CN102159234A

CN102159234A - 使用哺乳动物β防御素的类风湿性关节炎的治疗

Info

Publication number: CN102159234A
Application number: CN200980136396XA
Authority: CN
Inventors: 坦贾·M·R·凯尔; 托马斯·克鲁泽; 珀尔·H·迈金德; 卡罗琳·S·布林奇; 泽伦·凯拉尔夫; 伯吉特·安德森
Original assignee: Novozymes Adenium Biotech AS
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Priority date: 2008-07-18
Filing date: 2009-07-17
Publication date: 2011-08-17
Also published as: BRPI0915778A2; US20120309686A1; AR072525A1; MX2011000567A; EP2320928A2; US20100016231A1; IL210716A0; AU2009272683A1; KR20110031970A; NZ590469A; WO2010007168A3; EP2320928B1; JP2011528334A; EA201170220A1; CA2730666A1; US8232248B2; WO2010007168A2; TW201004639A; ZA201100460B; AP2011005536A0

Abstract

本发明系关于使用哺乳动物β防御素治疗类风湿性关节炎。

Description

使用哺乳动物β防御素的类风湿性关节炎的治疗

涉及序列表

本申请含有呈计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文中。

发明背景

发明领域

本发明涉及通过施用人β防御素而预防与治疗类风湿性关节炎。

背景

在许多其它元件中，先天免疫的关键组分为个别显示相当大选择性但集体能够快速杀死广谱的细菌、病毒及真菌的抗微生物肽(AMP)。AMP的生物重要性因其在自然界中之普遍分布而更为突出，且其有可能由所有多细胞生物体产生。在人类中，优势AMP为防御素。人防御素为阳离子小肽，基于其三个分子内半胱氨酸二硫键之拓扑学可分为α-防御素及β-防御素。α-防御素可进一步细分为首先自嗜中性粒细胞颗粒分离的α-防御素(HNP1-4)及由Paneth细胞在小肠隐窝中表达的α-防御素(HD5及HD6)。β-防御素主要由多种组织及器官中的上皮细胞产生，所述组织及器官包括皮肤、气管、胃肠道、泌尿生殖系统、肾、胰及乳腺。β-防御素家族最具特征的(best characterized)成员为hBD1-3。然而，使用多种生物信息学工具，已在人基因组中注释了几乎40个编码推定β-防御素同源物的开放阅读框。一些人防御素是组成型产生的，而其它是由促炎性细胞因子或外源微生物产物诱导的。

已经越来越清楚的是，除直接抗微生物活性外，人防御素也具有宽范围的免疫调节/替代性质。所述性质包括诱导多种趋化因子及细胞因子、趋化活性及细胞凋亡活性，诱导前列腺素、组胺及白细胞三烯释放，抑制补体，通过铎样受体(toll-like receptor)信号传导刺激树突细胞成熟，以及刺激由嗜中性粒细胞的病原体清除。此外，人防御素也在伤口愈合、上皮及成纤维细胞的增殖、血管生成(angiogenesis)及血管发生(vasculogenesis)中起作用。

有越来越多的人防御素在许多感染性及炎性疾病中发挥重要作用的证据。发炎和/或感染皮肤中通常观察到人防御素之过表达，很可能是因为由微生物组分或内源性促炎性细胞因子局部诱导。在牛皮癣(psoriasis)中，hBD2及hBD3过于充足，且在患有寻常痤疮(acne vulgaris)或浅表性毛囊炎(superficial folliculitis)的患者的受损上皮中观察到hBD2的显著上调。另一方面，异位性/特应性皮炎(topic dermatitis)与hBD2及hBD3的下调相关。

类风湿性关节炎为一种慢性、全身性发炎病症，其可影响许多组织与器官，但主要侵袭关节，产生常常发展成关节软骨之破坏与关节之僵硬的炎性滑膜炎。类风湿性关节炎也可于肺、心包、胸膜、以及巩膜产生弥漫性发炎、以及结节状损害，其在皮肤下的皮下组织中最常见。虽然类风湿性关节炎之原因不明，自体免疫在其长期性与进展中扮演重要的角色。

发明详述

定义

防御素：如本文所用之术语“防御素”系指本领域的技术人员公认属于抗微生物肽之防御素类之多肽。为确定多肽是否为根据本发明之防御素，可通过使用免费可用之HMMER软件包将氨基酸序列与PFAM数据库之隐马尔可夫模型序型(hidden markov model profile)(HMM序型)比较。

PFAM防御素家族包括例如防御素-1或“哺乳动物防御素”(登录号PF00323)及防御素_2或防御素_β或“β防御素”(登录号PF00711)。

本发明之防御素属于β防御素类。β防御素类之防御素享有共同的结构特征，如半胱氨酸模式。

根据本发明之防御素之实例包括人β防御素1(hBD1；参见SEQ ID NO：1)、人β防御素2(hBD2；参见SEQ ID NO：2)、人β防御素3(hBD3；参见SEQ ID NO：3)、人β防御素4(hBD4；参见SEQ ID NO：4)及小鼠β防御素3(mBD3；参见SEQ ID NO：6)。

同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。

就本发明而言，通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277；http://emboss.org)，优选3.0.0版或更新版本之Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定两个氨基酸序列之间的同一性程度。使用之任选参数为缺口开放罚分(10)、缺口延伸罚分(0.5)及EBLOSUM62(BLOSUM62之EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记之“最长同一性”之输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性且如下计算：

(相同残基×100)/(比对长度-比对中之缺口总数)。

就本发明而言，通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，同上；http://emboss.org)、优选3.0.0版或更新版本之Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度。使用之任选参数为缺口开放罚分(10)、缺口扩展罚分(0.5)及EDNAFULL(NCBI NUC4.4之EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记之“最长同一性”之输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性且如下计算：

