CN102215871B - 糖结合分子 - Google Patents
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Abstract
本发明提供包含或使用糖结合分子的化合物,组合物,药物和方法。更确切的,本发明提供治疗由病原体,特别是微生物病原体,引起或促成的疾病和/或病症的手段及筛选,鉴定,检测,给糖加标签和/或标记的糖的方法。
Description
发明领域
本发明提供包含或应用糖结合分子的化合物,组合物,药物和方法。更具体地的,本发明提供治疗由病原体,特别是微生物病原体,引起或促成的疾病和/或病症的手段及筛选,鉴定,检测,给糖加标签和/或标记糖的方法。
发明背景
大多数哺乳动物细胞表面富有复合糖并且很多病原体利用这些复合糖的末端糖在发病机制初期阶段进行细胞附着。以实例说明,病毒病原体流行性感冒和副流行性感冒都与哺乳动物细胞表面的唾液酸受体结合。
唾液酸的识别由凝集素或凝集素样分子和它们相应的受体介导(3)。在大多数情况下,结合唾液酸的凝集素,其也包含几种病毒糖蛋白和细菌毒素(2,4),以及哺乳动物凝集素超家族例如涎免凝集素(5)和选凝素(6),由于这些分子的多价性质,它们以相对高亲和力与它们的受体结合,因而减少了大多数蛋白质-糖相互作用所关联的固有的低亲和力(7,8)。通常,这样的凝集素结合单价和双价唾液酸糖苷(sialoside)的缔合常数(Ka)可达到104M-1。然而,由于它们的多价性,有些唾液酸结合凝集素可以和多价的细胞表面多糖相互作用以通过亲和性(avidity)作用取得达到109M-1的亲和力。这些被增加的亲和力已显示出一部分原因是由于经配体结合促成的蛋白质结构包装的改善,这与有利的结合能量学相关(9-11)。其中研究最多的多价凝集素-唾液酸相互作用中的一种是流感病毒三聚血凝素,与当一个或两个实体不在多价状态时大约4x102M-1的亲和力相比(12),其能获得至108M-1的亲和力。
唾液酸酶,或神经氨酸酶,催化从很多种复合糖而来的唾液酸的水解作用并常常是模块式酶,包含粘附于蛋白质催化核心的附属组件。这些组件中有些已经被识别为糖结合组件(CBMs).CBMs广泛发现于糖苷水解酶中且是不连续的,非催化性组件,它们的存在目的主要是使母体酶靶向它们的底物通过增加底物表面酶的浓度来进行有效水解(13)。在糖基水解酶结构中组件可以是单个的,串联的或多重的。研究表明当和母体分子分离时,它们可以和它们特异性的多糖独立性地结合,并且当分离成串联式时,也可以表现为协同方式(14,15)。基于主要的序列相似性,目前CBMs被归类进52个家族(http://www.cazy.org/fam/acc_CBM.html)。CBMs结构中的细微差别能导致多种多样的配体特异性,这使CBMs成为一个用来阐明蛋白质-糖机制具有吸引力的系统。
一个题名为“EngineeringMultivalentSialicAcidRecognitionusingtheCBM40modulefromVibriocholeraeSialidase(利用来自霍乱弧菌唾液酸酶的CBM40组件来改造多价唾液酸识别)”的海报(公开发表于2008年5月17日:见http://www.biochem.emory.edu/conferences/glycot/Images/GlycoTProgram-Posters.pdf)描述了通过多价性来研发对唾液酸具有增加的亲和力的试剂。然而,该海报没有公开这样的试剂在治疗由病原体引起的疾病和/或病症中有任何应用。
已经有充分的记载,即目前具有的流感抗病毒药(特别是,罗氏(Roche)的达菲)有递增的耐药性并且已经强调了寻找替代性方法来抵抗流感的需要。先前的研究已经表明利用无毒性的凝集素,例如来自接骨木的SNA凝集素作为一种流感病毒抑制剂,但是这显示与唾液酸微弱的结合力并有赖于两个或三个不同的糖结构部分的存在以识别和有效的抑制。最近利用一种称为DAS181(Fludase,由NexBioInc.研发)的重组唾液酸酶-融合蛋白质的工作当前正在作为这些备选的另外一种进行研究。这种蛋白质有效地在上皮细胞的表面去除了唾液酸,使得病毒无法和受体结合。然而,利用唾液酸酶来去除唾液酸,这同时可能暴露隐藏的受体,而它们可能作为其它病原体的受体。
本发明目的在于提供有利于治疗由病原体引起的疾病和/或病症的化合物,组合物,药物和方法,并消除与现有技术相关的问题。
发明概述
本发明基于这样的发现,即糖结合分子(CBMs)可用于抵抗和/或预防疾病或病症,所述疾病或病症的发生是病毒和/或细菌病原体感染所导致的。
已知为了结合/粘附,建群或进入细胞,一些病原体利用细胞表面上糖类的存在。以实例说明,呼吸道病原体,如属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)或副粘病毒属(Paramyxovirus)家族的病毒,利用细胞表面糖类来结合和进入多种哺乳动物组织的特异性细胞类型。类似地,细菌如属于链球菌(Streptococcus)属的细菌利用细胞表面糖类作为结合/粘附细胞和/或进入某些细胞的手段。
哺乳动物细胞表面包含大量不同类型的分子。特别地,哺乳动物细胞富有复合糖,它们的末端糖是典型的唾液酸。于是,某些病原体已经进化形成利用细胞表面唾液酸的存在来结合/粘附那些细胞和/或进入那些细胞。
CBM组的成员通常发挥功能以将糖基水解酶例如唾液酸酶或神经氨酸酶靶向或导向于它们的底物以得到有效的水解作用。同样地,CBMs对细胞表面糖类如,例如,唾液酸,半乳糖,岩藻糖,N-乙酰葡糖胺,和血型抗原有亲和力。本领域技术人员会意识到对细胞表面糖显示出亲和力的化合物,可以被用来阻断病原体结合,或识别该糖的能力,因而可能预防病原体建群和/或进入细胞。
于是发明人已经发现通过利用CBM对糖类的亲和力,很有可能提供有利于治疗一系列由那些病原体引起或促成的疾病和/或病症的化合物,组合物,药物和/或方法,那些病原体在病理机制过程中结合/粘附细胞表面糖类或用别的方法与细胞表面糖类缔合。
因此,在第一方面,本发明提供了一种糖-结合组件(CBM)用于治疗或预防由一种或多种病原体引起或促成的疾病和/或病症。
在第二方面中,本发明提供了糖-结合组件(CBM)在制备用于治疗或预防由一种或多种病原体引起或促成的疾病和/或病症的药物中的应用。
除了以上所述之外,本发明的第三个方面提供了一种药物组合物,该药物组合物包含CBM,其用于治疗或预防由一种或多种病原体引起或促成的疾病和/或病症。
优选地,本发明提供的药物组合物被配制成无菌药物组合物并且合适的赋形剂,载体或稀释剂可以包括,举例来说,水,盐水,磷酸缓冲盐水,葡萄糖,甘油,乙醇,离子交换剂,氧化铝,硬脂酸铝,卵磷脂,血清蛋白,如血清白蛋白,缓冲物质如磷酸盐,甘氨酸,山梨酸,山梨酸钾,饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物,水盐或电解质如硫酸鱼精蛋白,磷酸氢二钠,磷酸氢钾,氯化钠,锌盐,胶态硅石,三硅酸镁,聚乙烯吡咯烷酮,基于纤维素的物质,聚乙二醇(polyethyleneglycon),羧甲基纤维素钠,聚丙烯酸酯,蜡类,聚乙烯-聚丙烯-嵌段聚合物,聚乙二醇和羊毛脂等,或其组合。
所述药物组合物可以被配制成,举例说明,适合用于口服,肠胃外或局部施用的形式。
