤ 10 cm，优选地≥ 1 mm且≤ 5 cm、≥ 3 mm且≤ 5 cm、≥ 3 mm且≤ 3 cm、或≥ 5 mm且≤ 3 cm。
如本文所用，“挤出机(extruder)”指适于使材料(例如分隔材料、细胞悬浮液和/或包含细胞信号分子的溶液)推动或牵拉通过根据本发明的喷嘴的任何装置。在具体实施方案中，挤出机由使用标准注射器的注射器泵构成，其中注射器通过例如小管与喷嘴连接。
在特定实施方案中，分隔材料、细胞悬浮液和/或包含细胞信号分子的溶液的流速是≥ 0 m/min且≤ 10 m/min、≥ 0 m/min且≤ 8 m/min、≥ 0 m/min且≤ 6 m/min、≥ 0 m/min且≤ 4 m/min、≥ 0 m/min且≤ 2 m/min、≥ 0 m/min且≤ 1.5 m/min、≥ 0 m/min且≤ 1 m/min、或≥ 0 m/min且≤ 0.5 m/min。
如本文所用，术语 “细胞悬浮液(cell suspension)”指在允许所述细胞的维持、繁殖、分化或生长的任何适当流体中悬浮的多个细胞。在一个实施方案中，流体是细胞营养培养基。细胞营养培养基尤其可以是培养或生长培养基，并且确切成分将取决于细胞悬浮液包含的细胞类型。细胞营养培养基的一个实例是Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Gibco)培养基，其补充有10%胎牛血清(FCS)、1%青霉素/链霉素和1% Glutamax (Invitrogen)。
在本发明的具体实施方案中，细胞悬浮液具有≥ 1且≤ 109个细胞/ml的浓度，在一个特定实施方案中，细胞悬浮液具有≥ 1000且≤ 108个细胞/ml、更优选地 ≥ 105且≤ 107个细胞/ml的浓度。最优选地，细胞悬浮液具有约2×105 个细胞/ml的浓度。
在本发明的进一步具体实施方案中，细胞选自干细胞、祖细胞、完全分化的细胞、神经细胞、神经胶质细胞、施万细胞、少突胶质细胞、脂肪-衍生干细胞(ASCs)、间充质干细胞(MSCs)、胰腺祖细胞、饲养细胞、内皮祖细胞(EPC)、多潜能干细胞(pluripontent stem cells)、体干细胞、骨髓干细胞和/或淋巴干细胞。
人ASCs已显示出分化成骨、软骨、脂肪和肌肉，而来自大鼠的ASCs转变为神经元。
MSCs是多潜能干细胞，其可以分化成多种组织并且可以与脐带血、脐带胶质、胎盘、脂肪组织、肺和骨髓分离。MSCs对于临床治疗而言是有吸引力的，这归因于它们分化、提供营养支持和调节先天免疫应答的能力。EPC对于骨折和伤口愈合的研究是非常重要的。
单一细胞悬浮液中的细胞可以是单一细胞类型或更多细胞类型的细胞。在进一步的实施方案中，细胞是培养细胞。
并且，可以规定，下列添加剂中的任一种都可以加入细胞悬浮液或包含细胞信号分子的溶液中：
(i)  增强挤出产品的生物相容性的试剂；
(ii) 生物可降解的和/或生物上安全的材料；
(iii)      标签或标记；和/或
(iv)      生长因子；
(v) 抗生素。
如本文所用，术语“微组织(microtissue)”指当挤出细胞溶液中的细胞沉降在分隔材料层(一个或更多个)上时产生的至少一个汇合细胞层(参见，例如图3a和6a)。因此，术语微组织指细胞汇合层，其中细胞间的接触被建立。
如本文所用，术语 “细胞信号分子(cell signaling molecule)”指对给定细胞的维持、繁殖、分化、去分化或生长有作用的任何分子。这种细胞信号分子的优选实施方案是生长因子、细胞因子和/或趋化因子。
在本发明的具体实施方案中，细胞信号分子是选自下列的至少一种分子：G-CSF、GM-CSF、SCF、IL-3、IL-6、IGF-1、成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性FGF(bFGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、活化素-A、骨形态发生蛋白4(BMP-4)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、 β神经生长因子(β-NGF)、视黄酸、FGF-1、FGF-2、血小板生成素(TPO)和/或促红细胞生成素(EPO)。
在一个具体实施方案中，细胞信号分子是胰岛素样生长因子 1(IGF-1)，已显示出促进肌细胞增殖。
在进一步的具体实施方案中，细胞信号分子是神经营养蛋白。神经营养蛋白是诱导神经元的存活、发育和功能的蛋白家族。它们属于一类生长因子，分泌蛋白，其能够发信号给特定细胞，以便存活、分化或生长。生长因子，诸如促进神经元存活的神经营养蛋白被称为神经营养因子。神经营养因子由靶组织分泌，并且通过防止相关神经元启动程序性细胞死亡从而允许神经元存活而起作用。神经营养蛋白也诱导祖细胞分化，以形成神经元。
在进一步的具体实施方案中，细胞信号分子是肝细胞生长因子/分散因子(scatter factor)(HGF/SF)，它是旁分泌细胞生长、运动性和形态发生因子。它由间充质细胞分泌，并且主要靶向和作用于上皮细胞和内皮细胞，但也作用于造血祖细胞。其已显示出在胚胎器官发育、在成体器官再生以及在伤口愈合方面具有主要作用。肝细胞生长因子在与原致癌c-Met受体结合后通过激活酪氨酸激酶信号级联而调节细胞生长、细胞运动性和形态发生。肝细胞生长因子由间充质细胞分泌，并且充当主要是上皮起源的细胞上的多功能细胞因子。其刺激有丝分裂发生、细胞运动性和基质侵入的能力为其赋予了在血管发生、肿瘤发生和组织再生中的重要作用。
在进一步的具体实施方案中，细胞信号分子是生长分化因子9(GDF9)。由卵巢体细胞合成的生长因子直接地影响卵母细胞生长和功能。GDF9在卵母细胞中表达，并且认为其是卵巢滤泡生成所需的。GDF9是转化生长因子-β(TGFβ)超家族的一个成员。GDF9在卵巢中的初级卵泡发育中起重要作用。它在颗粒细胞和卵泡膜细胞生长中、以及在卵母细胞的分化和成熟中具有关键作用。GDF9已被关联于排卵速度和卵巢功能的过早停止的差异，因此在生育中具有显著作用。
在本发明的一个实施方案中，细胞因子是成纤维细胞生长因子(FGF)-20。FGF-20是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的一个成员，成纤维细胞生长因子的家族成员具有广泛的促有丝分裂和细胞存活活性，并且参与包括胚胎发育、细胞生长、形态发生、组织修复、肿瘤生长和侵入在内的多种生物学过程。FGF-20已显示出在正常脑、尤其是小脑中表达，并且能够增强中脑多巴胺能神经元的体外存活。进一步显示出FGF-20具有产生衍生自hESCs的大量多巴胺能神经元的有效作用。
