CN102159219A - 提高转化生长因子-β信号发送的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明针对一种用于增强在个体(subject)转化生长因子-β信号发送的方法，其中包括对上述个体(subject)给予一个网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂，其数量足以增强转化生长因子信号发送。在另一个方面，本发明针对一种处理因转化生长因子-β信号发送减少相关状况的患者的方法，其中包括给予患者一个治疗有效量的网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂。

Description

提高转化生长因子-β信号发送的方法
相关应用 
这个申请要求在2008年9月16号提交的美国临时申请号61/097,302的优先权。以上所述应用的整个教学教义作为本申请的参考。 
政府支持 
这项发明，全部或部分，接受美国国立卫生研究院HL087463和AR052578资助。 
发明背景
转化生长因子(TGFβ)是一pleiotrophic细胞因子的家族系列，抑制大多数细胞类型(包括上皮细胞，内皮细胞和淋巴细胞)的生长。在哺乳动物中，转化生长因子-β家族系列包括转化生长因子-β1，-β2和-β3。转化生长因子-β是体内最有效或最强的细胞外基质合成和沉积的一种刺激剂。它在伤口愈合和组织纤维化扮演重要的角色。根据探讨研究的组织，它具有抗炎和促炎不同的活性。
在其抗炎的活性中，转化生长因子-β抑制T细胞，B细胞，巨噬细胞和NK细胞的活性并抑制几种促炎基因在这些细胞的表达(Piccirillo等，(1998)J.Immunol.161，3950-3956；Prud’homme and Piccirillo，(2000)J.Autoimmun.14，23-42；Li，M.等，(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.344，701-707)。由于它有调节生 长，抗炎和免疫调节的活性，转化生长因子-β已被确定为治疗若干疾病的标的。例如，转化生长因子-β体细胞基因治疗已被证明可用在非肥胖糖尿病小鼠上防止自身免疫性疾病(Piccirillo等，(1998)J.Immunol.161：3950-3956)。转化生长因子-β1注射液也已证明，在小鼠上可以防止胶原蛋白诱导的关节炎(Kuruvilla等，(1991)PNAS 88，2918-2921)和复发的实验性变态反应性脑脊髓炎(Johns等，(1991)J.Immunol 147，1792-1796)，这两种疾病分别为风湿关节炎模型和多发性硬化的模型。转化生长因子-β注射液也可防止同种异体移植排斥的反应。此外转化生长因子-β也已被证明在心血管系统的脉粥样硬化中扮演一个防护性的重要角色(Wallick等，(1990)J.Exp.Med.172，1777-1784).(1995)(Grainger D.J.(2004)，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.，24，399-304；Metcalfe and Grainger(1995)，Biochem.Soc.Trans.23，403-406)。例如，它已被证明升高胆固醇造成动脉粥样硬化的一个机制是因为高量胆固醇使血管细胞对转化生长因子-β的反应降低(Chen等，(2007)J.Cell Sci.120，3509-3521；Chen等，(2007)J.Cell Sci.120，3509-3521)。此外转化生长因子-β在癌变扮演另外一个复杂的角色。在癌变早期，这个细胞因子被认为是具有抑制肿瘤活性，但在以后的阶段，它的肿瘤抑制活性会丢失，反而变成一个肿瘤生长的促进剂(Derynck等，(2001)J.Nat.Genet 29，117-129)；Piek and Roberts(2001)Adv.Cancer Res.83，1-54；Stover等，(2007)，J.Cell Biochem.101，851-861)。因为降低转化生长因子-β信号发送，而引起的疾病或状况，包括阿尔茨海默病((Tesseur等，(2006)J Clin Invest.116，3060-3069；Das等，(2006)J.Clin.Invest.116：2855-2857)，系统性红斑狼疮((Ohtsuka等，(1998)J.Immunol.，160：2539-2545)，慢性伤口(Kim等，(2003).J.Cell.Phys.，195(3)：331-6)，慢性阻塞性肺疾病(Baraldo等，(2005)Thorax 60：998-1002)，炎症性肠道疾病((Fiocchi等，(2001)，J.Clin.Invest.108(4)：523-526)，格林巴利综合征(Creange等，(1998)，J  Neurol Neurosurg Psychiatry 64：162-165)，大肠直肠癌(Markowitz等，Science 268，1336(1995)，Valle等，(2008)Science：321，1361)。
由于转化生长因子-β可以用来治疗几种疾病和改善健康状况，发展确认一些可以增强转化生长因子-β的信号发送或增加细胞对转化生长因子-β反应的化剂将是有益的。
本发明的概要
本发明是基于一个令人惊讶的发现就是，网格蛋白依赖(clathrin-dependent)内吞作用的抑制剂能够增强转化生长因子-β信号发送。例1所示，在网格蛋白依赖的内吞作用抑制剂提高转化生长因子-β诱导的信号发送(即转化生长因子-β刺激Smad2的磷酸化和核本地化)。
本发明涉及一种提高转化生长因子-β在信号发送的方法，包括注入网格蛋白依赖的内吞作用的抑制剂，其数量足以增强转化生长因子-β信号发送。
