CN102124122A - 用于检测具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及调节对具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分的摄取和/或清除的方法，可将此方法用于处理和/或预防如癌症，自身免疫性以及感染一类的疾病。本发明还涉及调节对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分的物质的抗原识别、加工和/或呈递，以及免疫应答的方法。本发明进一步涉及检测具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分的方法。

Description

用于检测具有破坏的细胞膜的细胞,受病原体感染的细胞,将死的细胞或死亡的细胞的方法
发明领域
本发明涉及调节对具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的摄取和/或清除的方法，可将此方法用于处理和/或预防如癌症，自身免疫性以及感染的疾病。本发明还涉及调节对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的抗原识别、加工和/或呈递，以及免疫应答的方法。本发明进一步涉及检测具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的方法。
发明背景
树突状细胞生物学
树突状细胞(DC)发现于大多数组织中，其中它们持续对抗原环境进行采样，并使用数种类型的受体监测入侵的病原体。在稳定状态下，非-淋巴组织中的哨兵DC(当检测到病原体时会以增加的速率)迁移到淋巴结器官中，在那里它们向T细胞呈递其已经收集并加工的Ag。T细胞所获得的表型取决于DC呈递其Ag的背景环境。如果Ag为无害的自身-组分，DC可以诱导多种形式的T细胞的不反应性(耐受)(Kenna等人，2008)。然而，如果Ag源自病原体，或受损的自身，DC会接收危险信号，受到激活，并且T细胞接着受到刺激变成效应子，这对提供保护性免疫是必需的(Heath and Villadangos，2005)。此外，DC能引导效应子T细胞获得适合于对抗具体病原体的独特能力(迁移属性，细胞因子分泌)。由DC-病原体相互作用确定要得到适合的免疫性所需要的信息，通过分泌的细胞因子或膜蛋白质 进行这些信息由DC到T细胞的通讯。
DC异质性
不同的DC亚型(Shortman and Naik，2007)构成了DC网络。DC可以广泛分成常规DC(cDC)和类浆细胞DC前体(pDC)。在受到刺激时pDC分泌高水平的IFNα，并且仅在激活后发育成DC(O′Keeffe等人，2002；Hochrein等人，2001)。cDC具有立即的DC形式以及Ag呈递功能，并且可以分成“淋巴结组织驻留”DC以及常规的经由淋巴到达淋巴结(LN)的“迁移性”DC。小鼠的淋巴组织驻留DC可进而被分为CD8+和CD8-子集(Belz等人，2004；Lahoud等人，2006；Henri等人，2001)。此外，存在由于感染或炎症而发育自单核细胞的炎性DC(Shortman and Naik，2007)。重要的是，各种DC亚型共享许多功能(摄取，加工和呈递Ag至幼稚T细胞)，但是也显示出子集-特异性作用。这些包括Toll-样受体的差异化表达，具体趋化因子的产生，IL-12的分泌(这些主要限制在指导T细胞成为Th1细胞因子状态的CD8+DC内)，经由MHC I的外源Ag的交叉-呈递(主要限制在CD8+DC内)，这使得这些DC成为病毒Ag向CD CD8+T细胞的主要呈递者，从而使其发展出细胞毒性功能。
人很可能含有这些DC子集的等价物，因为提取自相同组织(血液或胸腺)的小鼠和人的DC是相似的(Vandenabeele等人，2001；O’Keeffe等人，2003)。然而，大多数鼠类淋巴样器官驻留DC子集的人等价物仍是未知的，这是由于缺乏物种之间的标记物(CD8α在人DC上不表达)的差异和获得人淋巴样器官样品用于详细分析的困难。因此对小鼠和人之间保守的DC子集-特异性标记物进行定义成为主要的挑战。
细胞死亡及免疫应答
在发育过程中以及在免疫系统内持续发生着细胞凋亡。其特征在于细胞膜皱缩，细胞核浓缩以及细胞分块成为仍然保持其细胞内容物的凋亡小体；“吞噬细胞”常常吞掉这些凋亡小体而不释放细胞内容物。相反，在损伤或感染中可能发生的细胞坏死的特征在于细胞膜崩解以 及细胞内容物的释放。然而，如果不迅速被吞掉，凋亡细胞也可能释放出细胞内容物(继发性坏死)。迅速清除凋亡细胞一般会促进避免对自身-Ag发生炎性反应的免疫抑制性环境，而坏死或没有清除凋亡细胞则促进对自身-Ag的免疫应答(Hume，2008；Nagata，2007；Peng等人，2007)。因此，对凋亡细胞的早期识别对于维持内环境稳定以及防止自身免疫至关重要。
死亡/将死细胞的识别
吞噬细胞，包括DC，感知将死的细胞中许多分子变化。正常在细胞之内存在的分子可能被分泌或呈递到凋亡细胞的表面，或最终当细胞膜崩解时被暴露出来。在对压力响应时可能会修饰现存的分子或产生新型分子。这类分子的一个实例为磷脂酰丝氨酸(PS)，这是在凋亡进程的早期被从细胞膜内部转位到外部的一种脂类，起“吃我”信号的作用。吞噬细胞上许多分子介导PS的识别，包括CD36，MFG-E8和Tim4。
在对压力响应时产生的分子的另一个实例为热休克或应激蛋白质(Hsp)，其在完整的细胞里起着分子伴侣的作用(Binder等人，2004)，并可向DC提供来自应激的/将死的细胞的信号(Delneste，2004)。所提出的吞噬细胞及DC上的Hsp受体包括CD91，Lox1/Clec8，CD40，TLR2，TLR4，CD36。进一步地，以有Hsp-作为伴侣的肽进行免疫是极为有效的，只需要pg量的蛋白质。
DC对死亡细胞的识别和摄取
巨噬细胞和DC都能摄取死亡或将死的细胞。巨噬细胞上的捕获受体中有很多也在DC上发现。然而，只有DC具有加工细胞组分然后有效地将其呈递至并激活幼稚T细胞的能力。在不存在另外的病原体信号时DC摄取凋亡细胞通常诱导耐受(Steinman等人，2000)，而摄取坏死细胞诱导DC的成熟及刺激免疫应答(Sauter等人，2000)。因此，DC上的受体对这些状态进行差异化的识别对免疫系统是至关重要的。小鼠CD8+cDC比CD8-DC在对凋亡/死亡细胞的摄取以及随 后对所结合的细胞和病毒Ag向T细胞呈递两方面都更为有效，尤其是在MHC I上向CD8 T细胞进行的“交叉-呈递”方面(Belz等人，2004；Schnorrer等人，2006；Belz等人，2005；Iyoda等人，2002)。已经声明人pDC在摄取将死的细胞时是有效的(Hoeffel等人，2007)。因此，DC亚型选择性表达死亡细胞摄取受体是重要的事件。
发明概述
本发明人已鉴定了结合于具有破坏的细胞膜的细胞，受到病原体感染的细胞，将死的细胞以及死亡细胞上配体的分子。
在第一个方面，本发明提供了在受试者中调节对具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的摄取和/或清除的方法，该方法包括施用调节多肽对所述多肽的配体的结合的化合物，其中的多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
在另一方面，本发明提供了在受试者中调节对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的抗原识别、加工和/或呈递的方法，该方法包括施用调节多肽对所述多肽的配体的结合的化合物，其中的多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
在进一步的方面，本发明提供了在受试者中调节针对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的免疫应答的方法，该方法包括施用 调节多肽对所述多肽的配体的结合的化合物，其中的多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
在一个实施方式中，化合物是多肽。
在另一个实施方式中，化合物是抗体或其抗原结合片段。实例包括但不限于，单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体、双抗体、三抗体或四抗体。
在一个实施方式中，抗体是24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4或23/05-4C6，或包括24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4或23/05-4C6的至少一个互补决定区的抗体。
在另一个实施方式中，所述化合物包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；或
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
在一个实施方式中，所述的生物学活性的、可溶性和/或抗原性片段结合此配体。
在一个进一步的实施方式中，化合物缀合至治疗剂。在一个实施方式中，治疗剂为细胞毒性试剂。在一个进一步的实施方式中，治疗剂为药物和/或药学试剂。
在另一方面，本发明提供了在受试者中调节对具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的摄取和/或清除的方法，该方法包括施用调节多肽的产生的化合物，所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
在进一步的方面，本发明提供了在受试者中调节对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的抗原识别、加工和/或呈递的方法，该方法包括施用调节多肽的产生的化合物，所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
在还进一步的方面，本发明提供了在受试者中调节针对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的免疫应答的方法，该方法包括施用调节多肽的产生的化合物，所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
优选地，前三方面的化合物为多核苷酸。优选地，将此多核苷酸可操作地连接于能够指导此多聚核苷酸在动物的细胞中表达的启动子。
在一个实施方式中，多核苷酸下调了来自编码所述多肽的基因的mRNA水平。实例包括但不限于，反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化多核苷酸、微小RNA和双链RNA。
在一个实施方式中，多核苷酸为反义多核苷酸，其在生理学条件下与包含如SEQ ID NO 9-16中提供的核苷酸序列中任何一个或多个的多核苷酸相杂交。
在另一个实施方式中，多核苷酸为催化多核苷酸，其能够将包含如SEQ ID NO 9-16中提供的核苷酸序列中任何一个或多个的多核苷酸裂解。
在一个进一步的实施方式中，多核苷酸为双链RNA(dsRNA)分子，其包括含有如SEQ ID NO 9-16中提供的核苷酸序列中任何一个或多个中至少19个连续核苷酸的寡核苷酸，其中分子双链部分长度至少为19碱基对，并含有所述的寡核苷酸。在一个实施方式中，由单一的启动子表达所述多核苷酸，其中双链部分的链由一个单链部分相连。
在一个备选的实施方式中，多核苷酸上调来自编码所述多肽的基因的mRNA水平。
在一个实施方式中，对具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的摄取和/或清除有所增加。在一个备选的实施方式中，对具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的摄取和/或清除有所减少。
在另一个实施方式中，对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的抗原识别、加工和/或呈递有所增加。在一个备选的实施方式中，对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的抗原识别、加工和/或呈递有所减少。
在另一个实施方式中，针对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的免疫应答有所增加。在一个备选的实施方式中，对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的免疫应答有所减少。
在一个进一步的实施方式中，受试者患有与具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分相关的疾病。这些疾病的实例包括但不限于，移植物抗宿主病(GVHD)，自身免疫疾病，感染，神经退行性疾病，系统性炎症反应综合征(systemic inflammatory reaction syndrome，SIRS)，癌症及创伤。
在另一个方面，本发明提供了检测具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞的方法，此方法包括：
i)将细胞与结合多肽的配体的化合物相接触，所述多肽包括：
a)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
c)a)或b)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段，以及
ii)确定是否存在化合物对配体的结合，
其中化合物结合至配体表明细胞具有破坏的细胞膜，受到病原体的感染，是将死的或死亡的。
在一个进一步的方面，本发明提供了诊断、预测和/或监测与具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞相关疾病的状态的方法，包括
i)将细胞与结合多肽的配体的化合物相接触，所述多肽包括：
a)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
c)a)或b)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段，以及
ii)确定是否存在此配体，
其中配体存在提供了诊断、预测和/或疾病的状态。
在一个实施方式中，化合物是多肽。
在进一步的一个实施方式中，化合物是多肽，所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段。
在另一个实施方式中，化合物为抗体或其抗原结合片段。实例包括但不限于，单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体、双抗体、三抗体或四抗体。
在一个实施方式中，抗体是24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4或23/05-4C6，或包括24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4或23/05-4C6的至少一个互补决定区的抗体。
在一个优选的实施方式中，化合物是可检测标记的。
在一个实施方式中，在受试者中体内实施此方法。在一个备选的实施方式中，在获自受试者的样品上体外实施此方法。
如上文提出的，与具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞相关的疾病的实例包括但不限于，移植物抗宿主病(GVHD)，自身免疫疾病，感染，神经退行性疾病，系统性炎症反应综合征(SIRS)，癌症及创伤。
在一个进一步的方面，本发明提供监测疗法的方法，此方法包括：
i)将细胞暴露于疗法，并
ii)使用本发明的方法检测具有破坏的细胞膜的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分。
在一个实施方式中，疗法预期杀死细胞，存在具有破坏的细胞膜的细胞，将死的细胞或死亡的细胞表明疗法有效。在一个备选的实施方式中，疗法不预期杀死细胞，存在具有破坏的细胞膜的细胞，将死的细胞或死亡的细胞表明疗法具有不想要的副作用。
在一个实施方式中，步骤i)中的细胞是体内的。在一个备选的实施方式中，步骤i)中的细胞是体外的。
优选地，对受试者施用此疗法。在一个实施方式中，受试者患有与具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞相关的疾病。在一个优选的实施方式中，受试者患有癌症或感染。
在一个进一步的实施方式中，步骤ii)是在获自受试者的样品上进行的。
疗法可以是任何类型的操作。实例包括但不限于，药物疗法或放射疗法。
在另一个方面，本发明提供了鉴定多肽的配体的方法，此方法包 括：
a)获得具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，
b)将所述多肽与获自细胞或其部分的候选化合物相接触，
c)确定化合物是否结合所述多肽，
其中多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段。
在一个进一步的方面，本发明提供了鉴定多肽的配体的方法，此方法包括：
a)获得具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，
b)将多肽暴露于结合所述多肽的结合伙伴，以及获自细胞或其部分的候选化合物，并且
c)评估候选化合物与结合伙伴竞争结合所述多肽的能力，
其中多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段。
在前两方面的一个优选的实施方式中，候选化合物为蛋白质，或蛋白质-相关分子如碳水化合物。
在一个进一步的实施方式中，所述候选化合物在活细胞细胞内定位，并在膜破坏后暴露出来。
在另一个实施方式中，候选化合物可能获自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分之中一种或多种的组合。
在一个实施方式中，结合伙伴是抗体。
在一个进一步的实施方式中，结合伙伴是可检测标记的。
在另一方面，本发明提供了在早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞、坏死细胞或死亡的细胞之间进行区分的方法，此方法包括，
i)将细胞与结合多肽的配体的化合物接触，所述多肽包括：
a)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
