CN102220376B - 腺伴随病毒(aav)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用 - Google Patents
腺伴随病毒(aav)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了新的腺伴随病毒衣壳与载体的序列以及含有这些序列的宿主细胞。也描述了使用这种宿主细胞和载体产生rAAV颗粒的方法。也提供了使用本发明的载体AAV‑介导的递送治疗性和免疫原性基因。
Description
本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2004/028817,国际申请日为2004年9月30日,进入中国国家阶段的申请号为“200480027905.2”,发明名称为“腺伴随病毒(AAV)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用”的发明专利申请的分案申请。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本申请包括由国家卫生研究院(NIH)的NIDDK P30DK47757和NHLBI P01HL59407拨款资助的工作。美国政府享有本发明的一定权力。
发明背景
腺伴随病毒(AAV)是细小病毒科家族的成员,它是小的无包膜、二十面体病毒,具有4.7千碱基(kb)到6kb的单链线形DNA基因组。由于该病毒是作为纯化的腺病毒原种的污染物被发现,AAV指定为依赖病毒属(Dependovirus)。AAV的生命周期包括潜伏期(AAV基因组在感染后位点特异性地整合进宿主染色体),感染期(腺病毒或单纯疱疹病毒感染后,整合的基因组接着得到拯救、复制并包装进感染性病毒)。非致病性的特性、感染性的宽宿主范围(包括非分裂细胞)与潜在的位点特异性染色体整合使得AAV成为用于基因转移的有吸引力的工具。
近来的研究表明AAV载体是用于基因递送的优选运载体。迄今为止,已从人或非人灵长类(NHP)分离了几种表征良好的不同AAV。
已发现不同血清型的AAV表现出不同的转染效率,也表现出对不同细胞或组织的向性。然而,以前还未对这些不同血清型之间的关系进行研究。
基于AAV的构建物用于递送异源分子是理想的。
发明概述
本发明提供AAV的系统发生相关序列的“超家族”或“进化支”。这些AAV进化支提供用于将分子靶向和/或递送至所需靶细胞或组织的AAV序列源。
本发明一方面提供具有至少三个AAV成员的AAV进化支,这些成员是基于AAV vp1氨基酸序列对比,使用自引值为至少75%(基于至少1000次复制)的邻接启发式算法(Neighbor-Joining heuristic)与不大于0.05的泊松校正距离测量值(Poissoncorrection distance measurement)确定为系统发生相关的。合适的AAV进化支由用于产生载体的AAV序列组成。
本发明还提供以前未知的人AAV血清型,这些血清型在本文中称为克隆28.4/hu.14或AAV血清型9。因此,本发明另一方面提供一种由AAV衣壳组成的血清型9的AAV,该衣壳在血清学上与SEQ ID NO:123的氨基酸1-736的序列的衣壳相关,在血清学上与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8中的任一衣壳蛋白不同。
用该huAAV9的衣壳构建的载体表现出的基因转移效率类似于肝脏中的AAV8、优于肌肉中的AAV并且比肺中的AAV5高200倍。此外,该新的人AAV血清型与以前所述的AAV1到AAV8的序列同一性小于85%,并且不被任何这些AAV交叉中和。
本发明也提供其它新的AAV序列、含有这些序列的组合物及它们的应用。有利的是,这些组合物特别适用于出于治疗或预防目的需要反复施用的AAV载体。
本发明的这些和其它方面可通过以下发明详述得到明白。
附图简述
图1是使用带泊松校正距离测量值的邻接启发式算法构建的系统发生关系树。基于分离的AAV vp1衣壳蛋白与分组于进化支中分离的AAV确定关系。单个衣壳克隆的组基于它们共同的祖先分类在进化支中。进化支以A到F命名;亚型以进化支字母加上一个数值表示。
图2A-2AE对比了本发明的AAV vp1衣壳蛋白的氨基酸序列(公布了各个序列的编号)与以前公布的AAV1[SEQ ID NO:219]、AAV2[SEQ ID NO:221]、AAV3-3[SEQ ID NO:217]、AAV4-4[SEQ ID NO:218]、AAV5[SEQ ID NO:216]、AAV6[SEQ ID NO:220]、AAV7[SEQ ID NO:222]、AAV8[SEQ ID NO:223]与rh.25/42-15、29.3/bb.1、cy.2、29.5/bb.2、rh.32、rh.33、rh.34、rh.10、rh.24、rh14、rh.16、rh.17、rh.12、rh.18、rh.21(以前称为41.10)、rh.25(以前称为41.15)、rh2、rh.31、cy.3、cy.5、rh.13、cy.4、cy.6、rh.22、rh.19、rh.35、rh.37、rh.36、rh.23、rh.8和ch5[公开的美国专利申请号2003/0138772Al(2003年7月24日)]。本发明的序列包括hu.14/AAV9[SEQ ID NO:123]、hu.17[SEQ ID NO:83]、hu.6[SEQ ID NO:84]、hu.42[SEQ ID NO:85]、hu.38[SEQ ID NO:86]、hu.40[SEQ ID NO:87]、hu.37[SEQ IDNO:88]、rh.40[SEQ ID NO:92]、rh.52[SEQ ID NO:96]、rh.53[SEQ ID NO:97]、rh.49[SEQ IDNO:103]、rh.51[SEQ ID NO:104]、rh.57[SEQ ID NO:105]、rh.58[SEQID NO:106]、rh.61[SEQ ID NO:107]、rh.50[SEQ ID NO:108]、rh.43[SEQ ID NO:163]、rh.62[SEQ ID NO:114]、rh.48[SEQ ID NO:115]、4-9/rh.54[SEQ ID NO:116]和4-19/rh.55[SEQ ID NO:117]、hu.31[SEQ ID NO:121]、hu.32[SEQ ID NO:122]、hu.34[SEQ ID NO:125]、hu.45[SEQID NO:127]、hu.47[SEQ ID NO:128]、hu.13[SEQID NO:129]、hu.28[SEQ ID NO:130]、hu.29[SEQ ID NO:132]、hu.19[SEQ IDNO:133]、hu.20[SEQ ID NO:134]、hu.21[SEQ IDNO:135]、hu.23.2[SEQ ID NO:137]、hu.22[SEQ ID NO:138]、hu.27[SEQ ID NO:140]、hu.4[SEQ ID NO:141]、hu.2[SEQ IDNO:143]、hu.1[SEQ ID NO:144]、hu.3[SEQ ID NO:145]、hu.25[SEQ ID NO:146]、hu.15[SEQ ID NO:147]、hu.16[SEQ ID NO:148]、hu.18[SEQ IDNO:149]、hu.7[SEQID NO:150]、hu.11[SEQ ID NO:153]、hu.9[SEQ ID NO:155]、hu.10[SEQID NO:156]、hu.48[SEQ ID NO:157]、hu.44[SEQ ID NO:158]、hu.46[SEQ ID NO:159]、hu.43[SEQID NO:160]、hu.35[SEQ ID NO:164]、hu.24[SEQ ID NO:136]、rh.64[SEQ IDNO:99]、hu.41[SEQ ID NO:91]、hu.39[SEQ ID NO:102]、hu.67[SEQ ID NO:198]、hu.66[SEQID NO:197]、hu.51[SEQ ID NO:190]、hu.52[SEQ ID NO:191]、hu.49[SEQ IDNO:189]、hu.59[SEQ ID NO:192]、hu.57[SEQ ID NO:193]、hu.58[SEQ ID NO:194]、hu.63[SEQ IDNO:195]、hu.64[SEQ ID NO:196]、hu.60[SEQ ID NO:184]、hu.61[SEQID NO:185]、hu.53[SEQ ID NO:186]、hu.55[SEQ ID NO:187]、hu.54[SEQ ID NO:88]、hu.6[SEQ ID NO:84]与rh.56[SEQ ID NO:152]。这些衣壳序列也见引为参考的序列表中。
图3A-3CN对比了本发明的AAV vp1衣壳蛋白的核酸序列(公布了各个序列的编号)与以前公布的AAV5(SEQ ID NO:199)、AAV3-3(SEQ ID NO:200)、AAV4-4(SEQ ID NO:201)、AAV1(SEQ ID NO:202)、AAV6(SEQ ID NO:203)、AAV2(SEQ ID NO:211)、AAV7(SEQ ID NO:213)与AAV8(SEQ ID NO:214)、rh.25/42-15、29.3/bb.1、cy.2、29.5/bb.2、rh.32、rh.33、rh.34、rh.10、rh.24、rh14、rh.16、rh.17、rh.12、rh.18、rh.21(以前称为41.10)、rh.25(以前称为41.15;GenBank登录号AY530557)、rh2、rh.31、cy.3、cy.5、rh.13、cy.4、cy.6、rh.22、rh.19、rh.35、rh.36、rh.37、rh.23、rh.8与ch.5[公开的美国专利申请号2003/0138772A1(2003年7月24日)]。本发明的核酸序列包括hu.14/AAV9(SEQ ID NO:3)、LG-4/rh.38(SEQIDNO:7)、LG-10/rh.40(SEQID NO:14)、N721-8/rh.43(SEQ ID NO:43)、1-8/rh.49(SEQIDNO:25)、2-4/rh.50(SEQ ID NO:23)、2-5/rh.51(SEQ ID NO:22)、3-9/rh.52(SEQ IDNO:18)、3-11/rh.53(SEQ ID NO:17)、5-3/rh.57(SEQ ID NO:26)、5-22/rh.58(SEQ IDNO:27)、2-3/rh.61(SEQ ID NO:21)、4-8/rh.64(SEQ ID NO:15)、3.1/hu.6(SEQ IDNO:5)、33.12/hu.17(SEQ ID NO:4)、106.1/hu.37(SEQ ID NO:10)、LG-9/hu.39(SEQ IDNO:24)、114.3/hu.40(SEQ ID NO:11)、127.2/hu.41(SEQ ID NO:6)、127.5/hu.42(SEQID NO:8)与hu.66(SEQ ID NO:173)、2-15/rh.62(SEQ ID NO:33)、1-7/rh.48(SEQ IDNO:32)、4-9/rh.54(SEQID NO:40)、4-19/rh.55(SEQ ID NO:37)、52/hu.19(SEQ IDNO:62)、52.1/hu.20(SEQ IDNO:63)、54.5/hu.23(SEQ ID NO:60)、54.2/hu.22(SEQ IDNO:67)、54.7/hu.24(SEQ ID NO:66)、54.1/hu.21(SEQ ID NO:65)、54.4R/hu.27(SEQ IDNO:64)、46.2/hu.28(SEQ ID NO:68)、46.6/hu.29(SEQ ID NO:69)、128.1/hu.43(SEQ IDNO:80)、128.3/hu.44(SEQ ID NO:81)与130.4/hu.48(SEQ ID NO:78)、3.1/hu.9(SEQ IDNO:58)、16.8/hu.10(SEQ ID NO:56)、16.12/hu.11(SEQ ID NO:57)、145.1/hu.53(SEQID NO:176)、145.6/hu.55(SEQ IDNO:178)、145.5/hu.54(SEQ ID NO:177)、7.3/hu.7(SEQ ID NO:55)、52/hu.19(SEQ ID NO:62)、33.4/hu.15(SEQ ID NO:50)、33.8/hu.16(SEQ ID NO:51)、58.2/hu.25(SEQ ID NO:49)、161.10/hu.60(SEQ IDNO:170)、H-5/hu.3(SEQ ID NO:44)、H-1/hu.1(SEQ ID NO:46)、161.6/hu.61(SEQ IDNO:174)、hu.31(SEQ ID NO:1)、hu.32(SEQ ID NO:2)、hu.46(SEQ IDNO:82)、hu.34(SEQ ID NO:72)、hu.47(SEQ ID NO:77)、hu.63(SEQ ID NO:204)、hu.56(SEQIDNO:205)、hu.45(SEQ ID NO:76)、hu.57(SEQ ID NO:206)、hu.35(SEQ ID NO:73)、hu.58(SEQ ID NO:207)、hu.51(SEQ ID NO:208)、hu.49(SEQ ID NO:209)、hu.52(SEQID NO:210)、hu.13(SEQ ID NO:71)、hu.64(SEQ ID NO:212)、rh.56(SEQ ID NO:54)、hu.2(SEQ IDNO:48)、hu.18(SEQ ID NO:52)、hu.4(SEQ ID NO:47)与hu.67(SEQ IDNO:215)。这些衣壳序列也见引为参考的序列表中。
图4A-4D提供了对基于AAV的新灵长类载体在体外和体内基因转移效率的评价。AAV载体是如[Gao等,Proc Natl Acad Sci美国,99:11854-11859(2002年,9月3日)]所述具有AAV1、2、5、7、8和6与ch.5、rh.34、cy.5、rh.20、rh.8和AAV9衣壳的假型。如图4A所示,为进行体外研究,接种于95-孔板的84-32细胞(表达腺病毒血清型E4的293细胞)以每细胞1×104GC的感染复数(MoI)用假型AAVCMVEGFP载体感染。感染后48小时使用紫外显微镜将相对EGFP转导效率估计为绿色细胞的百分比并显示在Y轴上。为进行体内研究,分别经门内(intraportal)(图4B)、气管内(图4C)和肌肉内(图4D)以每只动物1×1011GC的剂量给予NCR裸鼠(4-6周龄)的肝(图4B)、肺(图4C)和肌肉(图4D)以表达分泌的报道基因A1AT的载体。在基因转移后第28天比较血清A1AT水平(ng/ml)并示于Y轴上。X轴表示所分析的AAV与它们所属的进化支。
发明详述
在任何用于治疗或预防的载体库中,为所需应用选择载体源,需要能将大分子携带至靶细胞的各种不同载体。迄今为止,关于将AAV用作载体的一个问题是缺乏各种不同的病毒来源。本发明通过提供AAV的进化支来克服该问题,所述进化支用于选择系统发生相关的(或选择治疗方案所需的),或系统发生不同的AAV并用于预测功能。本发明还提供新的AAV病毒。
当术语“基本同源性”或“基本相似性”指核酸或其片段时意味着当合适的核苷酸插入物或缺失物与另一核酸(或其互补链)最佳对比时,对比序列中至少约95%到99%的核苷酸序列同一性。优选在全长序列、或其开放读框、或另一至少长15个核苷酸的合适片段上具有同源性。合适片段的例子描述于本文。
文中用于核酸序列的术语“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“相同百分比”指当对比最大一致性时,两条序列中的残基相同。序列同一性比较的长度可是基因组全长、基因编码序列的的全长,或需要至少约500到5000个核苷酸的片段。然而,较小片段中的同一性也是需要的,例如至少约9个核苷酸、通常至少约20到24个核苷酸、至少约28到32个核苷酸、至少约36或更多个核苷酸的片段。类似地,氨基酸序列、蛋白全长、或其片段的“序列同一性百分比”可容易地确定。合适片段的长度至少约8个氨基酸,也可达约700个氨基酸。合适片段的例子描述于文中。
当术语“基本同源性”或“基本相似性”指氨基酸或其片段时意味着当合适的氨基酸插入物或缺失物与另一氨基酸(或其互补链)最佳对比时,对比序列中至少约95%到99%的氨基酸序列同一性。优选在全长序列,或其蛋白质(例如,cap蛋白、rep蛋白),或其至少8个氨基酸,或更希望至少15个氨基酸长度的片段上具有同源性。合适片段的例子描述于本文。
术语“高度保守的”表示至少80%的同一性、优选至少90%的同一性、更优选超过97%的同一性。本领域的技术人员可凭借本领域技术人员已知的算法和计算机程序容易地确定同一性。
一般当提及在两种不同的腺伴随病毒之间的“同一性”、“同源性”或“相似性”时,“同一性”、“同源性”或“相似性”是参考“对比”的序列确定的。“对比”的序列或“对比”指多核酸序列或蛋白(氨基酸)序列,与参考序列相比,该序列通常含有缺失的或附加的碱基或氨基酸的校正。在实施例中,使用公开的AAV2或AAV1序列作为参考点进行AAV对比。然而,本领域的技术人员可容易地选择另一AAV序列作为参考。