在另一个方面，该发明是针对一种治疗方法，施给因为降低转化生长因子-β的信号发送相关联的病人，一种治疗有效量的网格蛋白依赖的内吞作用抑制剂。
在另一个方面，该发明是针对一种治疗方法，施给癌变的病人治疗有效量的网格蛋白依赖的内吞作用抑制剂。
在进一步的例子，本发明是一种药物组合物包括一种治疗有效量网形蛋白依赖的内吞作用抑制剂和一种HMG-CoA还原酶抑制剂。
优选实施例图画的简要说明
上述及其它对象及这个发明的特点和优势，从以下这个更具体的描述的例子会很明显。其中的参考附图作更详细的说明。图画没有一定的规格，而是着重在发明的原则。
图1显示在Mv1Lu细胞，网格蛋白依赖的内吞作用抑制剂会提高转化生长因子-β1刺激引起的Smad2的磷酸化和核定位(A-I，K)。这些细胞先用10毫克/毫升的环糊精β-CD(A，K)，20μM的MDC(B)，40μM的Monensin(C)，20μM的TFP(D)和0.45M的sucrose(K)或不同浓度的(如图所示)，环糊精(β-CD)(E)和TFP(F)，monensin(G)，(氯喹)chloroquine(H)，dynasore(I)，在37℃处理1个小时，然后用100pM转化生长因子-β1(加或不加)刺激(A至I)或不同浓度(如图所示)的转化生长因子-β1(K)。在37℃经过不同的时间(如图所示)，细胞裂解液进行7.5％SDS分析，西方墨点法分析，用P-Smad2和Smad2的抗体和化学发光发展(a或顶部)和密度定量(b或底部)来分析。P-Smad2相对的表达水平用任意单位来表示(AU)A，B，C，D，K)(b)在转化生长因子-β细胞单独处理的P-Smad2的相对水平作为100％(底部E至I，)。数据显示是3个独立实验的代表。(J)细胞先用10毫克/毫升的β-CD在37℃处理(c，d)，1小时后，这些细胞用100pM转化生长因子-β刺激(b，d)与没有转化生长因子-β刺激(a)，在37℃，30分钟后，细胞被固定并用P-Smad2的抗体，进行间接免疫荧光染色。放大率是200倍。数据显示是3个独立实验的代表。
图2显示网格蛋白依赖的内吞作用抑制剂加强SARA与TβR-I共存在及积累在Mv1Lu细胞质膜。细胞先用与20μM的TFP，10毫克/毫升的β-CD，40uM的dynasore(Dyn)或200μM的(氯 喹)choloquine(CQ)处理，37℃，1小时。处理过的细胞，然后用100pM的转化生长因子-β1刺激或不加转化生长因子-β1。经过30分钟在37℃下，细胞被固定并用TβR-I，SARA的抗体，进行间接免疫荧光染色(小图1-10显示TβR-I，)和SARA(小图11-20)，DAPI(核染色)(小图21-30)。显示合并后的染色(小图31-40)。插图(小图33-36内)显示SARA与TβR-I共存在与积累在细胞膜。
图3显示在Mv1Lu细胞，笼形蛋白依赖性的细胞内吞作用抑制剂增转化生长因子-β刺激PAI-1的表达。(A-G)细胞先处理不同浓度(如图所示)的β-CD(A，C)，thioridazine(B)，TFP(D)，氯喹(chloroquine)(E)，莫能菌素(monensin)(F)and MDC(G)在37℃下1小时，，然后用50pM转化生长因子-β1刺激。在37℃，经过2小时，细胞裂解液中PAI-1和G3PDH的mRNA的表达由北方杂交分析(上)和使用PhosphoImager量化(下)(A，B)或real-time RT-PCR检测(C-G)。实验一式三份实施。显表数据的是3个独立实验的代表。在没有转化生长因子-β刺激的PAI-1的表达数据是作为100％(A，B)或1倍(C到G)。实验共进行了一式三份。*显示数值比无抑制剂处理的对照组有显著的统计上的差异，p＜0.001。**显示数值比无抑制剂处理对照组有显著的统计上的差异，P＜0.05。(H)细胞先用不同浓度(如图所示)的dynasore在37℃处理1小时，然后用50pM转化生长因子-β1刺激。经过2小时在37℃，用real-time RT-PCR定量PAI-1的mRNA。用转化生长因子-β1单独处理作为1(100％)。实验共进行了一式三次。该显示的数据是3个独立的实验的代表。
图4显示了野生型和ApoE无效的老鼠的冠状动脉组织学分析(A)和TβR-II免疫荧光染色(B)。野生型和ApoE无效的老鼠，没有dynasore处理(DMSO溶剂a，c)或1毫克dynasore/ 千克体重(b，d)处理每两天一次一共进行了8周。冠状动脉组织学分析H&E染色(A)和用TβR-II抗体进行间接免疫荧光染色分析(B)。星号(*)指示冠状动脉管腔的位置。该箭头表示在主动脉内皮有TβR-II的免疫染色。
发明的详细说明
本发明的优选实例说明如下。
在该条款中，“一个”或“一个”是指以包括一个或多个，除非另有规定。
本发明是针对提高转化生长因子-β信号发送或增加转化生长因子-β的反应方法，包括用一种网格蛋白依赖内吞作用的抑制剂。本发明还针对各种疾病或健康状况以借着增强转化生长因子-β信号发送或增加转化生长因子-β的反应。给于治疗或改善。