c)a)或b)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段，以及
ii)确定是否存在此化合物与配体的结合，
其中化合物与配体结合表明细胞为晚期凋亡细胞、坏死细胞或死亡的细胞。
优选地，此方法进一步包括检测凋亡或坏死细胞，或具有破坏的细胞膜的细胞。可使用任何本领域已知的方法实施该实施方式，如检测磷脂酰丝氨酸的暴露情况(可通过Annexin V结合而检测到)。
在一个进一步的方面，本发明提供在受试者中调节针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括
i)获得树突状细胞或其前体的群体，
ii)调节多肽的产生和/或活性，所述多肽包括：
a)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
c)a)或b)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段，
iii)将树突状细胞或其前体与抗原接触，以及
iv)对受试者施用树突状细胞或其前体。
在一个优选的实施方式中，步骤iii)包括将树突状细胞或其前体与包括所述抗原的具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞和/或其一部分相接触。
在一个进一步的实施方式中，步骤iii)包括
a)获得包括所述抗原的细胞，
b)破坏此细胞的细胞膜，以及
c)将步骤b)的产物与树突状细胞或其前体接触。
在另一个实施方式中，此方法进一步包括，在步骤ii)之前富集表达所述多肽的细胞群体。
在一个实施方式中，步骤ii)和iii)是同时进行的。
在一个实施方式中，具有破坏的细胞膜的细胞，将死的细胞或死亡的细胞为癌细胞。
在另一个实施方式中，所述多肽的生产和/或活性有所增加。在一个备选的实施方式中，所述多肽的生产和/或活性有所减少。
在一个实施方式中，所述前体细胞为单核细胞。
优选地，针对此抗原的免疫应答有所增加。
优选地，受试者为动物。更优选地，受试者为哺乳动物，如人、狗、猫、马、牛或绵羊。最优选地，受试者为人。
在另一方面，本发明提供了调节多肽对所述多肽的配体的结合的化合物在制备用于在受试者中调节具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的摄取和/或清除的药物中的用途，其中所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
在另一方面，本发明提供了调节多肽对所述多肽的配体的结合的化合物在制备用于在受试者中调节对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的抗原识别、加工和/或呈递的药物中的用途，其中所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基 酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
在另一方面，本发明提供了调节多肽对所述多肽的配体的结合的化合物在制备用于在受试者中调节针对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的免疫应答的药物中的用途，其中所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
在另一方面，本发明提供了调节多肽的产生的化合物在制备用于在受试者中调节具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的摄取和/或清除的药物中的用途，所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
在另一方面，本发明提供了调节多肽的产生的化合物在制备用于在受试者中调节对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的抗原识别、加工和/或呈递的药物中的用途，所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
在另一方面，本发明提供了调节多肽对所述多肽的产生的化合物在制备用于在受试者中调节针对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细 胞的物质的免疫应答的药物中的用途，所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
如显而易见的，本发明的一个方面的优选特征和特性可应用于本发明的许多其他方面。
本说明书自始至终单词“包括”或者其变化“包含”或“含有”应理解为暗示包括所述元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组。
本发明在下文中通过下述非限制性实施例并参考附图进行描述。
附图简述
图1.由小鼠(m)和人(h)5B6基因编码的基因组结构和预测的蛋白质结构。编码(A)小鼠和(B)人5B6的全长cDNA。(C)由小鼠和人5B6编码的预测的蛋白质序列的蛋白质序列比对。序列同一性以深灰色突出显示，相似性以浅灰色显示。箭头指示外显子边界。(D)示意性表示通过cDNA分别与C57BL/6J小鼠的基因组序列数据库(2006年2月的UCSC集合)和人数据库(2006年3月的UCSC集合)比对测定的小鼠和人5B6的基因结构。编码5B6基因的编码区的外显子由黑框指示，并且外显子和内含子的大小(bp)在下面显示。(E)小鼠和人5B6蛋白质的图示。
图2.小鼠和人5B6(Clec9A)的CTLD与共享序列同源性的蛋白质的比对。包括大鼠甘露糖结合蛋白A(MBP-A)用于作为常规C型凝集素结构域比较，所述常规C型凝集素结构域具有功能性碳水化合物识别结构域。灰色框指示保守残基，(+)指示涉及蛋白质同二聚化的另外一对半胱氨酸残基，(＊)标记形成二硫键的保守半胱氨酸残基。连接MBP-A中的Ca2+的残基指定为1和2。
图3.小鼠5B6的基因表达谱。实时定量PCR用于研究相对于在 (A)淋巴样器官稳态DC包括脾cDC子集；DN、CD4+和CD8+、胸腺cDC子集；CD8-和CD8+、LN cDC子集；CD8-、CD8+、皮肤和朗格罕氏细胞(LC)中以及在胸腺和脾pDC中的Gapdh的5B6基因表达谱。(B)造血细胞包括胸腺细胞(thym)、淋巴结(LN)B和T细胞、脾(spl)B和T细胞、NK细胞、未成熟巨噬细胞(im mac)、成熟巨噬细胞(mat mac)、脾pDC和cDC。(C)从稳态(静止)小鼠和在体内用LPS和CpG激活3小时后分离的脾cDC。
图4.m5B6(Clec9A)蛋白质在DC和其他造血细胞上的表面表达。(A)对DC进行纯化且通过4色免疫荧光染色进行表面标记。DC用针对CD11c(N418-PeCy7)、CD45RA(14.8-APC)、CD8(53-6.7-APC-Cy7)和m5B6(10B4-生物素)的mAb进行染色。脾DC还用CD4(GK1.5-FITC)进行染色，胸腺DC用Sirpα(p84-FITC)进行染色，并且皮下LN DC用CD205(NLDC-145-FITC)进行染色。脾cDC分成CD4+cDC(CD11hiCD45RA-CD4+CD8-)、DN cDC(CD11hiCD45RA-CD4-CD8-)和CD8+cDC(CD11hiCD45RA-CD8+CD4-)；胸腺cDC分成CD8-cDC(SirpαhiCD8lo)和CD8+cDC(SirpαloCD8+)；并且LN cDC分成CD8-cDC(CD11c+CD205-CD8-)、皮肤cDC(CD11c+CD205intCD8-)、朗格罕氏细胞(CD11c+CD205hiCD8-)和CD8+cDC(CD11c+CD205hiCD8+)，如先前描述的31。pDC鉴定为CD11cintCD45RA+。脾细胞用针对CD3(KT3-1.1-FITC)、CD19(1D3-PeCy7)、NK1.1(PK136-PeCy7)、CD49b(Hmα2-APC)的mAb进行染色，并且鉴定了B细胞(CD19+CD3-)、T细胞(CD19-CD3+)和NK  细胞(NK1.1+CD49b+CD3-)。脾巨噬细胞如材料与方法中所示进行富集，并且用CD11b(M1/70-Cy5)和F4/80-FITC进行染色，并且鉴定为CD11bhiF4/80+。骨髓细胞和脾细胞用针对CD11b(M1/70-Cy5)和Ly6C(5075-3.6-FITC)的mAb进行染色，并且单核细胞鉴定为侧面散射olLy6ChiCD11bhi。骨髓巨噬细胞是Ly6CintCD11bhi。细胞群体用SA-PE进行复染，并且就m5B6表达进行分析。实线表示在门控细胞 上的m5B6染色，虚线表示用同种型匹配对照对门控细胞的染色。(B)脾DC的富集制备物用针对m5B6(10B4-生物素)、CD11c(N418-量子点655)、CD8α(YTS-169-PercpCy 和CD24(M1/69-Alexa 633)和120G8-FITC的mAb进行染色，随后用SA-PE进行复染。pDC(CD11cint120G8+)和cDC(CD11chi120G8-)就m5B6的表达进行分析。m5B6表达与在cDC上的CD8α和CD24表达相关。大多数脾pDC表达m5B6。(C)血液DC的富集制备物与脾DC(B)使用相同mAb进行平行染色，并且使用等同门控策略进行分析。血液DC不表达CD8α，但表达CD24。类似于脾DC，表达CD24的血液DC还共表达来自血液的5B6 pDC，如同其脾配对物，表达m5B6。
图5.5B6在人和猕猴DC和造血细胞上的表达。(A)分离人和猕猴外周血单核细胞(PBMC)，并且用针对HLADR、BDCA3、5B6以及包括CD3(T细胞)、CD14(单核细胞)、CD19(B细胞)和CD56(自然杀伤细胞)的PE缀合谱系混合物(cocktail)的mAb进行表面免疫荧光标记。对血液DC进行门控为HLADR+谱系(PE)-，并且就其5B6(人和猕猴)和BDCA3(人)的表达进行进一步分析。(B)人PBMC用针对所需的表面标记物和5B6的mAb进行表面免疫荧光标记。对单核细胞(CD14+)、NK细胞(NKp46+)、T细胞(CD3+)和B细胞(CD19+)进行门控，并且就其5B6的表达进行分析(实线)。虚线表示用同种型匹配对照对所门控的细胞进行染色。
图6.瞬时转染的293T细胞上可溶性5B6对膜结合的5B6的结合。293T细胞用编码全长未标记m5B6(283T-m5B6)、h5B6(293T-h5B6)或不含DNA(293T)的表达构建体进行瞬时转染。2天后，收获细胞并且使用可溶性FLAG标记的m5B6，h5B6和Cire进行表面免疫荧光标记，使用生物素化的抗Flag mAb 9H10和链霉亲和素PE检测结合情况。对活细胞在前向散射和碘化丙啶排除上进行门控，并且相对于用抗Flag Ab和链霉亲和素-PE染色的对照(虚线)，就其可溶性5B6(实线)的表面结合进行分析。
图7.Clec9A的可溶性重组胞外结构域的产生。(A)内源和重组的 可溶性mClec9A蛋白质的图示。内源蛋白质包括Clec9A细胞外结构域、跨膜(TM)和胞质(cyto)结构域。产生了两种形式的重组可溶性mClec9A蛋白质：mClec9A-ecto，其由全长的Clec9A胞外结构域、FLAG标签和生物素化保守序列构成(预测的mol wt～27kDa)；以及mClec9A-CTLD，其由Clec9A-CTLD、FLAG标签和生物素化保守序列构成(预测的mol wt～19.7kDa)。(B)内源mClec9A表达的Western印迹分析。在用Flt3L的骨髓培养物中生产DC(Naik等人，2005)，并且在非还原性(N)及还原性(R)条件下对DC裂解物进行电泳。使用抗-mClec9A Ab(24/04-10B4)杂交印迹，使用HRP缀合的抗-大鼠Ig以及Enhanced Chemiluminescence-Plus(Amersham)检测结合。观察到mClec9A在非还原性条件下以二聚体形式迁移。(C)对生物素化的重组可溶性mClec9A蛋白质的Western印迹分析。在非还原性(N)及还原性(R)条件下进行生物素化的mClec9A-ecto和mClec9A-CTLD的电泳，使用SA-HRP和Enhanced Chemiluminescence(Amersham)检测蛋白质。像内源mClec9A一样，观察到重组的mClec9A-ecto在非还原性条件下以二聚体形式迁移，其在还原条件下以单体形式迁移，而mClec9A-CTLD在所有条件下以单体形式迁移(B，C)。
图8.Clec9A胞外结构域对死亡细胞的结合。(A)对胸腺细胞进行γ-辐射(5Gy)，然后将其在37℃下于含有10％FCS的RPMI-1640中培养4h或16h，以遵循凋亡性死亡的进程。将样品与生物素化的mClec9A-ecto(实线)，或生物素化的Cire-ecto(虚线，作为背景对照)一并孵育并使用SA-PE检测结合情况。使用Annexin V-FITC对胸腺细胞染色，通过流式细胞术分析，并将其门控为Annexin V-(存活)细胞或Annexin V+(凋亡)用于分析Clec9A结合。在4h时，41％的Annexin V+细胞为PI+；在16h时，90％的Annexin V+细胞为PI+。使用生物素化的Cire-ecto观察到的背景与单独使用第二阶段试剂观察到的背景是类似的。(B)使过表达Noxa而失活Mcl-1的MEF(vanDelft等人，2006)生长到大约80％融合度，然后通过用2.5μMABT-737处理16h诱导其经历凋亡。收获对照的未处理MEF(存活) 和ABT-737处理的MEF(晚期凋亡)并与mClec9A-ecto(实线)、hCLEC9A-ecto(实线)或Cire-ecto(背景对照，虚线)一并孵育。使用生物素化的抗-FLAG mAb、SA-PE以及流式细胞术检测结合。基于正常前向散射(FSC)和PI排除(PI-)，90％的未处理MEF是存活的，而基于减小的FSC和阳性PI染色，95％的ABT-737处理的MEF是死亡的。(C)将对照的未处理MEF(存活)和ABT-737处理的MEF(2.5μM ABT-737处理16h；晚期凋亡)在单独PBS中或在DNaseI、RNaseA、蛋白酶K或胰蛋白酶存在下孵育。充分洗涤细胞以移除核酶和蛋白酶，然后将其与生物素化的mClec9A-ecto(实线)或生物素化的Cire-ecto(虚线，作为对照)一并孵育。使用SA-PE和流式细胞术检测结合情况。基于正常的FSC和PI排除，80％的未处理MEF是存活的，而基于减小的FSC和阳性PI染色，97％的ABT-737处理的MEF是死亡的。
图9.Clec9A结合是经由CTLD介导的，并针对多种物种表达的蛋白质。(A)将存活的或冻融的小鼠成纤维细胞(3T3细胞系)与生物素化的mClec9A或hCLEC9A胞外结构域或CTLD(实线)，或与生物素化对照(Cire-ecto，虚线)一并孵育。(B)将人293T细胞进行冻融然后与生物素化的mClec9A-ecto、hCLEC9A-ecto(实线)或Cire(虚线)在不存在或存在5mM EDTA(实线)时一并孵育。(C)对小鼠3T3细胞、昆虫SF21细胞、细菌JM109细胞以及酵母(巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))细胞进行两次冻融，然后与生物素化的mClec9A-ecto(实线)，或生物素化的对照(Cire-ecto，虚线)一并孵育。使用SA-PE和流式细胞术检测(A)-(C)中的结合情况。
图10.可溶性mClec9A不阻断CD8+DC对死亡细胞的摄取。(A)脾脏cDC上有Clec9A的表面表达。使用大鼠Ig和抗FcRmAb(2.4G2)封闭DC，使用针对CD11c(N418-PE-Cy7)、CD45RA(14.8-APC)、CD8(53-6.7-APC-Cy7)、CD172a(p84-FITC)的抗体以及Clec9A(24/04-10B4-biotin)或同种型对照-生物素(IgG2a-kappa；BDPharmingen)进行表面标记，然后用SA-PE进行复染并通过流式细胞 术进行分析。将脾脏cDC门控为CD11chi CD45RA-CD172ahi CD8-(CD8-)或CD11chi CD45RA-CD172alo CD8+(CD8+)，并分析其表面的Clec9A表达。实线代表门控细胞上的mClec9A染色，虚线代表使用同种型匹配的对照的门控细胞的染色。(B)脾脏cDC对死亡细胞的吞噬性摄取。将脾细胞冻融并用PI进行标记，然后将其在存在或不存在mClec9A-ecto时进行孵育。对DC表面标记上针对CD11c和CD8的mAb，然后与PI标记的脾细胞在4℃或37℃下共培养3h。将DC门控为CD8+(CD11chi CD8+)或CD8-(CD11chiCD8-)，分析PI阳性的细胞百分比作为死亡细胞摄取的测量。
序列表的索引
SEQ ID NO：1-人5B6。
SEQ ID NO：2-鼠类5B6。
SEQ ID NO：3-黑猩猩5B6。
SEQ ID NO：4-恒河猴5B6。
SEQ ID NO：5-犬5B6。
SEQ ID NO：6-牛5B6。
SEQ ID NO：7-马5B6。
SEQ ID NO：8-大鼠5B6。
SEQ ID NO：9-编码人5B6的开放阅读框。
SEQ ID NO：10-编码鼠类5B6的开放阅读框。
SEQ ID NO：11-编码黑猩猩5B6的开放阅读框。
SEQ ID NO：12-编码恒河猴5B6的开放阅读框。
SEQ ID NO：13-编码犬5B6的开放阅读框。
SEQ ID NO：14-编码牛5B6的开放阅读框。
SEQ ID NO：15-编码马5B6的开放阅读框。
SEQ ID NO：16-编码大鼠5B6的开放阅读框。
SEQ ID NO 17至28，38和39-寡核苷酸引物。
SEQ ID NO：29-鼠类5B6的抗原性片段。
SEQ ID NO：30-人5B6的抗原性片段。
SEQ ID NO：31-生物素化共有序列。
SEQ ID NO：32-小鼠Clec12a的部分序列。
SEQ ID NO：33-小鼠Dectin-1的部分序列。
SEQ ID NO：34-小鼠Clec8a的部分序列。
SEQ ID NO：35-小鼠NKG2D的部分序列。
SEQ ID NO：36-人NKG2D的部分序列。
SEQ ID NO：37-大鼠MBP-A的部分序列。
SEQ ID NO：40-包括茎的小鼠5B6。
SEQ ID NO：41-包括茎的人5B6。
SEQ ID NO：42-不包括茎的小鼠5B6。
SEQ ID NO：43-不包括茎的人5B6。
SEQ ID NO：44-包括茎的可溶性flag标签的小鼠5B6。
SEQ ID NO：45-包括茎的可溶性flag标签的人5B6。
SEQ ID NO：46-不包括茎的可溶性flag标签的小鼠5B6。