(相同脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中之缺口总数)。

如本文所用之术语“经分离变体”或“经分离多肽”系指自来源分离之变体或多肽。在一方面中，如SDS-PAGE所测定的，变体或多肽为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，且最优选至少90％纯。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文中表示含有按重量计至多10％、优选至多8％、更优选至多6％、更优选至多5％、更优选至多4％、更优选至多3％、甚至更优选至多2％、最优选至多1％且甚至最优选至多0.5％与之天然或重组相关之其它多肽物质的多肽制备物。因此，优选基本上纯的多肽按制备物中所存在之总多肽物质之重量计为至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯且甚至最优选100％纯。本发明之多肽优选呈实质上纯的形式。此可例如通过由众所周知之重组方法或由经典纯化方法制备多肽来实现。

哺乳动物β防御素

本发明涉及哺乳动物β防御素(如人β防御素和/或小鼠β防御素)在治疗类风湿性关节炎中的医药用途。治疗优选与降低所治疗组织中之TNF-α活性相关。

在一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6中之任一氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％且最优选至少95％的同一性程度。在一优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4中之任一氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％且最优选至少95％的同一性程度。在一更优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素1(SEQ ID NO：1)、人β防御素2(SEQ ID NO：2)、人β防御素3(SEQ ID NO：3)、人β防御素4(SEQ ID NO：4)、人β防御素4之变体(SEQ ID NO：5)和/或小鼠β防御素3(SEQ ID NO：6)组成。在一甚至更优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素1(SEQ ID NO：1)、人β防御素2(SEQ ID NO：2)、人β防御素3(SEQ ID NO：3)和/或人β防御素4(SEQ ID NO：4)组成。

在另一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素与SEQ ID NO：2之氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％且最优选至少95％的同一性程度。在一优选实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素2(SEQ ID NO：2)组成。

在又一实施方案中，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素和/或小鼠β防御素及其功能等效变体组成。优选地，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3、人β防御素4及小鼠β防御素3及其功能等效变体组成。更优选地，本发明之哺乳动物β防御素由人β防御素2及其功能等效变体组成。

本发明之哺乳动物β防御素也称为优选实施方案之化合物。

在本发明之上下文中，哺乳动物(例如人)β防御素之“功能等效变体(functionally equivalent variant)”为对类风湿性关节炎展现与亲本哺乳动物(例如人)β防御素大致相同之功效的经修饰哺乳动物(例如人)β防御素。优选，其也展现与哺乳动物(例如人)β防御素大致相同之对TNF-α活性之功效。

根据本发明，哺乳动物(例如人)β防御素之功能等效变体与哺乳动物(例如人)β防御素氨基酸序列相比可包含1-5个氨基酸修饰，优选1-4个氨基酸修饰，更优选1-3个氨基酸修饰，最优选1-2个氨基酸修饰且尤其1个氨基酸修饰。

术语“修饰”在本文中意指哺乳动物(例如人)β防御素之任何化学修饰。修饰可为氨基酸之取代、缺失和/或插入以及氨基酸侧链之置换；或在氨基酸序列中使用具有类似特性之非天然氨基酸。详言之，修饰可为酰胺化，如C-末端酰胺化。

优选地，氨基酸修饰是性质上较不重要的，其为不显著影响多肽之折迭和/或活性之保守性氨基酸取代或插入；单缺失；氨基-或羧基-末端小延伸；至多约20-25个残基之小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能而有利于纯化之小延伸，如多聚组氨酸标记、抗原表位或结合域。

保守取代的实例为在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)组内的取代。通常不改变比活的氨基酸取代在本领域是已知的，并由，例如，Neurath和Hill，1979在The Proteins，Academic Press，New York中描述。最通常发生的交换为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

除了20个标准氨基酸，非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上可得到的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定哺乳动物β防御素中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，对抗类风湿性关节炎的活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。必需氨基酸的身份(identity)也可由分析与相关于哺乳动物β防御素之多肽的同一性来推断。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO95/17413；或WO 95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利5,223,409号；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。

本发明之多肽之N-末端延伸可合适地由1至50个氨基酸、优选2-20个氨基酸、尤其3-15个氨基酸组成。在一实施方案中，N-末端肽延伸不含Arg(R)。在另一实施方案中，N-末端延伸包含如下文进一步定义之kex2或kex2-样切割位点。在一优选实施方案中，N-末端延伸为包含至少两个Glu(E)和/或Asp(D)氨基酸残基之肽，如包含以下序列之一的N-末端延伸：EAE、EE、DE及DD。

方法及用途

已发现人β防御素2在小鼠中于41天胶原蛋白诱导之类风湿性关节炎模型显著地减轻疾病参数之严重性；因此显示作为用于治疗类风湿性关节炎的药物的潜在活性。

本发明因此提供治疗类风湿性关节炎的方法，该治疗包括向需要该治疗之受试者施用有效量之例如药物组合物形式之哺乳动物β防御素，优选为人β防御素，更优选为人β防御素2。也提供者为哺乳动物β防御素(优选为人β防御素，更优选为人β防御素2)，其用于制造药物；及哺乳动物β防御素(优选为人β防御素，更优选为人β防御素2)用于制造治疗类风湿性关节炎的药物之用途。治疗包括治疗已有疾病或病症以及预防(prophylaxis或prevention)疾病或病症。

哺乳动物β防御素可治疗性用于组合物中，所述组合物经配制用于经由任何常规途径施用，常规途径包括肠内(例如经颊、经口、经鼻、经直肠)、胃肠外(例如，静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌肉内)或局部(例如，表皮、鼻内或气管内)。在其它实施方案中，本文中描述之组合物可作为持续释放植入物之一部分施用。