本文中所使用的术语“转化生长因子-β”包括转化生长因子-β1和转化生长因子-β2，转化生长因子-β3和转化生长因子-β的突变体(如转化生长因子-β蛋白表现相似的生物活性和不同于天然转化生长因子-β蛋白的简单或多个突变，例如更换，增加或省略一个或以上的氨基酸)。当血浆转化生长因子-β水平增高或当一个细胞对转化生长因子-β反应的信号发送增加时，转化生长因子-β信号发送会增强。血浆中转化生长因子-β的水平在不同条件下可以有所不同。例如，当转化生长因子-β基因在组织细胞中的表达增加时或转化生长因子-β的分解受到抑制时，血浆中转化生长因子-β水平可以增加，增强转化生长因子-β信号发送可以使一个细胞对转化生长因子-β的反应增加。例如，借着转化生长因子-β刺激Smad2的磷酸化，网格蛋白依赖(chatherin-dependent) 细胞内吞作用抑制剂会增强细胞对转化生长因子-β反应。真核细胞利用网格蛋白依赖和不依赖的两个内吞途径。网格蛋白依赖内吞作用的特点有三个阶段：有被小窝的形成(formation of the coated pit)，有被小窝的内陷(invagination of the coated pits)和有衣小泡的箍断(pinching off of the coated vesicles)(Mousavi等，2004)。在这里所谓一个“笼形蛋白依赖的内吞作用抑制剂”是一个化剂可以利用任何机制来抑制网格蛋白依赖内吞作用。根据本发明，可用于抑制网格蛋白依赖的内吞作用的化剂是：甲基-β-环糊精(β-CD)，hydrophobic amines(如吩噻嗪(phenothiazines)，monodansylcadaverine和氯喹(chloroquine))，莫能菌素(monensin)，高渗蔗糖(hyperosmotic sucrose)和dynasore。吩噻嗪(Phenothiazines)包括但不限于，氯丙嗪(chlorpromazine)，氟奋乃静(fluphenazine)，mesoridazine，奋乃静(perphenazine)，prochlorperazine，promazine，甲硫达嗪(thioridazine)，三氟拉嗪(trifluoperazine)and triflupromazine。β-CD借着有选择性地去除细胞质膜的胆固醇来抑制网格蛋白依赖的内吞作用。hydrophobic amines影响网格蛋白和笼形蛋白包被小泡的功能来抑制网格蛋白依赖的内吞作用。莫能菌素借着消散质子梯度(proton gradient)来抑制网格蛋白依赖的内吞作用。高渗蔗糖借着防止网格蛋白和适配器(adaptors)交互作用来抑制网格蛋白依赖的内吞作用。dynasore抑制dynaminGTPase，这个dynamin GTPase抑制剂对有被小窝的的形成有利。
在一个实施例中，网格蛋白依赖的内吞作用抑制剂是抑制有衣小泡从细胞质膜的箍断。在另一实施例中，网格蛋白依赖的内吞作用抑制剂是能够刺激细胞PAI-1的表达(PAI-1是一个细胞对转化生长因子-β刺激响应的基因)。在另一个的实施例中，dynasore本身是网格蛋白依赖的内吞作用抑制剂，而且它本身有 表现转化生长因子-β的活性，它也是转化生长因子-β的模仿体或拟态体。
在某些实施例中，网格蛋白依赖的内吞作用抑制剂是一种dynaminGTPase抑制剂。在进一步的体现，dynasore本身是dynamin GTPase抑制剂。dynasore具有式(I)的化学结构：
Figure BPA00001330495200081
本发明还包括一种方法用来治疗由于转化生长因子-β信号发送减少而造成的疾病。转化生长因子-β信号发送减少有关的疾病，包括但不限于，发炎症，自身免疫疾病，癌症，心血管病和某些皮肤病。发炎症包括但不限于，多发性硬化症(multiple sclerosis)。在某些实施例中，发炎症是一群病的组合包括阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)，哮喘(asthma)，慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease)，多发性硬化症(multiple sclerosis)，类风湿关节炎(rheumatoid arthritis)，动脉粥样硬化(atherosclerosis)，Guillan-Barre综合征，系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)。在另一例子，动脉粥样硬化是一种由于发炎造成的症状。
在一方面，本发明是一种治疗心血管疾病中的一个方法，其中包括给病人一个治疗有效量的一种笼形蛋白依赖的内吞作用的抑制剂。
本发明还针对一个治疗一种皮肤症状的方法。这症状是有关皮肤组织的异常增殖和/或生长，示例的疾病是银屑病(psoriasis)，基底细胞癌(basal cell carcinoma)，鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)，角化棘皮瘤(keratoacanthoma)，光化性角化病(actinic keratosis)，X连锁鱼鳞病(X-linked ichthyosis)，痤疮(acne)，皮炎(dermatitis)和表皮角化过度(epidermolytic hyperkeratosis)。
本发明是还针对另外一个方法用于治疗癌症，其中包括给病人一个治疗有效量的一种笼形蛋白依赖的内吞作用的抑制剂。示范性肿瘤包括恶性肿瘤(malignant tumors)，腺癌(adenocarcinomas)，癌(carcinomas)，肉瘤(sarcomas)，恶性肿瘤(malignant neoplasms)，白血病(leukemias)和上皮细胞来源癌症(epithelial cell derived)。上皮细胞衍生癌症的例子包括但不限于：乳腺癌(breast cancer)，结肠癌(colon cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，肺癌(lung cancer)和前列腺癌(prostate cancer)。在另一的例子，该方法涉及到从病情的治疗包括黑色素瘤(melanoma)，骨髓瘤(myeloma)，淋巴瘤lymphoma组成，包括给一种笼形蛋白依赖的内吞作用的抑制剂。由本发明方法处理的癌症。可包括对任何来源如染色体异常(chromosomal abnormalities)，变性的生长(degenerative growth)和退化发育障碍(developmental disorders)，有丝分裂剂(mitogenic agents)，紫外线辐射(UV)，病毒感染(viral infections)，癌基因(oncogenes)，突变基因(mutations in genes)，一个基因在细胞的不适当的表达，或致癌剂。