可使用任何各种公用或市售可得的多序列对比程序进行对比。这种程序的例子包括通过因特网的万维服务器可得的“Clustal W”、“CAP序列组件”、“MAP”和“MEME”。这种程序的其它来源是本领域技术人员已知的。或者也可使用VectorNTI实用程序。许多本领域已知的算法,包括包含在上述程序中的算法也可用于测量核苷酸序列同一性。使用GCG6.1版中的程序FastaTM来比较多核苷酸序列是另一个例子。FastaTM提供在查询和检索序列之间最佳重叠区域的对比和序列同一性百分比。例如,核酸序列之间的序列同一性百分比可使用GCG6.1版提供的具有默认参数的FastaTM(字长为6和用于计分矩阵的NOPAM系数)来确定,该程序纳入本文引作参考。多序列对比程序也可应用于氨基酸序列,例如“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME”和“Match-Box”程序。虽然本领域的技术人员可视需要改变这些设置,但通常这些程序以默认设置使用。或者,本领域的技术人员可利用另一种算法或计算机程序,该算法或程序提供的同一性或算法的水平至少同参考的算法和程序提供的一样。参见,例如J.D.Thomson等,Nucl.Acids.Res.,“多序列对比的综合比较”(A comprehensive comparison ofmultiple sequence alignments),27(13):2682-2690(1999)。
术语“血清型”区分具有在血清学上不同于其它AAV血清型的一种衣壳的AAV。血清学特殊性是基于与其它AAV相比,针对AAV的抗体之间缺乏交叉反应性来确定。
交叉反应性通常在中和抗体试验中测定。就该试验而言,使用腺伴随病毒在家兔或其它合适的动物模型中产生抗特异性AAV的多克隆血清。然后在该试验中测试所产生的抗特异性AAV的血清中和相同(同源)或异源AAV的能力。达到50%中和作用的稀释度看作中和抗体滴度。如果就两种AAV而言,倒数形式的异源滴度除以同源滴度的商小于16,则此两种AAV可视为是相同的血清型。相反,如果倒数形式的异源滴度与同源滴度之比是16或更大,此两种AAV视为是不同血清型。
如本文所定义,为形成血清型9,所产生针对所选AAV衣壳的抗体必须与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8中任一种不交叉反应。在一个实施方案中,本发明提供一种在本文中鉴定为人AAV血清型9的新血清型的AAV衣壳。
本说明书与权利要求书使用的术语“含有”和“包括”是包括其它成分、元素、整数、步骤等在内。相反,术语“由...组成”和其变体不包括其它成分、元素、整数、步骤等在内。
1.进化支
在一方面,本发明提供了AAV的进化支。进化支是基于AAV vp1氨基酸序列对比,使用自引值为至少75%(至少1000次复制)的邻接启发式算法与不大于0.05的泊松校正距离测量值确定为互相系统发生相关的一组AAV。
邻接算法详细描述于参考文献。参见,例如M.Nei与S.Kumar,《分子进化与系统发生学》(Molecular Evolution and Phylogenetics)(牛津大学出版社,纽约(2000)。计算机程序可用于执行该算法。例如,MEGA v2.1程序执行改进的Nei-Gojobori方法。使用这些技术与计算机程序,AAV vp1衣壳蛋白的序列,本领域的技术人员可容易地确定所选择的AAV是否包含在文中所鉴定的一种进化支内、另一种进化支内、或在这些进化支之外。
虽然本文所定义的进化支主要基于天然的AAV vp1衣壳,这些进化支不限于天然的AAV。这些进化支可包括非天然AAV,包括(但不限于)重组、修饰、嵌合、杂交、合成、人工的等,基于AAV vp1氨基酸序列对比,使用自引值为至少75%(至少1000次复制)的邻接启发式算法与不大于0.05的泊松校正距离测量值确定为系统发生相关的AAV。
本文所述的进化支包括进化支A(以AAV1和AAV6表示)、进化支B(以AAV2表示)、进化支C(以AAV2-AAV3杂交体表示)、进化支D(以AAV7表示)、进化支E(以AAV8表示)与进化支F(以人AAV9表示)。这些进化支以前文所述AAV血清型的进化支的成员代表。前文所述的AAV1和AAV6是单一进化支(进化支A)的成员,该进化支中4种分离物回收自3种人。前文所述AAV3和AAV5血清型明显相互不同,但在本文所述的筛选中未检测到,并且未包括于任何这些进化支中。
进化支B(AAV2)和进化支C(AAV2-AAV3杂交体)是在人中发现的AAV最丰富的(AAV2有22种分离物来自12种个体,进化支C有17个分离物来自8种个体)。
大量的序列分组于进化支D(AAV7)或进化支E(AAV8)。有趣的是,这些进化支普遍存在于不同物种中。进化支D对恒河猴与南美弥猴是独特的,具有分离自10种不同动物的15个成员。由于进化支E在人和非人灵长类中发现,它是令人感兴趣的:9种分离物回收自7种人而21种分离物得自9种不同的非人灵长类,包括恒河猴、狒狒和豚尾弥猴(pigtailmonkey)。
在其它两种动物中证实了某些序列的杂交特性,虽然在该情况中所有的序列似乎具有起源于两种协同感染病毒(在两种动物中是进化支D与进化支E病毒)的独立而不同的重组。这些重组体无一在其它动物或受试对象中鉴定到。
因为进化支C(AAV2-AAV3杂交体)在6种不同的人对象中鉴定到,重组甚至导致了合适的后代。另一方面,就AAV7-AAV8杂交体而言,仅有少数重组情况涉及AAV进化。这些重组情况说明AAV能重组,从而产生框内基因以及在一些情况中产生可包装和/或感染性衣壳结构。另一方面,进化支C(AAV2-AAV3杂交体进化支)是一组通过重组获得选择性优点的病毒,这种重组使它们忍受环境压力。
A.进化支A(以AAV1和AAV6表示):
在另一方面,本发明提供进化支A,其特征在于含有前文公开的AAV1和AAV6。参见,例如2000年5月18日的国际公开号WO 00/28061;Rutledge等,JVirol,72(1):309-319(1998年1月)。此外,该进化支包含有新AAV,包括(不限于)128.1/hu.43[SEQ ID NO:80和160]、128.3/hu.44[SEQ ID NO:81和158]、130.4/hu.48[SEQ ID NO:78和157]与hu.46[SEQ IDNO:82和159]。本发明还提供修饰的hu.43衣壳[SEQ ID NO:236]与修饰的hu.46衣壳[SEQID NO:224]。
在一个实施方案中,该进化支的一个或多个成员的衣壳与AAV1和/或AAV6衣壳的全长vp1、vp2或vp3具有至少85%、至少90%、至少95%或至少97%的氨基酸同一性。
在另一个实施方案中,本发明提供进化支A的新AAV,前提是新AAV均不含有AAV1或AAV6的任一种衣壳。这些AAV可包括(不限于)具有衍生自以下一种或多种衣壳的AAV:128.1/hu.43[SEQ ID NO:80和160]、修饰的hu.43[SEQ IDNO:236]、128.3/hu.44[SEQ IDNO:81和158]、hu.46[SEQ ID NO:82和159]、修饰的hu.46[SEQ ID NO:224]与130.4/hu.48[SEQ ID NO:78和157]。
B.进化支B(AAV2进化支):
在另一个实施方案中,本发明提供进化支B。
该进化支的特征在于最少包含前文所述的AAV2与本发明的新AAV,新AAV包括52/hu.19[SEQ ID NO:62和133]、52.1/hu.20[SEQ ID NO:63和134]、54.5/hu.23[SEQ ID NO:60和137]、54.2/hu.22[SEQ ID NO:67和138]、54.7/hu.24[SEQID NO:66和136]、54.1/hu.21[SEQ ID NO:65和135]、54.4R/hu.27[SEQ ID NO:64和140]、46.2/hu.28[SEQ ID NO:68和130]、46.6/hu.29[SEQ ID NO:69和132]、修饰的hu.29[SEQ ID NO:225]、172.1/hu.63[SEQ ID NO:171和195;GenBank登录号AY530624]、172.2/hu.64[SEQ ID NO:172和196;GenBank登录号AY530625]、24.5/hu.13[SEQ ID NO:71和129;GenBank登录号AY530578]、145.6/hu.56[SEQ IDNO:168和192]、hu.57[SEQ ID NO:169和193]、136.1/hu.49[SEQ IDNO:165和189]、156.1/hu.58[SEQ ID NO:179和194]、72.2/hu.34[SEQ ID NO:72和125;GenBank登录号AY530598]、72.3/hu.35[SEQ ID NO:73和164;GenBank登录号AY530599]、130.1/hu.47[SEQ ID NO:77和128]、129.1/hu.45(SEQ ID NO:76和127;GenBank登录号AY530608)、140.1/hu.51[SEQ ID NO:161和190;GenBank登录号AY530613]和140.2/hu.52[SEQ ID NO:167和191;GenBank登录号AY530614]。
在一个实施方案中,该进化支的一个或多个成员的衣壳与AAV2衣壳的全长vp1、vp2或vp3具有至少85%、至少90%、至少95%或至少97%的氨基酸同一性。
在另一个实施方案中,本发明提供进化支B的新AAV,前提是新AAV均不含有AAV2衣壳。这些AAV可包括(不限于)具有衍生自以下一种或多种衣壳的AAV:52/hu.19[SEQ ID NO:62和133]、52.1/hu.20[SEQ ID NO:63和134]、54.5/hu.23[SEQ ID NO:60和137]、54.2/hu.22[SEQ ID NO:67和138]、54.7/hu.24[SEQID NO:66和136]、54.1/hu.21[SEQ ID NO:65和135]、54.4R/hu.27[SEQ ID NO:64和140];46.2/hu.28[SEQ ID NO:68和130];46.6/hu.29[SEQ ID NO:69和132];修饰的hu.29[SEQ ID NO:225]、172.1/hu.63[SEQID NO:171和195]、172.2/hu.64[SEQID NO:172和196];24.5/hu.13[SEQ ID NO:71和129]、145.6/hu.56[SEQ ID NO:168和192;GenBank登录号AY530618]、hu.57[SEQ ID NO:169和193;GenBank登录号AY530619]、136.1/hu.49[SEQ ID NO:165和189;GenBank登录号AY530612]、156.1/hu.58[SEQ ID NO:179和194;GenBank登录号AY530620]、72.2/hu.34[SEQ IDNO:72和125]、72.3/hu.35[SEQ ID NO:73和164]、129.1/hu.45[SEQ ID NO:76和127]、130.1/hu.47[SEQ ID NO:77和128、GenBank登录号AY530610]、140.1/hu.51[SEQ IDNO:161和190;GenBank登录号AY530613]和140.2/hu.52[SEQ ID NO:167和191;GenBank登录号AY530614]。
C.进化支C(AAV2-AAV3杂交体进化支)
另一个方面,本发明提供进化支C,该进化支的特征在于包含前文所公开的AAV2与AAV3的杂交体的AAV,例如H-6/hu.4、H-2/hu.2[美国专利申请2003/0138772(2003年6月24日)]。此外,该进化支含有新AAV,包括(不限于)3.1/hu.9[SEQ ID NO:58和155]、16.8/hu.10[SEQ ID NO:56和156]、16.12/hu.11[SEQ ID NO:57和153]、145.1/hu.53[SEQ IDNO:176和186]、145.6/hu.55[SEQ ID NO:178和187]、145.5/hu.54[SEQ ID NO:177和188]、7.3/hu.7[SEQ ID NO:55和150;现在以GenBank登录号AY530628保藏]、修饰的hu.7[SEQ IDNO:226]、33.4/hu.15[SEQ ID NO:50和147]、33.8/hu.16[SEQ ID NO:51和148]、hu.18[SEQID NO:52和149]、58.2/hu.25[SEQ ID NO:49和146]、161.10/hu.60[SEQ ID NO:170和184]、H-5/hu.3[SEQ ID NO:44和145]、H-1/hu.1[SEQID NO:46和144]和161.6/hu.61[SEQID NO:174和185]。
在一个实施方案中,该进化支的一个或多个成员的衣壳与hu.4和/或hu.2衣壳的全长vp1、vp2或vp3具有至少85%、至少90%、至少95%或至少97%的氨基酸同一性。
在另一个实施方案中,本发明提供进化支C(AAV2-AAV3杂交体进化支)的新AAV,前提是该新AAV均不含有hu.2或hu.4的衣壳。这些AAV可包括(不限于)具有衍生自以下一种或多种衣壳的AAV:3.1/hu.9[SEQ ID NO:58和155]、16.8/hu.10[SEQ ID NO:56和156]、16.12/hu.11[SEQ ID NO:57和153]、145.1/hu.53[SEQ ID NO:176和186]、145.6/hu.55[SEQ ID NO:178和187]、145.5/hu.54[SEQ ID NO:177和188]、7.3/hu.7[SEQ ID NO:55和150]、修饰的hu.7[SEQ ID NO:226]、33.4/hu.15[SEQ ID NO:50和147]、33.8/hu.16[SEQID NO:51和148]、58.2/hu.25[SEQ ID NO:49和146]、161.10/hu.60[SEQ ID NO:170和184]、H-5/hu.3[SEQ ID NO:44和145]、H-1/hu.1[SEQ ID NO:46和144]和161.6/hu.61[SEQID NO:174和185]。
D.进化支D(AAV7进化支)
在另一个实施方案中,本发明提供进化支D。该进化支的特征在于包含前文所述的AAV7[G.Gao等,Proc.Natl.Acad.Sci美国,99:11854-9(2002年9月3日)]。编码该AAV7衣壳的核酸序列见SEQ ID NO:184;AAV7衣壳的氨基酸序列见SEQID NO:185。此外,该进化支含有许多前文所述的AAV序列,包括cy.2、cy.3、cy.4、cy.5、cy.6、rh.13、rh.37、rh.36和rh.35[公开的美国专利申请号US2003/0138772Al(2003年7月24日)]。另外,AAV7进化支含有新AAV序列,包括(不限于)2-15/rh.62[SEQ ID NO:33和114]、1-7/rh.48[SEQ ID NO:32和115]、4-9/rh.54[SEQID NO:40和116]与4-19/rh.55[SEQ ID NO:37和117]。本发明还包括修饰的cy.5[SEQ ID NO:227]、修饰的rh.13[SEQ ID NO:228]与修饰的rh.37[SEQ IDNO:229]。
在一个实施方案中,该进化支的一个或多个成员的衣壳与AAV7衣壳,SEQ IDNO:184和185的全长vp1、vp2或vp3具有至少85%、至少90%、至少95%或至少97%的氨基酸同一性。
在另一个实施方案中,本发明提供进化支D的新AAV,前提是该新AAV均不含有cy.2、cy.3、cy.4、cy.5、cy.6、rh.13、rh.37、rh.36和rh.35的任一种衣壳。这些AAV可包括(不限于)具有衍生自以下一种或多种衣壳的AAV:2-15/rh.62[SEQID NO:33和114]、1-7/rh.48[SEQ ID NO:32和115]、4-9/rh.54[SEQ ID NO:40和116]与4-19/rh.55[SEQ ID NO:37和117]。
E.进化支E(AAV8进化支)
一方面,本发明提供进化支E。该进化支的特征在于包含前文所述的AAV8[G.Gao等,Proc.Natl.Acad.Sci美国,99:11854-9(2002年9月3日)]、43.1/rh.2、44.2/rh.10、rh.25、29.3/bb.1与29.5/bb.2(公开的美国专利申请号US 2003/0138772A1(2003年7月24日))。