在另外的其它实施方案中，可利用提供冷冻干燥物稳定性之适当赋形剂将优选实施方案之组合物配制为冷冻干燥物，且接着复水。

含有哺乳动物β防御素之药物组合物可根据常规方法，例如通过混合、造粒、包覆、溶解或冻干过程制造。

优选实施方案之药物组合物包含哺乳动物β防御素及药学上可接受之载剂和/或稀释剂。

哺乳动物β防御素优选在药物组合物中以有效治疗类风湿性关节炎之量，优选具有对患者可接受之毒性之量使用。对于该治疗，适当剂量当然依赖于例如所使用之本发明化合物之化学性质及药物动力学数据、个体宿主、施用模式及接受治疗之病状之性质及严重性而变化。然而，一般而言，为在较大哺乳动物，例如人中获得令人满意的结果，指示每日剂量优选为约0.001mg/kg体重至约100mg/kg体重，优选约0.01mg/kg体重至50mg/kg体重，更优选约0.05mg/kg体重至20mg/kg体重，且最优选约0.1mg/kg体重至约10mg/kg体重，例如以多至一天一、二、三、或四次之分开的剂量施用。优选实施方案之化合物可以通常使用之类似施用模式及类似剂量向较大哺乳动物，例如人施用。

在某些实施方案中，优选实施方案之药物组合物可包括哺乳动物β防御素(如人β防御素)，其量取决于施用途径为每单位剂型约0.5mg或更少至约1500mg或更多，优选约0.5、0.6、0.7、0.8或0.9mg至约150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg，且更优选约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25mg至约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg。然而，在一些实施方案中，比以上所提及之更低或更高的剂量可为优选的。本领域的技术人员可容易地确定适当的浓度及剂量。

本领域的技术人员熟知药学上可接受之载剂和/或稀释剂。对于配制成液体溶液之组合物，可接受之载剂和/或稀释剂包括盐水及无菌水，且可任选地包括抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂及其它常见添加剂。组合物也可配制成丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂(包覆或未包覆)、(可注射)溶液、固体溶液、悬浮液、分散液、固态分散液(例如呈安瓿、小瓶、乳膏、凝胶、糊状物、吸入剂粉末、泡沫、酊剂、唇膏、滴剂、喷雾剂或栓剂的形式)。配制物可含有(除哺乳动物β防御素及其它任选之活性成分外)载体、填充剂、崩解剂、流动调节剂、糖及甜味剂、芳香剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、增溶剂、调节渗透压之盐、缓冲剂、稀释剂、分散剂及表面活性剂、粘合剂、润滑剂和/或如本领域已知之其它药物赋形剂。本领域的技术人员可进一步以适当方式且根据公认操作法(如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Gennaro编，Mack Publishing公司，Easton，PA 1990中描述之操作法)配制哺乳动物β防御素。

哺乳动物β防御素可单独使用或与一种、两种或更多其它药物化合物或药物物质和/或一或多种药学上可接受之赋形剂之组合疗法使用。

体外合成

哺乳动物β防御素可使用如本领域已知的常规方法通过体外合成制备。多种商业合成装置是可用的，例如Applied Biosystems公司、Beckman等之自动合成仪。通过使用合成仪，可用非天然氨基酸、尤其D-异构物(或D-形式)(例如D-丙氨酸及D-异亮氨酸)、非对映异构物、具有不同长度或官能团之侧链等取代天然存在之氨基酸。特定序列及制备方式将由适宜性、经济性、所需纯度等确定。

可提供与包含便于键联的官能团之多种肽或蛋白质之化学连接，所述官能团对于酰胺或经取代胺形成(例如还原胺基化)而言为胺基，对于硫醚或二硫化物形成而言为硫醇基，对于酰胺形成而言为羧基等。

如果需要，在合成期间或表达期间可向肽中引入多个允许与其它分子或表面连接之基团。因此，可使用半胱氨酸制得硫醚，组氨酸用于连接于金属离子复合物，羧基用于形成酰胺或酯，胺基用于形成酰胺及其类似物。

也可根据重组合成之常规方法分离且纯化哺乳动物β防御素。裂解物可由表达宿主制备，且裂解物可使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其它纯化技术纯化。

本发明由下列实施例进一步描述，所述实施例不应理解为限制本发明之范围。

实施例

实施例1

评估胶原蛋白诱导之类风湿性关节炎模型中之人β防御素2

在测试hBD2之免疫调节效应期间，出乎意料地观察到hBD2具有巨大的抗炎潜力。

此处，我们已展示hBD2于小鼠中于胶原蛋白诱导之类风湿性关节炎模型中在治疗类风湿性关节炎中有显著的效果。

人β防御素2(hBD2)

重组产生hBD2。将编码hBD2之合成DNA片段(DNA 2.0)克隆入pET-32(+)表达载体(Novagen)中。所得质粒编码翻译融合肽，该翻译融合肽含有N-末端硫氧还蛋白部分，继之以his-标记、肠激酶裂解位点且最后为hBD2肽。将表达质粒转化入大肠杆菌(E.coli)菌株BL21中。

在含有100微克/毫升氨苄青霉素之TB-甘油中将该菌株之过夜培养物稀释100倍且在37℃生长至OD600为约8且用0.5mM IPTG诱导3小时，此后通过离心收集细胞。使用标准方案在Ni-NTA珠(QIAGEN)上纯化his标记之trx-hBD2融合肽。随后将his-标记纯化融合肽过夜透析于肠激酶缓冲剂(50mM tris-HCl(pH 7.5)、1mM CaCl₂)中，且用肠激酶裂解以释放成熟hBD2。使用Source 15S基质(Amersham Biosciences)由阳离子交换层析进一步纯化hBD2肽。使用MALDI-TOF质谱验证hBD2之修正分子量。

使用相同方案产生mBD3(参见实施例5)。

随后使用与LC-MS及NMR光谱学偶联之胰蛋白酶消化验证hBD2分子之适当折叠及二硫桥拓扑学。

由制备型RP-HPLC在低pH值移除内毒素，且由LAL测定(Endosafe KTA2)测定内毒素含量且发现该水平低于测定之检测限(0.05EU/mg)。为确定低于内毒素测定之检测限之水平不能刺激PBMC，作以极有效脂多糖(大肠杆菌，O111:B4，Sigma L4391)刺激之滴定曲线。极低水平之该LPS(0.06ng/ml)能够刺激PBMC产生可检测之细胞因子。