在另一实施例中，本发明是针对一种治疗方法包括给病人一个治疗有效量的一种笼形蛋白依赖的内吞作用的抑制剂。这个症状的特征是有关因生长因子-β信号发送减少。其中特点是转化生 长因子-β信号发送减少不是由肺炎衣原体感染(Chlamydia pneumoniae infection)引起的。
在其它实施例中，本发明是针对一种治疗方法包括给病人一个治疗有效量的一种网形蛋白依赖的内吞作用的抑制剂来抑制癌变。抑制癌变包括防止有关癌症的发生或癌前状态或缓慢，停止或逆转恶化的癌症或癌前状态。癌前状态包括，例如，增生(hyperplasia)，化生(metaplasia)，异型增生(dysplasia)，口腔白斑(oral leukoplakia)，光化角化(actinic keratosis)太阳能角化(solar keratosis))，结肠癌或直肠癌(precancerous polyps of the colon or rectum)的癌前息肉，胃上皮不典型增生(gastric epithelial dysplasia)，腺瘤性发育异常(adenomatous dysplasia)，遗传性非息肉性结肠癌综合征(HNPCC)(hereditary nonpolyposis colon cancer syndrome(HNPCC))，Barrett食管(Barrett′s esophagus)，膀胱发育不良(bladder dysplasia)，子宫颈癌前(precancerous cervical)状况。
在另一个方面，该发明是一种治疗心血管疾病的方法在其中包括给病人一种治疗有效量的网格蛋白依赖的内吞作用抑制剂。在另一个方面，本发明是针对一种治疗方法给病人一个治疗有效量的一种笼形蛋白依赖的内吞作用的抑制剂来治疗心血管疾病。
本发明是针对一种治疗方法包括给病人一个治疗有效量的dynasore来治疗心血管疾病。在一个实施例，心血管疾病就是动脉粥样硬化。另一的例子，本发明还包括给予3-羟基-3-甲基辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)的抑制剂。在进一步的例子，HMG-CoA还原酶抑制剂是一种他汀类药物(statin)。他汀类药物包括洛伐他汀模范(lovastatin)，辛伐他汀(simvastatin)，普伐他汀(pravastatin)，氟伐他汀(fluvastatin)，阿托伐他汀(atorvastatin)，伊伐他汀(itavastatin)，罗苏伐他汀(rosuvastatin)和利伐他汀 (rivastatin)。本发明还针对包括对患心肌梗塞的风险病人，给一种网格蛋白依赖的内吞作用抑制剂在以防止心肌梗死。有高水平低密度脂蛋白(LDL)的病人会有患心肌梗塞的风险，病人会遭受动脉粥样硬化的痛苦。
在该条款中，“治疗”或“疗法”包括防止或延缓一种疾病的发病症状，并发症，或生物化学的标记，或减轻或减轻症状或制止或抑制的进一步发展疾病，状况或疾病。一个“治疗有效量”是一个量，其中单独或与一个或多个其它活性剂相结合，可以控制，降低，抑制，改善，防止或其它方面影响一个或多个症状疾病或状况来对待。在该条款中，一个一笼形蛋白依赖的内吞作用抑制剂的治疗的有效量是足以提高转化生长因子-β信号发送。
本发明还包括一种药物组合物，包括一治疗有效量的一种笼形蛋白依赖的内吞作用抑制抑制剂和HMG-CoA还原酶抑制剂。在一个实施例中，网格蛋白依赖的内吞作用抑制剂是dynasore本身。在另一实施例中，HMG-CoA还原酶抑制剂是一他汀类药物(statin)。
药物组合物包括一种在药学上可接受的载体或赋形剂。在药学上可接受的载体或赋形剂是根据在治疗中预期的给药途径来选择。给药的途径取决于如何处理病症。例如，治疗系统性疾病如白血病或淋巴瘤可能是首选静脉注射，治疗肠胃系统疾病首选口服。一个熟练的技士根据标准用量反応关系，可以决定服用方法和用量，避免不必要的实验手段。在作出决定的时候，必须考虑处理的相关情况包括一个或是多种状况，药物的选择，年龄，体重，和个别病人的反应，和病人的症状严重程度。
因此，根据不同的状况，药物可以口服，非肠道(肠外)，滴鼻，阴道，直肠给药，舌，舌下含服，颊地(buccally)，intrabuccaly和皮下(transdermal)给病人。因此，设计口腔，舌，舌下，颊，intrabuccal服用的药物可利用已知道的方法，避免不必要的实验手段，例如使用惰性稀释剂或与食用载体。该药物可以包含在明胶胶囊或压缩成片。对于口服治疗的药物，本发明的药品的成分可以与赋形剂合并并且用于片剂的形式的，锭剂、胶囊、药酒、悬浮液、糖浆、芯片、口香糖及类似品。
片剂，丸剂，胶囊剂，锭剂及类似品也可以含有粘合剂，辅料剂，崩解剂，润滑剂，甜味剂和调味剂。一些粘结剂的例子包括微晶纤维素(microcrystalline cellulose)，黄蓍树胶(gum tragacanth)或明胶(gelatin)。辅料剂的例子包括淀粉或乳糖。崩解剂的一些例子包括藻酸，玉米淀粉等等。润滑剂的例子包括：硬脂酸镁或硬脂酸钾。一个助流剂的例子是胶体硅二氧化碳。甜味剂的一些例子包括蔗糖，糖精及类似品。调味剂的例子包括薄荷，水杨酸甲酯，橙香味等等。
本发明的成分可经由肠外吸收，例如，通过静脉注射，肌肉注射，鞘内注射或皮下注射。肠外可以通过整合本发明的组成为一溶液或悬浮液。这种溶液或悬浮液也可以包括无菌的稀释剂如注射水，生理盐水，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶剂。肠外配方中还可能包括，例如，抗菌剂苯甲醇或者甲基苯甲酸酯，抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂如EDTA。缓冲剂，如醋酸，柠檬酸或磷酸盐和调整剂，如氯化钠或葡萄糖也可加入。肠外制剂可以包装在安瓿，一次性注射器或多剂量玻璃或塑料制成的小瓶。
