CN102159705A - 在核心基因和ns3区有突变的突变型瘟病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及突变型瘟病毒以及含所述病毒的疫苗。

Description

在核心基因和NS3区有突变的突变型瘟病毒
详述
本发明涉及突变型瘟病毒以及含所述病毒的疫苗。瘟病毒在全世界的动物中引起经济上有重要性的疾病。瘟病毒属，归于黄病毒科(Flaviviridae)，包含至少三个种：牛病毒性腹泻病毒(Bovine ViralDiarrhea Virus，BVDV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)和羊边界病病毒(ovine border disease virus，BDV)。据报道还存在包含来自牛和绵羊的分离物的第四种瘟病毒分型，目前通常将此额外的种称为BVDV-2；从而，将经典的BVDV株命名为BVDV-1。
CSFV在猪中引起猪瘟(classical swine fever)。猪瘟是在猪中具高度传染性且有时致命的疾病，并且可造成相当大的经济损失。动物可能通过接种疫苗来抵抗CSFV，不过，传统的经灭活或经修饰的活疫苗具有涉及安全性及效力方面的缺陷。因此，应该开发新的、改良的疫苗类型。
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是具有广泛临床表现的先天性肠道疾病的起因。该病最初被描述为具有高发病率和低死亡率的牛的传染病。被感染的牛表现出温度升高、腹泻和咳嗽。此状况被称为牛病毒性腹泻。现今，BVDV被认为是对全世界经济具有影响的牛的主要病原体。在牧群中BVDV感染的临床模式以及由此对生产的影响取决于数种因素的相互作用，包括病毒的株系、牛的年龄、牧群的免疫力以及应激物的相互影响。BVDV-1和B VD V-2二者均在牛中引起急性感染(腹泻、发热、出血综合症)以及(若在怀孕期间发生感染)流产、胎儿的畸形和小牛的持续感染。
瘟病毒的基因组由单链(+)RNA组成并包含单个大的开放阅读框架(ORF)，两侧是5′UTR和3′UTR。该ORF编码产生11至12种裂解产物的大前体多蛋白(polyprotein)。ORF通过细胞的以及病毒的蛋白酶被加工成各种病毒蛋白质。ORF内的病毒蛋白质是以以下次序排列的：
NH2-Npro-C-Erns-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH。瘟病毒的病毒颗粒由四种结构蛋白组成，即小的带正电荷的核心(C)蛋白，它被认为可能与RNA基因组一起形成核衣壳结构，以及三种糖基化的包膜蛋白(Erns，E1，E2)。主要针对E2-特异性抗体证实了中和活性。
例如通过建立缺少结构蛋白质有关基因序列的缺陷型瘟病毒基因组而对瘟病毒复制的最低必要条件进行了研究。研究发现，有缺陷的CSFV基因组仍然复制并且在与辅助A187-CAT RNA一起引入SK-6细胞时可被包装入病毒颗粒内(Moser et al.，J.Virol.，7787-7794，1999)。缺少编码C、Erns、E1、E2、p7和NS2的基因的自主复制但有缺陷的BVDV基因组已有报道(Behrens et al.，J.Virol.，72，2364-2372，1998)。Beer等人在WO04/016794中描述了另一种瘟病毒BVDV的反式互补C和E1缺失突变体。
关于CSFV，已披露了显示出病毒减毒的突变体。例如，Risattiet al.，Virology 364，371-382，2007，描述了在E2区域内具有取代的、显示出减毒表型的CSFV突变体。Maurer et al.，vaccine，23(25)，3318-28，2005也描述了CSFV E2突变体，其缺少全部或部分E2基因，显示出对高毒力CSFV的致死性攻击具有部分保护作用。Meyers et al.，Journal of Virology，73(12)，10224-10235，1999描述了在编码Erns蛋白的基因内有导致突变的突变的CSFV突变体。Wildjojoatmodjo etal.，J.Virol.，74(7)，2973-80，2000中描述了CSFV的反式互补Erns缺失突变体。