细胞信号分子溶液最初将借助围绕细胞悬浮液的分隔材料与细胞悬浮液分隔。在一个实施方案中，分隔材料是生物可降解的，并且因此会使得细胞悬浮液中的细胞与信号分子随着时间的流逝而接触。在另一实施方案中，分隔材料对于细胞信号分子(但不对于细胞)是可渗透的，并且因此，取决于渗透系数，其允许细胞信号分子受控地扩散到含有细胞悬浮液的隔室中。
如本文所用，术语 “分隔材料(separation material)”指适于分隔两种液体介质的任何种类的材料。在一个实施方案中，术语“分隔”意为防止两种所述液体介质的混合。优选地，分隔材料适于分隔细胞悬浮液与含有细胞信号分子的溶液和/或分隔细胞悬浮液与另一细胞悬浮液。根据本发明的分隔材料可以是凝胶，例如水凝胶、自动胶凝化的流体，或聚合性物质。
优选的分隔材料尤其是基于聚合物网络的水凝胶，所述聚合物网络衍生自单体诸如PEG丙烯酸酯、pNiPAAm、PAAm、PHEMA、PHEA并联合交联剂分子诸如PEGDA、PEGDMA、DEGDA、DEGDMA、TEGDA、TEGDMA、生物可降解交联剂分子二(甲基)丙烯酸酯材料(其含有低聚丙交酯链段、低聚乙交酯链段、低聚已内酯链段和其它低聚酯链段)。可选地，可以应用藻酸盐或肽两亲物纳米纤维基水凝胶，以及通过聚合诱导的相分离(PIPS)获得的多孔聚合物体系(膜)或温度响应性水凝胶(temperature responsive hydrogen)，诸如pNiPAAm和本领域已知的其它温度响应性水凝胶。
在具体实施方案中，这种多孔聚合物体系/膜可通过包含交联单体和单一致孔(porogenic)溶剂的混合物的光聚合诱导的相分离而获得，其中溶剂浓度是≥ 40且≤ 80 wt%，优选≥ 42且≤ 70 wt%，更优选≥ 45且≤ 60 wt%，最优选约50 wt%。
在进一步特定的实施方案中，膜可通过所述混合物的光聚合诱导的相分离而获得，其中交联单体是四乙二醇二甲基丙烯酸酯。在更优选的实施方案中，单一致孔溶剂是聚丙二醇或三丙二醇。
在另一优选实施方案中，所述膜进行生产，其中混合物包括甲基丙烯酸缩水甘油酯和/或丙烯酸作为其它活性单体。
致孔溶剂是在聚合期间适于形成孔和/或使聚合物链移位的溶剂。这种溶剂在大网络或大孔树脂形成中的特征和用途描述在US 4,224,415中，其通过引用包含于本文中。致孔溶剂是溶解正进行(共-)聚合的单体混合物但不溶解(共-)聚合物的溶剂。此外，致孔溶剂对聚合条件必须是惰性的，即，既不干扰聚合又不参与聚合。
根据本发明的一个实施方案，制备多孔膜的材料混合物是包括聚(甲基)丙烯酸材料的聚合物材料。
根据本发明的另一实施方案，多孔膜包含通过至少一种(甲基)丙烯酸单体和至少一种多官能(甲基)丙烯酸单体的聚合而制成的聚(甲基)丙烯酸材料。
根据本发明的另一实施方案，(甲基)丙烯酸单体选自包括下列的集合：(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酸羟乙酯、(甲基)丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯、甲基(甲基)丙烯酸羟乙酯、(甲基)丙烯酸异冰片酯、甲基(甲基)丙烯酸异冰片酯或其混合物。
根据本发明的进一步的实施方案，多官能(甲基)丙烯酸单体是双-(甲基)丙烯酰和/或三-(甲基)丙烯酰和/或四-(甲基)丙烯酰和/或五-(甲基)丙烯酰单体。
根据本发明的另一实施方案，多官能(甲基)丙烯酸单体选自包括下列的集合：双(甲基)丙烯酰胺、二(甲基)丙烯酸三丙二醇酯、三(甲基)丙烯酸季戊四醇酯、二(甲基)丙烯酸聚乙二醇酯、乙氧基化双酚-A-二(甲基)丙烯酸酯或其混合物。
根据本发明的一个实施方案，聚(甲基)丙烯酸材料中的交联密度是≥ 0.05且≤ 1，优选地≥ 0.1且≤ 0.8，更优选地≥ 0.4且≤ 0.5。
在一个实施方案中，分隔材料是生物可降解的和/或选择性可渗透的材料。
在一个实施方案中，分隔材料是具有电荷、即含有阴离子或阳离子基团，并且分别对阴离子或阳离子种类具有降低的渗透性的水凝胶。进一步的实例和具体实施方案是将阻碍Na+的用((3-丙烯酰胺基丙基)三甲铵)官能化的聚合物，将阻碍Cl-的用2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸官能化的聚合物。
在另一实施方案中，分隔材料是极性的，例如，将阻碍亲水性物质的疏水聚合物。在进一步的实施方案中，分隔材料的渗透性是交联密度和/或分隔材料的孔隙率的函数。作为一个实例，具有高交联密度的分隔材料充当具有较低分子截止(cut-off)的过滤器，且因此可用作对于具有较高分子量的物质选择可渗透的材料。
合适的生物可降解材料例如由Gunatillake P and Adhikari R, European Cells and Materials (5) 2003, 1-16描述，其全部内容通过引用并入本文中。在这些材料中的是：聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸)(PLA)及它的共聚物和衍生物，如聚(d,l-乳酸-co-乙醇酸)；聚内酯，如聚(已内酯)(PCL)和它们的衍生物；聚(富马酸丙二醇酯)(poly(propylene fumarate))(PPF)及其衍生物；聚酐如聚[1,6-双(羧基苯氧基)己烷]；酪氨酸-衍生的聚碳酸酯和它们的衍生物；聚原酸酯(POE)和它们的衍生物；聚氨基甲酸酯(PU)，其具有无毒降解产物如赖氨酸二异氰酸酯(LDI，2,6-二异氰酸根合已酸酯)和其它脂族二异氰酸酯，如六亚甲基二异氰酸酯(HDI)和1,4-丁烷二异氰酸酯，例如聚(乙交酯-co-γ-已内酯)、聚磷腈，如甘氨酸乙酯聚磷腈，和它们的衍生物等等。
其它生物可降解聚合物包括聚(马来酸)、聚(对-二                                                