直肠给药，包括给药物组合物药经过直肠或大肠。这可以使用栓剂或灌肠。栓剂可以很容易地已知的方法制备。例如，可以 加热甘油到约120℃，以溶解在甘油中的果胶成分，可以加入纯净水于加热甘油混合后，倒入混合物模具作成栓剂。
透皮给药包括经皮吸收通过皮肤的成分。透皮制剂包括补丁，药膏，乳霜，凝胶，药膏等等。
下面的例子进一步说明本发明，但不应以任何解释来限制其范围。
范例1：网格蛋白依赖内吞抑制剂加强转化生长因子-β信
号发送和反应
摘要
网格蛋白依赖的内吞作用被认为是与转化生长因子-β刺激细胞的反应有关，但转化生长因子-β诱导的信号发送在细胞内何处发生仍然不清楚。在这里我们说明，网格蛋白依赖的内吞作用抑制剂可以停止涂坑发展阶段的内吞作用，抑制细胞表面结合转化生长因子-β的内化和促进TβR-I和SARA在细胞膜的共定位和积累，这些作用是众所周知。这些抑制剂可以提高转化生长因子-β诱导的信号发送(比如Smad2的磷酸化/核定位和PAI-1的表达)。而且，dynasore是新确定的一个dynamine GTPase活性抑制剂，在所有测试中，它是一种最有效的抑制剂，也是一种有效的转化生长因子-β增强剂。而且，dynasore本身可以改善高胆固醇的ApoE无效的老鼠的血管内皮细胞的动脉粥样硬化，因为它可以抵消高胆固醇压制转化生长因子-β的反应灵敏度。这个作用相信借着它影响转化生长因子-β在血管细胞内吞作用和信号发送。
转化生长因子-β是一pleiotrophic细胞因子的家族系列。在哺乳动物中，转化生长因子-β家族包括转化生长因子-β1，-β2和-β3。这是一个具有双重功能的生长调节剂1。它抑制大多数细胞类型增长，包括上皮细胞，内皮细胞和淋巴细胞，它能刺激间质细胞的生长。转化生长因子-β的生长调节的活性跟致癌性，免疫调节和细胞分化有牵连的。转化生长因子-β是已知最有效细胞外基质合成和沉积的刺激剂。它在伤口愈合和组织纤维化扮演重要的角色。取决于研究的组织，转化生长因子-β具有消炎和促炎的活性。由于其抗发炎和免疫的活性，转化生长因子-β在心血管系统的动脉粥样硬化是个保护性的细胞因子2，3。
转化生长因子-β的刺激活性是因为它能在细胞质膜诱导形成heterooligomeric转化生长因子-β受体复合物4，5。在这个受体复合物的里头，基本活性的II型转化生长因子-β受体(TβR-II)，使I型转化生长因子-β受体(TβR-I)磷酸化来激活。这个激活和磷酸化的I型转化生长因子-β受体(TβR-I)能够磷酸化Smad2和Smad3。这个磷酸化可以被Smad蛋白锚定受体(SARA)促进6，7。磷酸化的Smad2/Smad3跟Smad4结合，转运到并累积在细胞核内。在细胞核内，它们调节反应基因的转录。Smad7对转化生长因子-β信号发送是一个负面的调节剂。它是跟与脂筏(lipid rafts)/细胞质膜微囊(caveolae)结合，转化生长因子-β/转化生长因子-β受体分解8，9。细胞对转化生长因子-β的反应是由转化生长因子-β选择在网格蛋白依赖性和细胞质膜微囊依赖内吞作用的路径来决定，8-12。前者促进信号发送和细胞反应，而后者则导致转化生长因子-β/转化生长因子-β受体的迅速分解而降低转化生长因子-β细胞反应灵敏度8-12。虽然网格蛋白依赖的内吞作用是参与信号发送3，6-15，其中转化生长因子-β诱导细胞内的信号发送路径仍然不清楚的16。
核内体(Endosome)被认为是转化生长因子-β诱导的信号发送的重要的调节器(mediator)3，8-15。这基于观察到超表达dynamin负变株K44A会抑制转化生长因子-β受体内化和转化生长因子-β诱导的细胞反应，还有SARA与内体标记共定位在核内体8，13。不过，Lu et.al16展示到超表达dynamin K44A表达抑制转化生长因子-β受体内部化，但不改变转化生长因子-β诱导的信号发送和它的细胞反应。些关于核内体转化生长因子-诱导的信号发送和转化生长因子-β感应的细胞反应扮演的角色有矛盾的结果，这是由于不同的dynamin负变株K44A8表达量不同和由于用的实验性的系统不同的结果8，16。要定义确定转化生长因子-β诱导的信号发送的细胞位点，我们用几个已知作用的网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂，包括dynamin抑制剂dynasore17，18，来研究这些关于核内体转化生长因子-β诱导的信号发送和转化生长因子-β细胞反应。此方法是避免因dynamin K44A的表达量的不同而产生不同结果的变通方法。
有一些化合物已被证明能够抑制网格蛋白依赖内吞作用。这些包括甲基-β-环糊精(β-CD)19，吩噻嗪20-22，monodansylcadaverine(MCD)23，氯喹24，莫能菌素25，高渗蔗糖渗26和dynasore17，18。β-CD借着有选择性提取细胞膜胆固醇来抑制网格蛋白依赖的内吞作用。疏水胺类例如吩噻嗪，氯喹和MDC等影响网格蛋白和笼形蛋白包被小泡的功能来抑制网格蛋白依赖的内吞作用20，24。莫能菌素是单价的离子载体，借着消散质子梯度来抑制网格蛋白依赖的内吞作用25。高渗蔗糖借着防止网格蛋白和适配器(adaptors)交互作用来抑制网格蛋白依赖的内吞作用。而且，dynasore本身是一个能够渗透细胞的dynamin GTPase活性的抑制剂，这个dynaminGTPase抑制剂在内吞作用的过程对有被小窝的的形成有利17，18。