本发明提供了突变型瘟病毒，它在编码核心蛋白的基因内有缺失，导致病毒不能表达功能性的核心蛋白质，其中所述病毒进一步的特征在于在NS3的解旋酶结构域的C末端结构域中包含一个或更多个突变。
优选的，本发明的突变型瘟病毒是猪瘟病毒(CSFV)或牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。
编码核心蛋白的基因区域内的突变应该是不能表达功能性核心蛋白质的突变类型。这可通过全部或部分缺失编码核心蛋白的基因来完成。核心蛋白C末端处的信号序列是多蛋白下游进一步加工所必需的。因此在缺失(部分)核心基因时应注意保留针对Erns的转位信号序列。
该转位序列是位于第250位和第267位氨基酸之间的18个氨基酸的区域，在CSFV Erns蛋白N末端前的切割位点之前(Ala-267/Glu-268)。(
Figure BDA0000050422620000031
et al.，J.Virol.，65(2)，589-597，1991；
Figure BDA0000050422620000032
et al.，J.Virol.，67(6)，3288-3294，1993)。对于BVDV，在Erns蛋白N末端之前的切割位点是Gly-270/Glu-271。
下游加工所必需序列的确切长度可能在每个株系或细胞类型之间有变化。例如，对于CSFV而言，核心编码序列可能缺失第169-248位氨基酸(p619)，从而将Npro的C末端与组成适于Erns的转位信号的核心蛋白C末端氨基酸融合(CPLWVTSC168/LEKALLAWAVITILLYQPVAA267/ENIT)。对于BVDV而言，核心编码序列可能缺失氨基酸169-251，从而将Npro的C末端与组成用于BVDV Erns的转位信号的核心蛋白C末端氨基酸融合(CPLWVSSC168/LEKALLAWAIIALVFFQVTMG270/ENIT)。大部分核心基因的缺失使得RNA可以在转染后复制但不产生有传染性的病毒后代。
通过本发明发现了缺失编码功能性核心蛋白的基因可以通过病毒基因组NS3区域内的突变进行补偿。将这些突变引入其中核心基因已缺失的瘟病毒cDNA拷贝内，(如上所述)可以恢复有传染性的病毒。NS3区域内的突变集中在NS3解旋酶结构域的C末端，更具体而言是在C末端结构域的100个氨基酸之内。对于CSFV而言，已鉴定了NS3区域解旋酶结构域的C末端结构域(第2160-2260位氨基酸)内的7个独立的突变。依照本发明优选的突变型CSF病毒在NS3解旋酶结构域的C末端结构域内具有一个或多个突变，选自Asn2177Tyr、Glu2160Gly、Pro2185Thr/Ala、Gln2189Lys、Pro2200Thr和Asn2256Asp。
将突变Asn2177Tyr引入CSFV核心Δ(p619)内并进行cRNA的电穿孔导致了有生存能力的传染性病毒颗粒的惊人释放。基因组RNA在Northern印迹分析中显示出大小似乎有轻微的减小，并且浓缩的病毒颗粒不包含核心蛋白。在SK6细胞中病毒滴度高达5×105ffu/ml，因此大约比p447野生型滴度低10倍。接下去将其它突变Glu2160Gly、Pro2185Ala、Gln2189Lys、Pro2200Thr和Asn2256Asp引入CSFV核心Δ(p619内，)产生了p1033(Ala2185)、p1034(Thr2200)、p1035(Lys2189)、p1036(Asp2256)、p1037(Gly2160)和p1038(Asp2256)。在所有情形下，在各自的SP6转录物电穿孔后回收到病毒，但生存能力有显著差异(生长曲线分析)。最有生存能力的是包含Asn2177Tyr交换的基因组。