此外,该进化支的新AAV序列包括(不限于)例如30.10/pi.1[SEQ ID NO:28和93]、30.12/pi.2[SEQ ID NO:30和95]、30.19/pi.3[SEQ ID NO:29和94]、LG-4/rh.38[SEQ IDNO:7和86]、LG-10/rh.40[SEQ ID NO:14和92]、N721-8/rh.43[SEQ ID NO:43和163]、1-8/rh.49[SEQ ID NO:25和103]、2-4/rh.50[SEQID NO:23和108]、2-5/rh.51[SEQ ID NO:22和104]、3-9/rh.52[SEQ ID NO:18和96]、3-11/rh.53[SEQ ID NO:17和97]、5-3/rh.57[SEQID NO:26和105]、5-22/rh.58[SEQ IDNO:27和58]、2-3/rh.61[SEQ ID NO:21和107]、4-8/rh.64[SEQ ID NO:15和99]、3.1/hu.6[SEQ ID NO:5和84]、33.12/hu.17[SEQ ID NO:4和83]、106.1/hu.37[SEQ IDNO:10和88]、LG-9/hu.39[SEQ ID NO:24和102]、114.3/hu.40[SEQ ID NO:11和87]、127.2/hu.41[SEQ ID NO:6和91]、127.5/hu.42[SEQ ID NO:8和85]、hu.66[SEQ IDNO:173和197]和hu.67[SEQ ID NO:174和198]。该进化支还包括修饰的rh.2[SEQ IDNO:231]、修饰的rh.58[SEQ ID NO:232]、修饰的rh.64[SEQ ID NO:233]。
在一个实施方案中,该进化支的一个或多个成员的衣壳与AAV8衣壳的全长vp1、vp2或vp3具有至少85%、至少90%、至少95%或至少97%的氨基酸同一性。编码该AAV8衣壳的核酸序列见SEQ ID NO:186;该衣壳的氨基酸序列见SEQ IDNO:187。
在另一个实施方案中,本发明提供进化支E的新AAV,前提是该新AAV均不含有AAV8.rh.8、44.2/rh.10、rh.25、29.3/bb.1与29.5/bb.2[公开的美国专利申请号US2003/0138772A1(2003年7月24日)]的任一种衣壳。这些AAV可包括(不限于)具有衍生自以下一种或多种衣壳的AAV:30.10/pi.1[SEQ ID NO:28和93]、30.12/pi.2[SEQ ID NO:30和95]、30.19/pi.3[SEQ ID NO:29和94]、LG-4/rh.38[SEQ IDNO:7和86]、LG-10/rh.40[SEQ IDNO:14和92]、N721-8/rh.43[SEQ ID NO:43和163]、1-8/rh.49[SEQ ID NO:25和103]、2-4/rh.50[SEQ ID NO:23和108]、2-5/rh.51[SEQ IDNO:22和104]、3-9/rh.52[SEQ ID NO:18和96]、3-11/rh.53[SEQ ID NO:17和97]、5-3/rh.57[SEQ ID NO:26和105]、5-22/rh.58[SEQID NO:27和58]、修饰的rh.58[SEQID NO:232]、2-3/rh.61[SEQ ID NO:21和107]、4-8/rh.64[SEQ ID NO:15和99]、修饰的rh.64[SEQ ID NO:233]、3.1/hu.6[SEQ ID NO:5和84]、33.12/hu.17[SEQ ID NO:4和83]、106.1/hu.37[SEQ ID NO:10和88]、LG-9/hu.39[SEQ IDNO:24和102]、114.3/hu.40[SEQ ID NO:11和87]、127.2/hu.41[SEQ ID NO:6和91]、127.5/hu.42[SEQID NO:8和85]、hu.66[SEQ ID NO:173和197]和hu.67[SEQ ID NO:174和198]。
F.进化支(AAV9进化支)
本文将该进化支鉴定为名为hu.14/AAV9[SEQ ID NO:3和123]的新AAV血清型。此外,该进化支含有其它的新序列,包括hu.31[SEQ ID NO:1和121]与hu.32[SEQ ID NO:2和122]。
在一个实施方案中,该进化支的一个或多个成员的衣壳与AAV9衣壳,SEQ IDNO:3和123的全长vp1、vp2或vp3具有至少85%、至少90%、至少95%或至少97%的氨基酸同一性。
在另一个实施方案中,本发明提供进化支F的新AAV,包括(不限于)具有衍生自以下一种或多种的衣壳的AAV:hu.14/AAV9[SEQ ID NO:3和123]、hu.31[SEQID NO:1和121]与hu.32[SEQ ID NO:1和122]。
本发明的AAV进化支可用于各种目的,包括提供用于产生病毒载体与产生靶分子的现成的相关AAV库。本领域的技术人员明白这些进化支也可用作用于各种目的的工具。
II.新的AAV序列
本发明提供在本文中可互换称为克隆hu.14/28.4和huAAV9的具有新AAV血清型的核酸序列和氨基酸。这些序列用于构建高效转导肝、肌肉和肺的载体。该新AAV及其序列也用于各种其它目的。这些序列由Genbank提交并给予本文所鉴定的登录号。
本发明还提供许多新AAV的核酸序列和氨基酸序列。如下文所总结的,许多这些序列包括上述作为进化支的成员的序列。
来自进化支A的128.1/hu.43[SEQ ID NO:80和160,GenBank登录号AY530606]、修饰的hu.43[SEQ ID NO:236]、128.3/hu.44[SEQ ID NO:81和158,GenBank登录号AY530607]和130.4/hu.48[SEQ ID NO:78和157,GenBank登录号AY530611];
来自进化支B的52/hu.19[SEQ ID NO:62和133,GenBank登录号AY530584]、52.1/hu.20[SEQ ID NO:63和134,GenBank登录号AY530586]、54.5/hu.23[SEQ IDNO:60和137,GenBank登录号AY530589]、54.2/hu.22[SEQ ID NO:67和138,GenBank登录号AY530588]、54.7/hu.24[SEQ ID NO:66和136,GenBank登录号AY530590]、54.1/hu.21[SEQ ID NO:65和135,GenBank登录号AY530587]、54.4R/hu.27[SEQ ID NO:64和140,GenBank登录号AY530592]、46.2/hu.28[SEQ IDNO:68和130,GenBank登录号AY530593]、46.6/hu.29[SEQID NO:69和132,GenBank登录号AY530594]、修饰的hu.29[SEQ ID NO:225],172.1/hu.63[SEQ IDNO:171和195]和140.2/hu.52[SEQ ID NO:167和191];
来自进化支C的3.1/hu.9[SEQ ID NO:58和155,GenBank登录号AY530626]、16.8/hu.10[SEQ ID NO:56和156,GenBank登录号AY530576]、16.12/hu.11[SEQ IDNO:57和153,GenBank登录号AY530577]、145.1/hu.53[SEQ ID NO:176和186,GenBank登录号AY530615]、145.6/hu.55[SEQ ID NO:178和187,GenBank登录号AY530617]、145.5/hu.54[SEQ ID NO:177和188,GenBank登录号AY530616]、7.3/hu.7[SEQ ID NO:55和150,GenBank登录号AY530628]、修饰的hu.7[SEQ IDNO:226]、hu.18[SEQ ID NO:52和149,GenBank登录号AY530583]、33.4/hu.15[SEQID NO:50和147,GenBank登录号AY530580]、33.8/hu.16[SEQID NO:51和148,GenBank登录号AY530581]、58.2/hu.25[SEQ ID NO:49和146,GenBank登录号AY530591]、161.10/hu.60[SEQ ID NO:170和184,GenBank登录号AY530622]、H-5/hu.3[SEQ ID NO:44和145,GenBank登录号AY530595]、H-1/hu.1[SEQ IDNO:46和144,GenBank登录号AY530575]和161.6/hu.61[SEQ ID NO:174和185,GenBank登录号AY530623];
来自进化支D的2-15/rh.62[SEQ ID NO:33和114,GenBank登录号AY530573]、1-7/rh.48[SEQ ID NO:32和115,GenBank登录号AY530561]、4-9/rh.54[SEQ IDNO:40和116,GenBank登录号AY530567]、4-19/rh.55[SEQ ID NO:37和117,GenBank登录号AY530568]、修饰的cy.5[SEQ ID NO:227]、修饰的rh.13[SEQ IDNO:228]和修饰的rh.37[SEQID NO:229];
来自进化支E的30.10/pi.1[SEQ ID NO:28和93,GenBank登录号AY53055]、30.12/pi.2[SEQ ID NO:30和95,GenBank登录号AY 530554]、30.19/pi.3[SEQ IDNO:29和94,GenBank登录号AY530555]、LG-4/rh.38[SEQ ID NO:7和86,GenBank登录号AY 530558]、LG-10/rh.40[SEQ ID NO:14和92,GenBank登录号AY530559]、N721-8/rh.43[SEQ ID NO:43和163,GenBank登录号AY530560]、1-8/rh.49[SEQ IDNO:25和103,GenBank登录号AY530561]、2-4/rh.50[SEQ ID NO:23和108,GenBank登录号AY530563]、2-5/rh.51[SEQ ID NO:22和104,GenBank登录号530564]、3-9/rh.52[SEQ ID NO:18和96,GenBank登录号AY530565]、3-11/rh.53[SEQ IDNO:17和97,GenBank登录号AY530566]、5-3/rh.57[SEQ ID NO:26和105,GenBank登录号AY530569]、5-22/rh.58[SEQ ID NO:27和58,GenBank登录号530570]、修饰的rh.58[SEQ ID NO:232]、2-3/rh.61[SEQ ID NO:21和107,GenBank登录号AY530572]、4-8/rh.64[SEQ ID NO:15和99,GenBank登录号AY530574]、修饰的rh.64[SEQ ID NO:233]、3.1/hu.6[SEQ ID NO:5和84,GenBank登录号AY530621]、33.12/hu.17[SEQ ID NO:4和83,GenBank登录号AY530582]、106.1/hu.37[SEQ IDNO:10和88,GenBank登录号AY530600]、LG-9/hu.39[SEQ ID NO:24和102,GenBank登录号AY530601]、114.3/hu.40[SEQ ID NO:11和87,GenBank登录号AY530603]、127.2/hu.41[SEQ ID NO:6和91,GenBank登录号AY530604]、127.5/hu.42[SEQ ID NO:8和85,GenBank登录号AY530605]、hu.66[SEQ ID NO:173和197,GenBank登录号AY530626]、hu.67[SEQ ID NO:174和198,GenBank登录号AY530627]和修饰的rh.2[SEQ ID NO:231];
来自进化支F的hu.14/AAV9[SEQ ID NO:3和123,GenBank登录号AY530579]、hu.31[SEQ ID NO:1和121,AY530596]和hu.32[SEQ ID NO:1和122,GenBank登录号AY530597]。
此外,本发明提供超出上述进化支范围的AAV序列,包括rh.59[SEQ ID NO:49和110]、rh.60[SEQ ID NO:31和120,GenBank登录号AY530571]、修饰的ch.5[SEQID NO:234]和修饰的rh.8[SEQ ID NO:235]。
也提供了本发明AAV序列的片段。每个这些片段可容易地用于各种载体系统和宿主细胞。理想的AAV片段中有cap蛋白,包括vp1、vp2、vp3和超变区。当需要时,描述于美国专利公开号US2003/0138772A1(2003年7月24日)的方法可用于获得以上鉴定的AAV克隆的rep序列。这种rep序列包括,例如rep78、rep68、rep52和rep40与编码这些蛋白的序列。类似地,可使用描述于参考的专利出版物的技术来获得这些克隆的其它片段,包括AAV末端反向重复(ITR)、AAV P19序列、AAV P40序列、rep结合位点与末端分辨位点(terminal resolutesite)(TRS)。其它合适的片段是本领域的技术人员容易明白的。
本发明的衣壳与其它片段可容易地用于各种载体系统和宿主细胞。这种片段可单独使用、与其它AAV序列或片段联用或与其它AAV或非AAV病毒序列的元件联用。在一个特别理想的实施方案中,载体含有本发明的AAV cap和/rep序列。
本发明的AAV序列与其片段可用于产生rAAV,也可用作反义递送载体、基因治疗载体或疫苗载体。本发明还提供含有本发明AAV序列的核酸分子、基因递送载体和宿主细胞。
可使用本文提供的信息来确定合适的片段。
如本文所述,含有本发明AAV衣壳蛋白的本发明载体尤其适用于其中中和抗体消除了基于其它AAV血清型的载体以及其它病毒载体的效力。本发明的rAAV载体特别有利于rAAV反复施用与重复基因治疗。
本发明的这些和其它实施方案及优点详述于下文。
A.AAV血清型9/hu14序列
本发明提供在本文中互换称为克隆hu.14(以前称为28.4)和huAAV9的新AAV的核酸序列与氨基酸。如本文所定义的,新血清型AAV9指具有以下衣壳的AAV,该衣壳产生与具有hu.14[SEQ ID NO:123]的序列的衣壳产生血清学交叉反应的抗体,并且该抗体不与针对AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8中任一种的衣壳所产生的抗体发生血清学交叉反应。
1.核酸序列
本发明的AAV9核酸序列包括由2211个核苷酸组成的SEQ ID NO:3的DNA序列。
本发明的核酸序列还包括与SEQ ID NO:3互补的链,以及对应于SEQ ID NO:3的RNA和cDNA序列及其互补链。本发明的核酸序列也包括SEQ ID NO:3的天然变体和工程改造的修饰物及其互补链。这种修饰物包括,例如本领域已知的标记、甲基化与用简并核苷酸取代一个或多个天然核苷酸。
本发明还包括与SEQ ID NO:3有约大于90%、优选至少约95%、最优选至少约98-99%相同或同源的核酸序列。
本发明也包括SEQ ID NO:3的片段、其互补链、以及与其互补的cDNA和RNA。合适的片段是至少15个核苷酸长,并且包括功能片段,即有生物学影响的片段。这种片段包括编码AAV9/HU.14衣壳的3种可变蛋白(vp)的序列,这3种可变蛋白是可变剪接变体:vp1[SEQ IDNO:3的nt1-2211]、vp2[SEQ ID NO:3约nt411-2211]与vp3[SEQ ID NO:3约nt609-2211]。SEQ ID NO:3的其它合适片段包括含有AAV9/HU.14衣壳蛋白的起始密码子的片段与本文所述编码vp1衣壳蛋白的超变区的片段。
除了包括附图与序列表所提供的核酸序列,本发明还包括设计为表达本发明的AAV血清型的氨基酸序列、蛋白质和肽的核酸分子和序列。因此,本发明包括使用这些序列和/或其独特的片段来编码以下产生的新AAV氨基酸序列和人工AAV血清型的核酸序列。
本文使用的人工AAV血清型包括(不限于)具有非天然衣壳蛋白的AAV。这种人工衣壳可通过任何合适的技术联用本发明的新AAV序列(例如,vp1衣壳蛋白的片段)与异源序列来产生,所述异源序列得自另一种AAV血清型(已知或是新的)、同一AAV血清型的非连续部分、非AAV病毒源或非病毒源。人工AAV血清型可是(不限于)嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。
2.HU.14/AAV9氨基酸序列、蛋白质和肽
本发明还提供由本发明的hu.14/AAV9核酸编码的蛋白质和其片段,与通过其它方法产生的hu.14/AAV9蛋白质和片段。本文使用的这些蛋白包括装配的衣壳。本发明还包括使用本发明的新AAV血清型的序列产生的AAV血清型,这些血清型是使用本领域技术人员已知的合成、重组或其它技术产生的。本发明不限于本发明的新AAV核酸序列表达的新AAV氨基酸序列、肽和蛋白质,而是包括通过本领域已知的其它方法,例如通过化学合成、其它合成技术或其它方法产生的氨基酸序列、肽和蛋白质。本文提供的任一AAV衣壳的序列可使用各种技术容易地产生。
合适的生产技术是本领域技术人员熟知的。参见,例如Sambrook等,《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),冷泉港出版社(冷泉港,纽约)。或者也可通过熟知的固相肽合成方法(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149(1962);Stewart和Young,《固相肽合成》(Solid Phase PeptideSynthesis)(Freeman,旧金山,1969)27-62页)来合成肽。这些或其它合适的生产方法是本领域技术人员已知的并且不限制本发明。