如同先前报告一样6-15，如果转化生长因子-β信号发送在核内体中发生，网格蛋白依赖的细胞内吞作用的抑制剂预计会削弱转化生长因子-β的信号发送如Smad2磷酸化和核的定位4，5。为了要测试这个理论，Mv1Lu细胞用或用网格蛋白依赖的内吞作用抑制剂处理在37℃，30分钟，然后用或没用100pM转化生长因子-β处理。在几个时段，使用P-Smad2和Smad2抗体，蛋白印迹分析分析细胞P-Smad2和Smad2。如图1所示的，β-CD、MDC、莫能菌素和三氟普马嗪(TFP)都能使转化生长因子-β受激Smad2磷酸化增强，它的增强的方式与时间有关(分别为图1Aa，1Ba，1Ca和1Da)。如果用转化生长因子-β刺激60分钟，β-CD、TFP、MDC和莫能菌素，增强转化生长因子-β受激Smad2磷酸化～1.5-2.5倍(分别为图1Ab，1Bb，1Cb，1Db)。为了进一步调查，这些抑制剂对Smad2磷酸化的影响，细胞在不同浓度的抑制剂，在37℃，先处理30分钟，然后再用100pM的转化生长因子-β在37℃刺激30分钟后，细胞液用蛋白印迹分析。如图1E至1I所示、β-CD、TFP，莫能菌素(monensin)，氯喹(chloroquine)和dynasore增强的转化生长因子-β受激Smad2的磷酸化随着浓度的增加而增强。以10毫克/毫升的β-CD，TFP(24μM)、莫能菌素(40μM)、氯喹(200μM)和dynasore(40μM)，都增强转化生长因子-β受激Smad2磷酸化～2-3倍。为了要确定β-CD在P-Smad2的转化生长因子-β受激核定位上的作用，Mv1Lu细胞先用或不用β-CD(10毫克/毫升)在37℃，处理一个小时，再用转化生长因子-β(10pM)处理30分钟，再用间接的荧光染色分析来看P-Smad2的核定位。如图1J所示的，β-CD和转化生长因子-β一起促进P-Smad2(d)的核定位，然而每一个独自存在就没有促进P-Smad2的核定位(b和c)。
在这里测试的细胞内吞作用抑制剂，能抑制细胞内小泡从质膜的箍断(核内体的形成)，以及使其停留在涂布的坑阶段，而阻止细胞内吞作用过程17-26。这表明对转化生长因子-β信号发送， 涂布的坑的阶段在网格蛋白依赖的细胞内吞作用过程中，它扮演一个重要的角色。为了要确定涂布的坑阶段在转化生长因子-β信号发送是重要的，我们用高渗的蔗糖(0.45M)或β-CD处理Mv1Lu细胞，再检查这些细胞中转化生长因子-β受激Smad2的磷酸化。高渗的蔗糖被认为能抑制浅的有被小窝(类型1的有被小窝)的形成或受体的集群26。在网格蛋白依赖的细胞内吞作用过程，β-CD被认为能抑制从浅的有被小窝(类型1有被小窝)以反折有被小窝(类型2有被小窝)的进展19。如图1K所示的，在用不同浓度的转化生长因子-β处理细胞，高渗的蔗糖能抑制转化生长因子-β受激Smad2的磷酸化(图1Ka和1Kb)。在与100pM转化生长因子-β一起刺激的细胞中，高渗的蔗糖削弱Smad2磷酸化～60％(图1Kb)。另一方面，在不同浓度的转化生长因子-β，β-CD确实能增强TGF-β1受激Smad2的磷酸化。与没有β-CD处理相 比，β-CD能增强转化生长因子-β受激Smad2磷酸化～2-4倍(图1Ka和1Kb)。这些结果建议转化生长因子-β信号发送在类型1的有被小窝阶段发生。
在TβR-I-SARA-Smad2配合物中，借着诱导TβRI和SARA(作为用于Smad2的锚定物)的结合，SARA和Smad2的结合，TβRI使Smad2的磷酸化，导致转化生长因子-β刺激Smad2磷酸化6，7。如果网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂增强TGF-β-信号发送(转化生长因子-β-受激Smad2磷酸化)，是借着增加TβR-I/TβRII配合物在有被小窝的积累，他们应当促进TβRI和SARA在质膜的共本地化和积累。为了要测试这个理论，Mv1Lu细胞被100pM转化生长因子-β刺激，。在37℃，30分钟，细胞其再次用抑制剂处理，再使用TβRI和SARA的抗体，进行荧光免疫检验法的显微术分析。图2展示，在Mv1Lu细胞，转化生长因子-β独自刺激TβRI和SARA在有被小窝(核内体)的共本地化和积累(图2，面板32对面板31)。这和以前的报告说：转化生长因子-β增强转 化生长因子-β受体内部化是符合的16。不过，共处理转化生长因子-β和TFP，β-CD，dynasore，或氯喹促进TβRI和SARA在质膜共本地化和积累(图2，小图33-36插入)。这些细胞内吞作用抑制剂，单独不可以引起TβRI和SARA在质膜共本地化和积累(图2，小图37-40对小图31)。这些结果支撑如下概念：网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂，是借着促进SARA和转化生长因子-β受体配合物在质膜或涂布的坑阶段的积累，而增强转化生长因子-β信号发送(比如转化生长因子-β受激Smad2磷酸化和核的本地化)。
PAI-1基因是细胞响应转化生长因子-β刺激最有研究的基因之一4，5。PAI基因的发起区域含有几个Smad2/3结合位点，这些结合位点已经被用作为转化生长因子-β响应组件(responsive element)增强一个报告基因(reporter gene)的表达4，5。为了要证明这些网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂是转化生长因子-β信号发送的增强剂，我们研究这些抑制剂，在Mv1Lu细胞，PAI-1因转化生长因子-β刺激的表达。细胞用不同浓度的β-CD、甲硫哒嗪、TFP的几个聚集度，MDC，莫能菌素和氯喹在37℃处理1个小时，然后用TGF-β1(50pM)一起刺激。在37℃，2小时以后，用数量的RNA印迹分析(图3A和3B)和实时的逆转录酶PCR(图3C-3G)分析PAI-1信使RNA的相对量。如图3所示的，这些抑制剂增强转化生长因子-β受激表达跟浓度有关。B-CD(10毫克/毫升)(A，C)、甲硫哒嗪(thioridazine)(5μM)(B)、TFP(6μM)(D)、氯喹(100μM)(E)、莫能菌素(10μM)(F)和MDC(100μM)(G)增强的PAI-1的转化生长因子-β-受激表达1.8至4.5倍。由于发现dynasore可以独自刺激PAI-1的表达，我们用几个不同浓度的dynasore及有和没有50pM转化生长因子-β的存在下来确定PAI-1在Mv1Lu细胞的表达。在图3H展示的，dynasore(25μM)独自刺激的PAI-1表达和50pM转化生长因子-β到达同样的程度。在50μM，dynasore增强转化生长因子-β受激PAI-1表达～5倍。