因此最优选的是本发明的突变型CSFV，其中NS3解旋酶结构域的C末端结构域内的突变包含Asn2177Tyr突变。为了研究这些突变是否具有累加效应，将最强的补偿突变体加以合并。对于双突变而言，将Asn2177Tyr与Glu2160Gly，Pro2185Ala，Gln2189Lys，Pro2200Thr和Asn2256Asp联合。三突变包含Asn2177Tyr，连同Pro2185Ala和Pro2200Thr、Pro2185Ala和Gln2189Lys、Gln2189Lys和Pro2200Thr以及Glu2160Gly和Gln2189Lys。所有测试的组合均显示出相较于单一突变而言生存能力有所降低，表明了添加可行突变改善了核心补偿中的NS3。
尽管对于亲代CSFV野生型而言物理或表型差异不明显，但CSFV核心Δ在天然宿主内高度减毒。因此本发明的突变型病毒适于用在疫苗中来保护猪抵抗CSFV的感染。
对于BVDV而言，已鉴定了NS3区域解旋酶结构域的C末端结构域(氨基酸2169-2269)内的8个独立的突变。本发明优选的突变型BVD病毒在NS3解旋酶结构域的C末端结构域内具有一个或多个突变，选自Glu2189Lys、Leu2190Pro、Thr2191Ala、Asp2192Glu、Pro2194Leu、Tyr2204His、Asn2265Tyr、Asn2265Asp。
最优选的是本发明的突变型BVDV，其中NS3解旋酶结构域的C末端结构域中的突变包含Asp2192Glu，Tyr2204His，Asn2265Tyr或Asn2265Asp突变。
核心蛋白显然不是形成传染性颗粒所必需的。显然C不是瘟病毒装配所需要的，但它提供了其它功能。它的功能被NS3解旋酶结构域内的突变所抵消。只要保持Erns的转位，则对于传染性病毒颗粒的形成而言就不需要覆盖CSFV Erns的转位信号(LEKALLAWAVITILLYQPVAA268)或BVDV Erns的转位信号(LEKALLAWAIIALVFFQVTMG270)(跨越Npro的C末端和Erns的N末端之间距离的序列)的核心蛋白剩余氨基酸的确切序列。无关糖蛋白的信号序列在功能上可置换真实的序列。其中核心的剩余氨基酸已被N-末端CD46转位信号完全置换的构建体是可存活的(CD46仅仅作为被转位细胞蛋白质的例子)。在引入牛CD46的跨膜结构域(SSGRSPGWLLLAPLLLLPTSSDA)时，回收到存活的病毒，滴度达到2×104ffu/ml。
在缺少核心的情况下瘟病毒的繁殖为瘟病毒标记疫苗提供了机会。预期在克服瘟病毒感染的动物血清中会存在针对核心蛋白质的抗体。核心蛋白是免疫原性的并且以显著量表达。
包含本发明传染性病毒颗粒以及药用可接受载体的疫苗同样属于本发明的部分。
实施例：
实施例1：核心蛋白缺失构建体
为了检验NS3中的取代会补偿丧失能力的核心蛋白这一假设，将核苷酸改变引入其中核心编码序列(aa169-248(SDDGASG-KPPESRKKL)被缺失的(p619)传染性CSFV cDNA内。因此Npro的C末端与组成有关Erns的转位信号的核心部分C末端氨基酸融合(CPLWVTSC168/LEKALLAWAVITILLYQPVAA267/ENIT)。大部分核心基因的缺失使得RNA可以在转染后复制但不产生有传染性的病毒后代。将突变Asn2177Tyr引入CSFV核心Δ内并进行cRNA的电穿孔导致了有生存能力的传染性病毒颗粒的惊人释放。该基因组RNA在Northern印迹分析中显示出大小有轻微的减小，并且浓缩的病毒颗粒不包含核心蛋白。在SK6细胞中病毒滴度高达5×105ffu/ml，因此比p447野生型滴度低大约10倍。接下去将其它突变Glu2160Gly、Pro2185Ala、Gln2189Lys、Pro2200Thr和Asn2256Asp引入CSFV核心Δ(p619)内，产生了p1033(Ala2185)、p1034(Thr2200)、p1035(Lys2189)、p1036(Asp2256)、p1037(Gly2160)和p1038(Asp2256)。在所有情形下，在经各自的SP6转录物电穿孔后均回收到病毒，但生存能力有显著差异。最有生存能力的是包含Asn2177Tyr交换的基因组(突变体″CSFV1017Core Δ″)。核心蛋白显然不是形成传染性颗粒所必需的。它的功能可通过NS3的螺旋酶结构域内的突变得到补偿。
