CN102172225A - 斑马鱼行为诱发和分析方法及其系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种斑马鱼行为诱发和分析方法及其系统。该系统包括视觉刺激装置、摄像头以及分析系统。视觉刺激装置至少能够诱发斑马鱼的眼动反应、视动反应行为。摄像头用以拍摄斑马鱼的行为，以获得视频数据。分析系统输入所述视频数据进行行为学分析，以获得斑马鱼的眼动反应和视动反应行为学数据。本发明可用于成年斑马鱼的眼动反应、视动反应分析，以及幼年斑马鱼的眼动反应分析。

Description

斑马鱼行为诱发和分析方法及其系统

技术领域

本发明涉及一种模式生物斑马鱼行为诱发和分析方法，尤其实施这一方法的诱发和分析系统。

背景技术

模式生物斑马鱼在生命科学领域广泛应用于肿瘤、造血系统疾病、心血管疾病、眼科疾病、肾病疾病、骨骼相关疾病、癫痫、神经系统等各项研究。斑马鱼行为学分析是一项重要的研究手段，但目前已有的行为系统不能用于成年斑马鱼OKR(optokinetic response，眼动反应)、OMR(optomotor response，视动反应)等行为的诱发和分析。

发明内容

本发明的目的是提出一种斑马鱼行为诱发和分析方法及其系统，能够进行成年斑马鱼的OKR分析。

本发明提出一种斑马鱼行为学诱发和分析系统，包括视觉刺激装置、摄像头以及分析系统。视觉刺激装置至少能够诱发斑马鱼的眼动反应、视动反应行为。摄像头用以拍摄斑马鱼的行为，以获得视频数据。分析系统输入所述视频数据进行行为学分析，以获得斑马鱼的眼动反应和视动反应行为学数据。

在本发明的一实施例中，所述视觉刺激装置是机械式视觉刺激装置，其包括电机、传动装置、光栅、以及灯管，所述电机用于产生旋转动力，所述传动装置用于把电机的转动传递至光栅以带动光栅转动，所述灯管用于照亮光栅产生视觉图像。