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烷酮)(poly(p-dioxanone))、聚(三亚甲基碳酸酯)、聚(3-羟基丁酸酯)、聚(3-羟基戊酸酯)(poly(3-hydroxyvalorate))和它们的共聚物。一类合适的响应性生物可降解聚合物是聚(N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺单/二乳酸酯)，如Soga O等, Biomacromolecules 2004 (5) 818-821所述，其全部内容通过引用并入本文中。
其它合适的生物可降解材料包括藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、胶原、明胶、丝或它们的组合。
这些生物可降解材料可以自身进行使用，或者它们在网络中连同交联剂一起进行使用。产生的网络将在一段时间后分解，并且如果交联剂具有低分子量，交联剂将被冲走。在另一实施方案中，生物可降解材料被固定在由非-生物可降解物构成的网络中。
如本文所用，术语“水凝胶”暗示各自材料的至少一部分包括在水中形成水溶胀性网络的聚合物和/或水溶性聚合物链网络。优选地，水凝胶渗透层在溶胀状态包含≥ 50%的水和/或溶剂，更优选地 ≥ 70%和最优选≥ 80%的水和/或溶剂，由此，优选的溶剂包括有机溶剂，优选地有机极性溶剂，且最优选链烷醇诸如乙醇、甲醇和/或(异-)丙醇。
在第一方面，本发明涉及用于同轴挤出的喷嘴8，其包括至少两个同轴圆筒，其中每个圆筒含有多个细胞1的细胞悬浮液、包含细胞信号分子的溶液或分隔材料 3，其中含有细胞悬浮液的或含有包含信号分子的溶液的圆筒被含有分隔材料的圆筒分隔，且其中最外面的圆筒含有分隔材料。
可以使用这种喷嘴以产生挤出的细长产品，所述产品包括多个细胞的悬浮液和/或包含细胞信号分子的溶液，它们被包封在分隔材料层中。因此，根据本发明的喷嘴允许产生含有多个细胞的悬浮液和/或包含细胞信号分子的溶液的隔室，其被分隔材料层围绕。如果产生多于一个隔室，则这些隔室是堆叠的，即，嵌套的。
喷嘴的最外面的圆筒要求是包含分隔材料的圆筒，且含有细胞悬浮液或包含细胞信号分子的溶液的圆筒被包含分隔材料的圆筒分隔。以此方式，包含液体诸如细胞悬浮液或包含信号分子的溶液的圆筒总是被包含分隔材料的圆筒分隔。因此，如果圆筒的内容物根据本发明方法被挤出，则不会发生液体的混合。
产生的隔室可以是嵌套的/堆叠的，如例如图5和6所示例。因此，在一个实施例和优选实施方案中，含有1类细胞的悬浮液的隔室和含有2类细胞的悬浮液的隔室可以彼此邻近地挤出，且隔室的(液体)内容物通过它们之间分隔材料层的共挤出而被分隔。在得到的挤出产品中，1类细胞通过分隔材料层与2类细胞分隔。
在另一实施例和优选实施方案中，含有细胞悬浮液的隔室和含有包含细胞信号分子的溶液的隔室可以彼此邻近地挤出。因此，在得到的挤出产品中，细胞悬浮液通过分隔材料层与包含细胞信号分子的溶液分隔。
在一个具体实施方案中，至少一个圆筒含有细胞悬浮液。优选地，细胞选自干细胞、祖细胞、完全分化的细胞、神经细胞、神经胶质细胞、施万细胞、少突胶质细胞、脂肪-衍生干细胞(ASCs)、间充质干细胞(MSCs)、胰腺祖细胞和内皮祖细胞(EPC)。
在本发明的一个实施方案中，如图1中所描绘，喷嘴8包括两个同轴圆筒，其中内部圆筒含有包含多个细胞 2的细胞悬浮液1，且外部圆筒含有分隔材料3。挤出产品由含有被分隔材料层封装的包含多个细胞的细胞悬浮液的细长隔室构成。本发明的该实施方案因而可以用于产生如图1、2a和2b所含有描绘的进行同轴封装的包含多个细胞的悬浮液的单个隔室。通过培养的方式——其取决于隔室中封装的和本领域已知的细胞类型，这些隔室可以转变成中空纤维状微组织，如图3a和3b所描绘。
在本发明的另一实施方案中，喷嘴包括三个同轴圆筒，其中内部和外部圆筒含有分隔材料，且中间圆筒含有细胞悬浮液。因此，分隔材料在中央圆筒中被挤出，被细胞悬浮液围绕，细胞悬浮液本身又被分隔材料制成的封装层封装。得到的挤出产品由这样的单个细长隔室构成，该细长隔室含有被在外部的分隔材料层封装的细胞悬浮液，且还含有中央分隔材料管。如图1和2所示例地，本发明的该实施方案可以用于产生单个纤维状隔室，其含有包含多个细胞 2的悬浮液1，悬浮液1被封装在由分隔材料3构成的同轴保护层中。
在另外的培养步骤之后，可获得中空纤维状微组织(参见图3)。
在本发明的另一实施方案中，喷嘴包括四个同轴圆筒，其中第一圆筒含有细胞悬浮液1，且第二圆筒含有细胞悬浮液4或包含细胞信号分子的溶液。含有细胞悬浮液或包含细胞信号分子的溶液的圆筒通过含有分隔溶液的圆筒而彼此分隔，且最外面的圆筒同样含有分隔溶液。
因此，挤出产品由含有细胞悬浮液的一个隔室和含有细胞悬浮液或包含细胞信号分子的溶液的另一隔室构成，其中这些隔室被分隔材料层封装和进行堆叠。以此方式，如果分隔材料对于所述两种内容物中的任一种都是完全不可渗透的，则不会发生包含在各自隔室中的内容物的混合。
在图4所描绘的一个具体实施方案中，最里面的圆筒含有包含1类细胞(2)的细胞悬浮液1，其被含有分隔溶液3的圆筒包封，该圆筒又被含有包含2类细胞(5)的细胞悬浮液4的圆筒包封。再次地，最外面的圆筒含有分隔溶液6。使用该喷嘴，纤维状异质组织，如同轴微组织，可以进行工程化，如图5和6所描绘(分别示出培养后早期和进一步发育状态)。
在一个具体实施方案中，1类细胞是神经元细胞，且2类细胞是神经胶质细胞(或是施万细胞或是少突胶质细胞)。这些神经胶质细胞然后可以形成髓鞘，髓鞘是在内部隔室中发育的电活性神经元的绝缘体。结果是，本发明提供带有围绕的绝缘髓鞘的功能性神经纤维的产生。
在进一步的具体实施方案中，1类细胞是干细胞，且2类细胞是饲养细胞。在一个优选实施方案中，这些细胞类型中的一种或两种分泌对另一细胞类型有效的信号分子。例如，如果两种细胞类型之一是饲养细胞，它们将分泌对于另一细胞类型的维持和/或生长所需的信号分子，所述另一细胞类型可为干细胞。
在进一步的具体实施方案中，喷嘴的四个圆筒中的仅一个含有细胞悬浮液，而另一个含有包含细胞信号分子的溶液。在一个实施方案中，细胞悬浮液被最里面的圆筒所包含，在另一实施方案中，包含细胞信号分子的溶液被最里面的圆筒所包括。因此，使用该喷嘴，挤出产品将由封装包含信号分子的溶液的隔室和封装细胞悬浮液的隔室构成，其中这两个隔室都被分隔材料封装层彼此分隔。
在进一步的实施方案中，分隔材料是生物可降解的和/或对信号分子(但不对细胞)可渗透的，这允许使可控递送信号分子给细胞。