SEQ ID NO：47-不包括茎的可溶性flag标签的小鼠5B6。
发明详述
一般技术和定义
除非另有具体定义，本文使用的所有技术和科学术语应理解为具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义(例如，在细胞培养、分子遗传学、分子生物学、树突状细胞生物学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)。
除非另有说明，在本发明中利用的重组蛋白质、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员众所周知的标准操作。这些技术在如下来源中的参考文献内描述且说明，例如，J.Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning，John Wiley和Sons(1984)，J.Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)，T.A.Brown(编辑)，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，第1和2卷，IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，DNA Cloning：A PracticalApproach，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)，和F.M.Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括迄今的所有更新)，Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988)，和J.E.Coligan等人(编辑)Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons(包括迄今的所有更新)。
如本文所使用的，短语“具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞”以及其变体包括这些情况，其中细胞在可能的时候包括这些特征中的一种或多种。例如，细胞可以具有受破坏的膜，受到病原体的感染并且即将死亡。
如本文使用的，术语“具有破坏的细胞膜的一些细胞”或“具有破坏的细胞膜的细胞”指的是其中细胞膜的完整性已经受到危害的细胞。这包括有孔的细胞，以及受损或破裂的细胞。
如本文所使用的，术语“将死的细胞”或“将死的一些细胞”指的是较晚期的凋亡细胞或坏死细胞。优选地，将死的细胞为AnnexinV+或碘化丙啶(PI)+。对于将死的有核细胞，优选地是其为AnnexinV+和PI+。在一个尤其优选的实施方式中，将死的细胞至少为AnnexinV+。在另一个实施方式中，坏死细胞为次级坏死的细胞。
如本文所使用的，“早期凋亡细胞”或“早期凋亡的一些细胞”包括是AnnexinV+且PI-的细胞。
如本文所使用的，术语“死亡的细胞”或“死亡的一些细胞”指的是已经通过了死亡进程中的一个不能回复的点的细胞，且其变化不能逆转。这些细胞可能通过凋亡或坏死而死亡。
对于短语“受到病原体感染的细胞”，术语病原体包括任何能够感染细胞的生物体。实例包括但不限于病毒、原生动物和细菌。
如本文所使用的，术语“或其一部分”指的是具有破坏的细胞膜的 细胞，受到病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡细胞的任何部分，这些部分包括本文限定的多肽的配体。实例包括但不限于泡体和细胞匀浆/裂解物。
如本文所使用的，术语对于具有破坏的细胞膜的细胞，受到病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分的“摄取和/或清除”指的是这些细胞的细胞物质，例如其蛋白质或片段的移除。在一个实施方式中，树突状细胞至少部分地负责这些细胞的摄取和/或清除。优选地，树突状细胞为5B6+(也称为Clec9A+)。
如本文所使用的，术语“周围细胞”指的是紧邻着具有破坏的细胞膜的细胞，受到病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞中一种或多种的细胞。
如本文所使用的，术语“治疗”，“处理”或“医治”包括施用治疗有效量的用于本发明的化合物，其足以减少或消除指定病状的至少一种症状。
如本文所使用的，术语“预防”，“防止”或“阻止”包括施用治疗有效量的用于本发明的化合物，其足以阻止或妨碍指定病状的至少一个症状的发展。
如本文所使用的，术语“诊断”或其变体指的是对疾病的检测。
如本文所使用的，术语“预测”或其变体指的是对疾病的未来结果的评估。
如本文所使用的，术语“监测状态”或其变体指的是确定疾病的阶段。可以在以用于此疾病的治疗施用于受试者之前、之中和/或之后确定此状态。
如本文所使用的，术语“5B6”和“Clec9A”指的是多肽，其包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段。
优选地，所述多肽至少在树突状细胞的子集上表达。
如本文所使用的，“样品”可以是怀疑包括具有破坏的细胞膜的细胞，受到病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡细胞，或其一部分的任何生物材料。实例包括但不限于，血液，例如全部外周血、脐带血、胎儿血，骨髓，血浆，血清，尿，培养细胞，唾液或尿道拭子，淋巴样组织，例如扁桃体，派伊尔斑，盲肠，胸腺，脾和淋巴结以及任何用作常规筛选、诊断或手术原因取得的活检样品，如肿瘤活检或发炎的器官/组织的活检。样品可以直接进行测试或在测试前可能需要某些形式的处理。例如，活检样品在测试前可能需要均质化，以产生细胞悬浮液。此外，至生物样品并非液体形式(例如，它可以是固体、半固体或脱水液体样品)的程度，它可能需要添加试剂例如缓冲剂以使样品移动。移动试剂(mobilizing reagent)可以在使样品与例如本文限定的化合物接触前与样品相混合。
如本文所使用的，术语“缀合”、“缀合的”或其变体广泛用于指用于本发明的化合物和治疗剂之间任何形式的共价或非共价结合，或使用于本发明的化合物和治疗剂置于彼此紧密接近例如在脂质体中。
如本文所使用的，术语“免疫应答”指受试者的免疫系统响应抗原的反应性中的变化，并且可能涉及抗体产生、细胞介导免疫的诱导、补体激活和/或免疫耐受的发展。
如本文所使用的，在最广泛的上下文中术语“获自细胞的候选化合物”用于这样的程度，其不仅包括直接获自细胞的分子，尤其是蛋白质，还包括从其他来源制备的分子，但这些分子是已知或必须显示出在具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分当中存在。
如本文所使用的，术语“调节生产和/或活性”指的是任何可用于改变本文限定的多肽的水平或生物学功能的机制。这些方法在本文以及WO 2009/026660中有所描述。在一个优选的实施方式中，是通过阻断多肽对其配体的结合来调节活性的。
如本文所使用的，词语“破坏细胞的细胞膜”指的是任何破坏细胞 膜完整性的方法。这些方法的实例包括但不限于放射、暴露于去污剂以及冻融。在一个实施方式中，通过此方法杀死细胞。
化合物
本发明人目前已首次显示5B6(在本领域中也称为CLEC9A和HEEE9341)在树突状细胞子集和或其前体中表达，其结合于具有破坏的细胞膜的细胞，受到病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡细胞，或其一部分上的配体。这使得调节5B6对配体的结合的化合物，和/或调节5B6或配体的产生的化合物能够在广泛多样的诊断、预测和治疗操作中使用。
用于本发明的化合物可以是任何类型的分子，如那些结合优选特异性结合5B6或配体的分子。化合物可以是例如纯化的和/或重组的天然存在的配体或合成配体。化合物和5B6之间或化合物和配体之间的结合可以由共价或非共价相互作用或者共价和非共价相互作用的组合来介导。当化合物和5B6或化合物和配体之间的相互作用产生非共价结合复合物时，发生的结合一般是静电、氢键合、或亲水/疏水相互作用的结果。在一个优选实施方式中，化合物是纯化的和/或重组的多肽。特别优选的化合物是纯化的和/或重组的抗体或其抗原结合片段，或本文描述的5B6的可溶性片段。
尽管不是必需的，但化合物可以与5B6或配体特异性结合。短语“特异性结合”意指在特定条件下，化合物结合5B6或配体且不与显著量的其他例如蛋白质或碳水化合物结合。在一个实施方式中，化合物特异性结合得自受试者的样品中的5B6而不是其他分子，所述样品包括树突状细胞。在另一个实施方式中，化合物特异性结合得自受试者的样品中的配体而不是其他分子，所述样品包括具有破坏的细胞膜的细胞，受到病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡细胞，或其一部分。在这些条件下的特异性结合可能要求就其特异性而选择的抗体。在另一个实施方式中，如果与另一种蛋白质相比在化合物的结合上存在超过10倍差异，并且优选25、50或100倍更大的差异，那么该化合物 视为“特异性结合”。
多种免疫测定法形式可以用于选择具有特异性免疫反应性的抗体。例如，表面标记和流式细胞术分析或固相ELISA免疫测定法常规上用于选择与蛋白质或碳水化合物具有特异性免疫反应性的抗体。关于可以用于测定特异性免疫反应性的免疫测定法形式和条件的描述，参见Harlow & Lane(同上)。
抗体可以作为完整免疫球蛋白，或多种形式中的修饰存在，包括例如但不限于，包括VH或VL结构域的结构域抗体，重链可变区的二聚体(VHH，如对于骆驼科动物描述的)、轻链可变区的二聚体(VLL)，仅包含轻链和重链可变区的Fv片段，或包含重链可变区和CH1结构域的Fd片段。由连接在一起以形成单链抗体的重链和轻链可变区组成的scFv(Bird等人，1988；Huston等人，1988)和scFv的寡聚物例如双抗体和三抗体也包括术语“抗体”内。还包括的是包含可变区和部分恒定区的抗体片段，例如Fab、(Fab′)2和FabFc2片段。还包括了CDR移植抗体片段和抗体片段的寡聚物。Fv的重链和轻链组分可以衍生自相同抗体或不同抗体，从而产生嵌合Fv区。抗体可以是动物(例如小鼠、兔或大鼠)或人起源或可以是嵌合的(Morrison等人，1984)或人源化的(Jones等人，1986)和UK 8707252)。如本文所使用的，术语“抗体”包括这些多种形式。使用本文提供的指导以及在上文引用的参考文献和此种出版物如Harlow & Lane(同上)中描述的本领域技术人员众所周知的那些方法，可以容易地制备用于在本发明的方法中使用的抗体。
抗体可以是包括可变轻链(VL)和可变重链(VH)的Fv区域。轻链和重链可直接或通过连接物连接。如本文所使用的，连接体指的是共价连接于轻链和重链并在两条链之间提供足够的空间以及柔韧性以使其能够达到能特异性结合其针对的表位的构象的分子。尤其优选的是蛋白质连接体，因为其可以作为融合多肽Ig部分的内部组分表达。
在另一个实施方式中，本发明的方法中使用了重组产生的单链scFv抗体，优选地是人源化scFv。
单克隆抗体
针对5B6表位或配体的表位的单克隆抗体可以由本领域技术人员容易地产生。使用5B6表位RWLWQDGSSPSPGLLPAERSQSANQVC-OH)(SEQ ID NO：30)用于产生此种抗体的方法的例子在实施例部分中提供。
用于通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是众所周知的。永生的抗体产生细胞系可以通过细胞融合来产生，并且还通过其他技术例如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞或用EB病毒转染来产生。针对合适的表位产生的单克隆抗体的实验对象组可以就各种性质；即就同种型和表位亲和力进行筛选。
动物衍生的单克隆抗体可以用于直接体内和体外免疫疗法。然而，已观察到当例如小鼠衍生的单克隆抗体在人中用作治疗剂时，患者产生人抗小鼠抗体。因此，动物衍生的单克隆抗体不优选用于治疗，特别是用于长期使用。然而，用已建立的基因工程技术可以产生嵌合或人源化抗体，其具有动物衍生和人衍生的部分。动物可以是例如小鼠或其他啮齿类动物例如大鼠。
如果嵌合抗体的可变区是例如小鼠衍生的，而恒定区是人衍生的，那么嵌合抗体一般将比“纯”小鼠衍生的单克隆抗体具有更少免疫原性。这些嵌合抗体将可能更适合于治疗用途，结果是“纯”小鼠衍生的抗体是不合适的。
用于产生嵌合抗体的方法可由本领域技术人员所使用。例如，使用例如在分别质粒中的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链可以分开表达轻链和重链。这些随后可以在体外纯化并装配成完全抗体；用于实现此种装配的方法已得到描述(参见例如，Sun等人，1986)。此种DNA构建体可以包括与编码人恒定区的DNA连接的DNA，其编码关于抗体的轻链或重链的可变区的功能上重排基因。用关于轻链和重链的DNA构建体转染的淋巴样细胞例如骨髓瘤或杂交瘤，可以表达并装配抗体链。
用于从还原的分离的轻链和重链形成IgG抗体的体外反应参数也已得到描述。轻链和重链在相同细胞中共表达以实现重链和轻链的细胞内结合和连接而成为完全H2L2 IgG抗体也是可能的。此种共表达可以使用相同或不同质粒在相同宿主细胞中完成。
在本发明的另一个优选实施方式中，抗体是人源化的，即通过分子建模技术产生的抗体，其中抗体的人内容物达到最大，同时引起可归于例如亲本大鼠、兔或鼠类抗体可变区的结合亲和力的很少丧失或无丧失。
下文描述的方法可应用于抗体的人源化。
存在在决定人源化过程中使用何种人抗体序列中考虑的数种因素。轻链和重链的人源化视为不依赖于彼此，但原因对于各自是基本上相似的。
这种选择过程基于下述原理：给定抗体的抗原特异性和亲和力主要由可变区CDR的氨基酸序列决定。可变结构域构架残基具有很少贡献或无直接贡献。构架区的主要功能是使CDR保持在其合适空间定向中，以识别抗原。因此，如果人可变结构域构架与它们所起源的动物可变结构域高度同源，那么动物例如啮齿类动物CDR置换到人可变结构域构架内最可能导致其正确空间定向的保留。因此应优选选择与一个或多个动物可变结构域高度同源的人可变结构域。合适的人抗体可变结构域序列可以如下选择。
步骤1。使用计算机程序，就与动物衍生的抗体可变结构域最同源的那些人抗体可变结构域序列搜索所有可获得的蛋白质(和DNA)数据库。合适程序的输出是与动物衍生抗体最同源的序列、与每种序列的同源性百分比、和每种序列与动物衍生序列的比对的列表。这不依赖于重链和轻链可变结构域序列而完成。如果仅包括人免疫球蛋白序列，那么上述分析更容易完成。
步骤2。列出人抗体可变结构域序列且就同源性进行比较。主要地，比较在CDR长度上执行，除非常可变的重链的CDR3外。人重链以及κ和λ轻链分成亚组；重链3个亚组、κ链4个亚组、λ链6 个亚组。在每个亚组内的CDR大小是相似的，但在亚组之间不同。通常可以使动物衍生的抗体CDR与人亚组之一匹配作为同源性的第一近似值。具有相似长度CDR的抗体随后就特别在CDR内以及在周围构架区中的氨基酸序列同源性进行比较。选择最同源的人可变结构域作为用于人源化的构架。
实际人源化方法/技术
根据EP 239400，通过将所需CDR移植到人构架上可以使抗体人源化。编码所需重构抗体的DNA序列因此可以从希望重构其CDR的人DNA开始进行制备。将包含所需CDR的动物衍生的可变结构域氨基酸序列与所选择的人抗体可变结构域序列的那种相比较。标记出需要改变成动物中的相对应残基的人可变结构域中的残基，已制备掺入动物衍生CDR的人可变区。人序列中还可以存在需要置换、添加或缺失的残基。
合成可以用于使人可变结构域构架诱变以包含所需残基的寡核苷酸。这些寡核苷酸可以具有任何方便的大小。长度通常仅由已可得的具体合成仪的能力所限制。寡核苷酸指导的体外诱变的方法是众所周知的。
合成的基因序列，如那些编码人源化抗体或其片段的序列，可以通过大量服务公司中任何一个进行商业订购，包括DNA 2.0(MenloPark，Calif.)，Geneart(Regensburg，Germany)，CODA Genomics(Irvine，Calif.)，and GenScript，Corporation(Piscataway，N.J.)。
备选地，可以使用WO 92/07075的重组聚合酶链反应(PCR)方法来实现人源化。使用这种方法，CDR可以在人抗体的构架区之间进行剪接。一般而言，WO 92/07075的技术可以使用包括2个人构架区AB和CD的模板以及在它们之间被供体CDR替换的CDR来执行。引物A和B用于扩增构架区AB，并且引物C和D用于扩增构架区CD。然而，引物B和C在其5′末端处各自还包含另外序列，所述另外序列与全部或至少部分供体CDR序列相对应。引物B和C重叠的 长度足以允许其5′末端在允许执行PCR的条件下彼此退火。因此，扩增区域AB和CD可以通过重叠延伸经历基因剪接，以在单反应中产生人源化产物。
在重构抗体的诱变反应后，诱变的DNA可以与编码轻链或重链恒定区的合适DNA连接，克隆到表达载体内，并且转染到宿主细胞优选哺乳动物细胞内。这些步骤可以以常规方式执行。重构抗体因此可以通过如下方法进行制备，所述方法包括：
(a)制备包括与DNA序列可操作地连接的合适启动子的第一种可复制表达载体，所述DNA序列至少编码Ig重链或轻链的可变结构域，所述可变结构域包括来自人抗体的构架区和人源化抗体所需的CDR；
(b)制备包括与DNA序列可操作地连接的合适启动子的第二种可复制表达载体，所述DNA序列分别至少编码互补Ig重链或轻链的可变结构域；
(c)用第一种或两种制备的载体转化细胞系；和
(d)培养所述转化的细胞系以产生所述改变的抗体。
优选地，步骤(a)中的DNA序列编码人抗体链的可变结构域和每个恒定结构域。可以使用任何合适的重组表达系统制备人源化抗体。进行转化以产生改变的抗体的细胞系可以是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或永生化哺乳动物细胞系，其有利地具有淋巴样起源，例如骨髓瘤、杂交瘤、三源杂交瘤或四源杂交瘤细胞系。细胞系还可以包括正常淋巴样细胞，例如B细胞，其已通过用病毒例如EB病毒转化而被永生化。最优选地，永生化细胞系是骨髓瘤细胞系或其衍生物。
用于表达抗体的CHO细胞可以是二氢叶酸还原酶(dhfr)缺陷的，并且因此依赖于胸苷和次黄嘌呤用于生长。亲本dhfr-CHO细胞系用编码抗体和dhfr基因的DNA进行转染，这使得能够选择dhfr阳性表型的CHO细胞转化体。通过在缺乏胸苷和次黄嘌呤的培养基上培养集落来执行选择，胸苷和次黄嘌呤的不存在阻止未转化的细胞生长，并且阻止转化的细胞再挽救(resalvaging)叶酸途径且因此绕 过选择系统。由于目的转染DNA和编码dhfr的DNA的共整合，这些转化体通常表达低水平的目的DNA。编码抗体的DNA的表达水平可以通过使用氨甲蝶呤(MTX)的扩增得到增加。这种药物是酶dhfr的直接抑制剂，并且允许分离抗性集落，所述抗性集落扩增足以在这些条件下存活的其dhfr基因拷贝数。因为编码dhfr和抗体的DNA序列在原始转化体中紧密连接，所以通常存在伴随扩增，并且因此增加所需抗体的表达。