在本发明的一实施例中，所述视觉刺激装置是弧形屏刺激器，其包括容纳斑马鱼的容器和包围该容器的弧形屏显示器，该弧形屏显示器产生图像，作为斑马鱼的视觉刺激。

在本发明的一实施例中，所述分析系统是基于预设的一个或多个模板对选定的视频图像的一个或多个感兴趣区域进行模板匹配，以跟踪获取斑马鱼眼动反应行为的眼动角度数据。

在本发明的一实施例中，所述分析系统是从视频图像中扣除背景再剪切出选定的感兴趣区域并通过二值化分离出目标，以跟踪获取斑马鱼视动反应行为的角度数据。

本发明另提出一种斑马鱼行为学诱发和分析方法，适用于成年斑马鱼眼动反应分析，该方法包括以下步骤：

麻醉成年斑马鱼后固定其位置，不让其游动；

成年斑马鱼清醒后，对成年斑马鱼进行视觉刺激；

拍摄成年斑马鱼眼动反应行为视频；

对所述视频进行分析，其包括以下步骤：

设置左眼、右眼、中心三个模板；

对所述视频中的至少部分图像，设置与该左眼、右眼、和中心模板对应的感兴趣区域；

使用模板匹配算法获得左眼、右眼和中心的坐标和角度；以及

对斑马鱼左眼、右眼和中心的运动参数进行统计，获得成年斑马鱼眼动反应的运动统计数据。

本发明还提出一种斑马鱼行为学诱发和分析方法，适用于幼年斑马鱼眼动反应分析，该方法包括以下步骤：

固定幼年斑马鱼的位置；

对幼年斑马鱼进行视觉刺激；

拍摄幼年斑马鱼眼动反应行为视频；

对所述视频进行分析，其包括以下步骤：

从所述视频的至少部分图像中选取局部图像作为参考中心，设置幼年斑马鱼的中心模板；

通过模板匹配算法获得该参考中心的坐标和角度；

对所述视频中的至少部分图像，选取幼年斑马鱼头部作为感兴趣区域，提取该感兴趣区域；

对提取的感兴趣区域进行二值化处理；以及

分析经过二值化处理的感兴趣区域，获取幼年斑马鱼左、右眼球对应的坐标和角度。

从另一角度看，本发明提出一种斑马鱼行为学分析系统，适用于成年斑马鱼眼动反应分析，该系统包括：

用于设置左眼、右眼、中心三个模板的装置；

用于对所述视频中的至少部分图像，设置与该左眼、右眼、和中心模板对应的感兴趣区域的装置；

用于使用模板匹配算法获得左眼、右眼和中心的坐标和角度的装置；以及

用于对斑马鱼左眼、右眼和中心的运动参数进行统计，以获得成年斑马鱼眼动反应的运动统计数据的装置。

从另一角度看，本发明还提出一种斑马鱼行为学分析系统，适用于幼年斑马鱼眼动反应分析，该系统包括：

用于从所述视频的至少部分图像中选取局部图像作为参考中心，设置幼年斑马鱼的中心模板的装置；

用于通过模板匹配算法获得该参考中心的坐标和角度的装置；

用于对所述视频中的至少部分图像，选取幼年斑马鱼头部作为感兴趣区域，且提取该感兴趣区域的装置；

用于对提取的感兴趣区域进行二值化处理的装置；以及

用于分析经过二值化处理的感兴趣区域，获取幼年斑马鱼左、右眼球对应的坐标和角度的装置。

本发明由于采用以上技术方案，使得能够对成年斑马鱼和幼年斑马鱼进行眼动反应分析。进一步，还能够对成年斑马鱼进行视动反应分析，且对幼年斑马鱼进行多点跟踪。

附图说明

图1示出本发明一实施例的行为诱发和分析系统示意图。

图2示出本发明一实施例的视觉刺激装置示意图。

图3示出图2所示装置的控制电路图。

图4示出本发明另一实施例的视觉刺激装置示意图。

图5示出图4所示装置的驱动电路图。

图6示出本发明一实施例的行为学分析系统架构。

图7示出本发明一实施例的成年斑马鱼OKR分析原理。

图8示出本发明一实施例的成年斑马鱼OKR分析流程图。

图9示出本发明一实施例的成年斑马鱼OKR分析界面。

图10示出本发明一实施例的成年斑马鱼OMR分析流程图。

图11示出本发明一实施例的成年斑马鱼OMR分析界面。

图12示出本发明一实施例的幼年斑马鱼OKR分析原理。

图13示出本发明一实施例的幼年斑马鱼OKR分析流程图。

图14示出本发明一实施例的幼年斑马鱼OKR分析界面。

具体实施方式

为让本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，以下结合附图对本发明的具体实施方式作详细说明。

图1示出本发明一实施例的行为诱发和分析系统示意图。参照图1所示，斑马鱼行为学系统1000包括：视觉刺激装置100、摄像头200、数据采集单元300及分析系统400。

视觉刺激装置100用于给斑马鱼运动的光栅图像刺激，形成特定的斑马鱼行为。视觉刺激装置的不同实施例将在后文参照图2-5来描述。

摄像头200用于采集斑马鱼运动的视频信息。在本发明的实施例中，摄像头200可以使用CCD或者CMOS通用摄像头和软件来构建。为了有效地分析数据，摄像头200的采集帧率≥25帧/秒。

数据采集单元300用于从摄像头200获取视频信息，并输入分析系统400。

分析系统400用于存储视频信息，并对视频进行分析，获取不同斑马鱼行为学数据。分析系统400的具体构成实例将在后文参照图6来描述。

在本发明一实施例中，数据采集单元300和分析系统400可由硬件实施。对于硬件实施而言，本文中所描述的实施例可在一个或多个专用集成电路(ASIC)或数字信号处理器(DSP)中来实现。在本发明另一实施例中，数据采集单元300和分析系统400可由计算机配合相关的软件来构建。

斑马鱼行为学系统1000的实施例可广泛地适用于成年斑马鱼(后文简称成鱼)OKR、成鱼OMR、幼年斑马鱼(后文简称幼鱼)OKR、幼鱼多点追踪分析。然而在不同的实施例中，斑马鱼行为学系统1000可以仅适用于部分场合的分析，例如成鱼OKR分析。对于以硬件实施的分析系统来说，在不同的实施例中，硬件可能需要有所变动。对于结合了软件的系统来说，可能仅需要对软件部分进行改动。

图2示出本发明一实施例的视觉刺激装置示意图。参照图2所示，该示例为机械式视觉刺激装置。斑马鱼机械式视觉刺激装置100的主要结构包括：壳体101，齿轮传动装置102，电机103，控制面板104，光栅托盘105，光栅106，环形灯光107，鱼缸托盘108以及控制电路110等。电机103通过齿轮传动装置102带动光栅托盘105转动，光栅托盘105的转动带动光栅106转动。通过控制面板104可以控制环形灯107的开关、电机103的正反转和转速。