在进一步的具体实施方案中，细胞选自干细胞、祖细胞、完全分化的细胞、神经细胞、神经胶质细胞、施万细胞、少突胶质细胞、脂肪-衍生干细胞(ASCs)、间充质干细胞(MSCs)、胰腺祖细胞、内皮祖细胞(EPC)、饲养细胞和/或培养细胞。
在进一步的实施方案中，信号分子是生长因子、细胞因子或趋化因子。在本发明的特定实施方案中，细胞信号分子选自G-CSF、GM-CSF、SCF、IL-3、IL-6、IGF-1、成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性FGF(bFGF)、转化生长因子β1(TGF- β1)、活化素-A、骨形态发生蛋白4(BMP-4)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、β神经生长因子(β-NGF)、视黄酸、FGF-1、FGF-2、血小板生成素(TPO)和/或促红细胞生成素(EPO)。
如上述，分隔材料可以(最初地)是完全不可渗透的材料，其防止封装的细胞悬浮液和/或包含信号分子的溶液离开隔室。根据进一步的实施方案，至少一个圆筒中含有的分隔材料是生物可降解材料和/或对信号分子是可渗透的。在一个优选实施方案中，所有圆筒中的分隔材料都是生物可降解的和/或对信号分子是可渗透的。如果分隔材料是生物可降解材料，封装层(一层或更多层)将随着时间的流逝而降解并因此允许隔室(一个或更多个)的围护被解除。并且，尤其是与再生医学、特别是细胞治疗和组织工程相关，由生物可降解分隔材料制成的封装层将完全分解并不存在于患者体内。作为一个实例，如果根据图2或图3的挤出产品被注射到患者中，则本发明挤出产品的最外面的封装和保护层3将在给定时间之后完全分解，只留下将在那时已分化为例如组织的细胞2。
根据进一步的实施方案，分隔材料是凝胶，通过自胶凝化作用而胶凝化或聚合。优选地，聚合可以通过光聚合实现。甚至更优选地，光聚合通过UV辐射进行诱导。
在进一步的实施方案中，公开了包括本发明喷嘴的装置。优选地，该装置是挤出机。
在本发明的一个实施方案中，挤出机进一步包括至少一个用于光聚合的辐射源9，其中用于光聚合的辐射源位于含有光聚合的分隔材料的分别的圆筒末端附近。在一个优选实施方案中，挤出机包括位于含有光聚合的分隔材料的圆筒的分别的末端的多于一个辐射源(图4, (9))。
在进一步的实施方案中，辐射源是UV光源。在具体实施方案中，辐射源是高密度平行UV源，其密度是≥ 0.1mW/cm2且≤ 5 W/cm2、≥ 1 mW/cm2且≤ 1 W/cm2、≥ 200 mW/cm2且≤ 500 mW/cm2或0.3 W/cm2。
在进一步的具体实施方案中，挤出机包括快门(shutter)，优选地，高速快门。快门可与辐射源连接。
在进一步的实施方案中，挤出机包括用于脉冲挤出模式的手段。脉冲挤出模式用于产生闭合的挤出产品7。该挤出模式是基于特定流动分布(flow profile)，即，挤出物的流速的时间依赖性改变。在一个具体实施方案中，分隔材料的流速最初(例如 t = 0秒)处于给定值(例如 0.5 m/min)，而细胞悬浮液或含有细胞信号分子的溶液的流速是0 m/min。因此，分隔材料将从围绕含有细胞悬浮液的圆筒的圆筒挤出，但无细胞悬浮液将被挤出。挤出的分隔材料这时形成密封部分，例如，在分隔材料是光聚合的且UV源位于含分隔材料的圆筒的出口点时。在随后的时间(例如 t = 0.5秒)，细胞悬浮液的流速被增加为分隔材料的流速(分隔材料的流速也可预先降低)。因此，细胞溶液将与在离开其各自圆筒后光聚合的分隔材料同轴挤出。在更长的时间(例如 t=1.5秒)，细胞溶液的流动再次停止，而分隔材料的流速保持或增加；分隔材料密封部分将再次形成。产生被分隔材料层包封的、含有细胞溶液的隔室，其中隔室是末端闭合的7。
在另一实施方案中，外部和内部圆筒的这种流动分布重复多次，以产生充满细胞悬浮液的多个闭合末端隔室。因此，本发明进一步提供充满细胞悬浮液的多个闭合末端隔室的产生方法。
在脉冲挤出模式的一个实例中，共挤出以脉动方式进行，同时在UV源前的快门持续打开。外部圆筒中的单体溶液从t=0以1 m/min的流速挤出。此时来自细胞悬浮液的流速等于0 m/min。在t= 0.5秒时，外部圆筒中的流动降至0.5 m/min，同时在内部圆筒中的流动从0增加至0.5 m/min。在t=1.5秒时，流动再次停止，同时外部圆筒中的流动恢复至1 m/min。在t =2秒时，所有流动都设置为0。该分布的结果是末端闭合的隔室7。
在特定实施方案中，分隔材料、细胞悬浮液和/或包含细胞信号分子的溶液的流速是≥ 0 m/min且≤ 10 m/min、≥ 0 m/min且≤ 8 m/min、≥ 0 m/min且≤ 6 m/min、≥ 0 m/min且≤ 4 m/min、≥ 0 m/min且≤ 2 m/min、≥ 0 m/min且≤ 1.5 m/min、≥ 0 m/min且≤ 1 m/min或≥ 0 m/min且≤ 0.5 m/min。
本发明的进一步方面涉及本发明喷嘴或挤出机用于产生被分隔材料层封装的、含有包含多个细胞的至少一种细胞悬浮液的至少一个细长隔室(参见图2和3)的用途。优选地，细长隔室包括至少两个堆叠/嵌套的隔室，如例如在图5和6中所描绘。
本发明的进一步方面涉及本发明喷嘴或挤出机用于产生含有被分隔材料层封装的、包含多个细胞的至少一种细胞悬浮液的至少两个连接的隔室的用途。连接的隔室指被连续挤出且被密封物 7分隔的隔室，尤其如实施例3所述。优选地，至少两个连接的隔室中的每一个包括至少两个堆叠/嵌套的隔室，如例如在图5和6中所描绘。
如从根据上面描述对技术人员而言将显而易见地，本发明还包括用于同时制备多于一个这种被分隔材料层封装的隔室的用途。如果根据本发明制备多于一个封装的隔室，则得到的隔室是嵌套的，即，得到的挤出产品由被分隔材料层封装的第一隔室构成，该第一隔室被分隔材料层封装的另一隔室所围绕。对技术人员而言显然的是，隔室的这种“嵌套”可以扩展至多于两个隔室，优选地，3、4或5个隔室。
在一个优选实施方案中，本发明的喷嘴或挤出机用于制造两个嵌套的隔室，其中一个隔室含有细胞悬浮液，另一个隔室或是含有相同或不同类型细胞的细胞悬浮液(图5和6)或是含有包含细胞信号分子的溶液。