特别理想的蛋白质包括由以上鉴定的核苷酸序列所编码的AAV衣壳蛋白。该AAV衣壳蛋白包括3种可变剪接变体的蛋白:vp1、vp2和vp3。图2提供了vp1的全长序列。AAV9/HU.14衣壳蛋白包括vp1[SEQ ID NO:123的氨基酸(aa)1-736]、vp2[SEQ ID NO:123的约aa138-736]、vp3[SEQ ID NO:123的约aa203-736]及其功能片段。该衣壳蛋白的其它理想的片段包括位于超变区(HVR)之间的恒定区和可变区。该衣壳蛋白的其它理想的片段包括HVR本身。
开发出以确定AAV2中序列趋异的区域的算法得到了12个超变区(HVR),其中的5个与前文所述的4个可变区重叠或是其一部分。[Chiorini等,J.Virol,73:1309-19(1999);Rutledge等,J.Virol.,72:309-319]使用该算法和/或本文所述的对比技术确定了新AAV血清型的HVR。例如,HVR位于以下位置:HVR1,aa146-152;HVR2,aa182-186;HVR3,aa262-264;HVR4,aa381-383;HVR5,aa450-474;HVR6,aa490-495;HVR7,aa500-504;HVR8,aa514-522;HVR9,aa534-555;HVR10,aa581-594;HVR11,aa658-667;与HVRI2,aa705-719[该编号系统是基于使用AAV2vp1作为参考点的对比方法]。使用默认设置的Clustal X程序,或使用其它市售或公用的默认设置的对比程序,例如本文所述的来进行本文所提供的对比方法,本领域技术人员可容易地确定本发明的新AAV衣壳的对应片段。
AAV9/HU.14衣壳蛋白的其它理想的片段包括SEQ ID NO:123的氨基酸1-184、氨基酸199-259、氨基酸274-446、氨基酸603-659、氨基酸670-706、SEQID NO:123的氨基酸724-736、aa185-198、aa260-273、aa447-477、aa495-602、aa660-669与aa707-723。此外,AAV衣壳的其它合适的片段包括:按照AAV9[SEQID NO:123]的编号为aa24-42、aa25-28、aa81-85、aa133-165、aa134-165、aa137-143、aa154-156、aa194-208、aa261-274、aa262-274、aa171-173、aa413-417、aa449-478、aa494-525、aa534-571、aa581-601、aa660-671与aa709-723。使用默认设置的ClustalX程序,或使用其它市售或公用的默认设置的对比程序来进行本文所提供的对比方法,本领域技术人员可容易地确定本发明新AAV衣壳的对应片段。
其它理想的AAV9/HU.14蛋白包括rep蛋白,例如rep68/78和rep40/52。
合适的片段至少长8个氨基酸。然而,可容易地使用其它所需长度的片段。这种片段可重组生产或通过其它合适的方法生产,例如化学合成。
本发明还提供使用本文提供的序列信息鉴定的其它AAV9/HU.14序列。例如,就本文提供的AAV9/HU.14序列而言,可使用基因组步行技术(genome walkingtechnology)(Siebert等,1995,Nucleic Acid Research,23:1087-1088;Friezner-Degen等,1986,J.Biol.Chem.261:6972-6985,BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)分离感染性AAV9/HU.14。基因组步行技术特别适用于鉴定和分离与按照本发明的方法鉴定的新序列毗连的序列。基于本文提供的新AAV衣壳与rep序列,该技术也用于分离新AAV9/HU.14血清型的末端反向重复(ITR)。
本发明的序列、蛋白质和片段可通过任何合适的方法生产,包括重组生产、化学合成或其它合成方法。这种生产方法是本领域技术人员已知的并且不限制本发明。
III.具有新AAV衣壳的rAAV的产生
本发明包括不含与这些病毒天然相关的DNA和/或细胞物质的新AAV衣壳序列。为避免重复本文提供的所有新的AAV衣壳,在本章节与以下章节中参考hu.14/AAV9衣壳。然而,应该理解的是,本发明的其它新的AAV衣壳序列可以类似的方式使用。
本发明另一方面提供利用本发明的新AAV序列(包括其片段)来产生用于将异源基因或其它核酸序列递送至靶细胞的分子。
本发明另一方面提供利用本发明的新AAV序列(包括其片段)来产生用于将异源基因或其它核酸序列递送至靶细胞的病毒载体。
含有AAV序列的本发明分子包含有可递送至宿主细胞的任何遗传元件(载体),例如传送携带于其上的序列的裸DNA、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、附加体、非病毒递送载体中的蛋白质(如,基于脂质的运载体)、病毒等。所选择的载体可通过任何合适的方法递送,包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被小球、病毒感染与原生质体融合。用于构建本发明的任何实施方案的方法是核酸操作领域的技术人员已知的并且包括遗传工程、重组工程与合成技术。参见,例如Sambrook等,《分子克隆:实验室手册》(MolecularCloning:A LaboratoryManual),冷泉港出版社,冷泉港,纽约。
在一个实施方案中,本发明的载体尤其含有编码本发明的AAV衣壳或其片段的序列。在另一个实施方案中,本发明的载体至少含有编码AAV rep蛋白质或其片段的序列。本发明的载体可任选含有AAV cap和rep蛋白质。在同时含有AAV rep和cap的载体中,AAV rep和AAV cap序列起源于同一进化支的AAV。或者,本发明提供的载体中rep序列来自不同于提供cap序列的AAV源。在一个实施方案中,rep和cap序列从单独的来源(例如,单独的载体,或宿主细胞和载体)表达。在另一个实施方案中,这些rep序列与不同AAV源的cap序列框内融合以现成嵌合AAV载体。本发明的载体任选是包装在本发明AAV衣壳中的载体。这些载体与本文所述的其它载体还可含有包含所选择的转基因的小基因,该小基因两侧是AAV5′ITR和AAV3′ITR。
因此,在一个实施方案中,本文所述的载体含有编码来自单独的AAV序列(例如,AAV9/HU.14)的完整的AAV衣壳的核酸序列。这种衣壳可含有SEQ ID NO:123的氨基酸1-736。或者,这些载体含有编码人工衣壳的序列,这些衣壳含有与异源AAV或非AAV衣壳蛋白(或其片段)融合的AAV9/HU.14衣壳的一个或多个片段。这些人工衣壳蛋白选自AAV9/HU.14衣壳的非连续部分或来自其它AAV的衣壳。例如,rAAV可具有包含一个或多个AAV9/HU.14衣壳区域的衣壳蛋白,所述衣壳区域选自vp2和/或vp3,或选自以下的其片段:AAV9/HU.14衣壳蛋白,SEQ IDNO:123的氨基酸1-184、氨基酸199-259、氨基酸274-466、氨基酸603-659、氨基酸670-706、氨基酸724-738。在另一个实施方案中,可能需要将vp3蛋白质的起始密码子改变为GTG。或者,rAAV可含有一个或多个本文鉴定的AAV血清型9衣壳蛋白的超变区,或其它片段,包括(不限于)AAV9/HU.14衣壳的aa185-198、aa260-273、aa447-477、aa495-602、aa660-669与aa707-723。参见,SEQ ID NO:123。这些修饰可增加表达、产量和/或改进选择的表达系统中的纯化,或可用于另一个需要的目的(例如,改变向性或修改中和抗体表位)。
本文所述的载体,例如质粒可用于各种目的,但特别适用于产生含有衣壳的rAAV,所述衣壳包含AAV序列或其片段。这些载体,包括rAAV、它们的元件、构建物和应用详述于本文。
本发明一方面提供一种产生具有AAV血清型9衣壳或其一部分的重组腺伴随病毒(AAV)的方法。该方法涉及培养宿主细胞,该宿主细胞含有如本文所定义的编码AAV血清型9衣壳蛋白的核酸序列或其片段;功能性rep基因;最少含有AAV末端反向重复(ITR)和转基因的小基因;与足够的辅助功能因子以将小基因包装进AAV9/HU.14衣壳蛋白。
需要在宿主细胞中培养将AAV小基因包装进AAV衣壳的成分可以反式提供给宿主细胞。或者,可由使用本领域技术人员已知的方法改造为含有一种或多种所需成分的稳定宿主细胞提供所需成分(例如,小基因、rep序列、cap序列和/或辅助功能因子)。这种稳定的宿主细胞最适合含有在可诱导启动子控制下的所需成分。然而,所需成分可在结构启动子的控制下。在本文讨论适合与转基因一起使用的调节元件中提供了合适的可诱导和组成型启动子的例子。或者,选择的稳定宿主细胞可含有在组成型启动子控制下的选择成分与在一个或多个可诱导启动子控制下的其它选择成分。例如,产生的稳定的宿主细胞来源于293细胞(该细胞含有在组成型启动子控制下的E1辅助功能物),但含有在可诱导启动子控制下的rep和/或cap蛋白。还有其它的稳定宿主细胞可由本领域技术人员制备。
产生本发明的rAAV所需的小基因、rep序列、cap序列和辅助功能物可以任一遗传元件的形式递送至包装宿主细胞,所述遗传元件传送其上所携带的序列。选择的遗传元件可通过任何合适的方法,包括本文所述的方法来递送。用于构建本发明的任何实施方案的方法是核酸操作领域的技术人员已知的并且包括遗传工程、重组工程与合成技术。参见,例如Sambrook等,《分子克隆:实验室手册》(MolecularCloning:A Laboratory Manual),冷泉港出版社,冷泉港,纽约。类似地,产生AAV病毒颗粒的方法是熟知的并且合适方法的选择不限制本发明。参见,例如K.Fisher等,J.Virol.,70:520-532(1993)与美国专利号5,478,745。
除非另有规定,本文所述的AAV ITR与其它选择的AAV成分可容易地选自任一AAV,包括(不限于)AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9与本发明的其它新AAV序列之一。这些ITR或其它AAV成分可使用本领域技术人员可用的技术容易地从AAV序列分离。这种AAV可分离自或得自学术、商业或公共来源(例如,美国模式培养物保藏所,Manassas,VA)。或者,AAV序列可参考,例如得自参考文献或数据库(例如,等)中的公开序列通过合成或其它合适的方法获得。
A.小基因
小基因最少由转基因及其调节序列与5’和3’末端反向重复(ITR)组成。在一个理想的实施方案中,使用AAV血清型2的ITR。然而,也可选择其它合适来源的ITR。是将该小基因包装进衣壳蛋白并递送至选择的宿主细胞。
1.转基因
转基因是编码感兴趣的多肽、蛋白质或其它产物的核酸序列,它对其侧翼的载体序列是异源的。核酸编码序列以允许转基因在宿主细胞中转录、翻译和/或表达的方式操作性连接于调节成分。
转基因序列的组成取决于所得到的载体的用途。例如,某类型的转基因序列包括报道序列,该序列在表达后产生可检测的信号。这种报道序列包括(不限于)编码以下物质的DNA序列:β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸腺激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP(EGFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶、膜结合蛋白,如CD2、CD4、CD8,流感血凝素蛋白和其它本领域熟知的,这些物质存在高亲和力抗体或可通过常规方法产生所述抗体,以及含有膜结合蛋白的融合蛋白,该膜结合蛋白适当地与血凝素或Myc的抗原标记区域融合。
当这些编码序列与驱动其表达的调节元件相关联时,可提供由常规方法检测的信号,所述常规方法包括酶法、放射显影法、比色法、荧光法或其它光谱测定,荧光激活的细胞分选测定与免疫测定,包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)和免疫组织化学。例如,当标记序列是LacZ基因时,携带信号的载体的存在通过测定β-半乳糖苷酶活性来检测。当转基因是绿色荧光蛋白或荧光素酶时,携带信号的载体可用光度计通过颜色或光的产生来目测。
然而,转基因理想地是编码用于生物或医药的产物的非标记序列,所述产物例如蛋白质、肽、RNA、酶、显性负突变体或催化性RNA。理想的RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化性RNA、siRNA、小发夹RNA、反式剪接RNA与反义RNA。有用的RNA序列的一个例子是抑制或消除靶核酸序列在处理的动物中表达的序列。合适的靶序列通常包括肿瘤靶点和病毒疾病。参见,就这种靶点的例子而言,肿瘤靶点与病毒在以下免疫原相关的章节中鉴定。
转基因可用于校正或改善基因缺陷,包括正常基因的表达低于正常水平的缺陷或功能基因产物不表达的缺陷。或者,转基因可为细胞提供天然不在该细胞类型中或该宿主中表达的产物。转基因序列的优选类型编码在宿主细胞中表达的治疗性蛋白质或多肽。本发明还包括使用多种转基因。在某些情况下,不同的转基因可用于编码一个蛋白质的各个亚基,或编码不同的肽或蛋白质。当编码蛋白质亚基的DNA的体积大,例如用于免疫球蛋白、血小板衍生的生长因子或抗肌萎缩蛋白是理想的。为使细胞产生多亚基蛋白,用含有每个不同亚基的重组病毒感染细胞。或者,蛋白质的不同亚基可由同一转基因编码。在该情况下,单个转基因包括编码每个亚基的DNA,而每个亚基的DNA由内部核糖体进入位点(IRES)隔开。当编码每个亚基的DNA的体积小,例如编码亚基的DNA与IRES的总体积小于5千碱基对时,这是理想的。除了IRES,DNA可用编码在翻译后阶段自我切割的2A肽的序列隔开。参见,例如,M.L.Donnelly等,J.Gen.Virol.,78(第一部分):13-21(1997年1月);Furler,S等,Gene Ther,8(11):864-873(2001年6月);Klump H等,Gene.Ther.,8(10):811-817(2001年5月)。该2A肽明显小于IRES,使得其非常适用于当间隔是限制因素时。更常见的是,当转基因是大的,含有多个亚基时,或当两个转基因共递送时,允许共施用携带所需转基因或亚基的rAAV以使得它们在体内多联体化以形成单一的载体基因组。在这种实施方案中,第一AAV可携带表达单一转基因的表达盒,而第二AAV可携带用于在宿主中共表达的不同转基因的表达盒。然而,选择的转基因可编码任何生物活性产物或其它产物,例如研究所需的产物。
本领域的技术人员可容易地选择合适的转基因。转基因的选择不限制本发明。
2.调节元件
除了以上鉴定的小基因的主要元件以外,该载体也包含有常规控制元件,该常规控制元件以允许转基因在细胞中转录、翻译和/或表达的方式操作性连接于转基因,所述细胞用本发明产生的质粒载体转染或病毒感染。本文使用的“操作性连接”的序列包括与感兴趣的基因毗连的表达控制序列与以反式起作用或在一定距离控制感兴趣基因的表达控制序列。
表达控制序列包括适当的转录起始子、终止子、启动子和增强子序列;有效的RNA加工信号,例如剪接与聚腺苷酸化(polyA)信号;稳定细胞质mRNA的序列;增强翻译效率的序列(即,Kozak共有序列);增强蛋白质稳定性的序列;以及当需要时增强编码的产物分泌的序列。许多表达控制序列,包括天然的、组成型、诱导型和/或组织特异性的启动子是本领域已知并可使用的。
组成型启动子的例子包括(不限于)逆转录病毒Rous肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选具有CMV增强子)[参见,例如Boshart等,Cell,41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子与EF1启动子[Invitrogen]。诱导型启动子能调节基因表达并可由外源提供的化合物、环境因素(例如温度)、或存在特定的生理状态,例如急性期、细胞的特定分化状态所调节,或仅在复制型细胞中。可用各种商业来源的诱导型启动子和可诱导系统,包括(不限于)Invitrogen、Clontech和Ariad。许多其它系统已描述并可由本领域技术人员容易地选择。由外源提供的化合物调节的诱导型启动子的例子包括锌-诱导的金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)-诱导的小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统[国际专利公开号WO 98/10088]、蜕皮素昆虫启动子[No等,Proc.Natl.Acad.Sci.美国,93:3346-3351(1996)]、四环素可阻抑系统[Gossen等,Proc.Natl.Acad.Sci.美国,89:5547-5551(1992)]、四环素可诱导系统[Gossen等,Science,268:1766-1769(1996),也参见Harvey等,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998)]、RU-486可诱导系统[Wang等,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)与Wang等,Gene Ther.,4:432-441(1997)]与雷帕霉素可诱导系统[Magari等,J.Clin.Invest.,100:2856-2872(1997)]。其它可用于本发明的诱导型启动子是可由特定的生理状态,例如温度、急性期、细胞的特定分化状态所调节的启动子,或仅在复制型细胞中。