图3示出图2所示视觉刺激装置的控制电路，参照图3所示，控制电路110由220V电源供电。测速探头111用于检测电机103的实时转速，转速表112用于显示速度，电阻R1用于调节电机的速度。开关K2、K3设在控制面板104上，分别控制环形灯107和电机103的正反转。

机械式视觉刺激装置功能和特点是：

1.提供均匀的散射光，光栅图像均匀清晰；

2.实时显示光栅转速，并且能调节光栅转动方向和光栅转速来改变光栅是时间频率；

3.光栅拆装容易，能方便地更换光栅的空间频率。

除了使用以上描述的机械式视觉刺激装置，还可以使用如图4所示的另一实施例的视觉刺激装置100，即弧形屏刺激器作为斑马鱼的视觉刺激。弧形屏刺激器使用弧形屏显示器128与鱼缸或者培养皿相结合。弧形屏显示器128可以根据程序控制显示图像，可以实现多种刺激模式。刺激的光栅可以任意的改变空间频率、时间频率、光栅的运动方向、颜色、角度以及斑马鱼左右眼不对称刺激，同时也可以显示复杂的图像。

图5示出图4所示的弧形屏显示器128的驱动电路。驱动电路中包含CPU122、存储器124、显示接口126。CPU 122可从存储器124中读取程序来执行，产生图像，通过显示接口126的驱动，在弧形屏显示器128上显示。

由于省去了机械结构，整个刺激装置体积小、结构简洁。而且使用程序控制，实现了自动化，使用方便。

图6示出本发明一实施例的行为学分析系统架构。参照图6所示，行为学分析系统400可包括视频分析模块402、数据修正模块404和数据导出模块406。

为了使该分析系统400适用于成鱼OKR、成鱼OMR、幼鱼OKR、以及幼鱼多点追踪分析等不同情形，上述这些模块，尤其是视频分析模块需要调整，以用于分析各种不同的斑马鱼行为学视频数据类型。

以下介绍在不同场合下进行分析的过程。

成鱼的OKR

成鱼的OKR是在斑马鱼身体被固定的条件下进行光栅刺激，左、右眼会跟跟踪光栅的运动。这时需要分析的是视频中每一帧左、右眼相对于中心线运动的角度。由此获得斑马鱼OKR角度随时间的曲线，即可从曲线中分析出眼动的角度、幅度、周期、次数等参数。

首先是OKR行为学诱发。成年斑马鱼经麻醉剂麻醉后，用大头针或者其他固定装置固定，阻止其游动。待斑马鱼清醒后适应5～10min，把固定斑马鱼置于机械式视觉刺激装置中(如图2)，或者弧形屏刺激器中(如图4)。给光刺激适应约2min，通过摄像头200记录成年斑马鱼头部的OKR，如图7所示。

图7示出本发明一实施例的成年斑马鱼OKR分析原理。从图7所示的成鱼的形态特征可以看出：成鱼的左眼和右眼，背侧观，由此可以明显地看出眼球的特征线。因此在进行分析时，可使用图像中的某一部分作为模板，使用模板匹配(Match Pattern)算法在图中寻找与模板匹配的图像，并最终获得与左眼、右眼、中心相匹配图像的数目、方向、坐标等参数。

成鱼OKR的分析过程如图8所示。首先是设置左眼、右眼、中心模板的步骤S1。这一步骤实现后述的模板匹配(Pattern Match)步骤S3所需的模板图像的选取。其次是设置ROI(region of interest，感兴趣区)，该步骤实现三个与左眼、右眼、中心对应的感兴趣区域。在步骤S3进行模板匹配，通过图像模块匹配算法获得左眼、右眼、中心三个模板对应的坐标和角度。最后在步骤S4存储这些坐标和角度等数据。

图9示出本发明一实施例的成年斑马鱼OKR分析界面500。在界面500的左侧有图像区域502，通过设置三个模板504、506、508作为跟踪对象，分别在三个ROI区域内通过模板匹配算法，跟踪获取视频中斑马鱼眼动角度数据。在界面的右侧有曲线区域510，其分别显示左眼、右眼和中心的运动曲线。

成鱼的OMR

当光栅移动时成年斑马鱼会追随光栅围绕鱼缸做圆周运动，这即是成鱼OMR。

首先将成鱼置于如图2或图4所示的视觉刺激装置100内，光适应几分钟后，摄像头200记录运动光栅顺时针或逆时针给视觉刺激的视频。

通过观察可知，成鱼的运动有以下特点：在圆心的空间内作往复的圆周运动；体形会在运动过程中改变。因此，这里结合使用扣除背景和图像二值化分析算法，通过背景扣除，来分离出要跟踪的目标。再经二值化后获取二值图形的坐标。