为了评估NS3内的突变对缺失的核心部分的补偿是否也适用于BVDV，用引物BVT86(GCAGCTTGAAACCCATAGGGGGCAG)和Core268(CTAGAGAAAGCCCTATTGGCCTG)对含XhoI/BglII片段(核苷酸222-2335)的亚克隆进行PCR，去除BVDV cDNA克隆NCP7(GeneBank登录号AF220247)的核心编码序列。经由测序证实缺失并通过XhoI/NcoI片段(核苷酸222-4671)的连接引入全长cDNA克隆中。所产生的缺少核心部分的全长质粒(p1026)编码在Erns信号序列之前的Npro，与CSFV核心Δ(p619)类似。在MDBK细胞中p1026的转录物是可复制的，但没有观察到有传染性的病毒。将取代Pro2194Ala、Pro2209Tyr和Asn2265Asp引入NCP7ΔC中使得在对MDBK细胞进行滴定时，传染性病毒滴度恢复到大约103ffu/ml。经人工改造适于在猪SK6细胞内繁殖的改良NCP7ΔC显示在Tyr2204His、Asn2265Tyr、Asn2265Asp、Pro2194Leu、Gln2198Lys和Leu2199Pro情况下有核心补偿。以显著的滴度从SK6细胞中恢复了缺少核心蛋白的NCP7病毒(Asn2265Tyr：3.3×105，Tyr2204His：2×104以及Asp2192Glu：1.5×104ffu/ml)。基于有传染性的BVDV C86拷贝，一种在MDBK细胞中生长良好的正常I型BVDV病毒，如上所述产生了核心部分缺失突变体并引入了类似于Asn2265Asp(Asn2433Asp)的突变。在SK6细胞中进行转染后以滴度5×104ffu回收到病毒。
核心蛋白衍生的跨膜结构域在功能上可被宿主的细胞序列所置换
为了排除覆盖适于Erns的转位信号(LEKALLAWAVITILLYQPVAA268)的剩余氨基酸的功能重要性，用牛CD46的跨膜结构域(SSGRSPGWLLLAPLLLLPTSSDA)置换CSFV核心ΔN2177Y(p1017)内跨越Npro C末端和Erns N末端之间距离的序列。将各自的cDNA(p1246)的SP6转录物转染入SK6细胞内。回收到可存活病毒，滴度达到2×104ffu/ml。
材料和方法
细胞和病毒
将SK6细胞在塑料皿上含10％胎牛血清和非必需氨基酸的DMEM中于具有5％CO2的培养箱内进行增殖。每3天对细胞进行传代。所有CSFV病毒均来自非-cp CSFV株Alfort-p447(Gallei et al.，J.Virol.，79(4)，2440-2448，2005)。
电穿孔：
将2μg的SP6转录物经电穿孔导入5×106个SK6细胞。为此目的，将SK6细胞(90％汇合率)经胰酶消化、用PBS(Ca++和Mg++)漂洗两次、与转录物混合成总体积为310μl，然后在2mm间隙的电击杯中进行电穿孔(Biorad Genepulser，0.18KV和0.95μFd)。从电击杯中回收细胞并接种于35mm塑料皿内补充了10％胎牛血清的DMEM中。
RNA制备和cDNA合成：
对用挽救的病毒感染的SK6细胞进行漂洗并按制造商的推荐使用Rneasy Kit(Quiagen)制备RNA。用由实际目的位置决定的不同引物对2μg RNA进行逆转录。用合适的引物进行PCR并亚克隆入pGEM-T载体(Promega)。
实施例2：动物实验.