本领域技术人员将意识到除了使用特异性结合糖类的各个或单一CBMs,在此提供的化合物,组合物和药物可以进一步包括其它的CBMs,这些CBMs与备选(alternate)的糖结合或对其表现亲和力,或对同一种糖显示出不同的亲和力。
如上所述,除了提供用于治疗或预防多样的疾病和/或病症的化合物,组合物和/或药物,本发明同时也提供了用于治疗受试者,特别是人受试者的方法,所述受试者正遭受或冒有风险染上由病原体,特别是那些有能力结合细胞表面糖类的病原体,而引起或促成的疾病和/或病症。
于是本发明的第四个方面提供了一种治疗或预防由病原体引起或促成的疾病的方法,所述方法包括施用治疗有效量的糖结合组件(CBM)的步骤。
本发明与已存在的治疗由病原体(例如,病毒和/或细菌性呼吸道病原体)引起或促成的疾病和/或病症的方法相比表现出明显的优势,所述现存的治疗方法包括例如,酶促去除细胞表面糖类。这种类型的策略可能把隐藏的受体暴露于其它的病原体使细胞易受感染。通过阻断与细胞表面糖类的接近而不是把它们从细胞表面去除,这样的问题可以避免,此外由于本文描述的CBMs与末端糖残基(如,以唾液酸为例)结合,CBM可能不会引发免疫反应。
本文使用的术语“病原体”,应该被理解为包含任何有结合,识别或以其它方法缔合细胞表面糖能力的病原体,特别是那些已经进化形成利用或使用细胞表面糖的存在作为结合/粘附细胞与和/或进入细胞的手段的病原体。同样地,在一个实施方案中,术语“病原体”包括微生物病原体并包括呼吸道病原体如属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)或副粘病毒科(Paramyxoviridae)家族的病毒,例如流行性感冒和人类副流行性感冒病毒,和属于链球菌属的细菌如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)和/或流感嗜血菌(Hemophilusinfluenzae),铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)--所有这些病原体具有结合哺乳动物细胞表面上糖类的能力。本领域的技术人员将意识到哺乳动物细胞最频繁地被本文描述的病原体类型建群/传染的是上皮细胞,尤其是那些衬在黏膜管道(mucosaltract)(例如,呼吸道上皮细胞)的上皮细胞。
鉴于以上所述,应用本文提供的化合物,组合物,药物或方法,可被治疗的或预防的疾病和/或病症有很多且是多样的并且应该认为是那些由任何一种本文提到的病原体引起或促成的疾病和/或病症。因此,由病毒性呼吸道病原体例如,以流感病毒和/或副流感病毒为例,和细菌性病原体例如,以肺炎链球菌为例,引起或促成的疾病和/或病症,可受益于本文提供的各种的化合物,组合物,药物和/或方法的应用。在这方面,本发明提供了用于治疗或预防疾病或病症,如流行性感冒和病毒性和/或细菌性呼吸道疾病如哮吼,肺炎和支气管炎中的化合物,组合物,药物和/或方法。鉴于以上所述,本发明的一个实施方案提供了用于治疗由选自由流感病毒,副流感病毒,和肺炎链球菌组成的组的一种或多种病原体引起或促成的疾病和/或病症的化合物,组合物,药物和/或方法。
术语“糖”应该被理解为包括任何糖,尤其是那些存在于细胞表面的那些糖和特别是存在于哺乳动物细胞表面,例如哺乳动物上皮细胞表面的那些糖。必须同样知道术语“糖”可以包括单糖单位,它还可以包括多糖,聚糖链和/或复合糖的糖结构部分。同样地,术语“糖”可以包括,例如唾液酸,其是这样的糖家族,所述糖具有九个碳骨架并且位于细胞表面的聚糖链末端(或远端)。唾液酸家族包括很多(大约50)可能由在C4,C5,C7,C8和C9乙酰化,糖基化(glycolylation),内酯化和甲基化作用产生的衍生物。此外,发现唾液酸在α(2,3)或α(2,6)连接于Gal和GalNAc或在α(2,8)或α(2,9)连接于另外的唾液酸。由此,懂得尽管术语“唾液酸”被用在整个的说明书中,在此它应被理解为包括其所有衍生物,类似物或变体(或是天然存在的或是人工合成的)以及二聚体,三聚体,寡聚体,聚合物或包含其的多联体是很重要的。其它细胞表面糖类可以包括N-乙酰葡糖胺,半乳糖,N-乙酰半乳糖胺,岩藻糖,甘露糖,和在血型抗原这样的表位中发现的它们的复合物。
CBMs在自然界中广泛存在并对各种各样不同的糖类显示出广泛程度的亲和力。到目前为止,基于它们初级序列相似性,CBMs已经被归类进52个家族,并必须注意本发明可涉及到任何一种CBM。当然,为了治疗已知由病原体引起的疾病或病症,该病原体和特定的细胞表面糖结合,与该糖结合的或对该糖显示出亲和力的CBM,在治疗或预防那种疾病或病症上将是特别有效的。
本发明的一个实施方案涉及那些显示对唾液酸具有亲和力或与之结合的CBM分子。本领域的技术人员将意识到与唾液酸结合的或对唾液酸显示出亲和力的CBMs,作为用于治疗由在病理机制过程中结合或与唾液酸缔合的病原体而引起或促成的疾病或病症的化合物,或组合物,药物或方法将是有效的。
应当注意很多不同的CBMs可显示针对特定的糖的亲和力并且那种亲和力的大小可能呈现不同。尽管如此,应当知道,在与细胞表面糖例如唾液酸结合的CBMs的情况下,任何一种对唾液酸显示亲和力的CBM应该被认为具有潜在有效性。
其中,潜在有效的CBMs是属于40家族和要不然可能作为“CBM40”而被知晓的CBMs。包含在CBM40家族内的是从霍乱弧菌(Vibriocholerae)和产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)而来的CBMs。
来自于霍乱弧菌的CBM40展示对唾液酸相对高的亲和力(Kd~30μM),而来自于产气荚膜梭菌的CBM40展示对唾液酸高毫摩尔的亲和力
除如上所述之外,发明人已经发现虽然单个的CBM分子可以显示对特定糖(如例如,唾液酸)的亲和力,通过连接或组合两个或更多的CBM分子,通过亲和性,可以产生一种针对那种糖具有更高亲和力的分子。
因此,本发明还涉及多价的CBM分子或多肽,其在下文中称为“CBM聚合物”,包含一个或多个通过某些途径被联结,连接或缀合在一起的CBMs(或单体)。
于是,本发明的第五个方面提供了包含两个或多个CBMs(CBM单体)的CBM聚合物。
术语“聚合物”将会很容易地被本领域的技术人员理解为包括包含很多个连接单元的分子。在这点上,术语“CBM聚合物”可以被用来描述CBM-二聚体(也就是,两个CBM单体),CBM-三聚体(三个CBM单体),CBM四聚体(四个CBM单体)和更大的,CBM-寡聚体(五个或更多个CBM单体)。
本领域的技术人员将意识到虽然生产包含相同重复性的CBM单体(例如,重复性的霍乱弧菌衍生的CBM40单体)的CBM聚合物可能是合乎需要的,产生包含很多不同CBM单体的CBM聚合物也是可以的,其中每一个单体有能力和不同的糖结合和/或每一个单体针对特定的糖显示不同的亲和力。类似地,包含和不同的细胞表面糖类结合或对其显示亲和力的CBM单体的CBM聚合物也落在本发明的范围内。象这样,根据本发明的CBM聚合物可以包含对唾液酸具有亲和力的CBM单体和对其它一些糖,例如甘露糖,半乳糖,岩藻糖,N-乙酰葡糖胺具有亲和力或与之结合的CBM单体。
如上所述,通过将CBM单体联结,连接或缀合在一起,可以产生出更大的聚合物分子,其通过亲和性,显示对特定的糖或很多的糖类更强的亲和力。因此,尽管一种特定的CBM单体,例如来自霍乱弧菌的CBM40可对唾液酸显示亲和力,当两个或多个所述CBM40单体连接,联结或缀合在一起时,产生出的聚合物可能显示对唾液酸增强的亲和力。