用于与CHO或骨髓瘤细胞一起使用的另一种优选表达系统是在WO 87/04462中描述的谷氨酰胺合成酶(GS)扩增系统。这种系统涉及用编码酶GS的DNA和编码所需抗体的DNA转化细胞。随后选择在无谷氨酰胺的培养基中生长，并且因此可以假定为已整合编码GS的DNA的细胞。随后使用甲硫氨酸砜亚胺(Msx)对这些所选择的克隆实施酶GS的抑制。为了存活，细胞将扩增编码GS的DNA并且伴随扩增编码抗体的DNA。
尽管用于产生人源化抗体的细胞系优选是哺乳动物细胞系，但可以备选使用任何其他合适的细胞系，例如细菌细胞系或酵母细胞系。特别地，设想可以使用大肠杆菌(E.coli)衍生的细菌菌株。所获得的抗体就功能性进行检查。如果丧失功能性，那么必须返回步骤(2)并且改变抗体的构架。
表达后，根据本领域的标准操作，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析法、凝胶电泳等(一般参见，Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.(1982))，可以回收且纯化完整抗体、其二聚体、个别轻链和重链、或其他免疫球蛋白形式。对于医学用途，至少约90至95％同质性的基本上纯的免疫球蛋白是优选的，并且98至99％或更多同质性是最优选的。纯化后，部分或需要时同质性，人源化抗体随后可以在治疗上使用或在开发且执行测定法操作、免疫荧光染色等中使用(一般参见，Lefkovits和Pernis(编辑)，ImmunologicalMethods，第I和II卷，Academic Press，(1979和1981))。
由Greenwood等人(1993)执行的研究已证实抗体的Fc区被人 效应子细胞的识别可以通过改造免疫球蛋白分子的恒定区得到最佳化。这可以通过使具有所需特异性的抗体的可变区基因与编码免疫球蛋白同种型的人恒定区基因融合来实现，已证实所述免疫球蛋白同种型在人受试者中的有效抗原依赖性细胞细胞毒性(ADCC)，例如IgG1和IgG3同种型(Greenwood和Clark，Protein Engineering of AntibodyMolecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man.Mike Clark(编辑)，Academic Titles，部分II，第85-113页，(1993))。
还可以通过给转基因动物施用抗原制备具有完全人可变区的抗体，所述转基因动物已改良以响应抗原攻击产生此种抗体，但其内源基因座已丧失功能。可以执行各种后续操作，以获得抗体本身或其类似物(参见例如，US专利号6,075,181)。
编码抗体或其片段的基因的制备
编码抗体的基因，轻链和重链基因或其部分，例如单链Fv区，可以由杂交瘤细胞系进行克隆。它们可以全部使用相同的一般策略例如RACE使用商购可得试剂盒进行克隆，所述试剂盒例如由Clontech生产的。一般地，例如，使用随机六聚体作为引物逆转录从杂交瘤细胞中提取的聚(A)+mRNA。对于Fv区，通过2种聚合酶链反应(PCR)分别扩增VH和VL结构域。使用5′末端引物和3′末端引物可以扩增重链序列，所述5′末端引物根据重链的氨基末端蛋白质序列进行设计，所述3′末端引物根据共有免疫球蛋白恒定区序列进行设计(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest.第5版U.S.Department of Health and Human Services，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。使用5′末端引物与引物C-κ相组合扩增轻链Fv区，所述5′末端引物根据轻链的氨基末端蛋白质序列进行设计。本领域技术人员应认识到可以采用许多合适引物以获得Fv区。
将PCR产物亚克隆到合适的克隆载体内。通过DNA限制鉴定包含正确大小插入片段的克隆。使用与克隆位点相邻的测序引物，随后 可以由双链质粒DNA测定重链或轻链编码区的核苷酸序列。商购可得的试剂盒(例如，SequenaseTM试剂盒，United States BiochemicalCorp.，Cleveland，Ohio，USA)可以用于促进DNA测序。可以通过任何合适方法制备编码Fv区的DNA，包括例如扩增技术例如PCR和LCR。
化学合成产生单链寡核苷酸。这可以通过与互补序列杂交，或通过使用单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合而转变成双链DNA。尽管可以化学合成整个单链Fv区，但优选合成许多较短序列(约100至150个碱基)，随后连接在一起。
备选地，可以克隆亚序列，并且使用合适的限制性酶切割合适的亚序列。随后可以连接片段以产生所需DNA序列。
获得Fv可变轻链和重链DNA后，使用本领域技术人员众所周知的技术，将序列直接连接在一起或通过编码肽接头的DNA序列连接在一起。在一个实施方式中，重链和轻链区域通过弹性肽接头(例如(Gly4Ser)3)连接，所述弹性肽接头在重链Fv结构域的羧基末处开始并在轻链Fv结构域的氨基末端处结束。整个序列编码以单链抗原结合蛋白质形式的Fv结构域。
治疗剂
本发明限定的化合物可以用于递送治疗剂。治疗剂的例子包括但不限于，抗原、细胞毒素剂、药物和/或药理学试剂。
在某些实施方式中，治疗剂可以是与化合物融合的多肽。包括化合物的融合多肽可以通过本领域技术人员已知的方法进行制备。例如，使编码Fv区的基因与编码治疗剂的基因融合。任选地，使Fv基因与编码肽连接体的区段连接。肽连接体可以存在，仅仅以提供化合物和治疗剂之间的间隔，或促进这些区域之间的移动以使得它们各自能够达到其最佳构象。包括连接体的DNA序列还可以提供序列(例如引物位点或限制位点)以促进克隆，或可以保留编码结合部分的序列与编码治疗剂的序列之间的阅读框。此种连接体肽的设计是本领域技术 人员众所周知的。
一般地产生融合多肽涉及例如，分开制备Fv轻链和重链以及编码它们与之融合的任何其他蛋白质的DNA，并且在质粒或其他载体中重组DNA序列，以形成编码特别需要的融合多肽的构建体。然而，更简单的方法涉及将编码特定Fv区的DNA插入已编码所需融合多肽的构建体内。使用本领域技术人员众所周知的技术，将编码Fv区的DNA序列插入构建体内。
通过本领域技术人员已知且可获得的任何方法，可以使用于本发明的化合物例如重组单链抗体与治疗剂融合或以其他方式结合。2种组分可以通过多种众所周知的化学操作中的任何而化学键合在一起。例如，连接可以经由异双功能交联剂，例如SPDP、碳化二亚胺、戊二醛等。多种免疫毒素的产生以及化学缀合方法是本领域众所周知的(参见例如，″Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates：Aiming theMagic Bullet，″Thorpe等人，Monoclonal Antibodies in ClinicalMedicine，Academic Press，第168-190页(1982)；Waldmann，1991；Vitetta等人，1987；Pastan等人，1986；和Thorpe等人，1987)。
药物和/或药理学试剂的例子包括但不限于促进DC激活的试剂(例如TLR配体)、抑制DC激活或功能的试剂(例如DC信号传导分子的特异性抑制剂或启动子例如激酶和磷酸酶)、和调节DC死亡的试剂(例如凋亡的启动子或抑制子)。此种药物和/或药理学试剂是本领域技术人员众所周知的。
技术人员应当理解存在许多细菌或植物多肽毒素，其适合于在本发明的方法中用作细胞毒素剂。这些多肽包括但不限于，多肽例如天然或修饰的假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、蓖麻蛋白、相思豆毒素、白树毒素、木鳖子苷II、细菌RIP例如志贺和志贺样毒素a-链、丝瓜素、天花粉素(atrichosanthin)、木鳖子苷I、紫茉莉属抗病毒蛋白质、美洲商陆抗病毒蛋白质、byodin 2(U.S.5,597,569)、gaporin、及其基因工程变体。天然PE和DT是高毒性的化合物，其一般通过肝毒性造成死亡。优选地，PE和DT经修饰成去除毒素的天 然靶向组分的形式，所述组分例如PE的结构域Ia和DT的B链。本领域技术人员应当理解本发明并不限于具体细胞毒素剂。
在本发明中使用的其他合适的细胞毒素剂包括但不限于，试剂例如细菌或植物毒素、药物例如环磷酰胺(CTX；cytoxan)、苯丁酸氮芥(CHL；瘤可宁)、顺铂(CisP；CDDP；顺氯氨铂)、白消安(马利兰)、美法仑、卡莫司汀(BCNU)、链脲霉素、三乙撑蜜胺(TEM)、丝裂霉素C和其他烷化剂；氨甲蝶呤(MTX)、依托泊苷(VP-16；凡毕士)、6-巯基嘌呤(6MP)、6-硫鸟嘌呤(6TG)、阿糖胞苷(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5FU)、达卡巴嗪(DTIC)、2-氯脱氧腺苷(2-CdA)、及其他抗代谢药；抗生素包括放线菌素D、多柔比星(DXR；阿霉素)、柔红霉素(道诺霉素)、博来霉素、光辉霉素以及其他抗生素；生物碱例如长春花新碱(VCR)、长春碱等；以及其他抗癌剂包括细胞生长抑制剂糖皮质激素例如氟美松(DEX；地塞米松)和皮质类固醇例如泼尼松、核苷酸酶抑制剂例如羟基脲等。
本领域技术人员应认识到存在众多其他放射性同位素和化学细胞毒素剂，其可以通过众所周知的技术与结合5B6的化合物偶联，并且递送以特异性破坏树突状细胞(参见例如U.S.4,542,225)。光激活毒素的例子包括二氢吡啶和Ω-芋螺毒素。可以使用的细胞毒素剂的例子包括125I、131I、111In、123I、99mTc和32P。抗体可以使用本领域已知的技术由此种试剂进行标记。例如，关于涉及抗体放射性标记物的技术，参见Wenzel和Meares，Radioimmunoimaging andRadioimmunotherapy，Elsevier，N.Y.(1983)(还参见Colcher等人，1986；″Order，Analysis，Results and Future Prospective of theTherapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy″，Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy，Baldwin等人(编辑)，Academic Press，第303-16页，(1985))。
在一个例子中，通过稳定硫脲共价键使接头-螯合剂tiuexutan与化合物缀合，以提供关于铟-111或钇-90的高亲和力螯合位点。
抗原
还可将用于本发明的方法的化合物缀合于“抗原”。
术语“抗原”进一步意欲包括已知的或野生型抗原例如上文描述那些的肽或蛋白质类似物。类似物可以比野生型抗原更可溶或更稳定，并且还可以包含使得抗原更具有免疫学活性的突变或修饰。在本发明中还有用的是如下肽或蛋白质，其具有与所需抗原的氨基酸序列同源的氨基酸序列，其中同源抗原诱导针对分别肿瘤或生物体的免疫应答。
如本文所使用的，“癌抗原”是与肿瘤或癌细胞相关的分子或化合物(例如，蛋白质、肽、多肽、脂质、糖脂、碳水化合物和/或DNA)，并且当在MHC分子背景中在抗原呈递细胞表面上表达时，其能够引发免疫应答。癌抗原包括自身抗原以及其他抗原，所述其他抗原可能并不与癌症特异地相关，然而当施用于动物时，诱导和/或增强针对肿瘤或癌细胞的免疫应答和/或减少肿瘤或癌细胞的生长。
如本文所使用的，“来自致病性和/或传染性生物体的抗原”是任何生物体的抗原，并且可以包括但不限于，传染性病毒、传染性细菌、传染性寄生虫包括原生动物(例如疟原虫属物种(Plasmodium sp.))和蠕虫以及传染性真菌。一般地，对于在本发明中的使用，抗原是来自生物体的蛋白质或其抗原性片段，或与天然存在的抗原等同或相似的合成化合物，其诱导对于相对应生物体特异的免疫应答。与天然存在的生物体抗原相似的化合物或抗原是本领域技术人员众所周知的。与天然存在的生物体抗原相似的化合物的非限制性例子是多糖抗原的肽模拟物。
癌抗原的特定实施方式包括例如诱变的抗原例如Ras p21原癌基因、肿瘤抑制基因p53和HER-2/neu以及BCR-abl癌基因的蛋白质产物，以及CDK4、MUM1、半胱天冬酶8和β连环蛋白；过表达抗原例如半乳凝素4、半乳凝素9、碳酸酐酶、醛缩酶A、PRAME、Her2/neu、ErbB-2和KSA，癌胚抗原(oncofetal antigen)例如甲胎蛋白(AFP)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)；自身抗原例如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)和黑色素细胞分化抗原例如 Mart 1/Melan A、gp100、gp75、酪氨酸酶、TRP1和TRP2；前列腺相关抗原例如PSA、PAP、PSMA、PSM-P1和PSM-P2；再活化胚胎基因产物例如MAGE 1、MAGE 3、MAGE 4、GAGE 1、GAGE 2、BAGE、RAGE，以及其他癌睾丸抗原例如NY-ESO1、SSX2和SCP1；粘蛋白例如Muc-1和Muc-2；神经节苷脂例如GM2、GD2和GD3，中性糖脂和糖蛋白例如Lewis(y)和globo-H；和糖蛋白例如Tn、Thompson-Freidenreich抗原(TF)和sTn。
癌抗原及其分别的肿瘤细胞靶包括例如细胞角蛋白，特别是细胞角蛋白8、18和19，作为关于癌的抗原。上皮膜抗原(EMA)、人胚胎抗原(HEA-125)、人乳脂肪球、MBr1、MBr8、Ber-EP4、17-1A、C26和T16也是已知的癌抗原。结蛋白和肌特异性肌动蛋白是肌性肉瘤的抗原。胎盘碱性磷酸酶、β-人绒毛膜促性腺激素和α-甲胎蛋白是滋养层和生殖细胞肿瘤的抗原。前列腺特异性抗原是前列腺癌的抗原、结肠腺癌的癌胚抗原。HMB-45是黑素瘤的抗原。在宫颈癌中，有用的抗原可以由人乳头状瘤病毒编码。嗜铬粒蛋白-A和突触囊泡蛋白是神经内分泌和神经外胚瘤的抗原。特别有利的是形成具有坏死区域的实体瘤团块的侵袭性肿瘤。
衍生自已知诱发特定癌症的病原体的抗原也可以在本发明中有利地使用。对于在本文提供的癌症疫苗中使用特别有利的病原体包括乙型肝炎病毒(肝细胞癌)，丙型肝炎病毒(肝瘤(heptomas))，EB病毒(EBV)(伯基特淋巴瘤，鼻咽癌，免疫抑制个体中的PTLD)，HTLVL(成人T细胞性白血病)，致癌人乳头状瘤病毒16、18、33、45型(成人宫颈癌)，以及细菌幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)(B细胞胃淋巴瘤)。可以在哺乳动物且更特别在人中充当抗原的其他医学相关微生物在参考文献中广泛描述，例如C.G.A Thomas，MedicalMicrobiology，Bailliere Tindall，(1983)。
示例性病毒病原体包括但不限于感染哺乳动物且更特别是人的传染性病毒。传染性病毒的例子包括但不限于：逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒，例如HIV-1(也称为 HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV、或HIV-III；及其他分离物，例如HIV-LP；细小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(Calciviridae)(例如，引起胃肠炎的毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(Coronoviridae)(例如，冠状病毒例如SARS冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviradae)(例如，水疱性口炎病毒、狂犬病病毒)；纤丝病毒科(Filoviridae)(例如，埃波拉病毒)；副粘液病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如，汉坦病毒、布尼亚(bunga)病毒、白蛉病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒)；呼肠病毒科(Reoviridae)(例如，呼肠病毒、环状病毒(orbiviurses)和轮状病毒)；双RNA病毒科(Birnaviridae)；嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(Parvovirida)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒；痘病毒科(Poxyiridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲猪瘟病毒)；和未分类病毒(例如，海绵样脑病的病原学因子、丁型肝炎的因子(尽管认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星)、非甲型、非乙型肝炎的因子(1类＝内部传播的；2类＝肠胃外传播的(即丙型肝炎)；诺瓦克和相关病毒、和星状病毒属)。