由于斑马鱼作循环的圆周运动，可以从视频不同帧的图形中经过剪切合并，合成出背景。

具体分析过程如图10所示。首先在步骤S11扣除背景，使用待分析的图像减去背景以获得与背景不同的对象。因为光栅是转动的，扣除背景后，光栅也会出现在图像中。因此为了避免光栅的干扰，在步骤S12，在扣除背景的图像中剪切出一个圆形的ROI区域作为分析的对象；在步骤S13，设置阈值把图像二值化，分离出目标；再经过步骤S14的二值图分析可以获得追踪的目标；最后在步骤S15储存数据。

图11示出本发明一实施例的成年斑马鱼OMR分析界面600。在图11所示的界面600中，左侧有图像区域602，其中央的包含成鱼图像的圆形区域604为ROI区域。界面右侧有曲线区域606，其显示成鱼在圆形区域604中的所处角度变化曲线。

由此通过合成背景、扣除背景、ROI选取、二值化阈值设置获得跟踪的目标，分析一段视频内斑马鱼逆/顺时针时针运动的圈数，以及运动距离、平均速度，最终获得斑马鱼视觉刺激后的运动变化。

幼鱼的OKR

由于幼鱼与成鱼在体形特征上有所不同，因此分析方法相应进行调整。分析幼鱼OKR时，定义了体轴作为中心线，左右眼转动的角度以中心线为参考，计算其相对角度，如图12所示。幼鱼的色素主要集中在眼部，在头部体表的色素上皮细胞也含有部分色素，但与眼部颜色相比较浅，且分散，因此经过二值化后，可以把两个眼球从背景中分离出来。

首先进行诱发。将幼鱼浸于甲基纤维素内，或者使用低温琼脂糖固定其位置，把幼鱼置于机械式视觉刺激装置(如图2)或弧形屏刺激器(如图4)内，给光栅刺激，同时摄像头200记录视频。

分析流程如图13所示。流程从两个方向同时或者先后进行。在步骤S21，视频的每一帧图像，首先从图中选取一个局部图像作为幼鱼眼动角度的参考中心，设置成为中心模板。在步骤S22，通过模板匹配算法，获得参考中心的坐标和角度，再到步骤S26存储数据。在分析眼动角度时，在步骤S23，选取设置头部为ROI区域，然后在步骤S24，提取ROI图像经过二值化后处理后，两个眼球对应为两个值为1的粒子，通过于步骤S25分析二值图可以获取左右眼球对应的坐标和角度。然后在步骤S26存储跟踪获得数据。

图14示出本发明一实施例的幼年斑马鱼OKR分析界面700。在图14所示的界面700中，左侧有图像区域702，设置幼年卵黄区作为幼鱼的中心模板，在图像区域702内设置一个ROI矩形框界定的幼鱼头部区域704，经过模板匹配、图像二值化、二值化分析后获得左右眼的坐标和角度。界面右侧有曲线区域706，其显示幼鱼在左右眼的角度变化曲线。

在视频数据分析以后，为了消除因视频图像质量，参数设置不当等原因造成的少数帧图象的分析错误，可以对该数据进行手动矫正，获取可靠的数据。

最后是数据输出，输出斑马鱼在每一帧的坐标X，Y、总帧数、总时间、总距离、平均速度、总运动圈数(OMR)，顺时针方向的圈数(OMR)，逆时针圈数(OMR)；眼动角度(OKR)，眼动次数(OKR)，平均眼动幅度(OKR)。

其中，总时间：

总距离：

(i＝N_{frames of viedo}，i≥1)，i为视频帧数，x，y分别为模板匹配或二值图分析获得的坐标。

平均速度： $\stackrel{\‾}{V}=S/t$

顺时针圈数：

((A_i-A_i-1)≥0或(A_i-A_i-1)≤180)，(i＝N_{frames of viedo})在OMR分析时，二值图分析获得的每个坐标，相对于ROI中心坐标有一个角度A，通过对比相邻两帧图像中，角度的改变，可判断出其游动的方向。

顺时针圈数：

((A_i-A_i-1)＜0或(A_i-A_i-1)＞180)，(i＝N_{frames of viedo})。

总圈数：N＝N_W+N_atW.