因此,本发明和特别是用在本发明的第一,第二和第三及第四个方面中的术语“CBM”应该被理解为包括在本文描述的CBM聚合物。
本领域的技术人员将意识到包含与不同的糖类结合或显示与其有亲和力的CBM单体的CBM聚合物它自身可能与相同的糖类结合或与其有亲和力。例如,如果CBM聚合物包含与两种不同细胞表面糖类结合或与其有亲和力的CBM单体,那么产生的CBM聚合物也可以与相同的两种细胞表面糖类结合或显示与其有亲和力。
包含很多不同的CBM单体和继而与很多不同的糖类分子结合或显示与其有亲和力的CBM聚合物,可能在治疗或预防由一种以上病原体引起或促成的疾病和/或病症的组合物,化合物,药物和/或方法中特别有效。
例如,如果受试者遭受或有倾向于感染由两种不同病原体引起或促成的至少两种疾病或病症(其中每一种病原体能与不同细胞表面糖类结合(作为建群和/或进入细胞的方式)),包含识别,结合或以别的方式与这些糖类缔合的CBM单体的CBM聚合物在治疗或预防所述疾病和/或病症中可以是有益的。作为选择性地,由两种或多种病原体引起的疾病和/或病症可以通过使用利用相关的单体CBMs的化合物或组合物,药物或方法进行治疗。
本领域的技术人员将意识到有很多种可以连接氨基酸,蛋白质和/或肽的方法。在一个实施方案中,氨基酸,肽和/或蛋白质可以通过化学手段和/或通过克隆和/或PCR技术被联结、连接或缀合。
以实例说明,编码相关的CBM(s)的核苷酸序列可以通过PCR来扩增和被修饰以致其一个或多个的拷贝可以被连接在一起或与其它CBM编码核苷酸序列连接。另外,CBM核苷酸序列可以被进一步修饰以在它们的3’端和/或5’端包含编码含有一个或多个氨基酸残基的接头结构部分的序列。
CBM聚合物(或多价的CBMs)还可以通过应用被修饰过以包含,例如,寡聚化结构域的CBM单体而产生。具有这些结构域的分子可能自己组装而形成寡聚体的结构。在一个实施方案中,寡聚化结构域可以从例如,细菌种类比如已知编码一种三聚化结构域的铜绿假单胞菌而得到。基于PCR的技术可以用来以这种方法修饰CBM分子。
扩增的和任选被修饰/连接的CBM序列然后可以被克隆进合适的载体中用以表达和纯化产生出的CBM或CBM聚合物。重组的CBM单体(例如编码寡聚化结构域的那些)或CBM聚合物可以在,例如大肠杆菌(E.coli)中表达。
鉴于以上所述,本发明的第六个方面可能提供了一种生产CBM聚合物的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)连接编码CBM的核苷酸序列;和
(b)表达被连接的CBM核苷酸序列生产CBM聚合物。
如上所述,本发明提供的CBM聚合物可包含通过某些形式的接头结构部分连接的CBM单体,所述接头结构部分可以以一种或多种氨基酸的形式存在。虽然包含接头结构部分的氨基酸确切的数目可能会变动,典型地,接头结构部分将包含从1到大约30个氨基酸的任何长度。
生产CBM聚合物的备选手段是通过分子生物技术,将寡聚化结构域与CBM连接。例如,发现于铜绿假单胞菌pseudaminidase中的三聚化结构域(残基335-438,Xu,G,Ryan,C.,Kiefel,M.J.,Wilson,J.C.和Taylor,G.L.(2009)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)386(3),828-840)可以通过接头肽和一个或多个CBM(s)连接。表达单一构建体会产生通过亲和性作用而具有增加的亲和力的三聚体。类似地,来自人血管舒张剂刺激的磷蛋白的四聚化结构域(KuhnelK.,等PNAS2004,101,17027-17032),即一种形成四聚体的卷曲螺旋结构的45-残基肽,可以通过适合的接头,与一个或多个CBM(s)连接,以形成例如通过亲和性作用而具有增加的亲和力的四聚体寡聚体。
本发明的第七个方面提供了筛选或鉴定在治疗疾病和/或病症中潜在有效的CBMs的方法,该方法包括以下步骤:
(i)使CBM或CBM聚合物与细胞在病原体存在的情况下接触,该病原体已知会结合或感染所述细胞;
(ii)鉴定病原体已经结合或病原体已经感染的那些细胞;和
(iii)将结果与没有加入CBM或CBM聚合物的标准或对照测定进行比较;
其中相对于对照测定,病原体已经结合的细胞数目的减少或病原体已经感染的细胞数目的减少,指示CBM或CBM聚合物在治疗由该病原体引起或导致的疾病和/或病症中是潜在有效的。
与CBM/CBM聚合物接触的细胞可以采取在组织培养条件下培养的细胞单层,或获自受试者的活组织检查组织或获自受试者的刮削物(scraping)的形式。另外,细胞可以存在于动物,如啮齿类动物(小鼠,大鼠,豚鼠,兔子等)中。当动物在本发明第七个方面提供的方法中被使用时,可以向所述动物施用待测试的CBM或CBM聚合物并且同时(或之前或之后)感染病原体(例如呼吸道病原体)。此外,标准或对照测定可以采取这样的动物形式,其已经被病原体感染但还未被施用CBM或CBM聚合物。
当使用动物时,为了确定CBM或CBM聚合物在治疗或预防由一种特定的病原体引起或促成的疾病中是否具有潜在有效性,完成由第七个方面提供的方法后,细胞可以从动物中取得并检查病原体是否已经结合所述细胞或感染所述细胞。另外的或作为选择性的,可以观察动物疾病的迹象或症状。当与经历对照或标准方案的动物作比较时,症状严重性的降低可以说明施用于该动物的CBM或CBM聚合物在治疗由该病原体引起或促成的疾病和/或病症中可能是有效的。
除了如上所述,发明人已经发现各种各样本文所述的CBMs和CBM聚合物的差异结合能力可以被利用来提供一些筛选,鉴定,检测,标记糖和/或给糖加标签的手段。
因此,在第八方面,本发明提供了在样品中筛选,鉴定,检测,标记糖和/或给糖加标签的方法,所述方法包含以下步骤:
(a)使样品与本文所述的CBM或CBM聚合物在适合于允许CBM/CBM聚合物与糖结合的条件下接触,所述CBM/CBM聚合物结合所述糖或对其具有亲和力;
(b)去除未结合的CBM或CBM聚合物;和
(c)检测结合的CBM或CBM聚合物。
本领域的技术人员将意识到由于CBMs显示对某些糖类一定程度的特异性,在步骤(c)中检测到的CBM或CBM聚合物将作为所述糖在样品中存在的标示。
必须知道术语“样品”包含生物学样品例如体液(尿液,血液,血浆,血清,汗液,唾液,精液等)和其它来源(如,例如食物,饮料和水源(河流,海洋))的样品。的确,可以使用几乎任何被认为含有糖类并且CBM或CBM聚合物可以加入其中的样品。
在一个实施方案中,样品包括细胞,优选的是哺乳动物细胞,其由组织活组织检查,刮削或分泌而来。用这种方法,本发明的第八方面提供的方法可以用于检测样品中某些细胞的存在。本领域技术人员将容易地意识到因为细胞在它们表面表达一系列的糖类,通过使样品与对已知在某种细胞类型上表达的糖有特异性的CBM接触并检测CBM是否和样品中的任何细胞已经结合,可以在异种的细胞群中识别某些细胞的存在。根据本发明,像FACS这样的技术可以用于鉴定用CBMs或CBM聚合物(任选地被修饰以包括可检测的标签)标记或加标签的细胞。另外,这类技术可用于诊断疾病或其它病症。例如,与已知表达在癌细胞上的糖类结合的或对其具有亲和力的CBMs或CBM聚合物可以用于鉴定或检测样品中癌细胞的存在。