此外，革兰氏阴性和革兰氏阳性菌可以通过主题组合物和方法在脊椎动物中被靶向。此种革兰氏阳性菌包括但不限于巴斯德氏菌属物种(Pasteurella sp.)、葡萄球菌属物种(Staphylococci sp.)和链霉菌属物种(Streptococcus sp.)。革兰氏阴性菌包括但不限于大肠埃希杆 菌(Escherichia coli)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)和沙门菌属物种(Salmonella sp.)。传染性细菌的具体例子包括但不限于：幽门螺杆菌、伯氏疏螺旋体(Borella burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌属物种(Mycobacteria sp.)(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、细胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)、链球菌属(Streptococcus)(草绿色组)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌属(厌氧物种)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、致病性弯曲杆菌属物种(Campylobacter sp.)、肠球菌属物种(Enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus infuenzae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus antracis)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae，)、棒状杆菌属物种(Coryn ebacterium sp.)、丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜杆菌(Clostridium perfringers)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀性巴斯德氏菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属物种(Bacteroides sp.)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidium)、细弱密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体属(Leptospira)、立克次氏体属(Rickettsia)和Actinomycesisraelli(疑为Actinomyces israeli，以色列放线菌)。
可以在主题组合物中用作抗原来源的细菌病原体的多肽包括但不限于铁调节外膜蛋白质(“IROMP”)、外膜蛋白质(“OMP”)、和引起疖病的杀鲑气单胞菌(Aeromonis salmonicida)的A-蛋白质、引 起细菌性肾病(“BKD”)的鲑鱼肾菌(Renibacterium salmoninarum)的p57蛋白质、主要表面相关抗原(“msa”)、表面表达的细胞毒素(“mpr”)、表面表达的溶血素(“ish”)和耶尔森菌病的鞭毛抗原；细胞外蛋白质(“ECP”)、铁调节外膜蛋白质(“IROMP”)、和巴斯德氏菌病的结构蛋白质；鳗弧菌(Vibrosis anguillarum)和奥氏弧菌(V.ordalii)的OMP和鞭毛蛋白质；鲇鱼爱德华氏菌(Edwardsiellosisictaluri)和迟钝爱德华氏菌(E.tarda)的鞭毛蛋白质、OMP蛋白质、aroA和purA；和小瓜虫属(Ichthyophthirius)的表面抗原；和柱状嗜纤维菌(Cytophaga columnari)的结构和调节蛋白质；以及立克次氏体属的结构和调节蛋白质。此种抗原可以重组或通过本领域已知的其他方法进行分离或制备。
病原体的例子进一步包括但不限于，感染哺乳动物且更特别是人的传染性真菌和寄生虫。传染性真菌的例子包括但不限于：新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和白色念珠菌(Candida albicans)。
寄生虫的例子包括细胞内寄生虫和专性细胞内寄生虫。寄生虫的例子包括但不限于恶性疟原虫、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)、果氏巴贝虫(Babesia microti)、分歧巴贝虫(Babesia divergens)、克鲁斯锥虫(Trypanosoma cruzi)、鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)、旋毛线虫(Trichinella spiralis)、硕大利什曼原虫(Leishmania major)、杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)、巴西利什曼原虫(Leishmania braziliensis)、热带利什曼原虫(Leishmania tropica)、冈比亚锥虫(Trypanosoma gambiense)、罗德西亚锥虫(Trypanosoma rhodesiense)、班氏吴策线虫(Wuchereriabancrofti)、马来丝虫(Brugia malayi)、帝汶布鲁丝虫(Brugia timori)、人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus) 和曼森血吸虫(Schistosoma mansoni)。
在哺乳动物且更特别是人中充当抗原的其他医学相关微生物在参考文献中广泛描述，例如参见C.G.A Thomas，MedicalMicrobiology，Bailliere Tindall，(1983)。除传染性人疾病和人病原体的治疗外，本发明的组合物和方法用于治疗非人哺乳动物的感染。示例性非人病原体包括但不限于小鼠乳房肿瘤病毒(“MMTV”)、劳斯肉瘤病毒(“RSV”)、禽白血病病毒(“ALV”)、禽成髓细胞瘤病毒(“AMV”)、鼠白血病病毒(“MLV”)、猫白血病病毒(“FeLV”)、鼠肉瘤病毒(“MSV”)、长臂猿白血病病毒(“GALV”)、脾坏死病毒(“SNV”)、网状内皮组织增殖病病毒(“RV”)、猿猴肉瘤病毒(“SSV”)、梅森-菲舍(Mason-Pfizer)猴病毒(“MPMV”)、猿猴逆转录病毒1型(“SRV-1”)、慢病毒例如HIV-1、HIV-2、SIV、维斯那病毒、猫免疫缺陷病毒(“FIV”)、和马传染性贫血病毒(“EIAV”)、T细胞白血病病毒例如HTLV-1、HTLV-II、猿猴T细胞白血病病毒(“STLV”)、和牛白血病病毒(“BLV”)、和泡沫病毒例如人泡沫病毒(“HFV”)、猿猴泡沫病毒(“SFV”)和牛泡沫病毒(“BFV”)。
可检测标记物
用于本发明的化合物可以在一系列检测系统中采用。例如，化合物可以在用于使受试者的内部区域成像和/或诊断受试者中疾病的存在或不存在的方法中使用。
对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的诊断、预测和/或监测方法涉及定量程度，以测定患者样品中存在的5B6水平、5B6表达细胞、配体和/或配体表达细胞。此种定量通过包括合适对照样品容易地提供。
优选地，在本发明的方法中包括内部对照。优选内部对照是取自一个或多个健康个体的一种或多种样品。
当在诊断上使用时，用于本发明的化合物可以与诊断剂例如可检测标记连接，以允许容易地检测在体外或在体内的结合事件。合适的 标记包括放射性同位素或非放射性标记，例如生物素、酶、化学发光分子、荧光团、染料标记物或用于检测和/或定位靶分子的其他显像剂。备选地，结合化合物的第二种标记的抗体或抗生物素蛋白(例如)可以用于检测。
在酶免疫测定法的情况下，酶可以与第二种抗体缀合，一般借助于戊二醛或高碘酸盐。然而，如容易认识到的，存在技术人员容易获得的广泛多样的不同缀合技术。常用酶尤其包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。在通过相对应酶水解后，一般选择与特定酶一起使用的底物，用于产生可检测的颜色改变。合适酶的例子包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。还可以采用荧光底物，其产生荧光产物而不是上文指出的生色底物。
在另一个例子中，荧光化合物例如但不限于尤其是荧光素和罗丹明，可以与例如抗体化学偶联而不改变其结合能力。当通过用特定波长的光照射而被激活时，荧色染料标记的抗体吸收光能，诱导在分子中应激性的状态，随后发出用光学显微镜可视觉检测的特征性颜色下的光。
作为进一步的非限制性例子，与显像剂偶联的化合物可以用于检测在组织化学组织切片中的5B6或配体表达。化合物可以与合适的超磁性、顺磁、电子密度、发生回波、放射性或非放射性标记例如生物素或抗生物素蛋白共价或非共价偶联。
标记的细胞检测和分离
可以通过本领域众所周知的多种技术从样品中检测到具有破坏的细胞膜的细胞，受到病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，所述技术包括细胞分选，特别是荧光激活细胞分选(FACS)，通过使用与底物(例如，塑料表面，如在淘选中)结合的亲和试剂，或通过使用与固相颗粒结合的亲和试剂，所述固相颗粒可以基于珠(例如，有色胶乳珠或磁性颗粒)的性质进行分离。天然地，用于富集细胞的操作将依赖于细胞如何进行标记。
在一个例子中，可以使用具有用于细胞分选器的合适特征的任何可检测物质(例如，在荧光染料的情况下，可以由分选器的光源激发的染料、和可以由细胞分选器的检测器检测出的发射谱)。在流式细胞术中，通过包含细胞的液流或其他颗粒投射激光束，当被聚焦光撞击时，所述液流或其他颗粒发出由检测器选出的信号。这些信号随后经转变用于计算机存储和数据分析，并且可以提供关于多种细胞性质的信息。用合适染料标记的细胞通过激光束激发，并且在特征性波长下发光。这种发射的光由检测器选出，并且这些模拟信号转变成数字信号，允许其存储、分析和显示。
许多更大型的流式细胞仪也是“细胞分选器”，例如荧光激活细胞分选器(FACS)，并且是具有将来自特定群体的细胞选择性沉积到管或其他收集容器内的能力的仪器。在一个特别优选的实施方式中，使用FACS分离细胞。这种操作是本领域众所周知的，并且通过例如Melamed等人，Flow Cytometry and Sorting，Wiley-Liss，Inc.，(1990)；Shapiro，Practical Flow Cytometry，第4版，Wiley-Liss，Inc.，(2003)；和Robinson等人，Handbook of Flow Cytometry Methods，Wiley-Liss，Inc.(1993)描述。
为了分选细胞，该仪器电子解释对于每种细胞收集的信号，因为它通过激光束询问并且将信号与计算机上的分选标准组进行比较。如果细胞符合所需标准，那么将电子电荷应用于液流，所述液流精确地分裂成包含细胞的小滴。在目的细胞将从流中脱落的那个时刻，将这种电荷应用于流，随后当荷电小滴已从流中脱落时去除。当小滴落下时，它们经过带强正或负电的2块金属板之间。荷电小滴被拉向相反极性的金属板，并且沉积在收集容器中，或显微镜载玻片上，用于进一步检查。
细胞可以作为单种细胞或多种细胞自动沉积在收集容器中，例如使用激光器例如氩激光器(488nm)和例如装配有Autoclone单元的流式细胞仪(Coulter EPICS Altra，Beckman-Coulter，Miami，Fla.，USA)。用于本发明的方法的合适FACS机器的其他例子包括 但不限于，MoFloTM高速细胞分选器(Dako-Cytomation ltd)、FACSAriaTM(Becton Dickinson)、FACS Diva(Becton Dickinson)、ALTRATM Hyper sort(Beckman Coulter)和CyFlowTM分选系统(Partec GmbH)。
使用固相颗粒从样品中检测具有破坏的细胞膜的细胞，受到病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，可以利用具有所需性质的任何颗粒。例如，大颗粒(例如，直径大于约90-100μm)可以用于促进沉淀。优选地，颗粒是“磁性颗粒”(即可以使用磁场进行收集的颗粒)。标记的细胞保留在柱(由磁场保持)中，而未标记的细胞直接通过并且在另一个末端处洗脱。磁性颗粒目前通常可从多个制造商获得，包括Dynal Biotech(Oslo，Norway)和Milteni Biotech GmbH(Germany)。磁性细胞分选(MACS)的例子由Al-Mufti等人(1999)提供。
激光捕获显微切割也可以使用本发明的方法用于在载玻片上选择性检测标记的细胞。使用激光捕获显微切割的方法是本领域已知的(参见例如，U.S.20030227611和Bauer等人，2002)。
结合5B6的化合物或其配体的鉴定
描述了筛选测试化合物的方法，其可以鉴定与5B6结合的化合物，或其配体，因此用于本发明的方法中。
通过求助于测定法和技术筛选5B6或其配体活性的抑制剂，所述测定法和技术用于鉴定能够与5B6多肽或其配体结合且因此抑制生物学活性的药物。此种测定法包括使用哺乳动物细胞系(例如，CHO细胞或293T细胞)用于噬菌体展示系统用于表达5B6多肽或其配体，且使用转染哺乳动物或大肠杆菌或其他微生物的培养物，以产生用于潜在结合化合物的结合研究的蛋白质。
作为另一个例子，用于鉴定与5B6多肽或其配体特异性结合的化合物的方法可以简单地包括下述步骤：使所选择的表达5B6或其配体的细胞与测试化合物接触，以允许测试化合物与5B6或其配体的结合， 并且测定与5B6或其配体结合的测试化合物(如果存在)的量。此种方法涉及测试化合物与固定在固体支持物上的5B6多肽或其配体的温育。一般地，允许包含固定的化合物的表面与包含蛋白质的溶液接触，并且使用合适的检测系统测量结合。合适的检测系统是本领域已知的，其中某些在本文中描述。
计算机建模和搜索技术允许鉴定可以结合5B6或其配体的化合物。可以测定5B6或其配体或其活性位点的三维几何结构。这可以通过已知方法完成，所述方法包括可以测定完整分子结构的X射线晶体学。
基于计算机的数字建模方法可以用于完成结构(例如，在其中测定不完整或不够精确的结构的实施方式中)或改善其精确度。可以使用本领域公认的任何方法，包括但不限于，对特定生物聚合物例如蛋白质或核酸特异的参数化模型，基于计算分子运动的分子动力学模型，基于热总体的统计力学模型，或组合模型。
通过使用计算机建模，使用对接程序例如GRAM、DOCK或AUTODOCK(Dunbrack等人，1997)，5B6或其配体的三维结构可以用于鉴定拮抗剂或激动剂。计算机程序也可以用于评估候选化合物与多肽的吸引、排斥和立体阻碍。一般地，拟合越紧密(例如，更低的立体阻碍、和/或更大的吸引力)，潜在激动剂或拮抗剂将更有效，因为这些性质与更紧密的结合常数一致。此外，在潜在激动剂或拮抗剂的设计中越特异，它将越不可能干扰其他蛋白质。
最初，可以通过例如筛选由重组噬菌体产生的随机肽文库或化学文库获得潜在化合物。随后可以通过计算机建模程序系统性修饰以这种方式选择的化合物，直至鉴定一种或多种有希望的潜在化合物。
此种计算机建模允许选择有限数目的合理化学修饰，与可以制备并且其中任何一种都可能产生有用激动剂或拮抗剂的无限数目的基本上随机的化学修饰相对比。每种化学修饰需要另外的化学步骤，这对于合成有限数目的化合物虽然是合理的，但如果需要合成所有可能修饰，很快变得势不可挡的。因此通过使用三维结构和计算机建模，在 计算机监视屏上可以快速筛选大量这些化合物，并且可以确定少数可能候选物而无需费力合成无数数目的化合物。
对于大多数类型的模型，代表组成成分原子和基团之间的力的标准分子力场是必需的，并且可以选自物理化学中已知的力场。本领域已知且可以在此种方法中使用的示例性力场包括但不限于，恒定价力场(CVFF)、AMBER力场和CHARM力场。不完整或较不精确的实验结构可以充当关于由这些建模方法计算的完整和更精确结构的约束。
分子建模系统的进一步例子是CHARMm和QUANTA程序(Polygen Corporation，Waltham，MA)。CHARMm执行能量最低化和分子动力学功能。QUANTA执行分子结构的构建、图形建模和分析。QUANTA允许分子相互的交互构建、修饰、显现和行为分析。
微生物保藏细节
杂交瘤20/05-3A4-26-16-Clone 5和杂交瘤23/05-4C6-29-3-Clone5是分泌针对人C型凝集素克隆5B6的单克隆Ab的杂交瘤。
杂交瘤24/04-10B4-24-8-FACS 9-5和杂交瘤42/04-42D2-66-4-1-Clone 4是分泌针对小鼠C型凝集素克隆5B6的单克隆Ab的杂交瘤。
抗体24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4和23/05-4C6通过杂交瘤细胞系产生，所述杂交瘤细胞系于2007年12月11日分别以保藏参考号07121101、07121102、07121103和07121104保藏于欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)24/04-10B4-24-8、42/04-42D2-66-4-1、20/05-3A4-26-16、23/05-4C6-29-3。
上述杂交瘤的更高抗体分泌亚克隆(24/04-10B4-24-8-FACS 9-5、42/04-42D2-66-4-1-Clone 4、20/05-3A4-26-16-Clone 5、23/05-4C6-29-3-Clone 5)于2008年4月29日保藏于ECACC，并且指定下述编号；
●杂交瘤24/04-10B4-24-8-FACS 9-5-登记号08042901
●杂交瘤42/04-42D2-66-4-1CLONE 4-登记号08042902
●杂交瘤20/05-3A4-26-16-CLONE 5-登记号08042903，和
●杂交瘤23/05-4C6-29-3-CLONE 5-登记号08042904。
根据国际承认用于专利程序以及其实施细则的微生物保藏布达佩斯条约进行这些保藏。这确保活培养物从保藏日期起维持30年。生物体将通过ECACC根据布达佩斯条约可获得，该条约确保在相关专利发布之日起公众能永久并不受限地得到该培养物的子代。
本申请的受让人已同意，如果在合适条件下培养时，培养物保藏死亡或丢失或破坏，它将在通知后立即用相同培养物的活样本替换。保藏菌株的可用性不应解释为违背根据任何政府当局依照其专利法授予的权利实践本发明的许可。
与具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞相关的疾病
与具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞相关的疾病的实例包括但不必限于以下：
1)在其中响应负责生物预防的免疫系统的细胞产生的信号而诱导了凋亡的疾病，例如移植物抗宿主病(GVHD)及自身免疫疾病(系统性红斑狼疮(SLE)、风湿性关节炎(RA)、硬皮病、Sjogren氏综合征、多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病、溃疡性结肠炎)。
2)在其中病毒感染诱导了细胞死亡或免疫系统细胞与受到病毒或寄生虫感染的细胞发生反应而诱导了凋亡的疾病，例如，病毒相关性噬血细胞综合征(VAHS)以及其他病毒感染(HCV、HIV、流感病毒)。
3)在其中异常凋亡信号诱导了细胞死亡的疾病，例如，神经退行性疾病(阿耳茨海默氏病、帕金森氏病)。
4)白血病，例如，急性淋巴性白血病。
5)在其中由例如射线暴露或药物(抗癌药物等)人为诱导了凋亡的疾病。