为了在实验条件下鉴定猪瘟病毒(CSFV)突变体″CSFV1017Core Δ″的毒力，进行动物实验。
目标：
该实验的主要目标是研究CSFV突变体″CSFV 1017Core Δ″是否显示出与亲本株″CSFV Alfort p447″相比较而言毒性减弱。站岗猪的使用可以粗略研究病毒的发散和传播。由于已证实毒性减弱，所以在1月2日用高度致病的CSFV病毒株Koslov对余下的猪进行攻击。
动物实验：
部分I-感染
6只断奶仔猪是于2006年10月16日购自商业猪场并放入病毒研究所的高容纳单元内。将动物随机分成两组，每组三只猪。全部动物均单独用数字和耳标进行标记。将两个组(组1：号码75-77的动物；组2：号码78-80的动物)在高容纳条件(负空气压为100Pa)下饲养于分开的笼子中，使它们在整个实验过程中没有任何的相互接触。每天喂养动物1次。水的补给随意。试验开始时动物在临床上是健康的。在实验开始前收集来自全部动物的血样并通过中和试验检查针对瘟病毒(CSFV)、边界病病毒(Border Disease Virus，BDV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的中和抗体的存在。在对新环境适应一段时间后，将每组的两只猪分别肌肉内注射约107TCID50的CSFV1017(组1)和CSFV Alfort p447(组2)进行感染。在接种后将站岗猪(每组1只)从组中取出至少12小时。此期间过后将它们再次放入各自的组中。每日监测两组动物的临床症状和体温。体温超过40℃记录为发热。在实验过程中，出于使动物安宁的原因将临床症状表现为不再能忍受的动物进行安乐死。对所有动物进行尸检并记录。在感染后第0，2，4，7，10，14，21和28天从所有动物中采集血样(原血和EDTA抗凝血)。另外的样品是在安乐死的那天采集。将原血样品以1500rpm于室温离心15分钟(Labofuge 400R，Heraeus，Germany)获取血清。然后将血清分成0.5至2ml的合适等分试样并贮存于-80℃至进一步检测。
部分II-攻击
对经感染(部分I)后继续存活的猪鼻内施加104.5 TCID50的高度致病的CSFV病毒株Koslov进行攻击(感染后第71天)。在激发后第0，3，6天和各个猪安乐死的当天采集血样。
实验室检验
白细胞计数
在以乙酸(2％)裂解红细胞后根据Neubauer(改良的)使用计数室对来自EDTA血的白细胞进行手动计数。将EDTA血依照Thoma吸入液稀释移液管中到达0.5刻度。然后，加入乙酸(2％)至刻度11，并将样品稀释液温和摇动约60秒。将稀释液注入准备好的计数室内，在光学显微镜下对白细胞计数区内的白细胞进行计数。依照计数室的说明计算确切的数值。数值在10G/l以下记录为白细胞减少症(leucopenia)。在感染后第0，2，4，7，10，14，21和28天进行白细胞计数。
中和过氧化物酶联接抗体检验
依照欧盟委员会的“诊断手册”(2002年2月1日的委员会决议2002/106)及其附带的技术部分，利用分别适于检测抗CSFV和BVDV/瘟病毒之抗体的以下病毒进行中和过氧化物酶联接抗体检验(NPLA)。
·BVDV NADL
·CSFV参照病毒株″Alfort 187″(CSF 902)
·CSFV Alfort p447(亲本病毒株)
·CSFV Koslov(攻击病毒株)
·CSFV Diepholz(CSF0104)
用于检测BVDV抗体的NPLAs用原代胎牛肾脏细胞进行，而用于检测CSFV抗体的NPLAs则用永生化的猪肾脏细胞(SK 6)进行。抗体效价表示为在两个重复孔中阻止病毒复制50％的最高起始血清稀释度的倒数。用
Figure BDA0000050422620000091
的方法计算这些中和稀释度50％(ND50)。在感染(CSFV Alfort p447，和CSF0902)后第0，10，14，21和28天进行用于检测CSFV抗体的NPLAs。此外，对在攻击后第0，3，和6天以及进行安乐死的当天采集的样品进行分析(CSFV Alfort p447，和CSF0902)。用CSFV Koslov和CSF0104对攻击后所取样品进行NPLA。在实验开始前进行关于检测抗BVDV的中和抗体的NPLA。
抗体酶联免疫吸附检验(ELISA)
除了NPLA之外，对感染后第0，14，21和28天以及安乐死当天收集的血清样品进行可商品化购买的抗体的酶联免疫吸附检验(ELISA)，以检测针对CSFV的抗体。所有检验均完全按制造商说明书所述进行。使用的ELISA检测试剂盒如下：