为了去除未结合的CBM或CBM聚合物,由上述步骤(a)产生的样品::CBM/CBM聚合物复合物可以用合适的缓冲液进行一个或多个清洗步骤。
在一个实施方案中,样品可以被固定在一种合适的基底,如例如,塑料,玻璃,琼脂糖,硝酸纤维素,纸等。
本领域的技术人员将意识到由本发明提供的CBMs或CBM聚合物可以再被修饰以包括一种或多种可检测的标签或标记。这样,修饰或缀合CBM或CBM聚合物以包括能够通过比色化学发光反应报告一定水平的酶可以检测出被结合的CBM或CBM聚合物。这样的酶可以包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AlkP)。另外地,或替代性地,本文提供的CBM或CBM聚合物可以缀合于荧光分子,如例如GFP和荧光团,如FITC,罗丹明或德克萨斯红(TexasRed)。其它类型的可以缀合于本文描述的CBM或CBM聚合物的分子可以包括放射性标记的结构部分。
在另一个实施方案中,本发明提供的CBM聚合物或CBMs可以进一步被修饰以包括将被递送到细胞中的例如抗体,小的有机分子,核酸,药物或毒素这样的结构部分。通过识别那些在细胞表面表达的糖,结合一种或多种被识别的糖类或对其有亲和力的CBM或CBM聚合物可以用于把上面列出类型的结构部分递送于那种细胞。
发明的详述
现在将用以下附图作为参考来详细描述本发明,附图显示:
图1:(A)显示侧邻凝集素样糖结合组件(CBMs)的中心催化结构域的霍乱弧菌唾液酸酶示意图。唾液酸识别CBM,CBM40位于图右侧。(B)此研究中构建的构建体的示意图。
图2:在ITC研究中使用的唾液酸糖苷。(A)3’唾液乳糖,(B)6′唾液乳糖,(C)双唾液乳糖(disialylactose)(DSL),(D)双唾液酸-乳-N-四糖(disialyl-lacto-N-tetraose)(DSLNT)。
图3:霍乱弧菌CBM40和3’唾液乳糖复合的晶体结构。(A)配体与CBM相互作用,其中氢键用虚线表示。σ-a加重的Fo-Fc电子密度图谱(sigma-aweightedFo-Fcelectrondensitymap)在3σ作图。(B)晶体结构中不对称单元的三个CBM40组件之间的关系。
图4:等温的滴定量热等温线显示各种配体与分离的CBM40的结合。(A)3′SL,(B)6′SL,(C)DSL,(D)DSLNT。
图5:等温的滴定量热等温线显示3′SL与各种CBM40构建体的结合。(A)2CBM(5),(B)2CBM(10),(C)2CBM(15),(D)3CBM(5),(E)3CBM(10),(F)4CBM(5)。
图6:表面等离子共振(SPR)感应图显示CBM40组件与固定的3′唾液乳糖受体的结合。(A)1CBM,(B)2CBM(5),(C)2CBM(10),(D)2CBM(15),(E)3CBM(5),(F)3CBM(10),(G)4CBM(5)。
图7:由在不同温度的SPR实验得来的Van’tHoff图。
图8:噬菌斑测定显示多价的CBM40多肽能降低流感病毒在体外的结合。
图9:鸡红细胞的血细胞凝集试验,用(a)疫苗X31,单体的和多价的CBM40,和(b)有和没有来自疫苗毒株X31A流感病毒的存在。
图10:哺乳动物MDCK细胞通过3CBM(5),4CBM(5)和CBMTD多肽保护抵抗流感病毒A/Udorn/72(H3N2)。
图11:(A)GFP-3CBM40(0.5mg/ml)与MDCK细胞的细胞表面结合;(B)MDCK细胞与GFP-3CBM40温育,用Udorn病毒感染后72小时的相差显微图片。组(a)只有CBM(0.5mg/ml),(b)-(f)0.5,0.1,0.05,0.01和0.005mg/mlCBM与Udorn病毒存在时,(g)只有Udorn病毒,和(h)未被感染的细胞。
图12:在被A型流感病毒感染的BALB/c小鼠中3CBM40对肺病毒滴度(A),和小鼠体重(B)的影响。被H1N1感染(103病毒pfu)前一天,感染当天或感染后1或3天,小鼠被施用3CBM40(黑色条)或BSA(白色条)。在感染后6天,将数据采集于每组4只小鼠。病毒对照组(第0天)以在条形图中的PBS显示。
材料和方法
重组DNA技术
将编码40CBM家族的霍乱弧菌唾液酸酶/神经氨酸酶(VCNA),残基25-216的DNA片段使用基于表2中列出的序列的寡核苷酸引物对1F和1R从含有nanH基因(16)的构建体pET30b+通过PCR进行扩增。将扩增的573bpDNA片段用NcoI和XhoI进行消化并克隆进入pEHISTEV载体(pET30的改造变体,其具有被烟草蚀斑病毒(TEV)蛋白酶裂解的N-末端6xHis标签)(DrH.Liu,未发表的研究),用相同的酶进行消化并用来转化大肠杆菌DH5a。将构建体,p1CBM用DNA测序证实(UniversityofDundeeSequencingService,UK)。
将编码霍乱弧菌CBM40的DNA片段通过使用不同的引物对在5’-和3’-末端修饰以结合不同的限制性内切核酸酶位点。这样操作以允许DNA片段的个体拷贝连接以产生串联形式的2,3和4个拷贝(图1B)。此外,引物对允许5,10或15个密码子的插入以代表连接个体组件的氨基酸长度。所有这些修饰使用在表2中列出的不同的引物对以及p1CBM作为模板,通过PCR扩增而获得。将产生的片段克隆进经过适当消化的pEHISTEV载体直到预想的组件数量达到为止。将这些进行标记,即p2CBM(5),p2CBM(10),p2CBM(15),p3CBM(5),和p3CBM(10),代表2和3个重复的唾液酸-结合结构域,其接头具有在括弧内所示数量的氨基酸。对于p4CBM(5),将HindIII-EcoRI-修饰过的和EcoRI-XhoI-修饰过的DNA片段先克隆进经合适的酶消化过的pET17b,之后组装成在pEHISTEV中的最终基因。所有的构建体都在大肠杆菌DH5a中增殖。阳性克隆通过DNA测序进行证实,之后将其转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)(1CBM,2CBM(5),3CBM(5),3CBM(10),4CBM(5))和大肠杆菌BL21(DE3)Gold(分别地2CBM(10),和2CBM(15))进行蛋白质生产。
蛋白质生产与纯化
所有构建体的生长和表达如对VCNA(16)所作的描述。简要地,将1L含有30μg/ml卡那霉素的Luria-Bertani肉汤培养基等分部分用单个集落接种并在37℃生长直到培养物的光密度在600nm达到0.4-0.6。细胞在42℃水浴中接受热休克20分钟并用1mMIPTG诱导,之后冷却至25℃,并且在相同的温度被搁置摇动过夜。通过离心(8000xg,4℃)收取细胞,并将沉淀物冷冻于-20℃直到需要使用。
所有的多肽如前所描述(16)通过镍亲和性层析法进行纯化。将样品用SDSPAGE进行分析,将部分纯化的多肽透析进TEV蛋白酶裂解缓冲液(PBS,0.3MNaCl,1mMDTT,0.5mMEDTA,20mM咪唑)并用TEV蛋白酶过夜消化。接着,将每个多肽用PBS,0.3MNaCl,10mM咪唑缓冲液进行进一步透析,之后进行经过镍填充的柱子以去除未消化的加His-标签的多肽的第二轮纯化。在应用前,将未加标签的多肽样品在10mMHEPES缓冲液,pH7.4,0.15MNaCl中大量透析和浓缩