本发明方法使得能够产生被分割材料层围绕的、含有包含多个细胞的细胞悬浮液和/或包含细胞信号分子的溶液的隔室。封装每一隔室的分隔材料围绕层保护该隔室，且在细胞悬浮液的情况下通过将细胞保留在隔室内而确保所述封装细胞间的接触。并且，分隔材料的封装层可分隔两个相邻的含有细胞悬浮液或包含细胞信号分子的溶液的隔室，且可以用于防止或延迟(例如，在使用生物可降解的和/或选择性可渗透的材料时)两个隔室的内容物的混合。并且，分隔层可以用于选择性地允许两个隔室中的内容物的交换(例如，如果使用选择性可渗透的材料)。在一个具体实施方案中，分隔材料是生物可降解材料。
在一个实施方案中，本发明提供用于封装细胞悬浮液和/或产生封装的微组织的方法，其中至少一种细胞悬浮液、至少一种分隔材料和任选地至少一种包含细胞信号分子的溶液被同轴挤出，其中细胞悬浮液或包含信号分子的溶液被分隔材料层分隔，且其中得到的最外面层由分隔材料组成(即，分隔材料被挤出在喷嘴的最外面的圆筒外)。
在特定实施方案中，分隔材料、细胞悬浮液和/或包含细胞信号分子的溶液的流速是≥ 0 m/min且≤ 10 m/min、≥ 0 m/min且≤ 8 m/min、≥ 0 m/min且≤ 6 m/min、≥ 0 m/min且≤ 4 m/min、≥ 0 m/min且≤ 2 m/min、≥ 0 m/min且≤ 1.5 m/min、≥ 0 m/min且≤ 1 m/min或≥ 0 m/min且≤ 0.5 m/min。
在进一步的具体实施方案中，细胞选自干细胞、祖细胞、完全分化的细胞、神经细胞、神经胶质细胞、施万细胞、少突胶质细胞、脂肪-衍生干细胞(ASCs)、间充质干细胞(MSCs)、胰腺祖细胞、饲养细胞、内皮祖细胞(EPC)、多潜能干细胞、体干细胞、骨髓干细胞和/或淋巴样干细胞。
在一个实施方案中，本发明方法提供用于产生多于一个隔室，其中该隔室是嵌套的/堆叠的。作为一个实例和更优选的实施方案，该方法涉及产生含有1类细胞的细胞悬浮液的中央隔室(图5和6，(1, 2))，其被分隔材料层(图5和6, (3) )围绕或封装，该分隔材料层本身被含有2类细胞的细胞悬浮液的又一隔室(图5和6, (4, 5))围绕，所述又一隔室同样地被分隔材料层(图5和6, (6))封装。因此，在得到的挤出产品中，1类细胞通过分隔材料层与2类细胞分隔。
本发明的(临时)封装的细胞悬浮液对再生医学领域、最优选地对体内细胞递送有重大价值。
优选地，得到的挤出的封装的细胞悬浮液(例如图2和图5)在进一步的步骤中和在技术人员已知的适当条件下进行培养，形成封装的微组织(例如，图3和图6)。
本发明方法允许产生中空纤维状微组织，其中含有多个细胞的单种悬浮液和单一围绕分隔材料以使得到的隔室由在单层分隔材料中封装的细胞悬浮液构成的方式被同轴挤出，如在例如图2中所描绘的。在进一步的步骤中，挤出产品然后在技术人员已知的适当条件下进行培养，且将最终形成中空纤维状微组织，如在例如图3中所描绘。
本发明方法允许产生中空纤维状同质或异质微组织，其中含有细胞悬浮液的至少一个隔室和含有细胞悬浮液的或含有包含信号分子的溶液的至少又一隔室被同轴挤出。该实施方案的一个实例在图4和5中描述。在进一步的步骤中，挤出产品然后在技术人员已知的适当条件下被培养，且将最终形成中空纤维状微组织，如在例如图6中所描绘。
通过本发明方法产生的微组织的特定实施方案包括神经组织、血管组织、骨组织、肾和/或肝组织。
这种(临时)封装的同质和异质微组织对在再生医学领域中的应用、最优选地用于体内微组织递送的应用有重大价值。
在一个实施方案中，分隔材料是生物可降解的。因此，封装/分隔是临时的，因为分隔材料在例如将封装的细胞悬浮液注射到患者体内后将随着时间的流逝而降解。
在进一步的实施方案中，分隔材料是选择性地可渗透的。因此，可以进行两个相邻隔室之间的选择性交换。作为一个实例和优选实施方案，一个隔室可含有干细胞，且相邻的另一隔室可含有饲养细胞。如果分隔材料对饲养细胞产生的信号分子——而不是对这两类细胞——是选择性可渗透的，则干细胞可以与饲养细胞保持紧密接触(确保干细胞的维持和生长)而使这两种细胞群混合。
在进一步的实施方案中，细胞选自干细胞、祖细胞、完全分化的细胞、神经细胞、神经胶质细胞、施万细胞、少突胶质细胞、脂肪-衍生干细胞(ASCs)、间充质干细胞(MSCs)、胰腺祖细胞、饲养细胞、培养细胞和/或内皮祖细胞 (EPC)。
在一个实施方案中，本发明方法涉及用于封装细胞悬浮液的多个细胞的制造方法，其中含有多个细胞的单种悬浮液和单种围绕分隔材料被同轴挤出。因此，得到的隔室由在单个分隔材料保护层中封装的细胞悬浮液构成，如在例如图2中所描绘的。在优选实施方案中，产生的封装的细胞悬浮液可以在进一步的步骤中和在技术人员已知的适当条件下进行培养，形成微组织(例如图3)。
根据另一实施方案，提供了中空纤维状微组织的产生方法，其中含有多个细胞的单种悬浮液在两个分隔材料层之间被同轴挤出。因此，分隔材料在喷嘴的中央圆筒中挤出，其被细胞悬浮液围绕，该细胞悬浮液本身又被分隔材料层封装。在一个优选实施方案中，挤出产品然后在进一步的步骤中在技术人员已知的适当条件下进行培养，并将最终形成具有中央通道的中空纤维状微组织。可通过该方法产生的微组织的实例包括神经组织(例如，被形成髓鞘的神经胶质细胞围绕的神经元细胞)、血管组织和/或骨组织。
在另一实施方案中，提供了纤维状同质或异质微组织的产生方法，其中含有多个细胞的两种悬浮液和两种分隔材料被同轴挤出。因此，如图4、5和6中示范性地描绘的，使用包括四个同轴圆筒的喷嘴，其中第一圆筒含有细胞悬浮液1且第二圆筒含有细胞悬浮液4。含有细胞悬浮液或含有包含细胞信号分子的溶液的圆筒通过含有分隔溶液的圆筒而彼此分隔，且最外面的圆筒同样含有分隔溶液。得到的挤出产品(示范性地描绘于图5中)从而包含由细胞悬浮液1构成的中央层，其被分隔材料3封装，分隔材料3又被由细胞悬浮液4构成的另一层封装，细胞悬浮液4 被最外面的分隔材料6层封装。在一个优选实施方案中，挤出产品然后在进一步的步骤中在技术人员已知的适当条件下进行培养，并将最终形成微组织。
在一个具体实施方案中，所述两种细胞悬浮液的细胞是相同细胞类型的细胞。在进一步的优选实施方案中，两种细胞悬浮液的细胞是不同细胞类型的细胞(图4、5、6 (2)和(5))。如果使用不同类型的细胞，则得到异质组织。
在另一特定实施方案中，所述细胞类型中的一种或两种选自干细胞、祖细胞、完全分化的细胞、神经细胞、神经胶质细胞、施万细胞、少突胶质细胞、脂肪-衍生干细胞(ASCs)、间充质干细胞(MSCs)、胰腺祖细胞、饲养细胞和/或内皮祖细胞(EPC)。
在特定实施方案中，根据该方法产生的微组织是神经组织、血管组织、骨组织、肾和/或肝组织。