以下研究之目的在于确定人β防御素2在类风湿性关节炎之抗炎活性。

测试系统

物种/株：小鼠/DBA/1

来源：Harlan，UK

性别：雄性

动物数目：n＝50

年龄：年轻成鼠，研究起始时为6-8周龄。

体重：胶原蛋白诱导时研究动物之重量差异不超过平均体重之±20％。

动物健康状况：到达时检查该研究中所使用之动物之健康状态。仅使健康的动物适应实验室条件且用于研究中。

适应：至少7天。

安置：适应期间及给药后，将动物安置于入口受限之啮齿动物设施中且分组饲养于配备有硬底且填充刨花作为铺垫材料之聚丙烯笼(45cm×25cm×13cm)中，每组最多10只小鼠。每周更换笼一次。

食物及水：向动物提供可自由取得的商业啮齿动物膳食且动物可自由获取经由具有不锈钢吸管(sipper tube)之聚乙烯瓶供应至各笼之饮用水。至少每3周更换水瓶。每周更换水3次。

环境：设定自动控制之环境条件维持在20-24℃，相对湿度(RH)为30-70％，12/12小时光照/黑暗循环，且研究房内每小时换气10-30次。由人工测量与控制计算机每天监测温度及RH。由控制计算机监测光照循环。

鉴定：给予动物唯一的动物鉴定耳编号。该编号也呈现在各笼前端可见之笼卡上。笼卡也含有研究编号。

随机性：将动物随机分配至实验组中。

终止：研究结束时，通过吸入O₂/CO₂使存活动物安乐死，接着放血。

理由：选择小鼠，因为其代表该实验动物模型之精选物种。小鼠之DBA/1品系高度易罹患胶原蛋白诱导之关节炎(CIA)。

材料

人β防御素2(hBD2)；参见以上

地塞米松(Sigma，目录号D1756)

第II型牛胶原蛋白(MD Biosciences，目录号804001314)

完全弗氏佐剂(CFA)(MD Biosciences，目录号501009703)

PBS(PAA，目录号H15-002)

测试组之构成

表1：测试组及处理

组规模

组编号

测试化合物

途径

剂量

体积

摄生法

n＝10

A

媒剂对照组

IV

0mg/kg

5mL/kg

每天一次

n＝10

B

地塞米松

IP

1mg/kg

5mL/kg

每天一次

n＝10

C

hBD2

IV

10mg/kg

5mL/kg

每天一次

n＝10

D

hBD2

IV

1mg/kg

5mL/kg

每天一次

n＝10

E

hBD2

IV

0.1mg/kg

5mL/kg

每天一次

IV：静脉内

IP：腹膜内

测试程序

关节炎诱导

研究第0天(研究开始)，在轻度异氟烷麻醉下使用塑料注射器使所有动物于尾部皮内注射0.1ml第II型胶原蛋白/CFA乳液(每只小鼠200微克胶原蛋白)。注射位置位于离尾巴根部约1cm之大致尾距离处。第21天，通过腹膜内注射胶原蛋白及PBS向动物提供胶原蛋白激发(200μg/小鼠)。

处理

研究第14天开始处理且整个期间继续每天一次。研究第42天，终止(terminate)所有存活小鼠。

施用途径：

(i)hBD2：静脉内

(ii)地塞米松：腹膜内

(iii)媒剂对照：静脉内

剂量及体积剂量(也参见表1)：

(i)hBD2：10、1或0.1mg/kg，以5mL/kg

(ii)地塞米松：1mg/kg，以5mL/kg

(iii)媒剂对照：0mg/kg，以5mL/kg

止痛：研究期间不使用止痛剂。

观察及检查

关节炎反应

研究第0天、第14天、第21天及此后每周5次直至研究终止，检查小鼠之外周关节中之致关节炎抗原反应(arthritogenic response)的病征。根据按严重性之递增顺序之0-4量表报导各爪之关节炎反应，如下所示：

临床病征

第0天、第14天、第21天及此后每周5次进行细致临床检查并加以记录。观察结果包括皮肤、毛皮、眼睛、粘膜之变化、分泌及排泄(例如腹泻)之发生及自主活动(例如流泪、流涎、立毛、瞳孔大小、不寻常呼吸模式)。也记录步态、姿势及对处理之反应之变化以及奇怪行为、颤抖、抽搐、睡觉及昏迷之存在。

第14天之前，每天监测小鼠之任何不寻常行为。

体重

研究第0天、第14天、第21天及此后每周5次直至研究终止，在关节炎诱导前即刻测定动物之个体体重。

实验关节炎之测量

研究第0天、第14天、第21天及此后每周5次通过使用针盘卡尺(dial caliper)(Kroeplin，Munich，Germany)以mm为单位测量各动物之两后爪厚度(左侧及右侧，恰在足垫下方与跟骨上方)的相对变化。

研究终止

研究第42天，终止所有小鼠。

样本收集

研究终止时，在吸入O₂/CO₂后，自所有剩余研究动物获得终端血样。由各样本制备血清且储存在-20℃。另外，收集左侧前爪及后爪且储存于福尔马林中，且收集右侧前爪及后爪且快速冷冻以用于可能的关节RNA分析。

人道终点

人道地使可发现处于濒死状态之动物及显示重度疼痛且忍受重度痛苦病征之动物安乐死。另外，人道地使显示体重比最初体重测定值减小超过20％之动物安乐死。出于人道原因，也选出总关节炎评分为12或超过12之小鼠。通过吸入O₂/CO₂使所有动物安乐死，接着放血。自所有研究动物获得爪样本及终端血样。

统计分析

评估主要基于关节炎评分之平均值及爪厚度量度。适当时，应用适当的统计方法分析数据以确定处理效应之显著性。使用ANOVA，接着使用吐基事后分析(Tukey post-hoc analysis)(Excel之Winstat 2005.1)评定处理组之间的统计学差异。