结晶化和结构确定
将单个的霍乱弧菌CBM40的晶体在作为沉淀剂的0.1MMOPSpH6.5,1.1M硫酸锂,0.6M硫酸铵中,用就座点滴法(sittingdropmethod)获得。通过把晶体先转入10%(v/v)甘油沉淀剂混合物中接着置于20%(v/v)甘油-沉淀剂中进行晶体低温保护。在ESRF的光束线(beamline)BM-14上收集延伸到的衍射数据。将结构用分子转换程序(molecularreplacementprogram)PHASER(18)进行解析,在不对称单元中发现有三个CBM40单体。提纯(refinement)通过使用具有用于建立模型的COOT(20)的REFMAC(19)来进行。数据收集和提纯统计信息在表3中显示。
等温的滴定量热法(ITC)
ITC实验用1.4ml细胞体积在MicrocalInc.(Northampton,MA)的VP-ITC微热量计(microcalorimeter)上操作。除非另作说明,所有的ITC滴定在25℃,在含有0.15MNaCl的10mMHEPES缓冲液pH7.4中进行。为了表征分离出的CBM40(1CBM),使用以下的配体:从DextraLabs(Reading,UK)购买的3′唾液乳糖(3′SL),6′唾液乳糖,(6′SL),和双唾液酸-乳-N-四糖(DSLNT),和从Sigma-Aldrich,UK购买的双唾液乳糖(DSL)(图2)。将冻干的唾液酸糖苷配体在脱气的,用于肽构建体透析的过滤的缓冲液中再次悬浮。对于其它的所有多肽构建体,将3′唾液乳糖在全程作为配体使用。分别用对1CBM(38410M-1cm-1),2CBM构建体(75860M-1cm-1),3CBM构建体(113790M-1cm-1)和4CBM(5)(151720M-1cm-1)计算出的摩尔消光系数在A280确定蛋白质浓度。CBM40多肽的浓度为0.007-0.084mM,并且唾液酸糖苷的浓度为0.45-2.14mM。将唾液酸糖苷的等分试样(10μl,除非另作说明)滴定进每种多肽溶液。将稀释液的热量从结合等温数据减去,之后将数据使用来自MicroCalOrigin软件的单结合位点模型,通过非线性回归分析进行拟合。
表面等离子共振(SPR)
结合动力学由SPR通过使用BIACORE3000生物传感仪器(GEBiosystems)进行确定。在使用之前,使链霉抗生物素蛋白(SA)包被的生物传感器芯片进入仪器中并用3次连续1分钟注射50mMNaOH中的1MNaCl预调节。在将生物素化的3′唾液乳糖-PAA(Glycotech)在HBS-P(10mMHEPESpH7.4,0.15MNaCl和0.005%表面活性剂P20)中稀释到1μg/ml之后,将其注射在芯片中4个流动细胞(flowcell)的3个上。针对每种细胞的配体,典型的固定水平大约为500RU。还制备用来减少体效应(bulkeffect)和与链霉抗生物素蛋白的非特异性相互作用的参考表面。运行缓冲液由10mMHEPESpH7.4组成,流速为100μl/min。
每种肽构建体和固定的3′唾液乳糖的相互作用分析在运行缓冲液中,在15,25和35℃进行。将纯化的肽构建体稀释到HBS-P中以产生一系列浓度:对于1CBM,0.625μM,1.25μM2.5μM,5μM,10μM;对于2CBM构建体20nM,125nM,250nM,500nM和1000nM;对于3CBM构建体1nM,5nM,20nM,62.5nM和125nM,并且对于4CBM0.18nM,0.5nM,1.6nM5nM和15nM。将所有分析物以30μl/min注射在流动细胞表面。分析物从表面的解离在3-5分钟内在相同流速的运行缓冲液中实现。以30μl/min,两次进行10mM甘氨酸-HClpH2.5的连续30秒注射来再生表面。将通过平衡解离常数(KD)所述的亲和力,通过用BIAevaluation软件(BIAcore),设定Langmuir(1∶1)结合,拟合于动力学同步ka/kd模型而全面进行确定。
不同的CBM多肽构建体与生物素酰化的3′唾液乳糖-PAA相互作用的自由能变化通过使用由对于每一温度的动力学速率常数的比率提供的平衡解离常数来确定。lnKD相对于1/T的van’tHoff图从斜率产生关于ΔH/R的值并从y截距产生关于-ΔS/R的值。
噬菌斑测定
将病毒噬菌斑测定用来证实在A型流感病毒存在时,多价的CBM40多肽结合的效果。在6-孔板内的汇合(106细胞)MDCK单层用无血清的DMEM清洗两遍,用1ml2CBM40或3CBM40溶液(10mg/ml,10-倍系列稀释于无血清的DMEM中),在37℃(+5%CO2)温育1小时。无血清的DMEM单独用于平行的“模拟”温育。CBM40试剂随后被去除,并且单层细胞用~80PFU的A型流感病毒/Udorn/72[H3N2]在37℃(+5%CO2)接种1小时。在病毒吸附后,去除接种物,用补充有2μg/ml胰蛋白酶和1%(w/v)琼脂糖的DMEM中的10mMHEPES(pH7.4)覆盖于细胞上。将倒置的平板在37℃(+5%CO2)温育2-3天。噬菌斑通过把单层细胞固定在5%甲醛中和用0.1%结晶紫着色而被显现。
血细胞凝集测定
将鸡红细胞在Alsever’s溶液中离心并用PBS至少清洗4次。细胞最后在1%(v/v)PBS中再次悬浮。将疫苗毒株X31(具有细胞表面HongKong/68HA和NA)用在PBS中的1∶4000贮存液的2-倍系列稀释物滴定在96-孔板内,其中已经添加了等体积的红细胞。将板在室温温育至少30分钟。将终点计算为观察到血细胞凝集反应的最低病毒浓度。将CBMs适当稀释并滴定进已被加入相同体积细胞的PBS中。还计算了CBM与细胞结合的终点。随后进行实验以确定当与鸡RBCs温育时固定浓度的1CBM与滴定病毒相对于只有病毒的效果
用寡聚化结构域研发CBM.TD
将包含1CBM40的pEHISTEV构建体,p1CBM进行修饰以在C-末端包含寡聚化结构域从而当在大肠杆菌中表达时,允许多肽自组装成寡聚体结构。为此,使用来自铜绿假单胞菌pseudominidase的三聚化结构域(Xu等,2009)。将编码残基333-440的DNA片段使用含有BamHI和XhoI的引物通过PCR进行扩增,并将其连接于之前被同样的酶消化过的p1CNM。将其随后用与所有其他CBM40构建体生长和表达相似的条件转化进大肠杆菌BL21(DE3)Gold细胞中。寡聚体的纯化使用镍亲和力和TEV蛋白酶水解进行,并且在凝胶过滤后显示大约为100kDa的分子量(数据未显示)。
研发GFP-3CBM40以监测细胞表面被CBM40结合的唾液酸
为构建GFP-融合的3CBM40片段,将3CBM40片段从p3CBM(5)用NcoI-XhoI消化,并插入类似地消化过的pEHISTEV载体,其包含这样的基因,所述基因编码在N-末端His标签下游的增强的绿色荧光蛋白(eGFP)(Liu等2009;Connaris等,2009)。针对MDCK细胞测试这个构建体以确定CBM40是否与细胞表面的唾液酸结合。为此,将96-孔板中的MDCK细胞的汇合单层在37℃与不同浓度的GFP-3CBM温育1小时,之后加入流感毒株A/Udorn/72(H3N2)病毒(moi=0.002)在相同温度进一步温育1小时。去除混合物并加入不含FCS的DMEM,将板温育72小时。
小鼠研究:剂量寻找实验