6)系统性炎症反应综合征(SIRS)，在其中因为免疫系统在响应 对活体的入侵时非特异性激活并因此不可能控制细胞因子产生而发生器官障碍的疾病(HPS，重症胰腺炎)。
7)其中缺少细胞死亡的疾病如癌症。
8)创伤，具体而言是创伤后恢复。
可以使用本发明确定活体中进行的细胞死亡，因此能监测这些疾病的进程。具体而言，此发明可用于GVHD、人免疫缺陷型病毒(HIV)、噬血细胞综合征(HPS)，尤其是病毒相关性噬血细胞综合征(VAHS)、急性淋巴性白血病、流行性脑炎、脑病以及疟疾。
多肽
术语“多肽”和“蛋白质”一般可互换使用并且指单条多肽链，其可以通过添加非氨基酸基团进行修饰或不修饰。应当理解此种多肽链可以与其他多肽或蛋白质或其他分子例如辅因子结合。如本文所使用的，术语“蛋白质”和“多肽”还包括本文描述的多肽的变体、突变体、生物学活性片段、修饰、类似物和/或衍生物。
多肽的同一性％通过GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)进行测定，其中缺口产生罚分＝5，并且缺口延长罚分＝0.3。查询序列的长度是至少25个氨基酸，并且GAP分析在至少25个氨基酸的区域上比对2个序列。更优选地，查询序列的长度是至少50个氨基酸，并且GAP分析在至少50个氨基酸的区域上比对2个序列。更优选地，查询序列的长度是至少100个氨基酸，并且GAP分析在至少100个氨基酸的区域上比对2个序列。更加优选地，查询序列的长度是至少200个氨基酸，并且GAP分析在至少200个氨基酸的区域上比对2个序列。更加优选地，GAP分析在其完整长度上比对2个序列。
如本文所使用的，“生物学活性片段”是如本文所描述的多肽的部分，其维持全长多肽的所定义活性。生物学活性片段可以是任何尺寸，只要它们维持所定义的活性。优选地，生物学活性片段长度是至少100个氨基酸。
如本文所使用的，“抗原性片段”是如本文所描述的多肽的部分，其可以施用于动物例如小鼠、兔或人，以诱导将结合多肽的抗体产生。
如本文所使用的，“抗原结合片段”指如本文限定的抗体的部分，其能够与全长分子结合相同的抗原。
如本文所使用的，“可溶性片段”指的是多肽的部分，其缺少跨膜区域。在一个优选的实施方式中，可溶性片段不包括SEQ ID NO 1至8中任何一个的至少约40、至少约50、至少约55、或至少约100个N末端残基。在一个进一步优选的实施方式中，可溶性片段包括多肽的C型凝集素样结构域，其中所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个所提供的氨基酸序列；或
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个有至少50％同一性的氨基酸序列。在一个进一步的实施方式中，可溶性片段包括：
i)如SEQ ID NO 40至47中任何一个所提供的氨基酸序列；或
ii)与SEQ ID NO 40至47中任何一个或多个有至少50％同一性的氨基酸序列。
其中可溶性片段不包括SEQ ID NO 1至8中任何一个的至少大约40个N-末端残基。
就所限定的多肽而言，应当理解高于上文提供那些的同一性％数字将包括优选实施方式。因此，当可应用时，根据最小同一性％数字，优选多肽包含这样的氨基酸序列，其与相关提名的SEQ ID NO至少50％、更优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、更优选至少99.1％、更优选至少99.2％、更优选至少99.3％、更优选至少99.4％、更优选至少99.5％、更优选至少99.6％、更优选至少99.7％、更优选至少99.8％、且更加优选至少99.9％等同。
本文描述的多肽的氨基酸序列突变体可以通过下述进行制备：将 合适的核苷酸改变引入本文限定的核酸内，或通过所需多肽的体外合成。此种突变体包括例如在氨基酸序列内的残基的缺失、插入或置换。可以进行缺失、插入和置换的组合以取得最终构建体，条件是最终多肽产物具有所需特征。
突变体(改变的)多肽可以使用本领域已知的任何技术进行制备。例如，可以对本文描述的多核苷酸实施体外诱变。此种体外诱变技术可以包括将多核苷酸亚克隆到合适载体内，将载体转化到“诱变”株例如大肠杆菌XL-1 red(Stratagene)内，并且使转化的细菌繁殖合适数目的代。在另一个例子中，对本文限定的多核苷酸实施如由Harayama(1998)广泛描述的DNA改组技术。衍生自诱变的/改变的DNA的产物可以使用本文描述的技术容易地筛选，以测定它们是否能够赋予所需表型。
在设计氨基酸序列突变体中，突变位点的定位和突变的性质将依赖于待修饰的一种或多种特征。用于突变的位点可以个别地或系列地进行修饰，例如通过(1)首先用保守氨基酸选择进行置换，随后依赖于达到的结果用更激烈的选择进行置换，(2)缺失靶残基，或(3)插入与定位位点相邻的其他残基。
氨基酸序列缺失一般范围为约1至15个残基，更优选约1至10个残基并且一般是约1至5个邻接残基。
置换突变体具有在多肽分子中去除的至少一个氨基酸残基，以及在其位置中插入的不同残基。对于置换诱变最有利的位点包括鉴定为对于功能重要的位点。其他有利位点是其中得自多种菌株或物种的特定残基是等同的那些(参见例如，图1)，和/或其中得自相关蛋白质的特定残基是等同的那些(参见例如，图2)。这些位置对于生物学活性可能是重要的。这些位点特别是包括在至少3个其他等同保守位点序列内的那些，优选以相对保守方式进行置换。此种保守置换显示于表1中。
此外，需要时，可以引入非天然氨基酸或化学氨基酸类似物作为在本文描述的多肽内的置换或添加。此种氨基酸包括但不限于，普通 氨基酸的D-同分异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、丙氨酸环己酯、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计的氨基酸例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸、和一般而言的氨基酸类似物。
表1-示例性置换。
  原始残基  示例性置换
  Ala(A)  val；leu；ile；gly
  Arg(R)  lys
  Asn(N)  gln；his
  Asp(D)  glu
  Cys(C)  ser
  Gln(Q)  asn；his
  Glu(E)  asp
  Gly(G)  pro，ala
  His(H)  asn；gln
  Ile(I)  leu；val；ala
  Leu(L)  ile；val；met；ala；phe
  Lys(K)  arg
  Met(M)  leu；phe
  Phe(F)  leu；val；ala
  Pro(P)  gly
  Ser(S)  thr
  Thr(T)  ser
  Trp(W)  tyr
  Tyr(Y)  trp；phe
  Val(V)  ile；leu；met；phe；ala
在本发明的范围内还包括的是在合成过程中或在合成后进行差异修饰的本发明的多肽，例如通过生物素化、苄化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白酶解切割、与抗体分子或其他细胞配体连接等。这些修饰可以作用于增加多肽的稳定性和/或生物学活性。
本文描述的多肽可以以多种方式产生，包括天然多肽的产生和回 收、重组多肽的产生和回收、以及多肽的化学合成。在一个实施方式中，本发明的分离的多肽通过下述产生：在有效产生多肽的条件下培养能够表达多肽的细胞，并且回收多肽。待培养的优选细胞是本发明的重组细胞。有效培养条件包括但不限于，允许多肽产生的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。有效培养基指其中培养细胞以产生本发明的多肽的任何培养基。此种培养基一般包括具有可同化碳、氮和磷源，以及合适盐、矿物质、金属和其他营养素例如维生素的水性培养基。可以在常规发酵生物反应器、组织培养瓶、摇瓶、试管、微量滴定皿和培养皿中培养本发明的细胞。培养可以在对于重组细胞合适的温度、pH和氧含量下进行。此种培养条件在本领域普通技术人员的专业知识内。
多核苷酸
术语“多核苷酸”在本文中可与术语“核酸”互换使用。
多核苷酸的同一性％通过GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)进行测定，其中缺口产生罚分＝5，并且缺口延长罚分＝0.3。除非另有说明，查询序列的长度是至少45个核苷酸，并且GAP分析在至少45个核苷酸的区域上比对2个序列。更优选地，查询序列的长度是至少150个核苷酸，并且GAP分析在至少150个核苷酸的区域上比对2个序列。更优选地，查询序列的长度是至少250个核苷酸，并且GAP分析在至少250个核苷酸的区域上比对2个序列。更加优选地，GAP分析在其完整长度上比对2个序列。
就所限定的多核苷酸而言，应当理解高于上文提供那些的同一性％数字将包括优选实施方式。因此，当可应用时，根据最小同一性％数字，优选本发明的多核苷酸包含这样的序列，其与相关提名的SEQID NO至少50％、更优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少 96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、更优选至少99.1％、更优选至少99.2％、更优选至少99.3％、更优选至少99.4％、更优选至少99.5％、更优选至少99.6％、更优选至少99.7％、更优选至少99.8％、且更加优选至少99.9％等同。
如本文所使用的，术语“杂交”指2个单链核酸分子能够通过氢键合形成至少部分双链核酸的能力。
如本文所使用的，短语“严格条件”指在其下多核苷酸、探针、引物和/或寡核苷酸将与其靶序列而不与其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同环境中将是不同的。在更高的温度下，更长序列在比更短序列特异性杂交。一般地，严格条件选择为比在限定离子强度和pH下关于特定序列的热解链温度(Tm)低约5℃。Tm是在其下与靶序列互补的50％探针与靶序列平衡杂交的温度(在限定离子强度、pH和核酸浓度下)。因为靶序列一般过量存在，所以在Tm下，50％的探针平衡占据。一般地，严格条件将是这样的，其中在pH 7.0至8.3下，盐浓度小于约1.0M钠离子、一般约0.01至1.0M钠离子(或其他盐)，并且温度对于短探针、引物或寡核苷酸(例如，10nt至50nt)是至少约30℃，并且对于较长探针、引物或寡核苷酸是至少约60℃。严格条件还可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来实现。
严格条件是本领域技术人员已知的，并且可以在Ausubel等人(同上)，6.3.1-6.3.6以及本文描述的实施例中找到。优选地，所述条件是这样的，使得彼此至少约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％同源的序列一般保持彼此杂交。严格杂交条件的非限制性例子是在高盐缓冲液中在65℃下杂交，所述高盐缓冲液包括6xSSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500mg/ml变性鲑精DNA，随后为在0.2.xSSC、0.01％BSA中在50℃下的一次或多次洗涤。在另一个实施方式中，提供了在中等严格条件下，可与包括SEQ ID NO 9至16的核苷酸序列的一种或多种核酸分子杂交的核酸序列。中等严格杂交条件的非限制性例子 是在6xSSC、5xDenhardt′s溶液、0.5％SDS和100mg/ml变性鲑精DNA中在55℃下杂交，随后为在1xSSC、0.1％SDS中在37℃下的一次或多次洗涤。可以使用的其他中等严格条件是本领域众所周知的，参见例如Ausubel等人(同上)，和Kriegler，Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual，Stockton Press，(1990)。在另外一个实施方式中，提供了在低严格条件下，可与包括SEQ ID NO 9至16的核苷酸序列中任何一个或多个的核酸分子杂交的核酸。低严格杂交条件的非限制性例子是在35％甲酰胺、5xSSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100mg/ml变性鲑精DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖中在40℃下杂交，随后为在2xSSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS中在50℃下的一次或多次洗涤。可以使用的其他低严格条件是本领域众所周知的，参见例如Ausubel等人(同上)和Kriegler(同上)。
当与天然存在的分子相比较时，本发明的多核苷酸可以具有一个或多个突变，其是核苷酸残基的缺失、插入或置换。突变体可以是天然存在的(即，从天然来源中分离)或合成的(例如，通过对核酸执行定向诱变)。
通常，多核苷酸或寡核苷酸的单体通过磷酸二酯键或其类似物连接，以形成大小从相对短的单体单位例如12-18个到数百个单体单位的寡核苷酸。磷酸二酯键的类似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate和氨基磷酸酯。
反义多核苷酸
术语“反义多核苷酸”应理解为意指DNA或RNA或其组合，其与编码多肽的特定mRNA分子的至少部分互补，并且能够干扰转录后事件例如mRNA翻译的分子。反义方法的使用是本领域众所周知的(参见例如G.Hartmann和S.Endres，Manual of AntisenseMethodology，Kluwer(1999))。反义技术在植物中的使用已由 Bourque，1995和Senior，1998综述。Bourque，1995列出了反义序列如何在植物系统中用作基因灭活方法的大量例子。她还阐述了可能不需要达到任何酶活性的100％抑制，因为部分抑制将更可能导致系统中的可检测改变。Senior(1998)阐述了反义方法目前是非常良好确定的用于操纵基因表达的技术。
用于本发明的反义多核苷酸将在生理条件下与靶多核苷酸杂交。如本文所使用的，术语“在生理条件下杂交的反义多核苷酸”意指在细胞优选人细胞中的正常条件下，多核苷酸(其是全部或部分单链的)至少能够与编码蛋白质的mRNA形成双链多核苷酸，所述蛋白质例如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的那些。
反义分子可以包括与结构基因相对应的序列，或实现对基因表达或剪接事件的控制的序列。例如，反义序列可以与靶基因的所靶向编码区、或5′非翻译区(UTR)或3′-UTR或这些的组合相对应。它可以与靶基因的内含子序列，优选仅与外显子序列部分互补，所述内含子序列可以在转录过程中或在转录后剪接掉。考虑到UTR一般更大的趋异性，靶向这些区域提供了基因抑制的更大特异性。
反义序列的长度应是至少19个邻接核苷酸，优选至少50个核苷酸，并且更优选至少100、200、500或1000个核苷酸。可以使用与完整基因转录物互补的全长序列。长度最优选是100-2000个核苷酸。反义序列与靶向转录物的同一性程度应是至少90％和更优选95-100％。反义RNA分子当然可以包括无关序列，其可以作用于稳定分子。
催化多核苷酸
术语催化多核苷酸和/或核酸指DNA分子或含DNA分子(在本文中也称为“脱氧核酶”)或RNA或含RNA分子(也称为“核酶”)，其特异性识别独特的底物并且催化这种底物的化学修饰。催化核酸中的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T(和U对于RNA)。
一般地，催化核酸包含用于特异性识别靶核酸的反义序列，和核酸切割酶促活性(在本文中也称为“催化结构域”)。在本发明中特别 有用的核酶类型是锤头核酶(Haseloff和Gerlach，1988；Perriman等人，1992)和发夹核酶(Shippy等人，1999)。
用于本发明的核酶和编码核酶的DNA可以使用本领域众所周知的方法进行化学合成。核酶还可以从与RNA聚合酶启动子可操作地连接的DNA分子(其在转录后产生RNA分子)进行制备，所述启动子例如关于T7 RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶的启动子。当载体还包含与DNA分子可操作地连接的RNA聚合酶启动子时，核酶可以在体外与RNA聚合酶和核苷酸一起温育后产生。在一个分开实施方式中，DNA可以插入表达盒或转录盒内。在合成后，RNA分子可以与具有稳定核酶的能力的DNA分子连接进行修饰，并且使得它对RNA酶有抵抗力。
与本文描述的反义多核苷酸一样，在“生理条件”下，即在细胞内的那些(特别是在动物细胞例如人细胞中的条件)，用于本发明的催化多核苷酸也应能够与靶核酸分子(例如，编码SEQ ID NO 1至8中提供的任何多肽的mRNA)杂交。
RNA干扰
RNA干扰(RNAi)特别用于特异性抑制特定蛋白质的产生。尽管不希望受理论限制，Waterhouse等人(1998)已提供关于dsRNA(双链体RNA)可以用于减少蛋白质产生所采用的机制的模型。这种技术依赖于dsRNA分子的存在，所述dsRNA分子包含与目的基因或其部分的mRNA基本上等同的序列，在本发明情况下，所述mRNA是编码根据本发明的多肽的mRNA。方便地，dsRNA可以在重组载体或宿主细胞中由单个启动子产生，其中有义和反义序列邻侧为无关序列，所述无关序列使得有义和反义序列能够杂交，以形成具有形成环结构的无关序列的dsRNA分子。关于本发明的合适dsRNA分子的设计和产生完全在本领域技术人员的能力内，特别考虑Waterhouse等人(1998)，Smith等人(2000)，WO 99/32619、WO 99/53050、WO 99/49029和WO 01/34815。
在一个例子中，引入DNA，其指导与待灭活的靶基因具有同源性的一种或多种至少部分双链RNA产物的合成。DNA因此包括有义和反义序列，当转录成RNA时，其可以杂交以形成双链RNA区域。在一个优选实施方式中，有义和反义序列通过包括内含子的间隔区分开，当转录成RNA时，所述内含子剪接掉。已显示这种安排导致更高效率的基因沉默。双链区域可以包括由一个或两个DNA区域转录的一种或两种RNA分子。双链分子的存在被认为触发来自单子叶植物系统的应答，这破坏来自靶植物基因的双链RNA以及同源RNA转录物，有效减少或消除靶基因的活性。