·HerdChek CSFV，Idexx Laboratories，
Figure BDA0000050422620000101
Germany。
病毒分离
依照EU诊断手册(委员会决议2002/106/EC)在永生猪肾脏细胞系SK6和Rie 5-1上经两代进行来自白细胞制品的病毒分离。用瘟病毒特异性单克隆抗体BVD/C16(Peters et al.，1986)和商品化的物种特异性过氧化物酶联接缀合物(RAMPO，Dako)进行间接免疫标记。
抗原ELISA
除了病毒分离之外，还完全按制造商说明书所述进行可商品化购买抗原的酶联免疫吸附检验(ELISA)。在第0，4，7和10天取样进行分析。
使用的ELISA检测试剂盒如下：
·CHEKIT HCV-抗原，构建者Dr.Bommeli AG，Liebefeld-Bern，瑞士
结果
部分I-感染
临床体征和温度(见图1)
在此实验的感染期间，只有76号动物在感染后第8天显示出轻微的发热(40.1℃)。对75号和76号动物在感染后的第14天记录到40.0℃的次发热温度。
相反，组2的全部动物均出现发热。动物78号在感染后第8和第9天以及从感染后第13天直至第28天实验结束表现出发热的温度。
动物79号在感染后第9天以及从第14天直至实验结束表现为发热。动物80号在感染后第7、9、10以及从第13天至第20天记录为发热的温度。在第21天，动物80号表现体温为35.6℃。
组1的动物(75-77号)在实验的第一部分期间未表现出指示关于CSFV感染的任何临床体征，而组2的全部动物(78-80号)则表现出明显的临床症状。不同动物之间的临床体征严重程度有所不同。动物76号在感染后第44天由于与CSF感染无关的严重跛腿而实施安乐死。在实验过程中，动物78号发生严重的腹泻、结膜炎、厌食、皮肤损伤和运动失调。在感染后第28天将动物安乐死。动物79号只表现出轻微的不典型症状，包括食欲下降和轻微的腹泻。该动物在感染后第28天被安乐死。动物80号表现出严重的症状，包括胃肠道和呼吸方面的征兆、厌食、迟钝和皮肤损伤。该动物在感染后第21天被安乐死。
白细胞计数(图2)
大体上，组1的动物未显示白细胞减少症。不过，动物75和77号在感染后第20天显示出低于10G/l的数值。同一天，动物76号显示仅10.3G/l。组2的全部动物在经CSFV Alfort p447感染后均表现为严重的白细胞减少症。在动物78号中，白细胞减少症在感染后第4天开始，且在安乐死当天记录仅为0.45G/l。站岗猪79号在感染后第21天和第28天显示白细胞减少的数值，并且在感染后第14天已达到10.6G/l的极限值。动物80号在感染后第4天开始显示严重的白细胞减少症。感染后第21天终值达1.4G/l。
病理学
在实验的感染部分期间组1的动物未被安乐死。
组2的动物显示不同的病理征兆。动物78号显示弥漫性皮炎，肿胀以及内脏和呼吸道内的出血性淋巴结、胸腺萎缩、支气管肺炎、溃疡性胃炎、卡他性肠炎、肾盂肾炎和肾皮层内的瘀点出血。动物79号表现出轻微的胸腺萎缩、内脏和呼吸道内淋巴结轻微肿胀、肺炎(肺叶)、溃疡性胃炎、严重的卡他性肠炎和膀胱炎。动物80号表现为真皮和皮下组织(肢端、腹部)的瘀点出血、极度扩大的水肿并出血性淋巴结(全身的)、严重的胸腺萎缩、脑膜、脾、会厌、气管、胃、内脏壁、回盲瓣、膀胱、肝、胆囊和肾脏内的瘀点出血。此外，动物80号表现出卡他性化脓性肺炎、在心内膜下和心肌内的广泛出血、严重的出血性胃炎、便秘和严重的间质性肾炎。
抗体检测
中和过氧化物酶联接抗体检验(Neutralization peroxidase-linkedantibody assay，NPLA)
经检测全部动物在实验前均为BVDV/瘟病毒抗体阴性。第0天采集的所有样品对NPLA中所用的两种CSFV株系(CSF0902和Alfortp447)均显示阴性(＜5ND50)结果。
利用CSFV株系Alfort p447，组1的动物在感染后第14天开始表现出阳性结果(动物75号)。具体而言，动物75号在感染后第14天显示抗体效价为7.5ND50，并在之后增加到316ND50。动物76号在感染后第21和28天显示抗体效价达158，5ND50的阳性结果。站岗动物77号未显示任何的抗体效价。
利用CSF0902，只有动物76号在感染后第28天显示出7.5ND50的低抗体效价。组2的动物在整个实验期间进行的所有NPLA中均保持对CSFV抗体阴性(＜5ND50)。