根据内政部(Home Office)规定，因关节炎严重性而选出总临床评分等于或大于12之小鼠。为不因移除高评分小鼠而人为曲解数据，将所述小鼠终止时之临床评分继续用于剩余研究分析中。

动物照顾及使用处理

根据英国内政部关于科学程序中使用动物之规定执行本研究。

结果

表2：42天观察期期间在胶原蛋白诱导之雄性DBA/1关节炎小鼠中确定的平均临床关节炎评分。*p＜0.05显著不同于媒剂组。

结论

记录研究第14天以来所有组之关节炎反应。媒剂处理小鼠之平均总关节炎评分(表2)之峰值在研究第41天为8.5±0.72。经10mg/kg hBD2处理之小鼠(C组)之平均总关节炎评分的峰值在研究第40天为5.0±1.04。自第23天直至研究结束，该组之平均关节炎评分与媒剂处理小鼠相比较低，然而仅在研究第41天时显著。

经1mg/kg hBD2处理之小鼠(D组)之平均总关节炎评分的峰值在研究第41天为5.2±1.11且自第21天直至研究结束与媒剂处理组相比一直较低，然而仅在第40天时显著。与媒剂处理组相比，用0.1mg/kg hBD2处理小鼠(E组)并不显著降低平均总关节炎评分。该组之平均评分之峰值在研究第40天为9.0±0.77。自研究第26天直至研究结束，地塞米松处理组(B组)中之小鼠与媒剂处理组相比显示显著较低的关节炎评分。

为确保研究早期因关节炎严重性而选出之小鼠去除不会人为曲解数据，将该等小鼠之关节炎评分继续用于分析中直至研究终止。

实施例2

人β防御素2(hBD2)之抗炎活性

在人PBMC培养物中，观察到用hBD2治疗对LPS、LTA或肽聚糖刺激培养物之细胞因子谱产生重大影响。先前已观察到hBD2能够诱导促炎性细胞因子及趋化因子IL-6、IL-1β、RANTES、IP-10及IL-8(Niyonsaba等，2007；Boniotto M.等，2006)。

此处，我们显示hBD2对两种促炎性细胞因子TNF及1L-1β具有下调潜力；且hBD2在酯多醣(LPS)、脂磷壁酸(LTA)或肽聚糖(PGN)诱导炎性刺激后也诱导IL-10。IL-10为潜在抗炎细胞因子且因此所得hBD2之效应为抗炎效应。人PBMC、单核细胞细胞系及类树突细胞系(dendritoid cell line)已观察到该结果。

hBD系如于实施例1中所述制备。

分离及刺激PBMC

自健康志愿者(经丹麦相关伦理委员会批准)抽取外周血。用RPMI 1/1(v/v)稀释肝素化血液，且在抽取的2小时内使之进行Ficoll密度离心。自个别供体之上层收集血浆且保持在冰上直至其以2％用于培养基中(自体培养基)。将经分离PBMC重悬于自体培养基中且接种于96孔培养板中，每孔255,000个细胞，总体积为200微升。以100、10或1μg/ml hBD2单独刺激或与0.6ng/mL或20ng/mL LPS(大肠杆菌，O111:B4，Sigma L4391)、1.25μg/ml脂磷壁酸(LTA)(来自枯草杆菌(B.subtilis)，Sigma L3265)或40μg/ml肽聚糖(PGN)(来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)，Sigma 77140)一起刺激来自相同供体之PBMC。在最初实验中针对3种不同供体优化用于刺激之浓度，对于LPS，使用两种不同浓度以确保其处于有可能调节之细胞因子水平。在一些实验中，用地塞米松及吲哚美辛单独以及与LPS或LTA一起处理PBMC作为下调炎性细胞因子之对照。在37℃温育24小时后收集上清液，且储存在-80℃直至测量细胞因子。在所有实验中由Alamar Blue(Biosource，DALL1100)测量生存力，且在一些情况下也根据制造商之说明书由MTS(Promega)测量生存力，且在一些实验中，也通过以Nucleocounter计数细胞来判断。

培养及刺激MUTZ-3

将人骨髓白血病衍生之细胞系MUTZ-3(DSMZ，Braunschweig，Germany)维持在补充有20％[体积/体积(v/v)]胎牛血清(Sigma F6178)及40ng/mlrhGM-CSF(R&D Systems 215-GM-050)的a-MEM(Sigma M4526)中。所述祖细胞位于以下说明之单核细胞细胞系中且所述单核细胞用100、10或1μg/ml hBD2单独刺激或与LPS或LTA一起刺激。

树突细胞分化

为产生类树突细胞系，使人骨髓白血病细胞系MUTZ-3(1×10⁵个细胞/毫升)在rhGM-CSF(150ng/ml)及rhlL-4(50ng/ml)存在下分化成不成熟DC历时7天。每2-3天更换培养基。进一步在hBD2存在或不存在下用LPS或LTA刺激分化之细胞系以探索hBD2对树突细胞之效应。

细胞因子测量

在FACSarray流式细胞仪上根据制造商之说明书(BD)用人发炎细胞计数珠阵列(CBA)通过流式细胞术测量上清液中细胞因子之产生。测量以下细胞因子：IL-8、IL-1β、IL-10、TNF、IL-12 p70、IL-6。在一些实验中，根据制造商之说明书由R&D systems之ELISA套组(IL-10、TNF-α、IL-1β)测量细胞因子。

数据分析

所有实验执行至少两次，显示代表性结果。所呈现之数据可以平均值+/-标准偏差(SD)表示。由变量为治疗(hBD2、地塞米松等)及刺激(LPS、LTA、肽聚糖等)之双因子(2-way)ANOVA，然后是Bonferroni后检验(post-test)确定统计显著性，如表标注中所报导的。p＜0.05视为差异显著。