在另一个实施方案中使用了转基因的天然启动子。当需要转基因的表达模拟天然表达时,天然启动子较佳。当转基因的表达必须暂时性或发展性调节、或以组织特异性的方式调节或响应于特定的转录刺激时,可使用天然启动子。在其它实施方案中,也可使用其它天然表达控制元件,例如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列以模拟天然表达。
转基因的另一实施方案包含有操作性连接于组织特异性启动子的基因。例如,如果需要在骨骼肌中表达,应该使用在肌肉中有活性的启动子。这些包括得自编码以下产物的基因的启动子:骨骼β-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、抗肌萎缩蛋白、肌肉肌酸激酶以及活性高于天然启动子的合成肌肉启动子(参见Li等,Nat.Biotech.,17:241-245(1999))。组织特异性启动子的例子已知有肝(白蛋白,Miyatake等,J.Virol.,71:5124-32(1997);乙肝病毒核心启动子,Sandig等,Gene Ther.,3:1002-9(1996);α-胎蛋白(AFP),Arbuthnot等,Hum.Gene Ther.,7:1503-14(1996))、骨的骨钙蛋白(Stein等,Mol Biol.Rep.,24:185-96(1997))、骨唾液蛋白(Chen等,J.BoneMiner.Res.,11:654-64(1996))、淋巴细胞(CD2,Hansal等,J.Immunol.,161:1063-8(1998);免疫球蛋白重链;T细胞受体链)、神经元,例如神经元-特异性烯醇酶(NSE)启动子(Andersen等,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993))、神经丝轻链基因(Piccioli等,Proc.Natl.Acad.Sci.,美国,88:5611-5(1991))与神经元-特异性vgf基因(Piccioli等,Neuron,15:373-84(1995))等。
携带治疗有用的转基因的质粒也可任选含有可选择标记,或者报道基因可含有编码遗传霉素、潮霉素或嘌呤霉素(purimycin)抗性等的序列。这种可选择报道基因或标记基因(优选位于病毒基因组外从而由本发明的方法所拯救)可用来预示细菌细胞中存在质粒,例如氨苄青霉素抗性。质粒的其它成分包括复制起点。可通过常规方法选择这些和其它启动子与载体元件并且许多这种序列可用[参见,例如Sambrook等,与本文引用的参考文献]。
为便于本文参考,转基因、启动子/增强子与5′和3′AAV ITR的组合称为“小基因”。依靠本文提供的指导,可凭借常规技术设计这种小基因。
3.将小基因递送至包装宿主细胞
任何递送至宿主细胞的合适载体,例如质粒上可携带小基因。用于本发明的质粒可改造为适合于在原核细胞、哺乳动物细胞(或二者)中复制以及任选整合。这些质粒(或其它携带5′AAV ITR-异源分子-3′AAV ITR的载体)含有允许小基因在真核细胞和/或原核细胞中复制的序列与用于这些系统的选择标记。可选择标记或报道基因可含有编码遗传霉素、潮霉素或嘌呤霉素抗性等的序列。这些质粒也可含有可用来预示细菌细胞中存在载体(例如氨苄青霉素抗性)的某些可选择报道基因或标记基因。质粒的其它成分可含有复制起点和扩增子,例如使用Epstein Barr病毒核抗原的扩增子系统。该扩增子系统或其它类似的扩增子成分允许细胞中高拷贝附加型复制。携带小基因的分子优选转染进其可暂时存在的细胞。或者,小基因(携带5′AAV ITR-异源分子-3′AAV ITR)可稳定地整合进宿主细胞基因组、或在染色体上或作为附加体。在某些实施方案中,小基因可以多份拷贝存在,任选采用头-对-头、头-对-尾或尾-对-尾多联体形式。合适的转染技术是已知的并可容易地用于将小基因递送至宿主细胞。
当通过转染递送含有小基因的载体时,递送到约1×104个细胞-1×1013个细胞,或约1×105个细胞的该载体的量一般约为5μg-100μg DNA、约10μg-50μgDNA。然而,考虑到诸如所选择的载体、递送方法和所选择的宿主细胞等因素,可调整递送至宿主细胞的载体DNA的相对量。
B.Rep与Cap序列
除了小基因以外,宿主细胞含有驱动本发明的新AAV衣壳蛋白(或含有其片段的衣壳蛋白)在宿主细胞中表达的序列与和小基因中发现的AAV ITR具有相同来源或交叉互补来源的rep序列。AAV cap和rep序列可独立得自上述AAV源并可以上述本领域人员已知的任何方式引入宿主细胞。此外,当AAV载体为假型时(例如,AAV9/HU.14衣壳),可用不同的AAV源(例如,AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8)提供编码每种主要rep蛋白的序列。例如,rep78/68序列得自AAV2,而rep52/40序列得自AAV8。
在一个实施方案中,宿主细胞稳定地含有在合适的启动子(例如上述的)控制下的衣壳蛋白。在该实施方案中,衣壳蛋白最好在诱导型启动子的控制下表达。在另一个实施方案中,衣壳蛋白以反式提供至宿主细胞。当衣壳蛋白以反式递送至宿主细胞时,它可通过含有引导选择的衣壳蛋白在宿主细胞中表达的所需序列的质粒递送。当质粒以反式递送至宿主细胞时,携带衣壳蛋白的质粒也最好携带包装AAV所需的其它序列,例如rep序列。
在另一个实施方案中,宿主细胞稳定地含有在合适的启动子(例如上述的)控制下的rep序列。在该实施方案中,主要的rep蛋白最好在诱导型启动子的控制下表达。在另一个实施方案中,rep蛋白以反式提供至宿主细胞。当rep蛋白以反式递送至宿主细胞时,它可通过含有引导选择的rep蛋白在宿主细胞中表达的所需序列的质粒递送。当质粒以反式递送至宿主细胞时,携带衣壳蛋白的质粒也最好携带包装AAV所需的其它序列,例如rep和cap序列。
因此,在一个实施方案中,rep和cap序列可在单独的核酸分子上转染进宿主细胞并且作为附加体稳定地存在于细胞中。在另一个实施方案中,rep和cap序列稳定地整合进细胞的染色体。在另一个实施方案中,rep和cap序列在宿主细胞中瞬时表达。例如,用于这种转染的有用核酸分子从5’到3’含有启动子、插在启动子与rep基因序列起始点之间任选的间隔子、AAV rep基因序列与AAV cap基因序列。
rep和/或cap序列可任选提供于载体上,该载体含有待引入宿主细胞的DNA序列。例如,载体可含有包含小基因的rAAV构建物。载体可含有一个或多个编码辅助功能物,例如腺病毒蛋白E1、E2a和E4ORF6的基因与用于VAI RNA的基因。
用于该构建物的启动子优选本领域技术人员已知的或上述任何组成型、诱导型或天然启动子。一个实施方案使用AAV P5启动子序列。选择AAV来提供任何这些序列不是对本发明的限制。
在另一个优选的实施方案中,rep的启动子是诱导型启动子,例如上述与转基因调节元件相连的。Rep表达优选的启动子是T7启动子。包含由T7启动子调节的rep基因和cap基因的载体转染或转化进组成型性地或可诱导地表达T7聚合酶的细胞。参见1998年3月12日出版的国际专利公开号WO98/10088。
间隔子在设计载体中是可任选的元件。间隔子是插在启动子和rep基因ATG起始位点间的DNA序列。间隔子可具有任何所需的设计;即,它可是随机的核苷酸序列,或者可编码一个基因产物,例如标记基因。间隔子可含有通常包括起始/终止和polyA位点的基因。间隔子可是原核生物或真核生物的非编码DNA序列、重复非编码序列、无转录控制的编码序列或有转录控制的编码序列。间隔子序列的两个示范性来源是噬菌体梯序列或酵母梯序列,二者购自,例如Gibco或Invitrogen等。间隔子可是任何大小只要足以降低rep78和rep68基因产物的表达,使rep52、rep40和cap基因产物的表达量处于正常水平。因此,间隔子的长度可约为10bp-10.0kbp、优选约100bp-8.0kbp。为减少重组的可能性,间隔子长度优选小于2kbp;然而,本发明不限于此。
虽然提供rep和cap的分子可瞬时存在于宿主细胞中(即,通过转染),但rep和cap蛋白之一(或二者)与控制其表达的启动子宜在宿主细胞中稳定地表达,例如作为附加体或通过整合进宿主细胞的染色体。用于构成本发明的实施方案的方法是常规遗传工程或重组工程技术,例如以上参考文献所述的。虽然本说明书提供了特定的构建物的说明性例子,但本领域的技术人员可使用本文提供的信息来选择间隔子、P5启动子和其它元件(包括至少一个翻译起始和终止信号)与任选加入的聚腺苷酸化位点,从而可选择和设计其它合适的构建物。
在本发明的另一个实施方案中,可由宿主细胞稳定地提供rep或cap蛋白。
C.辅助功能物
为包装本发明的rAAV,宿主细胞也需要辅助功能物。这些功能物可任选由疱疹病毒提供。所需的辅助功能物最好分别由人或非人灵长类腺病毒源提供,例如上述的和/或得自各种来源,包括美国模式培养物保藏所(ATCC),Manassas,VA(美国)。在一个现在优选的实施方案中,宿主细胞与以下基因产物一起提供和/或含有以下基因产物:E1a基因产物、E1b基因产物、E2a基因产物和/或E4ORF6基因产物。宿主细胞可含有其它腺病毒基因,例如VAI RNA,但这些基因不是必需的。在优选的实施方案中,宿主细胞中不存在其它腺病毒基因或基因功能物。
“表达E1a基因产物的腺病毒DNA”表示编码E1a或任何功能性E1a部分的任何腺病毒序列。表达E2a基因产物的腺病毒DNA与表达E4ORF6基因产物的腺病毒DNA的定义类似。也包括任何等位基因或腺病毒基因的其它修饰物或其功能部分。可借助常规遗传工程或诱变技术,以及其天然的等位变体来有意引入这种修饰,从而以某种方式增强腺病毒功能。本领域的技术人员已知这种修饰物和用于操作DNA以获得这些腺病毒基因功能物的方法。
腺病毒E1a、E1b、E2a和/或E4RF6基因产物以及任何其它所需的辅助功能物可使用任何使其在细胞中表达的方法提供。每条编码这些产物的序列可位于独立的载体上,或者一个或多个基因可位于同一载体上。载体可是本领域已知的或以上披露的任何载体,包括质粒、粘粒和病毒。载体可通过本领域已知或以上披露的任何方法引入宿主细胞,所述方法包括转染、感染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA-包被小球、病毒感染与原生质体融合等。一个或多个腺病毒基因可稳定地整合进宿主细胞基因组、稳定地表达为附加体或瞬时表达。基因产物可全部瞬时表达、表达在附加体上或稳定地整合,或者一些基因产物可稳定地表达,而另一些瞬时表达。此外,每个腺病毒基因的启动子可独立选自组成型启动子、诱导型启动子或天然腺病毒启动子。例如,启动子可由生物体或细胞的特定生理状态调节(即,由分化状态或在复制或静息细胞中)或由外源性添加的因素调节。
D.宿主细胞和包装细胞系
宿主细胞本身可选自任何生物体,包括原核(例如,细菌)细胞和真核细胞,包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。特别理想的宿主细胞选自任何哺乳动物种类,包括(不限于)以下细胞:A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10、VERO、W138、HeLa、293细胞(表达功能性腺病毒E1)、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、HepG2与来源于哺乳动物(包括人、猴、小鼠、大鼠、家兔和仓鼠)的初级成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。提供细胞的哺乳动物种类与哺乳动物细胞类型(即,成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞等)的选择不限制本发明。所用细胞的要求是:它不携带任何除E1、E2a和/或E4ORF6以外的腺病毒基因;它不含有在rAAV产生过程中可导致污染病毒的同源重组的任何其它病毒基因;并且它能感染或转染DNA并表达所转染的DNA。在优选的实施方案中,宿主细胞是rep和cap在细胞中稳定地转染的细胞。
用于本发明的宿主细胞是用编码rep和cap的序列稳定转化并用腺病毒E1、E2a和E4ORF6DNA和携带有上述小基因的构建物转染的宿主细胞。也可类似地使用稳定的rep和/或cap表达细胞系,例如B-50(国际专利申请公开号WO99/15685),或美国专利号5,658,785所述的细胞系。另一种较好的宿主细胞含有足以表达E4 ORF6的最少腺病毒DNA。还有其它细胞系可使用本发明的新AAV9cap序列构建。
制备本发明的宿主细胞涉及诸如装配选择的DNA序列的技术。可使用常规技术实现这种装配。这种技术包括熟知的且描述于上文引用的Sambrook等的cDNA和基因组克隆、使用腺病毒和AAV基因组的重叠寡核苷酸序列、与聚合酶链式反应结合、合成方法与其它提供所需核苷酸序列的合适方法。
也可使用技术人员已知和说明书中讨论的技术将这些分子(质粒或病毒)引入宿主细胞。在优选的实施方案中,使用标准转染技术,例如CaPO4转染或电穿孔和/或通过感染将杂交腺病毒/AAV载体引入细胞系,例如人胚胎肾细胞系HEK293(提供反式激活E1蛋白质的含功能性腺病毒E1基因的人肾细胞系)。
因为在人群中未发现针对AAV9/HU.14的中和抗体,本领域技术人员所制备的基于AAV9/HU.14的载体有利于将基因递送至选择的宿主细胞和基因治疗的患者。本领域的技术人员可使用已知的各种技术来容易地制备其它含有本文提供的AAV9/HU.14衣壳蛋白的rAAV病毒载体。类似地,人们还可制备其它含有AAV9/HU.14序列和其它来源的AAV衣壳蛋白的rAAV病毒载体。
本领域技术人员易于理解本发明的新AAV序列可容易地适用于体外、离体或体内基因递送的这些和其它病毒载体系统。类似地。本领域技术人员可容易地选择用于各种rAAV和非rAAV载体系统的本发明AAV基因组的其它片段。这种载体系统可包括如慢病毒、逆转录病毒、痘病毒、牛痘病毒和腺病毒系统等。这些载体系统的选择不限制本发明。
因此,本发明还提供使用本发明的新AAV的核酸与氨基酸序列产生的载体。这种载体用于各种目的,包括递送治疗性分子与用在疫苗给药方案中。含有本发明的新AAV的衣壳的重组AAV对递送治疗性分子特别理想。含有本发明的新AAV序列的这些或其它载体构建物可用于疫苗给药方案,例如用于共同递送细胞因子或用于递送免疫原本身。
IV.重组病毒及其应用
本领域的技术人员可使用本文所述的技术来产生rAAV,该rAAV具有本发明AAV的衣壳或其衣壳含有本发明AAV的一个或多个片段。一个实施方案使用单一AAV的全长衣壳,例如hu.14/AAV9[SEQ ID NO:123]。另一个实施方案中产生的全长衣壳含有本发明新AAV衣壳的一个或多个片段与另一个选择的AAV的序列或同一AAV的异源(即,非连续)部分融合。例如,rAAV可含有AAV9/HU.14的一个或多个新的超变区序列。或者,本发明的独特AAV序列可用于含有其它病毒或非病毒序列的构建物。重组病毒可任选携带编码一种或多种AAVrep蛋白的AAV rep序列。
A.递送病毒
本发明另一方面提供一种将转基因递送至宿主的方法,该方法涉及用本发明AAV9/HU.14序列(或其功能性片段)产生的重组病毒载体转染或感染所选宿主细胞。用于递送的方法是本领域技术人员熟知的并不限制本发明。
在一个较好的实施方案中,本发明提供用于AAV介导递送转基因至宿主的方法。该方法涉及用含有所选转基因和AAV9衣壳蛋白的重组病毒载体转染或感染所选宿主细胞,该转基因在指导其表达的序列的控制下。
宿主的样品可任选首先测定针对所选AAV源(例如,一种血清型)的抗体的存在。用于检测中和抗体的各种测定形式为本领域技术人员所熟知。选择这种测定不限制本发明。参见,例如Fisher等,Nature Med.,3(3):306-312(1997年3月)和W.C.Manning等,HumanGene Therapy,9:477-485(1998年3月1日)。该测定的结果可用于确定哪种含有特定来源的衣壳蛋白的AAV载体是递送所优选的,例如通过缺失针对该衣壳来源特异的中和抗体。
在该方法的一个方面,可在通过具有不同AAV衣壳蛋白的载体递送基因之前或之后递送具有本发明AAV衣壳蛋白的载体。因此,通过rAAV载体的基因递送可用于将基因反复递送至所选的宿主细胞。随后给予的rAAV载体宜携带相同于第一rAAV载体的转基因,但随后给予的载体含有衣壳蛋白来源不同于第一载体(优选不同的血清型)。例如,如果第一载体具有AV9/HU.14衣壳蛋白,随后给予的载体可具有选自其它AAV的衣壳蛋白,任选来自另一血清型或另一进化支。
多个rAAV载体可任选通过共同给予rAAV载体来递送大的转基因或多个转基因,所述rAAV载体在体内多联体化以形成单一载体基因组。在这种实施方案中,第一AAV可携带表达单一转基因(或其亚基)的表达盒,第二AAV可携带表达第二转基因(或不同亚基)的表达盒从而在宿主细胞中共同表达。第一AAV可携带多顺反子构建物的第一部分(例如,启动子和转基因,或亚基)的表达盒,第二AAV可携带多顺反子构建物的第二部分(例如,转基因或亚基和polyA序列)的表达盒。多顺反子构建物的这两个部分在体内多联体化以形成共同表达由第一和第二AAV递送的转基因的一个载体基因组。在这种实施方案中,携带第一表达盒的rAAV载体和携带第二表达盒的rAAV载体可在单个药物组合物中递送。在其它实施方案中,两个或多个rAAV载体以分开的药物组合物递送,这些药物组合物可基本上同时或一个紧接着另一个给予。