抗体酶联免疫吸附检验(Ab-ELISA)
动物75号在感染后第21天首次显示不确定的结果，并在感染后第28天为阳性，而动物76号在感染后第14天显示不确定的结果并在感染后第21和28天显示为阳性结果。动物77号保持阴性。
动物78和79号在整个试验中显示阴性结果，而动物80号则在安乐死的当天(感染后第21天)显示出不确定的结果。
病毒分离
组1的动物在用SK6和Rie 5-1细胞二者所进行试验的整个感染部分均显示阴性结果。
动物78号在分别感染SK6和Rie 5-1细胞后的第4、7、10(只对SK6细胞进行了调查)和14天均显示阳性结果。此外，该猪在感染Rie 5-1细胞后第2天达到阳性结果。站岗猪，即动物79号对两个细胞系均保持阴性。对于SK 6细胞，动物80号在感染后第7、10和14天显示阳性结果。对于Rie 5-1细胞在第7和14天(由于缺少样品材料第10天未检测)也发现阳性结果。
抗原酶联免疫吸附检验(Ag-ELISA)
对于组1的所有动物和组2的78和79号动物，其Ag-ELISA均保持阴性。只有动物80号在感染后第10天显示阳性结果。
部分II-攻击
临床体征和体温
在感染后第71天用高度致病的CSFV株系Koslov对经感染后余留的猪，即动物75和77号进行攻击。
动物75号未出现发热温度或者针对攻击感染的任何临床征兆，在攻击后第16天安乐死。
动物77号在攻击后第3天出现发热并持续至安乐死。该动物在攻击后第8天安乐死，出现严重的神经学上的症状。
病理学
在攻击之前，动物76号由于严重的跛腿而被安乐死。该动物未显示CSF指征性的任何病理损伤。它只表现肺叶的轻微肺炎。除了肺叶的轻微肺炎和轻微的溃疡性胃炎之外，动物75号未显示病理学方面的症状。动物77号显示肿胀、部分出血性淋巴结、卡他性肺炎、腹水、轻微的溃疡性胃炎、肝充血、胆囊水肿和间质性肾炎。
抗体检测
在攻击感染后，动物75号显示160ND50的抗攻击病毒的抗体效价(攻击后第16天)，以及＞640的抗CSF0104的效价。动物77号保持阴性。
概要和结论
·CSFV突变体″CSFV 1017核心部分Δ″显示与亲本株系″CSFVAlfort p447″相比近乎完全的毒性减弱。
·与组2的动物相反，对于组1动物在不同细胞系上的病毒分离物中未检测到病毒。
·除了站岗猪之外，组1的动物经CSFV 1017Core Δ感染后均产生了中和抗体。
·组1的站岗猪在抗体和抗原检测两方面均未显示任何阳性结果。因此，病毒突变体的发散和传播是极其不可能的。
·用高度致病性CSFV株系进行攻击感染后没有临床症状证实了先前用CSFV 1017Core Δ感染的动物得到了完全保护。
·站岗猪在用CSFV Koslov进行攻击感染后显示出急性致死的CSF进程。

Claims (8)

1.突变型瘟病毒，其特征在于所述病毒在编码核心蛋白的基因内有突变，导致该病毒不能表达功能性核心蛋白，所述病毒的进一步特征在于它在NS3之解旋酶结构域的C末端结构域内包含一个或多个突变。
2.依照权利要求1的突变型瘟病毒，其特征在于所述瘟病毒是猪瘟病毒(CSFV)。
3.依照权利要求2的突变型CSFV，其特征在于NS3之解旋酶结构域的C末端结构域内的突变选自Asn2177Tyr、Glu2160Gly、Pro2185Thr/Ala、Gln2189Lys，Pro2200Thr和Asn2256Asp。
4.依照权利要求2或3的突变型CSFV，其特征在于NS3之解旋酶结构域的C末端结构域内的突变包含Asn2177Tyr突变。
5.依照权利要求1的突变型瘟病毒，其特征在于所述瘟病毒是牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。
6.依照权利要求5的突变型BVDV，其特征在于NS3之解旋酶结构域的C末端结构域内的突变选自Glu2189Lys，Leu2190Pro，Thr2191Ala，Asp2192Glu，Pro2194Leu，Tyr2204His，Asn2265Tyr，Asn2265Asp。
7.依照权利要求5或6的突变型BVDV，其特征在于NS3之解旋酶结构域的C末端结构域内的突变包含Asp2192Glu、Tyr2204His、Asn2265Tyr或Asn2265Asp突变。
8.一种疫苗，其特征在于包含根据前述权利要求中任一项的突变型瘟病毒和药用可接受载体。
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