为了评估CBM多肽作为抵抗流感病毒的抗病毒剂的预防性/治疗性潜力,进行初步研究以确定CBM40在小鼠中施用所需要的剂量。这些研究在爱丁堡传染病中心的用于流感研究的动物试验装置中进行。为此,根据最初用于体外寻找的剂量,将5-6周的BALB/c小鼠用于剂量寻找实验以测试不利的反应。将小鼠用在40μlPBS中50μg和40μlPBS中500μg的3CBM40多肽经鼻内给药。将PBS和BSA作为对照。从第2天开始,小鼠每天被监测临床迹象和测体重。在第5天小鼠被处死(cull)(除了两个被施用500μg的小鼠,其等到14天处死)。
CBM40抗A型流感病毒的效果
为了评估CBM40抵抗A型流感病毒/WSN/33(H1N1)的预防性和治疗性效果,在用3CBM40和病毒处理前,用氟烷氧混合物对BALB/c小鼠轻度麻醉。用于实验的CBM40剂量为在PBS(40μl)中500μg的3CBM40,其经鼻内只一次递送。BSA和PBS用来作为对照。从鼻内感染103A/WSN/33pfu的前1天或当天,或之后+1或+3天开始,小鼠用CBM40或安慰剂治疗。每组的病毒滴度在感染后6天被确定,在此情况下,小鼠被处死,肺在PBS中进行匀浆化以提取病毒用于噬菌斑测定。被处死的小鼠体重也进行测量以确定体重减少。
结果
分离的CBM40组件的结构
将编码从霍乱弧菌唾液酸酶而来的唾液酸结合组件CBM40的基因片段亚克隆进pEHISTEV并在大肠杆菌中表达以产生继而被纯化用于结合和结构研究的1CBM。起初,1CBM尽管表达水平很高却不溶解,但是在对数生长期过程中把培养物在42℃热休克提高了这种CBM的可溶性以致于持续性地生产达到每升50-70毫克数量。霍乱弧菌CBM40的晶体在3′唾液乳糖的存在下生长。不对称单元包含三个CBM40单体,每个单体对配体的所有三个糖结构部分有明显的电子密度(图3A)。只有唾液酸和所述蛋白质产生相互作用,并且这些相互作用与那些由仅与完整的霍乱弧菌唾液酸酶复合的唾液酸产生的相互作用是相同的。在晶体的不对称单元中有三种CBM40组件,其中单体A和B包埋大约的界面(图3B)。
唾液酸糖苷的确定和霍乱弧菌CBM40的连接特异性
研究用1CBM进行以确定它对不同的单价-和双价-唾液酸糖苷的特异性。应用ITC,对每种相互作用直接测量结合常数Ka及焓(ΔH)和熵(ΔS)的变化,化学计量法(n,结合位点的数量)用数据对以上所描述的单位点结合模型(one-sitebindingmodel)的非线性最小二乘方拟合来确定。从稀释物校正的结合等温线的热量得到的数据证实1CBM对于α-唾液酸的偏好(图4),显示对α(2,3),α(2,6)和α(2,8)-连接的唾液酸糖苷广度的结合特异性。所有被测试的唾液酸糖苷展示相似的亲和力,其解离常数Kd范围在10-19μM之间(在25℃)(表4,图4)。双唾液酸糖苷,DSLNT和DSL与单价的配体相比对唾液酸显示1.5-2倍更高的亲和力。与DSL(-12.5kcal/mol)相比,DSLNT显示出更大的焓变化,具有ΔH值为-24kcal/mol。当对于结合DSLNT和DSL比较化学计量法时,观察到相应的n值为0.57和0.92,说明对于DSLNT,需要有两个1CBM的分子与DSLNT的一个分子结合,而对于DSL,是1∶1的相互作用。这里的差别不仅是由于存在的唾液酸结构部分的数量,还由于它们在唾液酸糖苷内的位置所导致。结构上,DSLNT是分支双价唾液酸糖苷,不像DSL具有两个以线性方式连接在一起的唾液酸结构部分,以致只有末端唾液酸结构部分被识别(图2)。这样的结果说明了DSLNT的ΔH值大约为3′唾液乳糖,6′唾液乳糖和DSL各自结合焓的总和,其具有一个化学计量法。
多价的唾液酸特异性CBM40多肽的改造
我们想研究如果相同拷贝的1CBM连接在一起以产生一种多价的种类,唾液酸结合是否会发生。为此,编码CBM40的基因拷贝用DNA接头(显示至多15个氨基酸)联接在一起以产生2,3,和4个组件串联的多肽,其分别被指定为2CBM(5),2CBM(10),2CBM(15),3CBM(5),3CBM(10)和4CBM(5)(括弧内的数字指示接头氨基酸的数量)(图1B)。这些基因构建体的表达在大肠杆菌中进行并且全都显示不可溶性直到培养物像针对分离的1CBM接受热休克处理。用镍亲和力层析法纯化后,对所有肽构建体的SDSPAGE分析显示单体的分子量对于1CBM,2CBM,3CBM和4CBM构建体分别为~21kDa,~42kDa,~63kDa和~85kDa(数据未显示)。
具有单价3′唾液乳糖的各种改造的CBM40多肽的结合等温线在图5中显示。使用ITC,显示了这种唾液酸糖苷与设计的CBM40多肽的结合是焓驱动的,具有在25℃从-12.3至-16.3kcal/mol的非常相似的范围的ΔH值(表5)。在对每一个多肽相互作用测得的所有其它的热动力参数中同样存在非常小的差异。实际上,多价CBM40对唾液酸的结合亲和力显现出与1CBM的非常相似。此外,从热动力学角度讲,组件间接头的长度没有显示出对这种相互作用的贡献是显著的(表5)。根据单位点结合模型,n值显示了每个CBM40多肽与3′唾液乳糖的相互作用的适当数量的位点。当我们增加被连接的组件数量,亲和力没有被观察到显著增加的事实提示了唾液酸-多价多肽的相互作用相似于单价-单体多肽的相互作用,说明了一种简单的双分子缔合。
多价CBM40多肽对多价3’唾液乳糖增强的结合亲和力
为了测试对于唾液酸的亲和性作用是否可以用多价的CBM40多肽来取得,用固定在链霉抗生物素蛋白芯片上的生物素酰化的3′唾液乳糖来进行表面等离子共振(SPR)。对所有注射在固定的3′唾液乳糖上的CBM40多肽的传感图在图6中显示。对每一种CBM40-3′SL的相互作用的亲和力,在此描述为平衡解离常数Kd,通过设定Langmuir1∶1结合,用从缔合/解离速率常数比率(ka/kd)得出的整体拟合模型来确定(表6)。当组件数量增加时,观察到对唾液酸亲和力的增加。对1CBM-3′SL在25℃的相互作用,和与其通过ITC测量的相应的单体的-单价相互作用(Kd~1。8μM)相比,结合力(Kd~18μM)有10-倍的增加。当组件数量增加到两个,观察到增加了的亲和力,在该情况下,有大约400-500-倍结合的增加,导致在25℃时亲和力在38-45nM之间(表6)。在这种情况下,接头长度表现出少量影响亲和性,因为当从5至15增加氨基酸数量时,只观察到1.2-倍亲和力的增加。关于3和4个CBM40组件,有进一步的10至20-倍对唾液酸亲和力的增强,在25℃对于5aa-,和10aa-连接的3CBM组件,达到的亲和力大约为4nM,对于4CBM组件,亲和力达到2.6nM。当在15℃结合多价的3′SL时,最高亲和力为4CBM(5),其具有Kd~861pM。因此,看来7000-10000-倍亲和力的增加可以通过从单价-单体的相互作用变为多价的相互作用而达到,这取决于相互作用的温度。对从在15,25和35℃测得的每一种CBM40多肽-唾液酸相互作用van’tHoff图得到的数据(图7,表7)显示了对于1CBM,ΔG值为-7.8kcal/mol,对于2CBM,ΔG值大约为-10kcal/mol,对于3CBM,ΔG值为11.3kcal/mol和对于4CBM,ΔG值为-12kcal/mol。1CBM和2CBM间ΔG值的巨大差别同样体现在相互作用的焓和熵的变化。在所有CBM40多肽中,2CBM多肽给予ΔG值为大约-20kcal/mol的最大焓变化,这样弥补了大量不利的熵的影响(表7)。这种在1CBM和2CBM相互作用的能量学中的巨大差别同样显示在与1CBM,3CBM和4CBM多肽相比,2CBM对唾液酸亲和力的增加中,这提示了配体-受体相互作用的协同性。