左眼动角度相对于中心的角度：A_L-o＝A_L-A_o

左眼动角度相对于中心的角度：A_R-o＝A_R-A_o

其中，A_L，A_R，A_o分别为左眼、右眼、中心的绝对角度，A_L-o，A_R-o分别为左、右眼相对于中心的角度

眼动次数：N_eye＝眼动曲线的波峰数

平均眼动幅度：

其中j为总波峰和波谷数，Max_j和Min_j分别为波峰和波谷。

虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种斑马鱼行为学诱发和分析系统，包括：

视觉刺激装置，至少能够诱发斑马鱼的眼动反应、视动反应行为；

摄像头，用以拍摄斑马鱼的行为，以获得视频数据；

分析系统，输入所述视频数据进行行为学分析，以获得斑马鱼的眼动反应和视动反应行为学数据。

2.如权利要求1所述的斑马鱼行为学诱发和分析系统，其特征在于，所述视觉刺激装置是机械式视觉刺激装置，其包括电机、传动装置、光栅、以及灯管，所述电机用于产生旋转动力，所述传动装置用于把电机的转动传递至光栅以带动光栅转动，所述灯管用于照亮光栅产生视觉图像。

3.如权利要求1所述的斑马鱼行为学诱发和分析系统，其特征在于，所述视觉刺激装置是弧形屏刺激器，其包括容纳斑马鱼的容器和包围该容器的弧形屏显示器，该弧形屏显示器产生图像，作为斑马鱼的视觉刺激。

4.如权利要求1所述的斑马鱼行为学诱发和分析系统，其特征在于，所述分析系统是基于预设的一个或多个模板对选定的视频图像的一个或多个感兴趣区域进行模板匹配，以跟踪获取斑马鱼眼动反应行为的眼动角度数据。

5.如权利要求1所述的斑马鱼行为学诱发和分析系统，其特征在于，所述分析系统是从视频图像中扣除背景再剪切出选定的感兴趣区域并通过二值化分离出目标，以跟踪获取斑马鱼视动反应行为的角度数据。

6.一种斑马鱼行为学诱发和分析方法，适用于成年斑马鱼眼动反应分析，该方法包括以下步骤：

麻醉成年斑马鱼后固定其位置，不让其游动；

成年斑马鱼清醒后，对成年斑马鱼进行视觉刺激；

拍摄成年斑马鱼眼动反应行为视频；

对所述视频进行分析，其包括以下步骤：

设置左眼、右眼、中心三个模板；

对所述视频中的至少部分图像，设置与该左眼、右眼、和中心模板对应的感兴趣区域；

使用模板匹配算法获得左眼、右眼和中心的坐标和角度；以及

对斑马鱼左眼、右眼和中心的运动参数进行统计，获得成年斑马鱼眼动反应的运动统计数据。

7.一种斑马鱼行为学诱发和分析方法，适用于幼年斑马鱼眼动反应分析，该方法包括以下步骤：

固定幼年斑马鱼的位置；

对幼年斑马鱼进行视觉刺激；

拍摄幼年斑马鱼眼动反应行为视频；

对所述视频进行分析，其包括以下步骤：

从所述视频的至少部分图像中选取局部图像作为参考中心，设置幼年斑马鱼的中心模板；

通过模板匹配算法获得该参考中心的坐标和角度；

对所述视频中的至少部分图像，选取幼年斑马鱼头部作为感兴趣区域，提取该感兴趣区域；

对提取的感兴趣区域进行二值化处理；以及

分析经过二值化处理的感兴趣区域，获取幼年斑马鱼左、右眼球对应的坐标和角度。

8.一种斑马鱼行为学分析系统，适用于成年斑马鱼眼动反应分析，该系统包括：

用于设置左眼、右眼、中心三个模板的装置；

用于对所述视频中的至少部分图像，设置与该左眼、右眼、和中心模板对应的感兴趣区域的装置；

用于使用模板匹配算法获得左眼、右眼和中心的坐标和角度的装置；以及

用于对斑马鱼左眼、右眼和中心的运动参数进行统计，以获得成年斑马鱼眼动反应的运动统计数据的装置。

9.一种斑马鱼行为学分析系统，适用于幼年斑马鱼眼动反应分析，该系统包括：

用于从所述视频的至少部分图像中选取局部图像作为参考中心，设置幼年斑马鱼的中心模板的装置；

用于通过模板匹配算法获得该参考中心的坐标和角度的装置；

用于对所述视频中的至少部分图像，选取幼年斑马鱼头部作为感兴趣区域，且提取该感兴趣区域的装置；

用于对提取的感兴趣区域进行二值化处理的装置；以及

用于分析经过二值化处理的感兴趣区域，获取幼年斑马鱼左、右眼球对应的坐标和角度的装置。

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