上述重组载体可按照公开的方法递送至宿主细胞。优选悬浮在生理相容运载体中的rAAV可给予人或非人哺乳动物患者。本领域的技术人员可依据传送病毒的指示容易地选择合适的运载体。例如,一种合适的运载体包括可用各种缓冲溶液配制的盐水(例如,磷酸缓冲盐水)。其它示范性运载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡萄糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。运载体的选择不限制本发明。
本发明组合物可任选含有除rAAV和运载体以外的其它常规药物组分,例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示范性防腐剂包括氯代丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯类、乙基香草醛、甘油、苯酚与对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
载体的给予量足以转染细胞并提供足够的基因传送和表达水平以提供治疗性益处而无过度不良作用或具有医学上可接受的生理作用,这可由医学领域技术人员确定。常规的和药学上可接受的给药途径包括(但不限于)直接递送至所需器官(例如,肝(任选经肝动脉)或肺)、口服、吸入、鼻内、气官内、动脉内、眼内、静脉内、肌肉内、皮下、真皮内和其它胃肠外给药途径。如果需要,可联合给药途径。
病毒载体的剂量主要取决于以下因素,例如待治疗的病症、患者的年龄、体重和健康状况,因此可依患者而变。例如,病毒载体的治疗有效的人用剂量一般约为0.1mL-100mL含有浓度约1×109-1×1016个基因组病毒载体的溶液。递送至大器官(例如,肝、肌肉、心脏和肺)的优选人用剂量可约为5×1010-5×1013个AAV基因组/kg,体积约为1-100mL。递送至眼的优选剂量约为5×109-5×1012份基因组拷贝,体积约为0.1mL-1mL。可调整剂量以平衡抗任何副作用的治疗性益处并且这种剂量可依所采用的重组载体治疗应用而变。可监测转基因的表达水平来确定导致病毒载体、优选含有小基因的AAV载体的剂量频率。可任选采用类似于治疗性目的所述的给药方案用本发明组合物来免疫接种。
由本发明的含AAV的载体递送的治疗性产物和免疫原性产物的例子于下文提供。这些载体可用于本文所述的各种治疗性或接种方案。此外,在所需的治疗性和/或接种方案中,这些载体可联合一种或多种其它载体或活性成分递送。
B.治疗性转基因
转基因编码的有用的治疗性产物包括激素与生长和分化因子,包括(不限于)胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、卵泡刺激素(FSH)、黄体激素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、促血管生成素、血管抑制素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生产素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-1和IGF-II)、转化生长因子α超家族中的任一个(包括TGFα)、活化素、抑制素、或骨形态发生蛋白(BMP)中的任一个BMP1-15、生长因子的调蛋白/神经调节蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族的任一个、神经生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白NT-3和NT-4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、neurturin、聚集蛋白、脑信号蛋白/瓦解蛋白家族的任一个、导蛋白-1和导蛋白-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、sonic hedgehog蛋白和酪氨酸羟化酶。
其它有用的基因产物包括调节免疫系统的蛋白,包括(不限于)细胞因子和淋巴因子,例如血小板生成素(TPO)、白介素(IL)IL-1到IL-25(如IL-2、IL-4、IL-12和IL-18)、单核细胞化学诱导物蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、干细胞因子、flk-2/flt3配体。免疫系统产生的基因产物也可用于本发明。这些产物包括(不限于)免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、I类和II类MHC分子以及改造的免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因产物也包括补体调节蛋白,例如补体调节蛋白、膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、CR1、CF2和CD59。
其它有用的基因产物包括激素受体、生长因子、细胞因子、淋巴因子、调节蛋白和免疫系统蛋白的任一种。本发明包括用于胆固醇调节和/或脂质调节的受体,包括低密度脂蛋白(LDL)受体、高密度脂蛋白(HDL)受体、极低密度脂蛋白(VLDL)受体和清除受体。本发明也包括以下基因产物:例如类固醇激素受体超家族的成员,包括糖皮质激素受体和雌激素受体。维生素D受体和其它核受体。此外,有用的基因产物包括转录因子,例如jun、fos、max、mad、血清效应因子(SRF)、AP-1、AP2、myb、MyoD和肌细胞生成蛋白、含有蛋白质的ETS-盒、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT-盒结合蛋白、干扰素调节因子(IRF-1)、Wilms肿瘤蛋白、ETS-结合蛋白、STAT、GATA-盒结合蛋白,例如GATA-3和翼状螺旋蛋白的叉头蛋白家族。
其它有用的基因产物包括氨甲酰合成酶1、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、胱硫醚β合成酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰-CoA脱氢酶、丙酰-CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA变位酶、戊二酰-CoA脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧酸盐、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、T-蛋白、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)序列和抗肌萎缩蛋白基因产物[例如,小-或微-抗肌萎缩蛋白]。其它有用的基因产物包括可用于酶活性缺乏所导致的各种病症,例如可用于酶替代治疗的酶。例如,含有甘露糖-6-磷酸的酶可用于治疗溶菌酶储存疾病(例如,含有编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)的合适基因)。
其它有用的基因产物包括用于治疗血友病的产物,包括B型血友病(包括因子IX)和A型血友病(包括因子VIII及其变体,例如杂二聚体和B-缺失结构域的轻链和重链;美国专利号6,200,560和6,221,349)。因子VIII基因编码2351个氨基酸,该蛋白具有6个结构域,从氨基向羧基端依次指定为A1-A2-B-A3-C1-C2[Wood等,Nature,312:330(1984);Vehar等,Nature,312:337(1984)与Toole等,Nature,342:337(1984)]。人因子VIII在细胞内加工以产生主要含有重链和轻链的杂二聚体,所述重链含有A1、A2和B结构域,所述轻链含有A3、C1和C2结构域。单链多肽与杂二聚体作为无活性的前体在血浆中循环直至在A2和B结构域之间被凝血酶切割而激活,释放B结构域并导致由A1和A2结构域组成的重链。B结构域以该蛋白激活的前凝血质形式除去。此外,在天然蛋白质中,B结构域两侧的两条多肽链(“a”和“b”)与二价钙阳离子结合。
在一些实施方案中,小基因含有编码10个氨基酸信号序列以及人生长激素(hGH)聚腺苷酸化序列的因子VIII重链的前57个碱基对。在供选择的实施方案中,小基因还含有A1和A2结构域,以及B结构域N-末端的5个氨基酸和/或B结构域C末端的85个氨基酸以及A3、C1和C2结构域。在还有的实施方案中,编码因子VIII重链和轻链的核酸以被编码B结构域的14个氨基酸的42核酸隔开的单一小基因提供[美国专利号6,200,560]。
本文使用的治疗有效量指AAV载体的量可产生足够量的因子VIII以降低受试对象血液凝结所需时间。因子VIII水平低于正常水平的1%的严重血友病患者的血液凝结时间一般大于60分钟,而非血友病患者约为10分钟。
本发明不受任何具体的因子VIII序列的限制。已分离和产生了因子VIII的许多天然和重组形式。因子VIII的天然和重组形式的例子见专利和科学文献,包括美国专利号5,563,045;美国专利号5,451,521;美国专利号5,422,260;美国专利号5,004,803;美国专利号4,757,006;美国专利号5,661,008;美国专利号5,789,203;美国专利号5,681,746;美国专利号5,595,886;美国专利号5,045,455;美国专利号5,668,108;美国专利号5,633,150;美国专利号5,693,499;美国专利号5,587,310;美国专利号5,171,844;美国专利号5,149,637;美国专利号5,112,950;美国专利号4,886,876;国际专利公开号WO 94/11503;WO 87/07144;WO 92/16557;WO91/09122;WO 97/03195;WO 96/21035和WO 91/07490;欧洲专利申请号EP 0 672138;EP 0 270 618;EP 0 182 448;EP 0 162 067;EP 0 786 474;EP 0 533862;EP0 506 757;EP 0 874 057;EP 0 795 021;EP 0 670 332;EP 0 500 734;EP 0 232112和EP 0 160 457;Sanberg等,世界血友病联合会第20届国际会议(XXthInt.Congressof the World Fed OfHemophilia),(1992)和Lind等,Eur.J.Biochem.,232:19(1995)。
编码上述因子VIII的核酸序列可使用重组方法或通过从已知包含该序列的载体衍生该序列得到。此外,可使用标准技术直接从含有该序列的细胞和组织直接分离所需序列,所述标准技术例如酚提取与cDNA或基因组DNA的PCR[参见,例如Sambrook等]。除了克隆以外,核苷酸序列也可合成产生。可用标准方法制备重叠的寡核苷酸,从重叠的寡核苷酸装配完整的序列并装配进完整的编码序列[参见,例如Edge,Nature,292:757(1981);Nambari等,Science,223:1299(1984)和Jay等,J.Biol.Chem.,259:6311(1984)]。
此外,本发明不限于人因子VIII。实际上,本发明应该包括除人以外的动物的因子VIII,所述动物包括(但不限于)陪伴动物(例如、犬、猫和马)、牲畜(例如,牛、山羊和绵羊)、实验室动物、海生动物、大型猫科动物(large cats)等。
AAV载体可含有编码因子VIII的片段的核酸,该片段本身无生物活性,但当施用进受试对象时改善或恢复血液凝结时间。例如,上述因子VIII蛋白含有两条多肽链:由B结构域隔开的重链和轻链,而B结构域在加工过程中被切断。如本发明所证明的,用因子VIII的重链和轻链共同转导受体细胞导致生物活性因子VIII的表达。由于大多数血友病患者仅在一条链(例如,重链或轻链)中有突变或缺失,可能仅施用患者有缺陷的链来补充另一条链。
其它有用的基因产物包括非天然多肽,例如具有天然氨基酸序列的嵌合或杂交多肽,而所述天然氨基酸序列含有插入、缺失或氨基酸取代。例如,单链改造的免疫球蛋白可用在某些免疫受损患者中。其它类型的非天然基因序列包括可用于降低靶过度表达的反义分子和催化性核酸,例如核酶。
降低和/或调节基因表达用于治疗以过度增殖细胞为特征的过度增殖疾病,例如癌症和银屑病尤其理想。靶多肽包括与正常细胞相比,专门地或在过度增殖细胞中较高水平产生的多肽。靶抗原包括癌基因与易位基因编码的多肽,所述癌基因例如是myb、myc、fyn,所述易位基因如bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF。除了作为靶抗原的癌基因产物,用于抗癌治疗和保护性治疗方案的靶多肽包括B细胞淋巴瘤产生的抗体的可变区与T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区,这些T细胞淋巴瘤在一些实施方案中也用作自身免疫疾病的靶抗原。其它肿瘤相关多肽可用作靶多肽,例如在肿瘤细胞中较高水平发现的多肽,包括单克隆抗体17-1A所识别的多肽和叶酸结合多肽。
其它合适的治疗性多肽和蛋白质包括通过赋予抵御自身免疫相关靶的宽基础保护性免疫应答来治疗患自身免疫疾病和紊乱的个体的多肽和蛋白质,所述靶包括细胞受体和产生“自我定向抗体”的细胞。T细胞介导的自身免疫疾病包括类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、综合征、结节病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、自身免疫甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、银屑病、脉管炎、韦格纳肉芽肿病、克罗恩病和溃疡性结肠炎。这些疾病中的每种均以与内源性抗原结合并启动自身免疫疾病相关的炎性级联反应的T细胞受体(TCR)为特征。
C.免疫原性转基因
本发明AAV载体适当地避免产生针对包含于载体中的AAV序列的免疫应答。然而,这些载体的配制方式可能是使得载体携带的转基因表达以诱导对所选抗原的免疫应答。例如,为促进免疫应答,转基因可从组成型启动子表达,给载体加入本文所述辅助载体和/或可将载体放进退化组织中。
例如,合适的免疫原性转基因可选自各种病毒科。需要免疫应答来抵御所需病毒科的例子包括导致约50%病例的普通感冒的鼻病毒属的小RNA病毒科;包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒和人肠病毒(如甲肝病毒)的肠病毒属;与主要在非人灵长类中导致口蹄疫的口疮病毒属。在小RNA病毒科内,靶抗原包括VP1、VP2、VP3、VP4和VPG。其它病毒科包括星状病毒和杯状病毒科。杯状病毒科包括作为流行性肠胃炎重要病因的病毒的诺瓦克群。另一种希望用于靶抗原在人或非人动物中诱导免疫应答的病毒科是披膜病毒科,该科包括甲型病毒属,该病毒属包括辛德毕斯病毒、罗斯河病毒、和委内瑞拉、东部和西部马脑炎病毒和风疹病毒属,包括风疹病毒。黄病毒科包括登革热、黄热、日本脑炎、圣路易斯脑炎和蜱传性脑炎病毒。其它靶抗原可从丙型肝炎或冠状病毒科产生,其中包括许多非人病毒,例如感染性支气管炎病毒(家禽)、猪传染性胃肠病毒(猪)、猪凝血性脑脊髓炎病毒(猪)、猫感染性腹膜炎病毒(猫)、猫肠冠状病毒(猫)、犬冠状病毒(犬)和可导致普通感冒和/或非-甲型、乙型或丙型肝炎的人呼吸冠状病毒并且包括严重急性呼吸道综合症(SARS)的假定病因。在冠状病毒科内,靶抗原包括E1(也称为M或基质蛋白)、E2(也称为S或Spike蛋白)、E3(也称为HE或血凝素-依尔替糖)、糖蛋白(不存在于所有的冠状病毒中)或N(核衣壳)。其它抗原可靶向抵御动脉炎病毒科和弹状病毒科,弹状病毒科包括水疱病毒属(例如,疱疹口炎病毒)和狂犬病病毒属(例如,狂犬病)。在弹状病毒科内,合适的抗原来源于G蛋白或N蛋白。包括出血热病毒,例如马尔堡和埃博拉病毒的丝状病毒科是合适的抗原来源。副黏病毒科包括1型副流感病毒、3型副流感病毒、3型牛副流感病毒、腮腺炎病毒(流行性腮腺炎病毒)、2型副流感病毒、4型副流感病毒、新城疫病毒(小鸡)、牛瘟病毒、麻疹病毒,包括麻疹和犬瘟热,和肺病毒,包括呼吸道合胞病毒。流感病毒分类在正黏病毒科内并且是抗原(例如,HA蛋白、N1蛋白)的合适来源。布尼亚病毒科包括布尼亚病毒属(加利福尼亚脑炎,拉克罗斯脑炎)、白蛉热病毒属(裂谷热)、汉坦病毒属(普马拉是hemahagin热病毒)、内罗毕病毒属(内罗毕绵羊病)和各种未命名的银环蛇病毒(bungaviruses)。沙粒病毒科提供抗LCM和拉沙热病毒的抗原来源。抗原的另一来源是博内病毒科。呼肠孤病毒科包括呼肠孤病毒属、轮状病毒属(导致儿童急性肠胃炎)、环状病毒属和科罗拉多蜱热病毒属(科罗拉多蜱热病毒属、Lebombo病毒属(人)、马变性脑病病毒属、蓝舌病病毒属)。逆转录病毒科包括RNA肿瘤病毒亚科,该亚科包括人和兽医疾病,例如猫白血病病毒、HTLVI和HTLVII、慢病毒亚科(包括HIV、猿免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、犬感染性贫血病毒和泡沫病毒亚科)。乳多空病毒科包括多瘤病毒亚科(BKU和JCU病毒)和乳头瘤病毒亚科(与癌症或乳头瘤的恶性进展有关)。腺病毒科包括导致呼吸疾病和/或肠炎的病毒(EX、AD7、ARD、O.B.)。细小病毒科包括猫细小病毒(猫肠炎)、猫全白细胞减少病病毒、犬细小病毒和猪细小病毒科。疱疹病毒科包括α疱疹病毒亚科,该亚科包括单纯疱疹病毒属(HSVI、HSVII)、水痘病毒属(假狂犬病、水痘-带状疱疹);β疱疹病毒亚科,该亚科包括巨细胞病毒属(HCMV,鼠巨细胞病毒属);和γ疱疹病毒亚科,该亚科包括淋巴潜伏病毒属、EBV(伯基特淋巴瘤)、人疱疹病毒6A、6B和7、卡波西肉瘤相关疱疹病毒与弥猴疱疹病毒(B病毒)、传染性鼻气管炎病毒属、马雷克病病毒属和细长病毒属。痘病毒科包括脊椎动物痘病毒亚科,包括正痘病毒属(大天花(天花)和牛痘(牛痘))、副痘病毒属、禽痘病毒属、山羊痘病毒属、兔痘病毒属、猪痘病毒属和昆虫痘病毒亚科。嗜肝DNA病毒科包括乙肝病毒。可是抗原的合适来源的一种未分类病毒是肝炎δ病毒、戊肝病毒和朊病毒。另一种抗原来源的病毒是Nipan病毒。其它的病毒来源包括鸟感染性粘液囊病病毒和猪呼吸和生殖综合征病毒。甲型病毒科包括马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