杂交的有义和反义序列的长度应各自是至少19个邻接核苷酸，优选至少30或50个核苷酸，并且更优选至少100、200、500或1000个核苷酸。可以使用与完整基因转录物相对应的全长序列。长度最优选是100-2000个核苷酸。有义和反义序列与靶向转录物的同一性程度应是至少85％、优选至少90％且更优选95-100％。RNA分子当然可以包括无关序列，其可以作用于稳定分子。RNA分子可以在RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子的控制下进行表达。后者的例子包括tRNA或snRNA启动子。
优选的小干扰RNA(‘siRNA’)分子包括与靶mRNA的约19-21个邻接核苷酸等同的核苷酸序列。优选地，靶mRNA序列从二核苷酸AA开始，包括约30-70％(优选30-60％、更优选40-60％且更优选约45％-55％)的GC含量，并且与它待引入其中的动物(优选人)基因组中除靶外的任何核苷酸序列不具有高同一性百分比，例如，如通过标准BLAST搜索测定的。
微小RNA
微小RNA调节是RNA沉默途径的明显特化分支，其朝向基因调节进化，与常规RNAi/PTGS相异。微小RNA是特定的一类小RNA，其在以特征性反向重复组构的基因样元件中编码。当转录时，微小RNA基因产生茎-环前体RNA，随后由其加工微小RNA。微小RNA 长度一般是约21个核苷酸。释放的miRNA掺入包含Argonaute蛋白质的特定子集的RISC样复合物内，其发挥序列特异性基因阻遏(参见例如Millar和Waterhouse，2005；Pasquinelli等人，2005；Almeida和Allshire，2005)。
共抑制
可以使用的另一种分子生物学方法是共抑制。共抑制的机制并未充分理解，但被认为涉及转录后基因沉默(PTGS)，并且在这点上可能与反义阻遏的许多例子非常相似。它涉及以就启动子而言的有义方向将基因或其片段的额外拷贝引入植物内用于其表达。有义片段的大小、其与靶基因区域的对应性、及其与靶基因的序列同一性程度是关于上文描述的反义序列。在某些情况下，基因序列的另外拷贝干扰靶植物基因的表达。关于实现共抑制途径的方法，参考WO 97/20936和EP 0465572。
重组载体
用于本发明的重组载体可包括被插入到能够将多核苷酸分子递送到宿主细胞内的、任何载体内的本文描述的至少一种分离多核苷酸分子，和/或编码如本文所描述的多肽的多核苷酸。此种载体包含异源多核苷酸序列，其是未天然发现与本发明的多核苷酸分子相邻，并且优选衍生自除一种或多种多核苷酸分子由其衍生的物种外的物种的多核苷酸序列。载体可以是RNA或DNA，原核生物或真核生物的，并且一般是转座子(例如US 5,792,294中描述的)、病毒或质粒。
一种类型的重组载体包括与表达载体可操作地连接一种或多种多核苷酸。短语可操作地连接指多核苷酸分子以这样的方式插入表达载体内，使得当转化到宿主细胞内时所述分子能够被表达。如本文所使用的，表达载体是DNA或RNA载体，其能够转化宿主细胞且实现特定多核苷酸分子的表达。优选地，表达载体还能够在宿主细胞内复制。表达载体可以是原核生物或真核生物的，并且一般是病毒或质粒。表 达载体包括在重组细胞中起作用(即指导基因表达)的任何载体，包括在细菌、真菌、内寄生虫、节肢动物、动物和植物细胞中。载体还可以用于在无细胞表达系统中产生多肽，此种系统是本领域众所周知的。
如本文所使用的，“可操作地连接”指2个或更多个核酸(例如DNA)区段之间的功能关系。一般地，它指转录调节元件与转录序列的功能关系。例如，启动子与编码序列例如本文限定的多核苷酸可操作地连接，如果它在合适宿主细胞和/或在无细胞表达系统中刺激或调节编码序列的转录。一般地，与转录序列可操作地连接的启动子转录调节元件与转录序列在物理上邻接，即它们是顺式作用的。然而，某些转录调节元件例如增强子无需与它们增强其转录的编码序列在物理上邻接或位于紧密接近中。
特别地，表达载体包含调节序列，例如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点、和其他调节序列，其与重组细胞相容并且控制本发明的多核苷酸分子的表达。特别地，本发明的重组分子包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录起始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的那些，例如启动子、增强子、操纵子和抑制子序列。合适的转录控制序列包括可以在本发明的至少一种重组细胞中起作用的任何转录控制序列。多种此类转录控制序列是本领域技术人员已知的。优选的转录控制序列包括在细菌、酵母、节肢动物、线虫动物、植物或动物细胞中起作用的那些，例如但不限于tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、噬菌体λ、噬菌体T7、T7lac、噬菌体T3、噬菌体SP6、噬菌体SP01、金属硫蛋白、α-交配因子、毕赤酵母属醇氧化酶、甲病毒属亚基因组启动子(例如辛德比斯病毒亚基因组启动子)、抗生素抗性基因、杆状病毒、玉米夜蛾(Heliothiszea)昆虫病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、浣熊痘病毒、其他痘病毒、腺病毒、巨细胞病毒(例如立即早期启动子)、猿猴病毒40、逆转录病毒、肌动蛋白、逆转录病毒长末端重复、劳斯肉瘤病毒、热休克、磷酸盐和硝酸盐转录控制序列以及能够控制原核生物或真核生物细胞中 的基因表达的其他序列。
宿主细胞
还可用于本发明的实施方式的是重组细胞或其后代细胞，所述重组细胞包括用本文描述的一种或多种重组分子转化的宿主细胞。多核苷酸分子转化到细胞内可以通过将多核苷酸分子插入细胞内的任何方法来完成。转化技术包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、脂质转染、吸附和原生质体融合。重组细胞可以保持单细胞的，或可以生长成组织、器官或多细胞生物体。本发明的转化的多核苷酸分子可以保持为染色体外的，或可以以这样的方式整合到转化(即重组)细胞染色体内的一个或多个位点内，使得保留它们待表达的能力。
对于转化的合适宿主细胞包括可以用本发明的多核苷酸转化的任何细胞。本发明的宿主细胞可以内源地(即天然)能够产生本文描述的多肽，或可以在用如本文所描述的至少一种多核苷酸分子转化后能够产生此种多肽。本发明的宿主细胞可以是能够产生本文限定的至少一种蛋白质的任何细胞，并且包括细菌、真菌(包括酵母)、寄生虫、线虫动物、节肢动物、动物和植物细胞。宿主细胞的例子包括沙门菌属、埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、李斯特菌属(Listeria)、酵母菌属(Saccharomyces)、斜纹夜蛾属(Spodoptera)、分枝杆菌属、粉纹夜蛾(Trichoplusia)、BHK(幼仓鼠肾)细胞、CHO细胞、293细胞、EL4细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、CV-1细胞、COS(例如COS-7)细胞和Vero细胞。宿主细胞的进一步例子是大肠杆菌，包括大肠杆菌K-12衍生物；伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)；鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)包括减毒株；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)；粉纹夜蛾；和非致瘤性小鼠成肌细胞G8细胞(例如ATCC CRL 1246)。
重组DNA技术可以用于改善转化的多核苷酸分子的表达，通过操纵例如多核苷酸分子在宿主细胞内的拷贝数、这些多核苷酸分子的转录效率、所得到的转录物的翻译效率、和翻译后修饰的效率。用于 增加本发明的多核苷酸分子表达的重组技术包括但不限于，使多核苷酸分子与高拷贝数质粒可操作地连接、多核苷酸分子整合到一个或多个宿主细胞染色体内、给质粒添加载体稳定性序列、转录控制信号(例如，启动子、操纵子、增强子)的置换或修饰、翻译控制信号(例如，核酶结合位点、夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列)的置换或修饰、本发明的多核苷酸分子的修饰以与宿主细胞的密码子使用相对应、和使转录物去稳定的序列的缺失。
基因疗法
可以依照本发明采用本文描述的治疗性多核苷酸分子，通过以通常称为“基因疗法”的治疗模式表达此种多核苷酸。例如，编码人5B6的多核苷酸(例如，SEQ ID NO：1)，编码5B6的配体的多核苷酸，或上调或下调细胞中5B6或其配体的产生的多核苷酸可以在基因疗法技术中采用而用于治疗疾病。因此，来自患者的细胞可以用多核苷酸例如DNA或RNA进行改造，以离体编码多肽。随后将经改造的细胞提供给待用多核苷酸治疗的患者。在这个实施方式中，细胞可以离体进行改造，例如，通过使用包含编码本文所述多肽的RNA的逆转录病毒质粒载体，可以用于转化例如干细胞或分化的干细胞。此种方法是本领域众所周知的，并且根据本文教导，它们在本发明中的使用将是显而易见的。
进一步地，细胞可以通过本领域已知的操作在体内进行改造，用于在体内表达多肽。例如，编码如本文所描述的多肽的多核苷酸可以进行改造，用于在复制缺陷型逆转录病毒载体或腺病毒载体或其他载体(例如，痘病毒载体)中表达。随后可以分离表达构建体。用包含编码如本文所述多肽例如人5B6的可溶性片段的RNA的质粒载体转导包装细胞，从而使得包装细胞目前产生包含目的基因的感染性病毒颗粒。这些生产细胞可以施用于患者，用于在体内改造细胞和在体内表达多肽。根据本发明的教导，用于施用多肽的这些和其他方法对于本领域技术人员将是显而易见的。
衍生出上文提及的逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒、劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓组织增生肉瘤病毒和乳腺瘤病毒。在一个优选实施方式中，逆转录病毒质粒载体衍生自莫洛尼鼠白血病病毒。
此种载体将包括一种或多种启动子用于表达多肽。可以采用的合适启动子包括但不限于逆转录病毒LTR；SV40启动子；和人巨细胞病毒(CMV)启动子。还可以使用细胞启动子例如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、RNA聚合酶III、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、白蛋白启动子、5B6启动子、人珠蛋白启动子和β-肌动蛋白启动子。可以采用的另外病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。根据本文包含的教导，合适启动子的选择对于本领域技术人员将是显而易见的。
逆转录病毒质粒载体可以用于转导包装细胞系，以形成生产细胞系。可以转染的包装细胞系的例子包括但不限于PE501、PA317、Y-2、Y-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、YCRE、YCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DAN细胞系，如由Miller(1990)描述。载体可以通过本领域已知的任何方法转导到包装细胞内。此种方法包括但不限于电穿孔、脂质体的使用和CaPO4沉淀。在一种备选方法中，可以将逆转录病毒质粒载体封装在脂质体内，或与脂质偶联，并且随后施用于宿主。
生产细胞系将产生感染性逆转录病毒载体颗粒，其包括编码多肽的一种或多种核酸序列(例如)。此种逆转录病毒载体颗粒随后可以用于在体外或在体内转导真核细胞。经转导的真核细胞将表达编码多肽的一种或多种核酸序列。可以转导的真核细胞的例子包括但不限于胚胎干细胞、胚胎癌细胞、以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角化细胞、肌细胞(特别是骨骼肌细胞)、内皮细胞和支气管上皮细胞。
依照本发明的基因疗法可以涉及基因疗法多核苷酸在患者中的瞬 时(短暂)存在或多核苷酸永久引入患者内。
基因疗法如同本文讨论的试剂的直接施用，依照本发明可以单独使用或与其他治疗模式结合使用。
药物组合物、剂量和施用途径
包括化合物连同可接受的载体或稀释剂的组合物在本发明的方法中有用。
治疗性组合物可以通过下述进行制备：使具有合适纯度的所需组分(例如结合5B6的化合物)与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂相混合(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编辑(1980))，以冻干制剂、水溶液或水悬浮液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂优选在所采用的剂量和浓度下对于接受者是无毒的，并且包括缓冲剂例如Tris、HEPES、PIPES、磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚；丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；糖例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子例如钠；和/或非离子型表面活性剂例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
此种载体的另外例子包括离子交换剂、铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质例如人血清白蛋白、缓冲物质例如甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和蔬菜脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐、或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、硫酸氢钾、氯化钠、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮和基于纤维素的物质。
用于在体内施用的治疗性组合物应是无菌的。这经由在冻干和重 构前或后通过无菌滤膜过滤容易地完成。如果全身性施用，那么组合物可以以冻干形式和在溶液中贮藏。如果以冻干形式，那么它一般与其他成分相组合进行配制，用于在使用时用合适稀释剂进行重构。液体制剂的例子是填入用于皮下注射的单次剂量小瓶中的无菌、澄清、无色的无防腐剂溶液。
治疗性组合物一般置于具有无菌接入口的容器内，例如具有可通过皮下注射针穿透的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。组合物优选例如作为静脉内注射或输注以皮下、肌内或肠胃外施用，或施用到体腔内。
化合物可以以约0.001至2000mg/kg体重/剂量的量施用，并且更优选约0.01至500mg/kg体重/剂量。重复剂量可以如由治疗医生开处方地施用。
依赖于如由患者需要且耐受的剂量和频率，施用组合物的单次或多次施用。剂量和频率一般将根据对于每个患者特异的因素而改变，依赖于所施用的特定治疗或预防剂，疾病严重度和类型或所需免疫应答，施用途径，以及患者的年龄、体重、应答和既往病史。合适方案可以由本领域技术人员通过考虑这些因素且通过下述进行选择，例如在参考文献中报告且在Physician′s Desk Reference，第56版，(2002)中建议的剂量。一般地，剂量足以治疗或改善疾病的症状或体征，而不产生对患者无法接受的毒性。
在一个实施方式中，组合物包括脂质体或膜囊。此种脂质体的例子在US 2007/0026057，Leserman(2004)和van Broekhoven等人(2004)中描述。在这些情况下，本发明的化合物可以用于靶向脂质体以增强目的试剂的递送。如US 2007/0026047中概述的，用于制备在本发明中使用的膜囊的过程在WO 00/64471中描述。
用于检测具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡细胞，或其一部分，调节免疫应答，和/或抗原识别、加工和/或呈递的组合物通常以肠胃外、通过注射例如皮下、肌内或静脉内进行施用。适合于其他施用方式的另外制剂包括栓剂，以及在某些情况下的口服制剂。对于栓剂，传统粘合剂和载体可以包括例如聚烷 撑二醇或甘油三酯；此种栓剂可以由混合物形成，所述混合物包含0.5％至10％，优选1％至2％范围中的活性成分。口服制剂包括此种通常采用的赋形剂，如例如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉剂的形式，并且包含10％至95％活性成分，优选25％至70％。如果疫苗组合物是冻干的，可以在施用前重构冻干材料，例如作为悬浮液。重构优选在缓冲液中实现。用于经口施用于患者的胶囊、片剂和丸剂可以与肠包衣一起提供，所述肠包衣包括例如Eudragit″S″、Eudragit″L″、乙酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素或羟丙基甲基纤维素。
在任何治疗方案中，治疗性组合物都可以单独或在包含其他治疗剂、组合物等的混合物中施用于患者。
实施例
实施例1——5B6的克隆和表达
材料与方法
小鼠
在The Walter and Eliza Hall Institute(WEHI)在无特异病原体条件下繁殖小鼠。使用在6-12周龄的雌性小鼠；备选地，产生性别年龄匹配的同期组群。动物根据National Health and Medical ResearchCouncil of Australia的指导进行处理。实验操作得到Animal EthicsCommittee，WEHI批准。
5B6的序列鉴定
使用Big Dye Terminator版本3.1(Applied Biosystems，Victoria，Australia)和200ng质粒DNA执行测序，并且在ABI 3730xl 96-毛细管自动化DNA测序仪上实施电泳。使用National Center forBiotechnology Information(www.ncbi.nlm.nih.gov)，通过基本局部比对搜索工具(BLAST)执行序列与已表达序列标签、cDNA和蛋白 质数据库的比较。使用University of California Santa Cruz，GenomeBrowser(www.genome.ucsc.edu/)，通过BLAT比对执行对小鼠集合(2006年2月)和人集合(2006年3月)的基因组定位。
定量RT-PCR