结果

测试hBD2对经或未经LPS及LTA治疗之人PBMC之效应(表1、2及3)。hBD2之治疗使得所有三个测试浓度之刺激培养物中之TNF显著下调(表1)，该下调对0.6ng/ml之LPS而言及对LTA而言系剂量依赖的。对于IL-1β，主要在最高剂量下观察到下调(表2)。引人关注的是IL-10剂量依赖性显著上调(表3)。促炎性细胞因子之下调及抗炎细胞因子之诱导显示hBD2之极强抗炎潜力。由两种不同测定测量生存力以排除hBD2归因于细胞毒性效应之抗炎效应。在表4及表5中，可见hBD2不对细胞产生细胞毒性效应，所观察到之效应为归因于导致细胞增殖之LPS或LTA之刺激的刺激效应。因此，hBD2对所述细胞不具有细胞毒性效应。

在表8、9及10中，由ELISA而不是由流式细胞术以细胞计数珠阵列分析另一供体之上清液之细胞因子，此处观察到相同结果，但测定之灵敏度较低且检测限高得多，且因此效应不显著。

为测试另一铎样受体配体，研究hBD2对肽聚糖刺激之PBMC的效应(表9及10)。观察到相同结果：TNF剂量依赖性下调且IL-10剂量依赖性诱导。

作为TNF下调之阳性对照，在测定中测试两种抗炎化合物，地塞米松及吲哚美辛。选择浓度以使化合物无毒且为由于培养基中之溶解度可实现之浓度。经LTA刺激后，仅吲哚美辛抑制TNF(表11)，而地塞米松有效下调TNF产生，IL-1β也观察到相同结果(表13)。吲哚美辛为COX-1及COX-2抑制物且为用于治疗轻度至中度疼痛之非类固醇抗炎药(NSAID)且有助于减轻关节炎之症状，且地塞米松为主要用于治疗炎性病症之合成糖皮质激素且其在极低剂量下对促炎性细胞因子具有极有效的下调效应(Rowland等，1998)，对于TNF-α及IL-1β，我们也观察到相同结果。hBD2与该两种抗炎化合物一样有效或比其更好。

在表14及15中，显示了hBD2对单核细胞细胞系中之下调TNF及树突细胞的效应，对PBMC也观察到相同结果。经hBD2及LPS或hBD2及LTA刺激之树突细胞也诱导IL-10(结果未显示)。

为排除hBD2与LPS或LTA之结合引起TNF及IL-1β之下调，测试hBD2对合成配体(Pam3CSK4(TLR2-TLR1配体)，InvivoGen tlrt-pms)所致之PBMC刺激的效应。在经该配体刺激后，hBD2也能够下调TNF，表明LPS或LTA之中和不会引起所观察到的效应(结果未显示)。此外，含有TNF-α及IL-α之细胞因子混合物(cocktail)连同hBD2对树突细胞之刺激与单独用细胞因子混合物之刺激相比对1L-1β及IL-8及IL-6具有下调效应。显然，未分析到归因于TNF-α之刺激之对TNF的效应(结果未显示)。

表3：在hBD2存在及不存在下经LPS或LTA处理后，自人外周血单核细胞(PBMC)产生TNF，所有样本针对相同供体测试，出自5个供体之代表性实验。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量TNF，***指由双因子ANOVA分析(各数据组之N＝约200)，与各自对照(粗体)相比，p＜0.001。

表4：在hBD2存在及不存在下经LPS或LTA处理后，自人外周血单核细胞(PBMC)产生IL-1β，所有样本针对相同供体测试，出自5个供体之代表性实验。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量IL-1β，***指由双因子ANOVA分析(各数据组之N＝约200)，p＜0.001。

表5：在hBD2存在及不存在下经LPS或LTA处理后，自人外周血单核细胞(PBMC)产生IL-10，所有样本针对相同供体测试，出自5个供体之代表性实验。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量IL-10，***指由双因子ANOVA分析(各数据组之N＝约200)，p＜0.001，**指p＜0.01，*指p＜0.5。

表6：由MTS检定测量之24小时刺激后PBMC之生存力。由双因子ANOVA，接着由邦弗朗尼事后检验检验，各列中具有不同下标字母之值差异显著。

表7：由阿拉马蓝(Alamar Blue)测量之PBMC生存力，出自5种不同供体之5个实验中之一个代表性实验。由双因子ANOVA，接着由邦弗朗尼事后检验检验，各列中具有不同上标字母之值及各行中具有不同上标数字之值差异显著。

表8：经hBD2、LTA、LPS或其组合刺激后PBMC之TNF-α分泌。由ELISA测量TNF-α，nd：未检测到，测定之检测限为0.01ng/ml，*指与各自对照相比，p＜0.05，**指与各自对照相比，p＜0.01。

表9：经hBD2、LTA、LPS或其组合刺激后，PBMC之IL-10分泌，由ELISA测量TNF-α，nd：未检测到，测定之检测限为0.03ng/mL。

表10：经hBD2、LTA、LPS或其组合刺激后，PBMC之IL-1β分泌，由ELISA测量TNF-α，nd：未检测到，测定之检测限为0.016ng/mL，**指与各自对照相比，p＜0.01。

表11：在hBD2存在及不存在下，经PGN处理后，自人外周血单核细胞(PBMC)产生TNF，所有样本针对相同供体测试。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量TNF，***指由双因子ANOVA分析(各数据组之N＝约200)，与各自对照相比，p＜0.001。

表12：在hBD2存在及不存在下，经PGN处理后，自人外周血单核细胞(PBMC)产生IL-10，所有样本针对相同供体测试。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量TNF，***指由双因子ANOVA分析(各数据组之N＝约200)，与各自对照相比，p＜0.001。

表13：在hBD2或抑制TNF之两种不同对照(地塞米松及吲哚美辛)存在及不存在下，经LPS或LTA处理后，自人外周血单核细胞(PBMC)产生TNF；所有样本针对相同供体测试。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量TNF，由双因子ANOVA分析(各数据组之N＝约200)，与各自对照(粗体)相比，加下划线之值显著减小。