近来已经发现，在高胆固醇诱导的粥样硬化的致病原因中，压制在血管细胞中的转化生长因子-β反应灵敏度扮演重要的角色3，12。我们假设转化生长因子-β增强剂例如网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂，可以改善因高胆固醇抑制血管细胞转化生长因子-β感应灵敏度，而诱导的粥样硬化3，12。为了要测试我们的假设，我们用高胆固醇血的ApoE无效的老鼠，每隔一天，用腹膜内给药(1毫克dynasore/千克的体重)，一共8星期。我们选择dynasore有三个原因。这些包括：1)利用Mv1Lu细胞及其它类型细胞包括牛的主动脉的内皮细胞(BAEC细胞)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，在测试抑制剂之中，dynasore是最强的转化生长因子-β增强剂(未出版的结果)。在这些类型细胞，dynasore(50μM)能增强TGF-β受激PAI-1的表达～4-5倍，2)Dynasore是唯一的抑制剂，能独自刺激的PAI-1表达。这是一个转化生长因子-β增强器以及一个转化生长因子-β模拟物，3)腹膜内给dynasore(1毫克/千克体重)，每2天一次，8星期以后，检测野生型老鼠的肝，心脏，肺和肾并没有明显的宏观的或微观的异常。如图4A示，在ApoE无效的老鼠，有许多巨噬细胞或泡沫细胞被连接至内皮上冠状动脉(图4Ac)。相反地，在dynasore(图4Ad)处理过的高胆固醇血的ApoE无效的老鼠，很少巨噬细胞或泡沫细胞(图4Ad)。Dynasore不影响ApoE无效的老鼠血胆固醇的水平(Dyasore处理过的ApoE无效的老鼠，460±50毫克/分升，对没有dynasore处理过的ApoE无效的老鼠，470±61毫克/分升)。在野生型老鼠中用或不用dynasore处理，它们的冠状动脉显示正常的形态学(图4Aa和4Ab)。那些血管胆固醇水平在用或不用dynasore处理的野生型老鼠中分别是120±10和125±20毫克/分升。
在ApoE无效的老鼠12的主动脉的内皮，血胆固醇过多会抑制TβRII的表达，我们检查用dynasore处理过的老鼠中，TβRII的表达。如图4B所示，在用或不用dynasore处理过的野生型老 鼠，我们发现在主动脉的内皮中及平滑肌中有TβRII染色，表示有TβRII的表达(图4Ba和4Bb)。不过，我们在没有dynasore处理的ApoE无效的老鼠中的主动脉的内皮中及平滑肌中没有发现TβRII染色(图4Bc)，表示没有TβRII的表达。Dynasore处理，似乎恢复TβRII染色在那些的老鼠冠状动内皮中(图4Bd)。有趣地，我们发现在内皮附近的平滑肌中，有TβRII轻微的染色(图4Bd)。这些结果建议dynasore对改善粥样硬化是有效的，在ApoE无效的老鼠，至少部分是由于dynasore抵消主动脉的的内皮血胆甾醇过多对TβRII表达的抑制12。
网格蛋白依赖的细胞内吞作用的抑制剂被认为抑制在细胞内吞作用不同的步骤的过程。高渗的蔗糖抑制类型1有被小窝(coated pits)的形成19，28。B-CD和dynasore抑制从类型1有被小窝到类型2的进展17，18。吩噻嗪类、MDC和氯喹抑制有被小窝从类型2到类型3的进展的过程23，24。莫能菌素和dynasore抑制有被小窝从类型3进展到有衣小泡(coated vesicles)的过程18，25。除高渗蔗糖外，所有测试的抑制剂增强TGF-β信号发送和响应。这些抑制剂阻止细胞内吞作用的涂布的坑阶段，这表明转化生长因子-β感应的信号主要发生在有被小窝阶段。高渗蔗糖抑制类型1有被小窝的形成和削弱转化生长因子-β信号发送和响应。由于导致类型2有被小窝的形成和有衣小泡发形成的过程，这两者过程都要dynamin，通过dynasore的抑制发动蛋白的作用预计阻碍网格蛋白依赖的细胞内吞作用两者过程和增加有被小窝的累积。这说明dynasore比其它抑制剂，例如吩噻嗪类，MDC，莫能菌素，是网格蛋白依赖的细胞内吞作用的更有效的的抑制剂的原因，，也是更强的转化生长因子-β增强剂，因所有的抑制剂只抑制细胞内吞作用在单一个步骤。
所有这些网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂会抑制细胞表面受约束的转化生长因子-β的内部化(附图1)。用免疫荧光显微镜展示，除高渗蔗糖的之外，所有的抑制剂，会增强TβRI和SARA在质膜的局部化和积累。这与报告的活性是符合的，也就是它们能够阻止类型1，类型2或类型3涂布的坑17细胞内吞作用的过程 17-26。报告指出超表达dynamin K44A会增强TβRI在质膜的累积16。Lu等16报告：超表达dynamin K44A会抑制细胞表面TβRI的内化。但不影响转化生长因子-β受激细胞反应。事实上，在它们的实验性的系统，它们的数据显示dynaminK44A的超表达会增强转化生长因子-β受激响应～2倍。我们认为在它们K44A细胞的数据中那野生型dynamin的超表达16不是一适当的实验控制。野生型dynamin的超表达可以增强转化生长因子-β-的受激细胞反应(3TP荧光素酶的表达和ARE-荧光素酶)借着促进细胞内吞作用以及涂布的坑的不断增加的形成16。dynaminK44A的超表达可以增强转化生长因子-β受激细胞的响应，其借着在涂布的坑阶段16阻止细胞内吞作用。