本发明也包括用于免疫人或非人动物抵御其它病原体的免疫原,所述病原体包括细菌、真菌、寄生微生物或感染人和非人脊椎动物的多细胞寄生虫、或来自癌细胞或肿瘤细胞的病原体。细菌病原体的例子包括致病性革兰氏阳性球菌,包括肺炎球菌、葡萄球菌(与其产生的毒素,例如肠毒素B)和链球菌。致病性革兰氏阴性球菌包括脑膜炎球菌、淋球菌。致病性肠革兰氏阴性杆菌包括肠杆菌科;假单胞菌属、不动杆菌属和埃肯菌属;类鼻疽假单孢菌属;沙门氏菌属;志贺氏菌属;嗜血杆菌属;莫拉氏菌属;杜克雷嗜血杆菌(H.ducreyi)(导致软下疳);布鲁杆菌(布鲁杆菌病);野兔热弗朗西丝菌(Franisella tularensis)(导致兔热病);鼠疫耶尔森菌(鼠疫)和其它耶尔森菌属(巴斯德菌属);念珠状链杆菌和螺菌属;革兰氏阳性杆菌,包括单核细胞增多李斯特菌;红斑丹毒丝菌;白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)(白喉);霍乱;炭疽杆菌(B.anthracis)(炭疽);多诺万病(腹股沟肉芽肿)和巴尔通体病。致病性厌氧细菌导致的疾病包括破伤风、肉毒中毒(肉毒梭菌(Clostridum botulimum)及其毒素);产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)及其ε毒素;其它梭菌属;结核病、麻风和其它分枝杆菌属。致病性螺旋体疾病包括梅毒;密螺旋体病:雅司病、品他病和地方性梅毒;以及钩端螺旋体病。较高致病性细菌和致病性真菌导致的其它感染包括鼻疽(鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiamallei);放线菌病;诺卡菌病;隐球菌病、芽生菌病、组织胞浆菌病和球孢子菌病;念珠菌病、曲霉病和毛霉病;孢子丝菌病;副球孢子菌病、石样真菌病、球拟酵母病、足分枝菌病和着色真菌病;和皮真菌病。立克次体感染包括斑疹伤寒热、落矶山斑疹热、Q热(伯内特科克斯立克次体(Coxiellaburnetti))和立克次氏体痘。支原体和衣原体感染的例子包括:支原体肺炎、性病性淋巴肉芽肿、鹦鹉热和围产期衣原体感染。致病性真核细胞包括致病性原生动物和蠕虫并且由其产生的感染包括:阿米巴病、疟疾、利什曼病、锥虫病、弓形体病、卡氏肺囊虫(Pneumocystiscarinii)、Trichans、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、巴贝虫病、贾第虫病、旋毛虫病、丝虫病、血吸虫病、线虫、吸虫(trematodes)或吸虫(flukes)感染和绦虫(绦虫)感染。
作为具有用于生物攻击潜力的制剂的许多这些生物体和/或其产生的毒素由疾病控制中心[(CDC),健康与人类服务部(Department ofHeath and Human Services),美国]鉴定。例如,一些生物制剂,包括现在分类为A类制剂的炭疽杆菌(Bacillusanthracis)(炭疽)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)及其毒素(肉毒中毒)、鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)(鼠疫)、大天花(天花)、野兔热弗朗西丝菌(Franisellatularensis)(兔热病)和病毒性出血热[丝状病毒(例如,埃博拉病毒、马尔堡病毒)和沙粒病毒[例如,拉沙病毒、马丘博病毒]];现在分类为B类制剂的伯内特科克斯立克次体(Coxiella burnetti)(Q热)、布鲁杆菌(布鲁杆菌病)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)(鼻疽)、假鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)(类鼻疽)、蓖麻(Ricinus communis)及其毒素(蓖麻蛋白毒素)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)及其毒素(ε毒素)、葡萄球菌(Staphylococcus)及其毒素(肠毒素B)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)(鹦鹉热)、水上安全恐吓(water safety threats)(例如,霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、斑疹伤寒热(普氏立克次体(Richettsiapowazekii))和病毒性脑炎(甲型病毒,例如委内瑞拉马脑炎、东部马脑炎、西部马脑炎);和现在分类为C类制剂的Nipan病毒和汉坦病毒。此外,其它如此分类或不同地分类的生物体在将来可鉴定和/或用于这种目的。容易理解的是,文中所述的病毒载体和其它构建物可用于传递这些生物体的抗原、病毒、其毒素或其它副产物,这些物质可预防和/或治疗感染或使用这些生物制剂产生的其它不良反应。
施用本发明的载体来递送抗T细胞可变区的免疫原引发包括CTL的免疫应答来消除T细胞。在类风湿性关节炎(RA)中已鉴定了参与疾病的TCR的几种特定可变区。这些TCR包括V-3、V-14、V-17和V-17。因此,递送至少编码这些多肽的一种的核酸序列引发靶向参与RA的T细胞的免疫应答。在多发性硬化症(MS)中已鉴定了参与该疾病的TCR的几种特定的可变区。这些TCR包括V-7和V-10。因此,递送至少编码这些多肽的一种的核酸序列引发靶向参与MS的T细胞的免疫应答。在硬皮病中已鉴定了参与疾病的TCR的几种特定可变区。这些TCR包括V-6、V-8、V-14和V-16、V-3C、V-7、V-14、V-15、V-16、V-28和V-12。因此,递送至少编码这些多肽的一种的核酸分子引发靶向参与硬皮病的T细胞的免疫应答。
因此,本发明的rAAV衍生的病毒载体提供足够的基因传送载体,这些载体能在体内或离体,甚至是生物体具有针对一种或多种AAV来源的中和抗体的情况下将所选的转基因递送至所选的宿主细胞。在一个实施方案中,rAAV与细胞离体混合,使用常规方法培养感染的细胞,将转导的细胞重新注入患者。
这些组合物尤其适用于治疗目的和免疫接种的基因递送,包括诱导保护性免疫。此外,本发明的组合物也可用于在体外产生所需基因产物。就体外生产而言,所需产物(例如,蛋白质)可在用含有编码所需产物的分子的rAAV转染宿主细胞,并在允许表达的条件下培养细胞培养物后从所需培养物中获得。然后,可视需要纯化和分离该表达产物。合适的转染、细胞培养、纯化和分离技术是本领域技术人员已知的。
以下实施例阐述了本发明的几个方面与实施方案。
实施例1-灵长类AAV序列的计算分析
A.收集灵长类组织
非人灵长类组织的来源已得到描述[N.Muzyczka,K.I.Berns,刊于《病毒学领域》(Fields Virology),D.M.Knipe,P.M.Howley编(Lippincott Williams & Wilkins,费城,2001),第2卷,2327-2359页]。通过两个主要的国家人组织供应方,合作人类组织网(Cooperative Human Tissue Network)(CHTN)和国家疾病研究交流协会(NationalDisease Research Interchange)(NDRI)从手术过程中或尸检或器官供者收集人组织。用于此项研究的人组织由18种不同的组织类型组成,包括结肠、肝、肺、脾、肾、脑、小肠、骨髓、心脏、淋巴结、骨骼肌、卵巢、胰腺、胃、食道、子宫颈、睾丸和前列腺。组织样品来自不同性别、种族(高加索人、非洲-美洲人、亚洲-西班牙人)和年龄(23-86岁)组的个体。在来自250个人体的259份分析样品中,约28%的组织与病理学相关。
B.AAV序列的检测与分离
如前所述,总的细胞DNA从人和非人灵长类组织中提取[R.W.Atchison等,Science194,754-756(1965)]。使用引物和类似于用在非人灵长类分析中的条件通过签名(signature)或全长cap PCR确定AAV在人中的分子优势和组织分布。在所选人组织的AAV分离物中采用与非人灵长类AAV的扩展家族的分离和鉴定使用的相同PCR克隆方案。简言之,通过PCR和Topo-克隆(Invitrogen)从组织DNA扩增含有部分rep和全长cap序列的3.1kb片段。人AAV克隆最初通过限制酶切作图分析来协助鉴定AAV序列的多样性,然后通过精度达99.9%的SeqWright(SeqWright,休斯顿,得克萨斯)进行全序列分析。鉴定了总共67个分离自人组织的衣壳克隆(hu.1-hu.67)。86个非人灵长类组织的cap克隆得到测序,其中70个克隆来自恒河猴、6个克隆来自南美弥猴、3个克隆来自豚尾弥猴、2个克隆来自狒狒、5个克隆来自黑猩猩。
C.AAV序列的分析
分析了所有毗连序列的AAV衣壳病毒蛋白(vp1)开放读框(ORF)。用ClustalX1.81TM程序[H.D.Mayor,J.L.Melnick,Nature 210,331-332(1966)]对比AAV衣壳vp1蛋白序列,用BioEditTM[U.Bantel-Schaal,H.Zur Hausen,Virology 134,52-63(1984)]软件包产生框内DNA对比。用MEGATM2.1版和TreePuzzleTM软件包推断系统发育情况。使用邻接、最大简约性和最大可能性[M.Nei,S.Kumar,《分子进化和系统发生学》(MolecularEvolution andPhylogenetics)(牛津大学出版社,纽约,2000);H.A.Schmidt,K.Strimmer,M.Vingron,A.von Haeseler,Bioinformatics18,502-4(2002年3月);N.Saitou,M.Nei,Mol Biol Evol4,406-25(1987年7月)]算法来确认单族组中类似的序列成簇。
然后从所有蛋白质序列的邻接系统发生树确定进化支。使用泊松-校正估计氨基酸距离。用1000个复制品进行自引分析。当序列具有0.05遗传距离内的连接节点时,可认为它们是单族的。3个或更多来源的一组序列认为是1个进化支。还通过序列分析评估了AAV种系发生的重组证据。执行裂口分解算法[H.J.Bandelt,A.W.Dress,Mol PhylogenetEvol 1,242-52(1992年9月)]筛选相似性。然后用Simplot软件中的Bootscan算法[M.Nei和S.Kumar,《分子进化和系统发生学》(MolecularEvolution and Phylogenetics)(牛津大学出版社,纽约,2000)]进一步分析以该方式获取的裂口的重组情况。使用400个核苷酸的滑动窗口(10个核苷酸/步)获得100自引复制邻接树。然后,从假定的重组片段推断裂口分解和邻接系统发生。自引值的明显提高、裂口的降低和杂交序列与其亲代来源的再分组可认为是重组的标准。
扩增自8个不同人对象的许多不同cap序列显示在Cap DNA序列的位置1400处的常见断点周围与AAV2(5’)和AAV3(3’)的系统发生关系,这与杂交病毒的重组和形成一致。从恒河猴的肠系膜淋巴结分离物检测到重组是在cap基因的通用区域[Gao等,Proc NatlAcad Sci美国100,6081-6086(2002年5月13日)]。执行Neib-Gofobori方法选择基于Z-测试的全部密码子[R.M.Kotin,Hum Gene Ther 5,793-801(1994年7月)]。
再次进行排除阳性鉴定为杂种的克隆的系统发生分析。在该项分析中包括鹅与鸟AAV作为外类群(l.Bossis,J.A.Chiorini,J Virol 77,6799-810(2003年6月))。图1是邻接树;使用最大简约性和最大可能性分析得到了类似关系。
该项分析证明11个系统发生群(总结于表1)。6个AAV进化支和5个单独AAV克隆(或克隆的集合)的种来源以数字或在取样中回收序列的来源表示。括号内显示每种类和每分组收集的序列总数。前述每个进化支的代号显示于右侧一列。Rhesus-恒河猴;cyno-南美弥猴;chimp-黑猩猩;pigtail-豚尾弥猴。
表1
每个种类和每个进化支或克隆的来源(序列)数目的分类
如上所示,因为在所用的标准系统发生算法中未执行重组,为了建立合适的系统发生树,从该分析中排除其重组祖先已确定的序列。所有非重组序列的邻接分析与确实利用重组得到的进化支并排表示。使用不同的算法与作为输入的核苷酸序列产生了类似结果。
如以下实施例所述,进行了其它实验来评估系统发生与作为血清学活性和向性检测到的功能有亲缘关系。
实施例2-新的人AAV的血清学分析
如以上实施例所述,获得的最后一个进化支来源于3个人的分离物,并且不含有上述的血清型。产生了针对该进化支的代表性成员的多克隆抗血清并综合研究了上述血清型之间的血清学交叉反应性。该研究表明新的人进化支在血清学上不同于其它已知的血清型,因此称为进化支F(以AAV9表示)。
通过用每种AAV载体的1×1013基因组拷贝与等体积的不完全弗氏佐剂一起对动物进行肌肉内接种产生针对AAV血清型1-9的家兔多克隆抗体。在第34天再次注射以加强抗体滴度。通过评价家兔抗血清对携带报道基因(携带增强型绿色荧光蛋白的AAVCMVEGFP)的载体转导293细胞的抑制作用确定AAV 1-9之间的血清学交叉反应性,所述载体是具有来源于不同AAV源衣壳的假型。用紫外显微镜评价AAVCMVEGFP载体对84-31细胞的转导。在评价两种AAV之间的血清学关系中,测试了异源和同源血清中和每种AAV载体的能力。如果血清以交互方式中和异源载体的能力低于中和同源载体的至少16倍,则认为此两种AAV是不同的血清型。如上所述测定中和滴度(G.P.Gao等,Proc Natl Acad Sci美国99,11854-9(2002年9月3日))。
表2
新的AAV载体的血清学评价
除了结构不同的AAV5和AAV1血清型的未预计的血清学反应性(即,在交互滴定中异源/同源滴度之比是1/4和1/8)之外,这些数据证实了不同克隆和进化支的系统发生分组。
该结果还表明AAVhu.14具有不同的血清学特性并且与产生自任何已知AAV血清型的抗血清无明显的交叉反应性。AAVhu.14独特的衣壳结构也证实了其血清学特殊性,其衣壳结构与所有其它在该研究中比较的AAV血清型共用低于85%的氨基酸序列。那些发现为我们将AAVhu.14命名为新的血清型,AAV9提供了基础。
实施例3-灵长类AAV作为基因传送载体的评价
通过产生假型载体研究了AAV的生物向性,该载体中表达GFP或分泌的报道基因α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的重组AAV2基因组用来源于各种克隆和用于比较的每种灵长类AAV进化支的一个代表性成员的衣壳来包装。例如,得自AAV1的数据用于代表进化支A,然后AAV2代表进化支B、Rh.34代表AAV4、AAV7代表进化支D、AAV8代表进化支E、AAVHu.14代表进化支F。AAV5、AAVCh.5和AAVRh.8作为单独的AAV基因型进行比较。
基于GFP转导评价了载体的转导效率以及体内在肝、肌肉或肺中的转导效率(图4)。
A.体外
表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体用于检测其在84-31细胞中的体外转导效率并用于研究它们的血清学特性。就功能分析而言,在84-31细胞中检测了不同的AAVCMVEGFP载体的体外转导,该细胞接种在96孔板中并以MOI为1×104GC每细胞用假型AAVCMVEGFP载体感染。用G.Gao等,Proc Natl Acad Sci美国99,11854-9(2002年9月3日)所述技术用具有AAV1、2、5、7、8和6个其它新AAV(Ch.5、Rh.34、Cy5、rh.20、Rh.8和AAV9)的衣壳假型AAV载体。相对EGFP转导效率以0、1、2和3评分,对应于感染48小时后用紫外显微镜估计的绿色细胞的0-10%、10-30%、30-70%和70-100%。
B.体内