与此相对,3CBM多肽显示微小的有利的熵增加,但是由于更大地有利的焓损失,相互作用的自由能变化仍然呈很强地负性(表7)。有趣的是,与1CBM和2CBM多肽相比,3CBM和4CBM多肽对于关于配体结合的ΔH和TΔS都显示更少的负性贡献,尽管事实上相互作用自由能随着组件数量的增加而增加,这可能对亲和力的增加有贡献。这些观察可基于很多因素如由于组件的构象排列,配体结合位点的可及性,结合方式例如分子内和分子间的结合,及组件的内部结构包装,相互作用对接头的柔性是敏感的。接头长度在3CBM多肽间的影响,在结合能量和亲和力方面是微不足道的,这类似于不同的2CBM多肽。由于用4CBM(5)在25℃没有获得相应的亲和力增加,已经决定多肽的进一步设计不再进行。
血细胞凝集测定
为了测试单体的和多价的CBM40是否结合红细胞和阻止流感病毒的结合,初期的实验用滴定的CBMs,和滴定的病毒,疫苗毒株X31针对红细胞进行。初步结果显示:在1CBM40的情况下,没有看见凝集反应,并且当这种CBM是单体时,预期它和细胞表面的唾液酸以单价的方式结合,即1∶1缔合(图9a)。至于多价的CBM40s,2和3CBMs都和红细胞凝集,就像疫苗X31一样(图9a)。另外,多价的CBM与红细胞凝集必需的终点浓度,3CBM40和2CBM相比更低(分别为0.122μM和0.48μM),提示重复的组件数量增加增加了它们与唾液酸的结合亲和力。然而,由于多价的CBMs和红细胞凝集,我们决定将滴定的疫苗和固定浓度(71.25μM)的1CBM的混合物与仅疫苗对比测试来观察血细胞凝集反应。如图9b所见,当和模拟细胞(只有病毒)相比时,当用疫苗攻击时,1CBM的存在阻止了病毒的结合。当板被置放于4℃2.5天,在1CBM和病毒的存在下,没有观察到血细胞凝集反应,提示了这种CBM40阻断竞争性分子结合的有效性。
噬菌斑测定
噬菌斑测定的初步结果提供强有力的证据启示10mg/ml3CBM(5)的1/100稀释物相比于相同稀释浓度的2CBM(10)更有效地阻断病毒进入细胞(见图8)。特别是,在MDCK细胞与不同的CBM重复片段温育后,可以看见噬菌斑在数量上有不同,当与模拟细胞相比和当H3N2存在下应用3CBM(5)时,出现非常少的噬菌斑。
对于3CBM(5)(1/100稀释物),有80-85%H3N2病毒噬斑形成单位的减少。对于2CBM(10)结果,虽然对于病毒阻断有作用,相同浓度的相同稀释物不具有与3CBM(5)相同的效果。像这样,显示了CBM组件数量的增加对有效地阻断病毒与细胞表面的唾液酸结合是重要的。
噬菌斑研究(用CBMTD)
病毒感染的MDCK细胞:--流感毒株A/Udorn/72(H3N2)病毒用CBM40多肽阻断。图10显示多肽3CBM40,4CBM40和CBMTD对MDCK细胞抵抗Udorn病毒的细胞保护作用。当连接的CBM40s数量从3增加到4CBM40时,有显示具有增加的CBM抑制流感毒株的潜力。此外,把MDCK细胞和寡聚体CBM.TD温育,之后加入病毒,与病毒对照相比,显示出在0.5mg/mlCBM有效的抑制和在0.1mg/mlCBM显著减少噬菌斑的数量(图10)。这些数据表明霍乱弧菌唾液酸酶CBM40,无论是串联式连接或作为自组装的具有至4个重复结构域的寡聚体,可以有效地保护MDCK细胞免受来自病毒的感染。
监测细胞表面被CBM40结合的唾液酸
图11a显示加入病毒后1小时GFP-3CBM40与MDCK细胞的细胞表面的结合。图11b显示即使在感染后72小时后,当与只有病毒的孔相比,GFP-3CBM40确实赋予针对病毒感染的某些保护。组(a)还表明加入MDCK细胞的CBM(0.5mg/ml),在没有病毒存在下,因为观察到细胞存活而显示72小时后无毒性作用,并与没有被感染的对照[组(h)]相比具有相似的形态学。
小鼠研究(剂量寻找实验)
表1显示研究开始和结束时小鼠体重的结果。从临床观察,小鼠都显示非常健康,在指定的第5天和第14天时间期间它们都增加了体重,并且没有对3CBM40有不利反应。进一步的研究,从抗体反应和肺组织组织学方面说来,还仍然得进行。
CBM40抗A型流感病毒的效果
初步结果启示在WSN病毒攻击前1天施用3CBM40显示显著降低病毒感染小鼠的效果,证明CBM40作为抗A型流感病毒的预防剂是有效的。在感染后第6天被处死的小鼠中,与BSA和PBS对照组相比,病毒滴度的降低是明显的,在该情况下,从103病毒pfu的初始剂量起测得只有1.5对数(log)滴度的增加(图12A)。在这组中的小鼠也获得体重增加并显示对来自病毒的攻击无不利作用(图12B)。当3CBM40与病毒同时施用(第0天),感染后6天观察到病毒的2.4-对数增加并体重增加超过100%,说明尽管病毒滴度增加,小鼠耐受病毒感染。然而,当在病毒感染后1天和3天施用CBM40时,小鼠显示体重降低和与初始负荷相比病毒滴度增加3至3.25对数,启示了CBM40当作为治疗剂给予时,至少在所述方法描述的条件下,可能不是有效的。进一步的研究,包含在感染过程中每日给药,而不是一次性给药,和优化施用途径可以确定CBM40是否可以考虑作为治疗性抗病毒剂,特别是在流感病毒感染的早期作为治疗性抗病毒剂。作为预防剂,这种蛋白质生物可以通过鼻内递送以保护呼吸道上皮黏膜免受来自病毒的攻击。
讨论
我们已经显示从霍乱弧菌唾液酸酶而来的唾液酸特异性的CBM可以成功地从它们的母体酶中分离出并被利用来产生与唾液酸以高亲和力结合的多价多肽。应用ITC和SPR组合,我们还显示了单价和多价形式的霍乱弧菌CBM40与唾液酸结合的热动力学,其呈现出受焓驱动的单价-和双价形式,正如目前很多的CBM-糖的相互作用(Boraston等2004,等),但当被引入多价表面时,连接的组件数量大于2时受熵驱动。
至于它们的配体和连接特异性,分离出的CBM40倾向于与α(2,3),α(2,6)和α(2,8)-连接的唾液酸以微摩尔亲和力结合。这种结合亲和力和被报道的霍乱弧菌唾液酸酶与非—可水解性的硫代唾液酸糖苷(thiosialoside)相互作用相似(16)。在不同连接的唾液酸糖苷之间存在少许区别的事实可以在与3′唾液乳糖CBM40复合的晶体结构中观察到。结构显示和唾液酸分子间相互作用的广泛的网络。半乳糖和葡萄糖结构部分不与蛋白质结构域相互作用,这被反映在本文观察到的与不同连接唾液酸糖苷有相似的Kd值和与结合自由能。
通过利用霍乱弧菌CBM40对唾液酸相对高的单价亲和力,我们已经成功的改造串联式连接的重复多肽至n=4,当与多价的表面相互作用时获得次纳摩尔级亲和性。这可能是第一个报导通过使用不同长度的接头肽融合相同拷贝可以操作CBM。之前有过报导应用分离的CBMs作为分子探针用于植物细胞壁聚合物的分析(21)和研究在多组件糖苷水解酶中自然发现的CBMs,其已经被分离作为单独的组件或作为与它们邻近的组件组合以确定它们的功能(14,17,22)。