我们最近发现：在培养细胞和在血胆固醇过多ApoE无效的的老鼠的主动脉的内皮中，胆固醇压制转化生长因子-β的反应灵敏度3，12。自累积的证明，对粥样硬化，血中的转化生长因子-β是一个保护的细胞因子(3-7)，这表明，血胆固醇过多引起粥样硬化，最少在某种程度上，是通过压制转化生长因子-β的反应灵敏度3，12。我们在这里展示，dynasore，是一有力的转化生长因子-β增强剂，在ApoE无效的老鼠有效地改善粥样硬化，大概通过抵消因血胆固醇过多而压制转化生长因子-β的反应灵敏度3，12。因降低转化生长因子-β水平和/或转化生长因子-β反应灵敏度，已经和其它疾病过程有牵连，例如自体免疫的疾病29，因此有效的转化生长因子-β增强剂，例如dynasore或dynasore类似的化合物，是用于治疗这样的疾病的治疗化合物。
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本发明已经特别用显示和描述优选实施例参考，所属领域的技术人员知道，在不脱离本发明的范围包括附加的权利要求的情况下，可以对形式和详细信息做些许的更动和修饰。

Claims (16)

1.一种用于增强个体转化生长因子-β信号发送的方法，包括给予个体一个足够量的网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂，以增强转化生长因子-β信号发送。
2.如权利要求1所述的方法，其中网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂是包含甲基B环状糊精的(methyl-B-cyclodextrin)，吩噻嗪(phenothiazine)，monodansylcadaverine、氯喹(chloroquine)、莫能菌素(monensin)和dynasore。
3.如权利要求2所述的方法，其中网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂是dynasore。
4.一种方法，用来治疗病人因减少转化生长因子-β信号发送引起的状况，包括给予病人一个治疗有效量的网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂。
5.如权利要求4所述的方法，其中网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂是包含甲基B环状糊精的(methyl-B-cyclodextrin)，吩噻嗪(phenothiazine)，monodansylcadaverine、氯喹(chloroquine)、莫能菌素(monensin)和dynasore。
6.如权利要求5所述的方法，其中网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂是dynasore。
7.如权利要求5所述的方法，因减少转化生长因子-β信号发送引起的状况，包括炎性(inflammatory condition)，癌(cancer)、心血管疾病(cardiovascular disease)和一个皮肤状况(skin condition)。
8.一个加速伤口愈合的方法，包括给予患者治疗有效量的一个网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂。
9.一种用于抑制患者中的致癌作用的方法，包括给予患者治疗有效量的一个网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂。
10.一种用于抑制患者的粥样硬化的方法，包括给予患者治疗有效量的dynasore。
11.如权利要求10所述的方法，还包括给予患者治疗有效剂量的他汀类抑制素(statin)。
12.如权利要求11所述的方法，其中他汀类抑制素(statin)选自组，其包括洛伐他丁(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、帕伐他丁(pravastatin)，氟伐他汀(fluvastatin)，阿活他汀(atorvastatin)，伊伐他汀(itavastatin)，罗苏伐他汀(rosuvastatin)和利伐他汀(rivastatin)。
13.一个药物组合物包括一治疗有效量的一个网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂，一治疗有效量的抑制素和一个药学上可接受载体。
14.如权利要求13所述的方法，其中网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂是包含甲基B环状糊精(methyl-B-cyclodextrin)(B-CD)，吩噻嗪(phenothiazine)、monodansylcadaverine、氯喹(chloroquine)、莫能菌素(monens in)，和dynasore。
15.如权利要求14所述的方法，其中网格蛋白依赖的细胞内吞作用抑制剂是dynasore。
16.如权利要求13所述的方法，其中他汀类抑制素(statin)选自组，其包括洛伐他丁(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、帕伐他丁(pravastatin)，氟伐他汀(fluvastatin)，阿活他汀(atorvastatin)，伊伐他汀(itavastatin)，罗苏伐他汀(rosuvastatin)和利伐他汀(rivastatin)。
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