在进一步特定实施方案中，用于两层(3)和(6)的分隔材料是同一分隔材料。在另一优选实施方案中，用于两层3和6的分隔材料是不同的分隔材料。
在图4所描绘的一个特定实施方案中，最里面的圆筒含有包含1类细胞(2)的细胞悬浮液1，其被含有分隔溶液3的圆筒包封，含有分隔溶液3的圆筒又被含有包含2类细胞(5)的细胞悬浮液4的圆筒包封。再次地，最外面的圆筒含有分隔溶液6。使用该喷嘴，纤维状的异质组织(如同轴微组织)可以进行工程化，如图5和6所描绘(分别示出培养后早期和进一步的发育状态)。
在另一特定实施方案中，1类细胞是神经元细胞，且2类细胞是神经胶质细胞(或是施万细胞或是少突胶质细胞)。
在进一步特定实施方案中，1类细胞是干细胞，且2类细胞是饲养细胞。在一个优选实施方案中，这些细胞类型中的一种或两种分泌对另一细胞类型有效的信号分子。
在另一特定实施方案中，分隔所述两个细胞隔室的分隔材料层是生物可降解的和/或对信号分子是选择性可渗透的。
在另一实施方案中，提供了纤维状微组织的产生方法，其中含有多个细胞的一种悬浮液、含有细胞信号分子的一种溶液和两种分隔材料被同轴挤出。因此，使用包括四个同轴圆筒的喷嘴，其中存在含有细胞悬浮液和含有包含细胞信号分子的溶液的两个圆筒，它们被含有分隔材料的圆筒分隔。再次地，最外面的圆筒含有分隔材料。
在一个特定实施方案中，细胞悬浮液作为被含有包含细胞信号分子的溶液的隔室围绕的中央隔室而挤出。因此，挤出产品包括由被分隔材料层封装的细胞悬浮液构成的中央隔室，其本身被由被分隔材料最后层封装的包含细胞信号分子的溶液构成的隔室围绕。
在另一特定实施方案中，包含细胞信号分子的溶液作为被含有细胞悬浮液的隔室所围绕的中央隔室而被挤出。因此，挤出产品包含由被分隔材料层封装的包含细胞信号分子的溶液构成的中央隔室，其本身被由被分隔材料最后层封装的细胞悬浮液构成的隔室围绕。
在一个优选实施方案中，挤出产品然后在进一步的步骤中在技术人员已知的适当条件下进行培养，以形成微组织。
本发明的这种实施方案可以产生纤维状组织，如同轴微组织，其中细胞与包含细胞信号分子的溶液共同被挤出，所述细胞信号分子在例如细胞分化中是有效的。
如上所述，分隔材料可以是形成凝胶材料、凝胶和/或可聚合材料。根据本发明的另一实施方案，挤出的分隔材料中的至少之一是光聚合的，且该方法进一步包括光聚合所述分隔材料的步骤。如图1或图4中所描绘，光聚合可以通过辐射源9的方式实现。优选地，辐射源位于分隔材料从喷嘴排出的点附近。因此，辐射源可以位于分别的分隔材料从喷嘴排出的点附近(之前或之后) (如图4中示范性地描绘)。辐射源确保分隔材料的光聚合进展到足够状态，使得另一层(例如细胞悬浮液层)可以被共挤出，且因而与防止两层混合的分隔材料层接触。
在一个优选实施方案中，辐射源是UV源。在一个特定实施方案中，辐射源是高密度平行UV源，其密度为≥ 0.1mW/cm2且≤ 5 W/cm2、≥ 1 mW/cm2且≤ 1 W/cm2、≥ 200 mW/cm2且≤ 500 mW/cm2或0.3 W/cm2。在进一步的特定实施方案中，UV源的峰波长是≥ 100 nm且≤ 500 nm、≥ 200 nm且≤ 400 nm、或≥ 300 nm且≤ 350 nm。
在另一特定实施方案中，用于光聚合的剂量(剂量 = 时间 * 密度)是≥ 300 mJ/cm2且≤ 1500 mJ/cm2、≥ 500 mJ/cm2且≤ 1000 mJ/cm2或≥ 600 mJ/cm2且≤ 900 mJ/cm2。适于本发明的UV 源可以在例如Fusion UV Systems, Inc., USA得到。
根据本发明的另一优选实施方案，挤出以脉冲共挤出模式进行，使得能够闭合隔室。如上所述，利用脉冲挤出模式以产生闭合的挤出产品7，其中圆筒中的细胞悬浮液、包含细胞信号分子的溶液和/或分隔材料的流速不保持恒定，而是在挤出期间变化。利用这种流动分布，挤出隔室的封闭得以实现。
本发明的另一方面是通过本发明方法或应用本发明喷嘴制备的封装的细胞悬浮液或微组织。本发明提供在被分隔材料保护层围绕的单个隔室中同轴封装细胞悬浮液、优选地培养的细胞的悬浮液的可能性。该多个细胞的同轴封装通过根据本发明的同轴挤出而实现，且引起封装的细胞的活力增加，因为这些细胞现在彼此接触。并且，从这些封装的细胞形成微组织也更经常和更容易地发生，因为存在细胞-细胞接触。
由于根据本发明的多个(培养的)细胞的封装允许所述封装的细胞的细胞-细胞相互作用，且引起细胞的活力增加及和微组织形成的较高机会，根据本发明的封装的细胞悬浮液和/或微组织可以用作药物，例如，用于多种细胞治疗应用和/或体内微组织递送中。
在进一步的方面，本发明涉及作为药物的封装的细胞悬浮液或微组织。在一个优选实施方案中，本发明涉及作为用于再生医学应用的药物的、封装的细胞悬浮液或微组织。在再生医学中的这种用途的实例和优选实施方案是细胞治疗应用和/或微组织递送应用，由于中风或缺血、截瘫、神经变性病症/疾病、阿尔茨海默氏病或帕金森症、或糖尿病引起的任何类型损伤的治疗。
在进一步的方面，本发明涉及将封装的细胞悬浮液或微组织递送至受损的组织区域。在该实施方案中，优选地使用帮助恢复受损组织的组织功能的干细胞(或从其产生的微组织)。这种方法对神经变性疾病如阿尔茨海默氏病或帕金森症的治疗以及对例如心中风(cardiac stroke)引起的坏死组织的修复是非常有前途的。
在一个特定实施方案中，封装的细胞悬浮液和/或微组织被用作用于治疗糖尿病和与其关联的症状的药物。在一个特定实施方案中，药物包括新的β-细胞和/或可发育成这种细胞的干细胞。在进一步的特定实施方案中，药物被递送到患有糖尿病的患者的胰腺。
在另一特定实施方案中，封装的细胞悬浮液和/或微组织被用作用于神经变性疾病如帕金森症和与其关联的症状的治疗的药物。在一个特定实施方案中，药物包括新的神经元细胞和/或可发育成这种细胞的干细胞。在进一步的特定实施方案中，药物被递送到患有神经变性疾病的患者的中枢神经系统，优选地脑。在帕金森症的情况下，这种细胞能够例如恢复多巴胺生产。
在另一特定实施方案中，封装的细胞悬浮液和/或微组织被用作用于脊髓损伤和/或截瘫的治疗的药物。在一个特定实施方案中，药物包括新的神经元细胞和/或可发育成这种细胞的干细胞。在进一步的特定实施方案中，药物被递送到患有脊髓损伤和/或截瘫的患者的脊髓，以便恢复运动功能。