表14：在hBD2或抗炎效应之两种不同对照(地塞米松及吲哚美辛)存在及不存在下，经LPS或LTA处理后，自人外周血单核细胞(PBMC)产生IL-10；所有样本针对相同供体测试。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量IL-10，由双因子ANOVA分析(各数据组之N＝约200)，与各自对照(粗体)相比，加下划线之值显著增加。

表15：在hBD2或抗炎效应之两种不同对照(地塞米松及吲哚美辛)存在及不存在下，经LPS或LTA处理后，自人外周血单核细胞(PBMC)产生IL-1β；所有样本针对相同供体测试。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量IL-1β，由双因子ANOVA分析(各数据组之N＝约200)，与各自对照(粗体)相比，加下划线之值显著减小。

表16：在hBD2存在及不存在下，经LPS或LTA处理后自人单核细胞细胞系(MUTZ-3)之上清液中产生TNF。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量TNF，*指由双因子ANOVA分析(各数据组之N＝约200)，与各自对照相比，p＜0.05，**指与各自对照相比，p＜0.01。

表17：在hBD2存在及不存在下，经LPS或LTA(产生成熟树突细胞(DC))刺激之不成熟树突细胞之上清液中产生TNF。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量TNF，*指由双因子ANOVA分析(各数据组之N＝约200)，与各自对照相比，显著减小之p＜0.05，***指与各自对照相比，显著减小之p＜0.01。

实施例3

hBD1、hBD2、hBD3及hBD4变体之抗炎活性

基本上如实施例2中所述进行实施例3。如下表中所示之化合物rhBD2为重组hBD2，其与实施例2中所使用之hBD2相同。

如下表中所示之化合物hBD1、hBD2、hBD3及hBD4变体系利用化学合成制备且自Peptide institute Inc获得。

重组hBD2(rhBD2)之氨基酸序列与由化学合成制备之hBD2之氨基酸序列相同。

下表中所示之hBD4变体由hBD4之氨基酸3-39组成，且氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

在各表中，所有样本针对对相同供体测试。SD意谓标准偏差。

结果

表18：在人β防御素、地塞米松或英利昔单抗存在及不存在下，经LPS治疗后，自人末稍血液单核细胞(PBMC)产生TNF。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量TNF，*指由双因子ANOVA分析且由邦弗朗尼事后检验与未处理细胞相比，p＜0.05，**指p＜0.01，***指p＜0.001。

表19：在人β防御素、地塞米松或英利昔单抗存在及不存在下，经LPS治疗后，自人外周血单核细胞(PBMC)产生IL-10。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量IL-10，*指由双因子ANOVA分析且由Bonferroni事后检验与未处理细胞相比，p＜0.05，**指p＜0.01，***指p＜0.001。

表20：在人β防御素、地塞米松或英利昔单抗存在及不存在下，经LPS治疗后，自人外周血单核细胞(PBMC)产生IL-1β。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量IL-1β，***指由双因子ANOVA分析且由Bonferroni事后检验与未处理细胞相比，p＜0.001。

测试hBD1、hBD2、hBD3及hBD4变体对经或未经LPS治疗之人PBMC之效应(表18、19及20)。为进行比较，在各情况中包括rhBD2。

对所有防御素而言，TNF下调。IL-1β分泌之减小可与TNF相当，但不如TNF明显。对hBD2及hBD4变体而言，IL-10之分泌剂量依赖性地显著增强。

也测试10μg/ml及40μg/ml之hBD3，且也测试40μg/ml之hBD4变体；然而，因为两种分子在所述浓度下对细胞有毒，所以不可能区分毒性效应与抗炎效应。

作为TNF下调之阳性对照，在该情况中包括两种抗炎化合物，地塞米松及英利昔单抗。

结论

所有测试之人β防御素均显示抗炎潜力。

实施例4

人单核细胞衍生的树突细胞及人PBMC之IL-23的减少

基本上如关于人PBMC之实施例2中所述进行实施例4；然而，读数为IL-23，而不是TNF、IL-1β及IL-10。此外，也研究rhBD2对人单核细胞衍生的树突细胞之效应。

单核细胞衍生的树突细胞(DC)之产生

根据Romani等最初描述之修改规程制备DC。简言之，通过Ficoll-pague(GE-healthcare)梯度离心自健康供体之血沉棕黄层(buffy coat)纯化外周血单核细胞(PBMC)。根据制造商之说明书通过磁珠(Dynal，Invitrogen)阳性选择CD14+细胞自PBMC分离单核细胞。在6孔板中在RPMI/2％人AB血清重组人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，20ng/ml)及IL-4(20ng/ml)(PeproTech)中将CD14+单核细胞培养6天，在2天及5天后补给培养基/细胞因子。培养6天后，于96孔板中再培养不成熟DC，浓度为1×10⁶个细胞/毫升，且不予处理或用混合物和/或hBD2再处理24小时。以四种浓度一式四份测试hBD2。使用含有LPS(100ng/ml)及IFN-γ(20ng/ml)之促发炎混合物分析hBD2之抑制hDC成熟变为促发炎表型之能力。在混合物之前20小时，添加地塞米松作为具有已验证之临床抗炎活性之化合物的阳性对照。在添加混合物之前4小时，与hBD2一起温育。

细胞因子ELISA

收集细胞培养物上清液且储存在-80℃。通过标准夹心ELISA使用商业上可用之抗体及标准物根据制造商之规程(eBioscience)测量IL-23之量。

MTT检定

使用基于MTT之细胞生长测定套组作为48小时后细胞存活之量度以评估是否有细胞严重受媒剂(vehicle)、混合物或hBD2处理影响，且根据制造商之规程(Sigma)进行。