我们想探索与它们的受体多价的相互作用的热动力学以确定构象的限制是否将阻止这些改造的多肽结合。众所周知,蛋白质亚单位间的接头长度可能影响相互作用的热动力学,并且在很多情况下,共价键连接的亚单位,通过降低用以解离的熵驱动力,可能提高相互作用中寡聚体的稳定性(23)。我们改造了范围从5个氨基酸至15个氨基酸的CBM组件间柔性肽接头以确定接头的长度是否将显著提高改造的CBM多肽针对唾液酸的亲和力。在2-串联连接的CBMs情况下,尽管在不同的2CBM构建体中观察到1.5-2-倍对唾液酸亲和力的增加,增加肽接头至10个氨基酸产生在构象上熵的显著的降低。这暗示了当两个CBMs连接在一起时,组件某种程度上的柔性已经产生。当与1CBM-多价3SL相互作用比较时,2CBMs和唾液酸结合的相互作用也显示结合焓的增加,这弥补了大量不利的熵的影响,导致了结合的自由能增加和对唾液酸亲和力的增加。这表明2CBM和唾液酸的结合是非常稳定的,分子内相互作用如关于1CBM,是焓驱使的。然而,对于3CBMs和固定的多价3SL相互作用,在不同长度的肽中没有显著的差别。事实上,由不同的3CBM-唾液酸相互作用的van’tHoff图导出的熵数据都显示了熵的增加。此外,当从2CBMs到3CBMs时,观察到结合焓显著降低,并且观察到10倍亲和力的提高。很有可能在3CBM和唾液酸结合的情况下,观察到的增加的亲和力由可能形成的存在于SPR芯片表面的稳定聚集物导致,并且焓的较大变化可能由于结构上有序的水分子受紧密的蛋白质-蛋白质包装的影响从水化层释放所导致。这可以从1CBM-3SL复合物的结构观察到,其中三个1CBM单体紧密叠集在一起(图3B)。熵-驱动的相互作用特别是在当分子间结合发生,导致聚集物形成时在其它多价的蛋白质-糖系统中观察到(24)(25),(26)。有趣的是,增加连接组件至4显示了对于3CBMs较少有利的熵供量和有利的结合焓,尽管这略微少于1CBM和固定的3’SL相互作用中的结合焓。结合的自由能稍微高于其它所有的CBMs,这与从3至4CBM略微增加的亲和力相对应。很可能改造的串联式连接的多肽的价在寡聚体的稳定化和它们的相互作用中可具有重要作用。Poon(20)描述了增加串联式连接的单个多肽链的价,这可以导致束缚(tethered)的寡聚体的分子数(molecularity)的相应性减少,这从热动力学角度来讲,变得更稳定。实际上,Poon声明高于寡聚体的分子数的价的串联,或不能被寡聚体的分子数除尽的价的串联将导致交联的寡聚体。因此,对于四聚体的寡聚体,例如在4CBM的情况下,串联的二聚体或四聚体是理想化的,而三聚体或五聚体的寡聚体需要相同的各个价的串联。
这些研究表明CBM40可以被分离和用融合它的相同拷贝操纵以通过亲和性来提高它对唾液酸的亲和力。此外,我们已经显示单体和由霍乱弧菌唾液酸酶改造而来的多聚体CBM40可以用来作为潜在的抗病毒剂抵抗A型流感病毒。利用这类技术,因而有可能使其它的CBMs可以被分离出来并改造成作为高亲和力的工具用作多糖的筛选和概况分析。另外,确定在和它的多糖复合物中的CBM结构能帮助用于糖组学领域中选择性试剂的研发。
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表1.在BALB/c小鼠中施用3CBM40的剂量查找实验。
小鼠数量 | 笼/组 | 剂量 | 第0天体重 | 死亡体重 |
89 | 5dys | 50ug 3CBM | 17.1 | 17.5 |
90 | 5dys | 50ug 3CBM | 15.05 | 15.5 |
91 | 5dys | PBS | 12.5 | 13.1 |
92 | 5dys | PBS | 14.7 | 15.4 |
93 | 5dys | 500ug 3CBM | 15.45 | 16.70 |
94 | 14dys | 500ug 3CBM | 14.6 | 18.3 |
95 | 14dys | 500ug 3CBM | 14 | 18.1 |
96 | 5dys | 500ug 3CBM | 14.75 | 16.05 |
97 | 5dys | 500ug BSA | 14.8 | 15.4 |
98 | 5dys | 500ug BSA | 13.4 | 14 |
99 | Tkip | 16.4 | 16.60 | |
100 | Tkip | 16.05 | 17.2 | |
101 | Tkip | 16.45 | 18.6 | |
102 | Tkip | 15 | 18.1 | |
103 | 0.5%DMSO | 17.15 | 18.25 | |
104 | 0.5%DMSO | 14.85 | 16.8 |
表2.用于扩增DNA片段的寡核苷酸引物。
表3.X-射线数据收集和提炼统计信息。括号内的数字涉及最高分辨率命令解析器(resolutionshell)。
Rmerge=∑hkl∑i|Ihkl,i-<Ihkl>|/∑hkl<Ihkl>Rcryst和Rfree=(∑||Fo|-|Fc||)/(∑|Fo|)
表4.从霍乱弧菌唾液酸酶中被分离出的CBM40和不同连接的唾液酸糖苷相互作用的热力学参数。
表5.CBM40肽和3′唾液乳糖结合的ITC结果(一式二份的实验测量)。
表6.对于不同CBM多肽和多价3′唾液乳糖(n=3次测定)相互作用的Biacore动力学参数。
表7.从van’tHoff图推导出的设计的唾液酸结合肽组件和多价3’唾液乳糖-PAA-生物素相互作用的热动力学参数。
Claims (11)
1.40家族糖结合分子(CBM40)用于制备用于治疗或预防由病毒呼吸道病原体和/或细菌病原体导致的疾病和/或病症的药物中的应用,所述病原体利用细胞表面糖的存在作为结合/粘附和/或进入细胞的手段,其中所述CBM40对细胞表面糖类显示出亲和力并且预防所述病原体建群和/或进入细胞。
2.根据权利要求1所述的应用,其中所述病毒呼吸道病原体属于正粘病毒科或副粘病毒科家族。
3.根据权利要求1所述的应用,其中所述细菌病原体是链球菌属(Streptoccus)的细菌,流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)或铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。
4.根据权利要求1所述的应用,所述应用用于治疗和/或预防流行性感冒、哮吼、肺炎和/或支气管炎。
5.根据权利要求1所述的应用,其中所述CBM40对唾液酸显示亲和力或与唾液酸结合。
6.根据权利要求1所述的应用,其中所述CBM40来源于霍乱弧菌(Vibriocholerae)或产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)。
7.根据权利要求1所述的应用,其中所述CBM40是包括两个或多个CBM40单体的多价CBM40。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的应用,其中所述CBM40或多价CBM40被修饰以包括将被递送至细胞中的结构部分。
9.一种CBM40聚合物,其包含两个或多个CBM40分子,其中所述CBM40聚合物与一种或多种细胞表面糖类结合或对一种或多种细胞表面糖类具有亲和力。
10.一种药物组合物,其包含权利要求9所述的CBM40聚合物和药用赋形剂。
11.权利要求10所述的药物组合物,其被配制用于口服、肠胃外或局部的施用。
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