在另一特定实施方案中，封装的细胞悬浮液和/或微组织被用作用于心肌梗塞和与其关联的症状的治疗的药物。心肌梗塞引起心肌细胞大量损失，导致纤维化组织形成和残留肌细胞的肥大反应。这引起心功能受损。在一个优选实施方案中，本发明的封装的细胞悬浮液或微组织通过心肌内注射而递送给患者。更优选地，该注射借助导管进行。在一个特定实施方案中，药物包括新的心脏肌细胞(心肌细胞)和/或可发育成这种细胞的干细胞。
在一个优选实施方案中，本发明的封装的细胞悬浮液或微组织通过注射被递送给患者。更优选地，这种注射借助导管进行。施用根据本发明的封装的细胞悬浮液或微组织的另一方式是借助光针(photonic needle)概念。光针是其中含有光导纤维的针，从而允许在应用针期间光学成像，例如，为了本发明的封装的细胞悬浮液或微组织的给药目的。光导纤维也可以用于与接近于出口位点的UV光结合，该UV光可以用于在体内使挤出单体聚合。因此，光针可以被设计为本发明的喷嘴，其允许根据本发明的封装的细胞悬浮液或微组织在患者体内挤出。
另一方面，根据本发明的微组织用于形成组织，以便克服组织工程领域中的主要问题之一。如果要在体外产生厚度为超过约100 μm的组织，通常面临向位于组织内的细胞供应例如营养物和氧的问题。因此，厚度为超过约100 μm的组织通过目前的方式不能产生，因为最里面的细胞不断地相继死亡。
该不利点通过本发明得以克服，原因在于本发明的微组织可以在彼此顶部堆叠，以便产生厚度≥ 100 μm、优选地 ≥ 1 cm和甚至更优选地 ≥ 2 cm的组织。
通过堆叠本发明的微组织，不形成由细胞构成的实体，而是形成的纤维状和细长的含有多个细胞的隔室的网。在这些封装的隔室之间，可以容易地完成气体交换和例如培养基的流动，且可为细胞供应需要的营养物，直至例如在工程组织内形成血管系统。
本发明因此提供了组织的产生方法，包括堆叠至少两层根据本发明的微组织的步骤；以及可通过该方法获得的组织。在一个特定实施方案中，该工程组织是异质的工程组织。
在进一步的特定实施方案中，该组织具有≥ 100 μm且≤ 5 cm的厚度。在另一特定实施方案中，组织具有≥ 300 μm且≤ 2 cm的厚度。在另一特定实施方案中，组织具有≥ 500 μm且≤ 1 cm的厚度。
在进一步的特定实施方案中，堆叠了≥ 1且≤ 100 个微组织。在进一步的特定实施方案中，堆叠了 ≥ 10且≤ 90、≥ 20且≤ 80、≥ 30且≤ 70或≥ 40且≤ 60 个微组织。在进一步的特定实施方案中，堆叠了≥ 2且≤ 10、≥ 3且≤ 9、≥ 4且≤ 8或≥ 5且≤ 7 个微组织。
尽管本发明已在附图和前面的说明书中进行了说明和描述，但这种说明和描述被认为是说明性的或示范性的，而非限制性的，本发明不限于所公开的实施方案。
在实施该请求保护的发明时，根据对附图、公开内容和所附权利要求书的研究，本领域技术人员可以理解并进行所公开的实施方案的其它变型。在权利要求书中，措辞“包括/含有/包含”不排除其它要素或步骤，且不定冠词“一个”或“一种”不排除复数。仅仅某些措施在互相不同的从属权利要求中提到的事实不表明这些措施的组合不能有利地进行使用。权利要求书中的任何引用标记都不应被解释为限制范围。
实施例
实施例 1
在标准的细胞培养条件(37℃，5% CO2, ~95%湿度)下，在培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium; DMEM, Gibco)中培养真核表皮样癌细胞A431(ATCC# CRL-1555)，所述培养基补充有10%胎牛血清(FCS)、1%青霉素/链霉素和1% Glutamax(Invitrogen)。
两天后，细胞形成汇合细胞层并去除培养基。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞2次，然后用 EDTA/胰蛋白酶温育10分钟。加入10 ml培养基，以产生细胞悬浮液。
细胞悬浮液(1×105 细胞/ml)被供给到同轴挤出装置的中央圆筒中，而分隔材料[丙烯酰胺 (10 w/w%)、双丙烯酰胺(biscarylamide)(0.5 w/w%和光引发剂 irgacure 2959 (0.1%)的水溶液]被进料到外部圆筒中。
外部圆筒中的单体溶液和内部圆筒中的细胞悬浮液以1 m/min的流速被共挤出。
将装备有高速快门的高密度平行UV源(0.3 W/cm2)置于挤出机喷嘴的出口。在分隔材料和细胞悬浮液共挤出期间，将快门以1 Hz的频率打开和关闭。
丙烯酰胺/双丙烯酰胺混合物的光聚合导致形成末端打开的隔室，其含有多个A431细胞并被围绕用的聚丙烯酰胺层封装。
实施例 2
应用脉冲挤出模式重复实施例1，同时UV源前的快门连续打开。所使用的流动分布如下：
在t=0时，外部圆筒中的单体溶液以1 m/min的流速被挤出，而此时细胞悬浮液的流速是0 m/min。
在t= 0.5秒时，外部圆筒中的流速降低为0.5 m/min，同时内部圆筒(细胞悬浮液)中的流动从0增加至0.5 m/min。
在t=1.5秒时，细胞悬浮液的流动再次停止，而外部圆筒中的流动同时恢复为1 m/min。
在t =2秒时，所有流动都设置为0。
该实验设立导致形成末端闭合的隔室，所述隔室含有A431细胞悬浮液并被围绕用的聚丙烯酰胺层封装。
实施例 3
重复实施例2，其中流动分布被重复30次。
该实验设立导致形成约30个连接的末端闭合的隔室，所述隔室含有A431细胞悬浮液并被围绕用的聚丙烯酰胺层封装。
实施例 4
重复实施例2，其中所使用的喷嘴包括三个同轴圆筒。
单体溶液被供给到中央圆筒和外部圆筒中，而细胞悬浮液被供给到中间圆筒中。用上文给定的流速进行共挤出。将装备有高速快门的两个高密度平行UV源(0.3 W/cm2)置于含有分隔材料的各自圆筒的出口点。
该实验设立导致形成闭合的细长隔室，所述隔室含有被在外部的分隔材料层封装的A431细胞悬浮液并另外含有分隔材料中央管。
实施例 5
该实验设立类似于对实施例2所描述的实验设立。然而，所使用的喷嘴包括四个同轴圆筒。
并且，A431细胞被替换为在技术人员已知的条件下培养的原代神经元细胞。另外，提供了含有多个(1 × 105/ml)原代神经胶质细胞的细胞悬浮液，其中神经胶质细胞已在技术人员已知的条件下进行培养。
将含有神经细胞的细胞悬浮液供给到中央圆筒中。将含有神经胶质细胞的细胞悬浮液供给到第三圆筒(从最里面的圆筒计数)中。将分隔材料供给到最外面的圆筒中和到含有细胞悬浮液的圆筒之间的圆筒中。
因此，挤出机的圆筒以下列方式供给(从最里面的圆筒起)：
神经细胞悬浮液-- 分隔材料 -- 神经胶质细胞悬浮液-- 分隔材料.