统计分析

所有实验执行至少两次，显示代表性结果。所呈现之数据可以平均值+/-标准偏差(SEM)表示。通过变量为治疗(hBD2、地塞米松等)及刺激(LPS、LTA、肽聚糖等)之双因子ANOVA，然后是Bonferroni事后检验确定统计显著性，如表标注中所报导。p＜0.05视为差异显著。

结果

表21：以培养基(未刺激)或LPS及IFN-γ刺激且经培养基(未处理)、hBD2或地塞米松处理之人CD14⁺单核细胞衍生之树突细胞上清液中的IL-23(pg/ml)，平均值(SEM)，N＝4，出自三个中之一个代表性供体。*指由双因子ANOVA分析且由Bonferroni事后检验与未处理细胞相比，p＜0.05，**指p＜0.01，***指p＜0.001。nd：未检测到(低于检测限)。

表22：经培养基(对照)、0.6ng/ml LPS、20ng/ml LPS或5μg/ml LTA刺激且经hBD2、地塞米松或英利昔单抗处理之人PBMC上清液中的IL-23(pg/ml)，平均值(SEM)。*指由单因子ANOVA分析且由杜氏多重比较(Dunnett′s Multiple Comparison)事后检验与未处理细胞相比，p＜0.05，**指p＜0.01，***指p＜0.001。

如表21中所示，hBD2剂量依赖性显著抑制IL-23自人CD14⁺单核细胞衍生之树突细胞的分泌。

对于人PBMC，IL-23分泌也显著得到抑制(表22)。对所述细胞，存在倒转的(inverse)剂量依赖性，当测试较低剂量之hBD2时，发现其为钟形(bell-shaped)剂量-反应抑制曲线(数据未显示)。

此显示hBD2可通过抑制IL-23分泌在慢性自体免疫病状中具有抑制效应，因为IL-23为发炎反应之重要部分。Th17细胞之存活及增殖取决于IL-23，且已显示Th17细胞在数种自体免疫疾病(如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、牛皮癣及多发性硬化)中呈病原性。

实施例5

小鼠β防御素3(mBD3)使TNF自PBMC之分泌减少

基本上如关于人PBMC之实施例2中所述进行实施例5。使用与实施例1中用于hBD2之产生之相同规程制备小鼠β防御素3(mBD3)。mBD3之氨基酸序列显示于SEQ ID NO：6中。如下所述制备小鼠PBMC。

分离及刺激小鼠外周血单核细胞(PBMC)

自十只NMRI小鼠之血液中分离小鼠外周血单核细胞。简言之，用RPMI1/1(v/v)稀释肝素化血液，且在抽取后2小时内使之进行Ficoll密度离心。自上层收集血浆且舍弃。将经分离PBMC重悬于培养基(具有1％青霉素及链霉素及1％L-谷氨酰胺之RPMI 1640(Gibco，42401))中，且接种于96孔培养板中，每孔115,500个细胞，总计200μl。用100、10或1μg/ml hBD2或mBD3(小鼠β防御素3)单独刺激或与20ng/ml LPS(大肠杆菌，0111:B4，Sigma L4391)一起刺激来自相同供体之PBMC。向经或未经LPS刺激之培养物中添加3.5ng/ml地塞米松。在37℃温育24小时后收集上清液，且储存在-80℃直至测量细胞因子。

在FACSarray流式细胞仪上根据制造商之说明书(BD)用小鼠发炎细胞计数珠阵列(CBA)通过流式细胞术测量上清液中细胞因子之产生。

收集上清液后，由阿拉马蓝(Biosource DALL 1100)测量生存力。

结果

表23：在hBD2存在及不存在下，经LPS处理后，自人外周血单核细胞(PBMC)产生TNF，所有样本针对相同供体测试，出自两个供体中之代表性实验。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量TNF，***指由双因子ANOVA分析(N＝2)，与各自对照相比，p＜0.001。

表24：在mBD3存在及不存在下，经LPS处理后，自小鼠外周血单核细胞(PBMC)产生TNF，所有样本针对相同供体测试，出自两个供体中之代表性实验。在FACSarray上由细胞计数珠阵列(CBA)测量TNF，***指由双因子ANOVA分析(N＝2)，与各自对照相比，p＜0.001。

如表23中所示，小鼠β防御素3(mBD3)以与hBD2及地塞米松相同之程度下调TNF自人PBMC之分泌。mBD3也下调TNF自小鼠PBMC之分泌(表24)。

因此，在该情况中，mBD3展现极佳抗炎活性。

参考文献

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Claims

1.一种哺乳动物β防御素在制造用于治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中该哺乳动物β防御素系胃肠外施用，优选系皮下或静脉内施用。

3.根据权利要求1-2中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素系以约0.1mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，优选约0.1mg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天之剂量施用。

4.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素。

5.根据权利要求1-4中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素与SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4之氨基酸序列具有至少80％之同一性。

6.根据权利要求1-5中任一项的用途，其中该人β防御素为人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。

7.根据权利要求1-6中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素与SEQID NO：2之氨基酸序列具有至少80％之同一性。

8.根据权利要求1-7中任一项的用途，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素2。

9.一种治疗类风湿性关节炎的方法，该方法包括向需要所述治疗之受试者施用有效量之哺乳动物β防御素。

10.权利要求9的方法，其中该人β防御素系胃肠外施用，优选系皮下或静脉内施用。

11.权利要求9的方法，其中该人β防御素或其功能等效变体系以约0.1mg/kg体重至约100mg/kg体重，优选约0.1mg/kg体重至约10mg/kg体重之剂量施用。

12.权利要求9的方法，其中该哺乳动物β防御素为人β防御素。

13.权利要求9的方法，其中该哺乳动物β防御素与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4之氨基酸序列具有至少80％之同一性。

14.权利要求9的方法，其中该哺乳动物β防御素与SEQ ID NO：2之氨基酸序列具有至少80％之同一性。

15.权利要求9的方法，其中该人β防御素为人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。