就体内研究而言,人α-抗胰蛋白酶(A1AT)选为载体中灵敏且定量的报道基因并且在CMV-增强的小鸡β-肌动蛋白启动子控制下表达。使用CB启动子能获得高水平的组织非特异性和组成型A1AT基因传送,也能够利用同一载体制备物在感兴趣的任何组织中进行基因传送研究。用新的AAV载体(AAVCBhAlAT)以每只动物1×1011份基因组拷贝的剂量处理4-6周龄的NCR裸鼠,分别通过门静脉内、气管内和肌肉内注射进行肝、肺和肌肉的定向基因传送。基因传送后在不同的时间点收集血清样品,通过基于ELISA的试验测定A1AT浓度并相对于基因传送28天后不同的血清A1AT水平评分为0、1、2和3,评分取决于载体的施用途径(肝:0=A1AT<400ng/ml,1=A1AT 400-1000ng/ml,2=A1AT 1000-10,000ng/ml,3=A1AT>10,000ng/ml;肺:0=A1AT<200ng/ml,1=A1AT 200-1000ng/ml,2=A1AT1000-10,000ng/m1,3=A1AT>10,000ng/ml;肌肉:0=A1AT<100ng/ml,1=A1AT100-1000ng/ml,2=A1AT 1000-10,000ng/ml,3=A1AT>10,000ng/ml)。
人AAV,克隆28.4/hu.14(现在命名为AAV9)转导肝的效率类似于AAV8,转导肺的效率比AAV5好两个对数,转导肌肉的效率优于AAV1,而其它两个人克隆24.5和16.12(hu.12和hu.13)在所有3种靶组织中的性能勉强合格。克隆N721.8(AAVrh.43)在所有的3种组织中也表现出高性能。
为进一步分析AAV9和rh 43相比于肝(AAV8)、肺(AAV5)和肌肉(AAV1)候补标记的基因传送效率,进行了剂量应答实验。两种新的载体在肌肉中表现出至少比AAV1高10倍的基因传送(效率),在肝中的效率类似于AAV8而在肺中比AAV5高2个对数。
我们证明在所有3种组织中有足够基因传送效率的一组AAV,它们在每种组织中的效率类似或优于其候补标记。迄今为止,该种类中有3个新的AAV,两个来自恒河猴(rh10和43),一个来自人(hou.14或AAV9)。该3个AAV与它们的候补标记在鼠的肝、肺和肌肉中的相对基因传送效率的直接比较表明一些具有最佳适合度的灵长类AAV可能作为“超级”病毒衍生自严格的生物选择和进化。这些AAV很适用于基因传送。
C.生物学活性特征
根据基因传送效率,在一组克隆或进化支的成员内证明不同AAV的独特的生物学活性特征基本上一致。然而,体外转导不能预测体内基因传送的效率。基于转基因表达和差异的累积分析水平的相对得分开发了用于比较两种不同AAV假型之间生物学活性的算法。
根据下式计算每对AAV的体外和体内基因传送得分的累积差异并示于表中ND=未确定)。载体A和B之间根据得分的累积功能差异=体外(A-B)+肺(A-B)+肝(A-B)+肌肉(A-B)。该数值越小,AAV之间的功能越相似。在(图中)灰色区域,序列的百分比差异以粗体斜体字表示。通过将成对删除缺口后的氨基酸差异数除以750(VP1蛋白序列对比的长度)来确定cap结构中的百分比差异。
AAV1 | AAV2 | AAV3 | Ch.5 | AAV4 | AAV5 | AAV7 | AAV8 | Rh.8 | AAV9 | |
AAV1 | 0 | 5 | ND | 4 | 4 | 4 | 2 | 4 | 5 | 4 |
AAV2 | 16.3 | 0 | ND | 3 | 2 | 4 | 7 | 7 | 6 | 9 |
AAV3 | 13.2 | 12.3 | 0 | ND | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
Ch.5 | 15.5 | 10.5 | 11.5 | 0 | 2 | 4 | 6 | 6 | 5 | 8 |
AAV4 | 33.7 | 36.7 | 34.8 | 34.9 | 0 | 2 | 7 | 6 | 5 | 8 |
AAV5 | 39.1 | 38.8 | 38.5 | 38.4 | 42.7 | 0 | 4 | 4 | 3 | 6 |
AAV7 | 14.1 | 16.7 | 14.9 | 15.6 | 33.2 | 38.5 | 0 | 2 | 3 | 2 |
AAV8 | 15.6 | 16.4 | 14 | 15.6 | 33.2 | 38. | 11.6 | 0 | 1 | 2 |
Rh.8 | 14.1 | 15.2 | 14.3 | 14.4 | 33. | 39.6 | 12.1 | 8.8 | 0 | 3 |
AAV9 | 17.2 | 17.3 | 15.6 | 14.8 | 34.5 | 39.7 | 17.5 | 14.3 | 12.5 | 0 |
这些研究指出了许多与人中细小病毒研究相关的组织。在广泛的人组织中普遍存在内源性AAV序列表明该病毒群的天然感染是很常见的。病毒序列的广泛组织分布和在肝、脾和肠道中频繁检测到表明传送是通过胃肠道进行并且病毒血症可能是感染的特征。
人和非人灵长类中序列的巨大多样性与向性和血清学功能性相关,表明多样性是由真实的生物压力,例如免疫逃逸驱动。明显,第二最常见的人进化支证明重组导致这种多样性,该进化支是上述两种AAV的杂交体。
系统发生分析的拓扑学检查揭示了病毒进化与其宿主限制之间的关系。整个依赖病毒属似乎衍生自鸟类AAV,这与Lukashov和Goudsmit(V.V.Lukashov,J.Goudsmit,JVirol 75,2729-40(2001年3月))发表的一致。AAV4和AAV5分离物早先分叉自其它AAV的后来发育。下一个重要的节将该种类分成两个主要的单族群。第一群有单独分离自人的克隆,包括进化支B、AAV3克隆、进化支C和进化支A;该群的种类限制的唯一例外是称为ch.5的黑猩猩的单一克隆。代表该属剩余成员的另一单族群来源于人和非人灵长类。该群包括从除弥猴以外的物种分离的进化支D和rh.8克隆与人特异性的进化支F。该群内的剩余进化支(即,进化支E)有来自人和许多非人灵长类的成员,说明该进化支的传播超越了种类障碍。有趣的是,分离自一些人的进化支E成员的衣壳结构与非人灵长类的一些基本相同,表明几乎未发生宿主适应。AAV8衍生载体的生物学分析证实了高水平的基因传送有宽范围的组织向性,这与更混杂的感染范围一致并且可以解释明显的人兽互通病。进化支F的基因传送的范围和效率甚至更大,增强了跨种传播的可能性,这是迄今为止未检测到的。
潜伏AAV在整个人和非人灵长类中广泛传播的存在及其明显的重组倾向与跨种障碍产生了重要的问题。重组可能导致出现有毒力改变的新传染物。尚待确定灵长类中AAV感染的临床后遗症的事实使得对这种可能性的评价复杂化。此外,AAV序列在肝中流行率高可能导致病毒通过同种和异种肝移植在人群中传播。最后,在人中发现内源性AAV涉及将AAV用于人基因治疗。野生型AAV在于灵长类中如此流行却未与恶性病变相关的事实说明它尤其不是致癌性的。事实上,AAVrep基因的表达显示抑制转化[P.L.Hermonat,Virology 172,253-61(1989年9月)]。
实施例4-用于治疗囊性纤维化气道疾病的AAV 2/9载体
迄今为止,传送至肺用于治疗CF气道疾病的CFTR基因受限于不佳的载体性能与气道上皮细胞造成有效的基因传送的明显障碍。包装于AAV9衣壳中的AAV2基因组(AAV2/9)在各种气道模型系统中与AAV2/5比较。
AAV2/9的50μl单一剂量的1×1011基因组拷贝(gc)鼻内滴注入裸鼠和C57B 1/6小鼠,该AAV2/9基因组表达在小鸡β-肌动蛋白启动子的转录控制下核靶向β-半乳糖苷酶(nLacZ)基因或绿色荧光蛋白(GFP)基因。21天后,处理肺和鼻以表达基因。用AAV2/9-GFP转导对照动物,未见LacZ阳性细胞。AAV2/9-nLacZ主要经气道成功地转导,AAV2/5-nLacZ主要经肺泡和几乎不经气道转导。AAV2/5和AAV2/9均穿越鼻气道上皮转导纤毛和非纤毛上皮细胞。
现在评价了上皮细胞特异性启动子来改善体内靶向气道细胞。然后,基于体内发现测试了AAV2/9对人气道上皮细胞的基因传送效率。气道上皮细胞分离自人气管和支气管并生长在胶原包被的膜支持物上的气-液-界面(ALI)处。一旦细胞极化与分化,用表达GFP的AAV2/9或AAV2/5从尖端和基底外侧转导它们。AAV2/5和AAV2/9成功地从基底外侧表面转导上皮细胞。然而,当应用于尖端表面时,AAV2/9转导的细胞数目高于AAV2/5的10倍。现在评价了AAV2/9在非人灵长类的肺与鼻气道中的基因传送效率。
该实验证实,AAV2/9可有效地转导鼠肺的气道和生长于ALI中的良好分化的人气道上皮细胞。
实施例5-AAV1(2/1)和AAV9(2/9)直接注射入成年大鼠心脏的比较
向两只成年大鼠(3月大)的左心室注射5×1011个AAV2/1或AAV2/9颗粒一次。
结果是惊人的,如lacZ组织化学方法所评价的,成年大鼠心脏中观察到AAV2/9载体表达明显高于AAV2/1。AAV2/9在新生小鼠心脏中也显示出更好的基因传送效率。
实施例6-用于B型血友病基因治疗的AAV2/9载体
该研究中,AAV2/9载体显示是用于B型血友病的肝和肌肉定向基因治疗中比传统的AAV来源更有效且更低免疫原性载体。
就肝定向方法而言,在小鼠和狗中血友病模型中评价AAV2/9假型载体。在免疫活性B型血友病小鼠(在C57BL/6背景中)中,以1×1011份基因组拷贝(GC)/小鼠门静脉内注射AAV2/7、2/8和2/9载体后实现了犬因子IX(cFIX,41-70μg/ml)的长期超生理水平与缩短的活化的部分凝血致活酶时间(aPTT),其中cFIX在肝特异性启动子(LSP)与旱獭乙肝转录后响应性元件(WPRE)控制下表达。剂量低10倍(1×1010GC/小鼠)的AAV2/8载体产生了正常水平的cFIX和aPTT时间。在北卡罗来纳大学(University of North Carolina)(UNC)B型血友病狗中,证实了将AAV2/8载体施用进已用AAV2载体处理过的狗中是成功的;第二次门静脉内注射(剂量=5×1012GC/kg)后的第6天达到表达cFIX峰值(10μg/ml),然后逐渐降低并在整个研究(1.5年)中稳定于700ng/ml左右(正常水平的16%)。该水平比相似剂量接受单次注射AAV2-cFIX的B血友病狗约高3倍。近来,以5.25×1012GC/kg剂量对两只首次用于实验的B型血友病狗门静脉内注射AAV2/8载体。注射10周后,一只狗(雄性)的cFIX水平达到正常水平的30%(1.5μg/ml)并维持于1.3-1.5μg/ml,而第二只狗(雌性)的cFIX表达约维持于正常水平的约10%。注射后,全血凝结时间(WBCT)和aPTT均缩短了,这说明抗原是生物活性的。手术后,两只狗中的肝酶(天冬氨酸转氨酶(SGOT))、丙氨酸转氨酶(SGPT)维持于正常水平。也评价了这些AAV用于B型血友病的肌肉定向基因治疗。以1×1011GC/小鼠的剂量肌肉内注射后,在免疫活性B型血友病小鼠(在C57BL/6背景中)中比较了用6种不同AAV来源包装的AAV-CMV-cFIX-WPRE[携带在CMV启动子控制下的cFIX并含有WPRE的AAV]。监测cFIX基因表达与抗体形成。在用AAV2/8载体注射的小鼠的血浆中检测到最高表达(在第42天为1460±392ng/ml),然后是注射AAV2/9(在第42天为773±171ng/ml)和注射AAV2/7的(在第42天为500±311ng/ml)。这些水平维持了5个月。令人意外的是,用AAV2/1的cFIX表达量的范围是0-253ng/ml(平均值:66±82ng/ml)。在一些AAV2/1注射的小鼠中检测到抗-cFIX抑制剂(IgG)。这些小鼠中的cFIX表达水平良好地与抑制剂水平相关。第28天的样品对所有AAV进行了进一步筛选抑制剂的形成。B型血友病小鼠显示针对AAV2/2的抑制剂形成最高,然后是AAV2/5和AAV2/1。注射AAV2/7、AAV2/8和AAV2/9的动物中仅检测到有个别和低水平的抑制剂。因此,用于B型血友病肌肉定向基因治疗的新AAV血清型2/9载体的优点是更有效且安全的载体而不引发任何明显的抗FIX抗体形成。
实施例7-本发明的新Rh.43载体
A.基于AAVrh.43的A1AT表达载体与AAV8和AAV9在小鼠肝脏定向基因传送中的比较
比较属于进化支E(通过系统发生分析)的新AAVrh.43载体与AAV8和新AAV9在门静脉内输注入小鼠肝脏后的hA1AT水平。更具体地说,在小鼠肝脏定向基因传送中比较了假型AAVrh.43、AAV2/8和AAV2/9载体。以1×1011GC、3×1010C与1×1010GC/动物的剂量向4-6周龄C57BL/6小鼠肌肉内施用假型载体。在载体输注后第28天从动物中收集血清样品用于人α1抗胰蛋白酶(hA1AT)测定。
数据表明新AAVrh.43载体在小鼠模型中实际上与AAV9性能类似。
B.假型AAV载体介导的核靶向LacZ基因传送至小鼠肝脏和肌肉
比较了本发明新的基于AAV9和AAVrh.43的载体与基于AAV1和AAV2的载体。以1×1011GC/小鼠的剂量将载体经门静脉内注射到靶肝脏或肌肉内注射到C57BL/6小鼠的右胫前肌肉中。基因传送后第28天处死小鼠并收集感兴趣的组织进行X-ga1组织化学染色。
证实AAVrh.43载体的基因传送效率接近AAV9但高于AAV1至少5倍。还用核靶向LacZ基因进一步分析了AAVrh.43在肝脏和肌肉中的特性,所述基因是作为报道基因用组织化学方法目测基因传送的程度。
C.基于AAVrh.43的A1AT表达载体与AAV5在小鼠肺定向基因传送中的比较
本发明新的基于rh.43的载体在肺组织中也表现出极好的基因传送能力。经气管内以不同剂量(1×1010、3×1010和1×1011GC/动物)向4-6周龄C57BL/6小鼠的肺部施用假型载体。于不同时间点收集小鼠的血清样品用于hA1AT测定。
比较不同剂量的该载体与AAV5在气管内滴注入小鼠肺部后hA1AT的水平。数据显示该新的载体在小鼠模型中比AAV5至少更有效100倍。
实施例8-用于肝脏和肺定向基因传送的新的基于人AAV的载体
人克隆AAVhu.37、AAVhu.41和AAVhu.47制成假型并检测在小鼠组织中的基因传送能力。使用本文所述的方法制备具有hu.37、hu.41和hu.47衣壳的假型AAVCBA1AT载体并经门静脉内与气管内注射施用至4-6周龄的C57BL/6小鼠。载体注射后第14天收集小鼠的血清样品用于按照公开的技术进行的hA1AT测定。AAVhu.47属于AAV2家族(进化支B)并且分离自人骨髓样品。AAVhu.37和AAVhu.41分别来自人睾丸组织和人骨髓样品。在系统发生学上,它们均属于AAV8进化支(进化支E)。
注射的动物的血清A1AT分析表明,AAV hu.41和AAV hu.47在3种测试的组织中表现不佳。然而,得自AAVhu.37的载体的基因传送能力类似于AAV8在肝脏和AAV9在肺中的。
本说明书中引用的所有出版物引为参考。尽管参考特别优选的实施方案描述了本发明,应该理解的是可做出改进而不脱离本发明的构思。
Claims (12)
1.一种腺伴随病毒(即AAV)载体,其包含AAV rh.64衣壳,所述AAV rh.64衣壳由vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白构成,所述vp1蛋白由选自SEQ ID NO:99或SEQ ID NO:233所示序列构成,其中所述AAV还包含小基因,所述小基因具有AAV末端反向重复和操作性连接于调节序列的异源基因,所述调节序列引导所述异源基因在宿主细胞中表达。
2.如权利要求1所述的腺伴随病毒载体,其特征在于,所述衣壳由SEQ ID NO:15所示的核酸序列编码。
3.如权利要求1-2中任一项所述的腺伴随病毒载体,其特征在于,所述末端反向重复来自与AAV rh.64异源的AAV。
4.一种分离的衣壳蛋白,所述衣壳蛋白选自下组:
由SEQ ID NO:99的氨基酸1-738构成的vp1衣壳蛋白,和
由SEQ ID NO:233的氨基酸1-738构成的vp1衣壳蛋白。
5.一种核酸分子,其包含编码权利要求4中所述蛋白的核酸序列。
6.如权利要求5所述的核酸分子,其特征在于,所述核酸的序列由SEQ ID NO:15的核苷酸1-2217构成。
7.如权利要求5或6所述的核酸分子,其特征在于,所述分子包含编码AAV衣壳蛋白和功能性AAV rep蛋白的AAV序列。
8.如权利要求7所述的核酸分子,其特征在于,所述分子是质粒。
9.一种产生含有AAV衣壳的重组腺伴随病毒(即AAV)的方法,所述方法包括培养宿主细胞的步骤,所述宿主细胞含有:(a)编码AAV衣壳蛋白的分子;(b)功能性rep基因;(c)含有AAV末端反向重复(ITRs)和转基因的小基因;和(d)允许将所述小基因包装进AAV衣壳蛋白的足够辅助功能物,其中所述宿主细胞含有如权利要求5-8中任一项所述的核酸分子。
10.一种用如权利要求1-3中任一项所述的腺伴随病毒载体或权利要求5-8中任一项所述的核酸分子体外转染的宿主细胞。
11.一种组合物,其含有如权利要求1-3中任一项所述的腺伴随病毒载体或权利要求5-8中任一项所述的核酸分子、以及生理相容运载体。
12.如权利要求1-3中任一项所述的腺伴随病毒载体或如权利要求11所述的组合物,其用于将分子递送到细胞。
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Infectious clones and vectors derived from adeno-associatedvirus(AVV)serotypes other than AVV type 2;Rutledge E A,et al;《Joural of Virology》;19980131;第72卷;1-58 * |
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