将装备有高速快门的两个高密度平行UV源(0.3 W/cm2)置于含有分隔材料的各自圆筒的出口点。
该实验设立导致形成末端闭合的隔室，其含有神经细胞的细胞悬浮液，其被围绕用的聚丙烯酰胺层封装，该聚丙烯酰胺层被神经胶质细胞的细胞悬浮液围绕，神经胶质细胞的细胞悬浮液同样地被围绕用的聚丙烯酰胺层封装。
实施例 6
重复实施例5，其中A431细胞被交换为人胚胎干细胞(hESCs)，且第二细胞悬浮液被交换为含有浓度为10 ng/ ml培养基的成纤维细胞生长因子-20 (FGF-20)的溶液。
因此，挤出机的圆筒以下列方式供给(从最里面的圆筒起)：
hESCs 细胞悬浮液-- 分隔材料 -- FGF-20 溶液  --  分隔材料。
该实验设立导致形成末端闭合的隔室，其含有hESCs的细胞悬浮液，其被围绕用的聚丙烯酰胺层封装，聚丙烯酰胺层被含有细胞信号分子 FGF-20的溶液围绕，且被外部围绕用的聚丙烯酰胺层封装。
实施例 7
重复实施例6，其中所使用的喷嘴包括6个同轴圆筒。并且，提供了含有PA6小鼠基质细胞(1 × 105/ml)的另外的细胞悬浮液。
挤出机的圆筒以下列方式供料(从最里面的圆筒起)：
包含细胞信号分子的溶液 -- 分隔材料 -- hESC 细胞悬浮液-- 分隔材料 -- PA6 细胞悬浮液-- 分隔材料。
将装备有高速快门的三个高密度平行UV源(0.3 W/cm2)置于含有分隔材料的各自圆筒的出口点。
该实验设立导致形成末端闭合的隔室，其含有FGF-20溶液，该溶液被聚丙烯酰胺层封装，然后被hESCs的细胞悬浮液封装，该hESCs的细胞悬浮液被围绕用的聚丙烯酰胺层封装，然后被PA6细胞的细胞悬浮液封装，PA6的细胞悬浮液被外部围绕用的聚丙烯酰胺层所围绕。
然后在技术人员已知的条件下培养得到的挤出产品3周。随后，将之前含有hESC悬浮液的隔室切开，并分析产生的微组织中酪氨酸羟化酶的表达。预期检测出表达酪氨酸羟化酶的大量细胞，这表明已经产生了衍生自hESCs的多巴胺能神经元。这种多巴胺能神经元对于帕金森症的细胞治疗将是高度地有用的。
实施例 8
重复实施例1和2，其中分隔材料是生物可降解的分隔材料：聚乳酸基交联剂(双[聚(L-丙交酯)] 3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1,17-二氧羰基封端的二丙烯酸酯)。
得到的所产生的封装隔室与实施例1和2的封装隔室相当。

Claims (15)

1.用于同轴挤出的喷嘴(8)，其包括至少两个同轴圆筒，其中每个圆筒含有细胞悬浮液(1)、包含细胞信号分子的溶液或分隔材料(3)，
其中含有细胞悬浮液或包含信号分子的溶液的圆筒被含有分隔材料的圆筒分隔，和
其中最外面的圆筒含有分隔材料。
2.根据权利要求1的喷嘴，其包括4个同轴圆筒，其中第一圆筒含有细胞悬浮液(1)，且第二圆筒含有细胞悬浮液(4)或包含细胞信号分子的溶液。
3.根据权利要求1的喷嘴，其中在至少一个所述圆筒中的分隔材料是生物可降解材料和/或对信号分子选择性可渗透的。
4.挤出机，其包括根据权利要求1的喷嘴。
5.根据权利要求1的喷嘴或根据权利要求4的挤出机的用途，它们用于产生至少一个包含被分隔材料层封装的细胞悬浮液的隔室。
6.用于封装细胞悬浮液和/或产生微组织的方法，所述方法包括：
同轴挤出至少一种细胞悬浮液、至少一种分隔材料和任选地至少一种包含细胞信号分子的溶液，
其中细胞悬浮液或包含信号分子的溶液被分隔材料分隔，和
其中得到的最外面的层由分隔材料组成。
7.根据权利要求6的用于产生封装的细胞悬浮液的方法，其中一种含有多个细胞的悬浮液和一种围绕用的分隔材料被同轴挤出。
8.根据权利要求6的用于产生微组织的方法，其中两种含有多个细胞的悬浮液和两种分隔材料被同轴挤出。
9.根据权利要求6的用于产生微组织的方法，其中一种含有多个细胞的悬浮液、一种包含细胞信号分子的溶液和两种分隔材料被同轴挤出。
10.根据权利要求6的方法，其中至少一种分隔材料是光聚合的，且所述方法进一步包括光聚合所述至少一种分隔材料的步骤。
11.封装的细胞悬浮液或微组织，其可通过根据权利要求6的方法获得。
12.根据权利要求11的封装的细胞悬浮液或微组织，其作为药物。
13.根据权利要求11的封装的细胞悬浮液或微组织，其作为用于细胞治疗和/或微组织递送应用的药物。
14.用于产生组织的方法，其包括堆叠至少两个根据权利要求11的微组织的层的步骤。
15.包括至少两个堆叠的根据权利要求11的微组织的层的或可通过权利要求14 的方法获得的组织。
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