RNA(多至1μg)用RQ1 DNA酶(Promega)进行DNA酶处理，并且随后使用随机引物(Promega)和Superscript II逆转录酶(GibcoBRL，Geithersburg，MD)逆转录成cDNA。使用Quantitect SYBRGreen PCR试剂盒(Qiagen)和Light循环仪(Roche，Victoria；Australia)，执行实时逆转录PCR(RT-PCR)，以测定造血细胞中的5B6和Gapdh表达。关于实时RT-PCR的特定引物如下：5B6；5’-TGTGACTGCTCCCACAACTGGA-3′(SEQ ID NO：17)；5’-TTTGCACCAATCACAGCACAGA-3’(SEQ ID NO：18)，Gapdh；5’-CATTTGCAGTGGCAAAGTGGAG-3’(SEQ ID NO：19)；5’-GTCTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3’(SEQ ID NO：20)。于95℃15分钟的起始活化步骤随后为40个循环：于94℃15秒(变性)、于50-60℃20-30秒(退火)和于72℃10-12秒(延伸)，随后解链温度分析。使用由10-2-10-6pg特定DNA片段制备的标准曲线测定关于每种基因的表达水平，并且表示为相对于Gapdh的比。
5B6的重组表面表达
使用Advantage cDNA聚合酶(Clontech)和下述引物，通过PCR扩增从脾DC cDNA分离全长小鼠和人5B6(m5B6和h5B6)：[5B6：5’-GCCATTTCTTGTACCAACCTACTCCT-3’(SEQ ID NO：21)；5’-CGGTGTGGTATGGATCGTCACTT-3’(SEQ ID NO：22)]，[HE：5’-AGCCTCCTGTGTGGACTGCTTT-3’(SEQ ID NO：23)；5’-TTCATGGCCCACATTTTGGTTT-3’(SEQ ID NO：24)]，并且将所得到的产物亚克隆到pGemT esay质粒(Promega)内。m5B6和h5B6在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的表面上作为C末端(细胞外) FLAG标签的蛋白质进行表达，并且在小鼠EL4细胞的表面上作为融合蛋白进行表达，其中绿色荧光蛋白(GFP)与5B6的N末端细胞质结构域融合。为了产生FLAG标签的蛋白质，使用Advantage高保真度聚合酶(Clontech)扩增5B6编码cDNA，用AscI和Mlu-1进行限制性消化，并且亚克隆到pEF-Bos载体内，所述pEF-Bos载体经修饰以包含FLAG表位(由Dr T.Willson；WEHI友情捐赠)。
CHO细胞通过电穿孔(Gene Pulsar，Biorad，NSW，Australia)用pEF-Bos-5B6凝集素和pGK-neo质粒进行共转染，所述pGK-neo质粒包含新霉素磷酸转移酶基因，并且用1mg/ml G418(Geneticin，Life Technologies)选择转染子。5B6凝集素阳性细胞用大鼠抗FLAGmAb，随后为抗大鼠Ig-PE(Caltag)进行染色，并且随后通过流式细胞术分选进行分离。在电穿孔到EL4细胞内且用1mg/ml G418选择前，通过下述产生GFP标记物的蛋白质：扩增5B6凝集素编码cDNA、用EcoRI限制性消化且亚克隆到pEGFP-C2载体(Clontech)内。通过GFP阳性细胞的流式细胞术分选来分离5B6阳性细胞。在电穿孔到CHO细胞内且用1mg/ml G418选择前，通过下述产生全长未标签的蛋白质：扩增5B6凝集素编码cDNA、用EcoRI限制性消化且亚克隆到pIRES-Neo载体内。
针对C型凝集素的mAb的产盐
Wistar大鼠用50μg钥孔血蓝蛋白(KLH)缀合的下述肽或表达5B6-FLAG的1x107个CHO细胞，以4周间隔免疫接种3至4次：5B6小鼠肽(H-DGSSPLSDLLPAERQRSAGQIC-OH)(SEQ IDNO：29)、人肽(H-RWLWQDGSSPSPGLLPAERSQSANQVC-OH)(SEQ ID NO：30)，并且在与Sp2/0骨髓瘤细胞融合前4天给予最后一次加强。使用表达C型5B6-FLAG的CHO细胞和表达GFP-5B6的EL4细胞，通过上清液的流式细胞术分析鉴定分泌特异性mAb的杂交瘤。产生对小鼠5B6和人5B6各自显示特异性反应性的杂交瘤。
总之，产生下述mAb且在本研究中利用，2种大鼠mAb 24/04-10B4(来自肽免疫)和42/04-42D2(来自CHO-5B6-FLAG免疫)针对小鼠5B6(m5B6)产生。2种大鼠抗体20/05-3A4和23/05-4C6(来自h5B6肽免疫)针对h5B6产生。
DC的分离和流式细胞术分析
如先前所述(Vremec等人，2000)执行来自淋巴样器官的DC分离。简言之，组织进行机械剁碎，用胶原酶和DNA酶进行消化，并且用乙二胺四乙酸(EDTA)进行处理。通过密度离心(1.077g/cm3Nycodenz，Axis-Shield，Oslo，Norway)富集低密度细胞。用mAb(KT3-1.1，抗CD3；T24/31.7，抗Thy1；TER119，抗红细胞；ID3，抗CD19；和1A8，抗Ly6G)包被非DC谱系细胞，并且随后使用抗大鼠Ig磁珠(Biomag beads，QIAGEN，Victoria，Australia)去除。通过去除红血细胞(RBC)(0.168M NH4Cl；在4℃下5分钟)和如上耗尽无关细胞来富集血液DC，除mAb混合物还包含mAb F4/80外。使用大鼠Ig和抗FcR mAb(2.4G2)阻断DC富集群体，随后用针对CD11c(N418)、CD205(NLDC-145)、CD4(GK1.5)、CD8(YTS169.4)、CD24(M1/69)、120G8或CD45RA(14.8)、Sirpα(p84)和m5B6(24/04-10B4-生物素)的荧色物缀合的mAb染色。
cDC选择为CD11chiCD45RA-或CD11chi120G8-；脾cDC进一步再分成CD4+cDC(CD11chiCD45RA-CD4+CD8-)、双阴性(DN)cDC(CD11chiCD45RA-CD4-CD8-)和CD8+cDC(CD11chiCD45RA-CD8+CD4-)；胸腺DC再分成CD8-cDC(SirpαhiCD8lo)和CD8+cDC(SirpαloCD8hi)；并且LN cDC再分成CD8-cDC(CD11chiCD205-CD8-)、皮肤DC(CD11c+CD205intCD8-)、朗格罕氏细胞(CD11c+CD205hiCD8-)和CD8+cDC(CD11c+CD205hiCD8+)，如先前所述(Lahoud等人，2006)。pDC分离为CD11cintCD45RA+或CD11cint120G8+。使用链霉亲和素(SA)-藻红蛋白(PE)检测生物素染色。分析在多种DC群体上的m5B6表达，并且与同种型对照染色(IgG2a，BD Pharmingen，San Diego，CA，USA)相比较。在 LSR II(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA)上执行流式细胞术分析，排除自体荧光和碘化丙啶(PI)阳性死细胞。
人血液DC和造血细胞的分离和流式细胞术分析
使用Ficoll-Pacq ue-PLUS(GE Healthcare，Rydalmere，NSW，Australia)密度分离，从人血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。血液供体给出知情同意书，并且收集得到了Human Research EthicsCommittee，Melbourne Health的批准。使用大鼠Ig和抗FcR mAb(2.4G2)阻断PBMC，随后用针对HLA-DR的mAb(L243；BectonDickinson)以及针对谱系标记物的PE缀合的mAb混合物染色，所述mAb混合物即CD3(BW264156；T细胞)、CD14(Tuk4；单核细胞)、CD19(6D5；B细胞)和CD56(AF12-7H3；NK细胞)。血液DC门控为HLA-DRhi、谱系-细胞，并且基于其BDCA-1(ADJ-8E3)、BDCA-3(AD5-14H2)、BDCA-4(AD5-17F6)和CD16(VEP13)表达进行进一步分离。PBMC还用作其他造血细胞的来源，所述其他造血细胞使用针对CD3(BW264156；T cells)、CD19(6D5；B细胞)、CD56(AF12-7H3)和NKp46(9E2)(CD56+NKp46+；NK细胞)和CD14(Tuk4；单核细胞)的mAb进行分离。执行关于h5B6(20/05-3A4)表达的染色和流式细胞术分析，排除PI阳性死细胞。除非另有说明，所有抗人mAb都购自Miltenyi Biotec(North Ryde，NSW，Australia)。
在小鼠造血细胞上的5B6的分离和分析
制备脾细胞上清液用于DC分离(Vremec等人，2000)。细胞用针对CD3(KT3-1.1)、CD19(ID3)、NK1.1(PK136)、CD49b(Hmα2；eBioscience，San Diego，CA，USA)的mAb染色，随后选择B细胞(CD19+CD3-)、T细胞(CD19-CD3+)和NK细胞(CD49b+NK1.1+CD3-)。首先通过1.082g/cm3密度离心(Nycodenz)以及CD3+T细胞和CD19+B细胞的免疫磁珠耗尽来富集脾巨噬细胞； 富集的细胞用针对CD11b(M1/70)和F4/80的mAb进行染色，随后巨噬细胞门控为CD11bhiF4/80+。首先富集关于脾的骨髓巨噬细胞和单核细胞，随后用CD11b(M1/70)和Ly6C(5075-3.6)染色；单核细胞随后门控为侧面散射loLy6ChiCD11bhi，并且巨噬细胞门控为Ly6CintCD11bhi。在用包括抗5B6 mAb(10B4-生物素)的各种mAb混合物免疫荧光染色前，所有细胞使用大鼠Ig和抗FcR mAb(2.4G2)进行封闭。使用链霉亲和素-PE检测生物素染色。样品在LSR II(Becton Dickinson)上就其5B6的表达进行分析，排除PI阳性死细胞。
可溶性5B6的重组表达
为了产生可溶性5B6，使用Advantage高保真度2聚合酶(Clontech)和下述引物扩增包含铰链和胞外域区的cDNA：[m5B6：5’-TAGTAGACGCGTGAGCAGCAGGAAAGACTCATC-3’(SEQ IDNO：25)；5’-TAGTAGACGCGTTCAGATGCAGGATCCAAATGC-3’](SEQ ID NO：26)，[H5B6：5’-TAGTAGACGCGTCAGCAGCAAGAAAAACTCATC-3’(SEQ ID NO：27)；5’-TAGTAGACGCGTTCAGACAGAGGATCTCAACGC-3’](SEQ ID NO：28)。扩增的cDNA用Mlu-1进行限制性消化，并且亚克隆到pEF-Bos载体的Mlu-1位点内，所述pEF-Bos载体经修饰以包含由大肠杆菌生物素全酶合成酶BirA特异性识别的生物素化共有序列(肽共有序列NSGLHHILDAQKMVWNHR(SEQ ID NO：31)和FLAG表位。所得到的凝集素融合构建体因此包括(以N末端次序)：IL3信号序列(以确保分泌)、生物素化共有肽序列、FLAG标签、铰链区和凝集素结构域。通过使用Fugene在含8微克DNA的DMEM-10％FCS/75cm2烧瓶中瞬时转染293T细胞(由多瘤/SV40大T抗原稳定转染的人肾上皮细胞系)来表达重组蛋白质。在8小时后，去除培养基，将细胞洗涤2次，随后在10ml X-Vivo-10无蛋白质/无血清培养基(BioWhittaker，Walkersville，MD)中温育36-60小时。收获包含 分泌的重组蛋白质的培养基，并且使用10,000mwt截断离心装置(Nanosep 10K Omega，PALL Life Sciences)，使来自培养上清液的重组蛋白质浓缩100倍。浓缩蛋白质随后直接使用或使用BIR酶(Avidity，Denver，CO)进行酶促生物素化。
研究可溶性5B6对膜结合5B6的结合的结合测定法
用在pIRES Neo中编码全长未标签5B6的表达构建体瞬时转染293T细胞。2-3天后，收获细胞，并且使用(1)可溶性FLAG标签的生物素化的m5B6、h5B6和Cire进行表面的免疫荧光标记，且用链霉亲和素PE进行检测，或(2)可溶性FLAG标签的5B6、生物素化抗FLAG mAb 9H10和链霉亲和素-PE进行表面的免疫荧光标记。活细胞在前向和侧面散射上进行门控，或通过碘化丙啶排除，并且就其可溶性5B6的表面结合进行分析。通过与其他可溶性FLAG标签的C型凝集素例如Cire的结合比较证实可溶性5B6的结合特异性
ELISA
通过捕获/双位点ELISA测定重组可溶性蛋白质分泌。简言之，用纯化的捕获mAb，即抗FLAG 9H1012.5ug/ml(内部产生)包被96孔聚氯乙烯微量滴定板(Costar，Broadway，Cambridge，UK)。使用生物素化抗m5B6抗体(24/04-10B4)-(2ug/ml)、链霉亲和素-HRP和ABTS底物检测培养上清液。通过捕获/双位点ELISA测定生物素化重组可溶性蛋白质。简言之，用纯化的捕获mAb，即抗FLAG 9H1012.5ug/ml(内部产生)包被96孔聚氯乙烯微量滴定板(Costar，Broadway，Cambridge，UK)。使用链霉亲和素-HRP和ABTS底物检测培养上清液。
结果
脾DC子集之间的基因表达模式的比较
基因表达谱分析鉴定鼠类cDNA克隆，相对于CD8-cDC，其由 CD8+cDC子集优先表达。命名为5B6的这种克隆代表在染色体6上发现的基因——“假定C型凝集素”的片段，其在CD8+DC中差异表达(Riken 9830005G06，近来命名为C型凝集素结构域家族9、成员A(Clec9a)Genbank登记AK036399.1，Unigene ID Mm.391518)。此外，公众数据库的分析揭示关于5B6(HEEE9341)在染色体12上的人直向同源物，近来重命名为CLEC9A。已鉴定直向同源物存在于其他动物中，例如黑猩猩(Genbank登记XP_001143778)、恒河猴(XP_001114857)、犬(Genbank登记XP_854151)、牛(XP_873119)、马(XP_001493987)和大鼠(Genbank登记XP_578403)。
C型凝集素的鉴定、表征和克隆
本发明人通过PCR扩增编码小鼠和人5B6的全长cDNA，并且对基因测序(图1A和1B)。
由跨越13.4kb基因组DNA的7个外显子编码的小鼠5B6的全长编码序列(图1D)，包含编码264氨基酸(aa)的蛋白质的单个开放阅读框(ORF)(795bp)(图1C)。人5B6编码序列由跨越12.9kb基因组DNA的6个外显子编码(图1D)，类似地包含编码241aa的蛋白质的单个ORF(图1C)。
小鼠和人5B6基因各自编码假定跨膜蛋白质，具有在其细胞外区域中的单个C型凝集素结构域、跨膜区和包含YXXL残基的胞质尾区，这是潜在的信号传导基序(Fuller等人，2007)(图1C)。人5B6具有比小鼠更短的铰链区。小鼠和人蛋白质序列的比对在图1C中表示(53％等同；69％相似)。提议的小鼠和人5B6蛋白质结构的图示显示于图1E中。
使用NCBI Blast蛋白质分析，测定m5B6与小鼠Dectin-1(Clec7A)、Clec12B和NKG2D共享最大的序列相似性，而h5B6与LOX-1(Clec8A)、Clec12B和DCAL-2(Clec12A)最相似。5B6的CTLD，如同常规C型凝集素大鼠甘露糖结合蛋白A(MBP-A)，具有形成2个二硫键的4个保守半胱氨酸残基(图2)。此外，5B6 在颈区中具有2个另外的半胱氨酸残基，其使得蛋白质能够同二聚化(Weis等人，1998)。关键的是，涉及常规C型凝集素中的Ca2+结合的残基不存在于小鼠和人5B6中(图2)。
C型凝集素基因的表达
微阵列分析预测相对于CD8-DC，5B6在CD8+DC中以3.5倍高的水平表达，并且相对于DN DC，在CD8+DC中以2.6倍高的水平表达。因此，本发明人设计引物并且通过定量RT-PCR，研究在小鼠脾cDC子集中的5B6表达。证实5B6由CD8+cDC优先表达；脾CD8+DC表达的mRNA是脾CD4+cDC表达的22倍(图3A)。
本发明人通过定量实时RT-PCR检查了小鼠和人5B6基因在造血细胞类型实验对象组中的表达。5B6 mRNA表达对DC，cDC和pDC两者特异，在NK细胞中具有中等水平的mRNA表达(图3B)。相对于CD8-cDC，它在脾CD8+DC中优先表达。它还在胸腺CD8+cDC和LN CD8+DEC205hi cDC中差异表达(图3A)。此外，在用CpG和LPS，分别针对Toll样受体9和4的配体在体内活化后3小时，在所有3种脾cDC群体中的基因表达减少(图3C)。
小鼠5B6蛋白质的表面表达
为了研究m5B6和h5B6的蛋白质表达，发明人产生通过流式细胞术识别在5B6转染细胞表面上的蛋白质的mAb。新鲜分离的小鼠造血细胞实验对象组用mAb 10B4的染色指出m5B6在cDC子集和大多数pDC上表达(图4A)。显著地，m5B6蛋白质在研究的大多数其他造血细胞上未检测出，包括T细胞、大多数B细胞、单核细胞和巨噬细胞。它在表达某些mRNA的NK细胞上也未检测出(图4A)。然而，小(3％)比例的B细胞展示对于m5B6明确的阳性染色。仅约3％骨髓细胞显示用10B4的任何染色，并且大多数染色很弱。因此，在造血系统中，m5B6表面表达看起来主要限制于DC(图4A)。此外，冷冻切片用mAb 10B4的染色未揭示除归于DC外的染色(数据 未显示)。
m5B6的表面水平随后在脾、LN和胸腺cDC上进行比较。m5B6由脾、胸腺和LN的CD8+cDC表达(图4A)。大多数脾、胸腺和LNCD8-cDC以及迁移cDC(皮肤DC和朗格罕氏细胞)对于m5B6表达是阴性的(图4A，B)。然而，小比例的CD8-cDC显示超过本底的染色；这可以归因于的CD8+cDC谱系的小比例DC尚未表达CD8α，已知所述CD8α存在于这种CD8-cDC门控内。在来自发炎小鼠脾的炎性CD11intCD11bhi DC的制备物上未检测出m5B6染色(Naik等人，2006)(数据未显示)。这些DC表面表达谱与通过定量RT-PCR观察到的基因表达一致(图3)。
m5B6在小鼠血液DC上的表面表达
与在脾内发现的DC相比较，小鼠血液包含极少成熟DC(CD11chi)，并且这些少数血液DC缺乏CD8的表达(O′Keeffe等人，2003)。然而，在小鼠中，CD24表达已与CD8的表达相关。在血液内小比例的成熟DC表达这种标记物；推测这些细胞在其成为CD8+的途中。为了测定5B6在血液DC上的表达，我们分离它们且用CD24和5B6对其进行染色。表达CD24的DC(其注定成为CD8+DC)也表达5B6(图4C)。
猕猴和人5B6的表面表达
为了研究人5B6(h5B6)的表面表达，我们产生了2种单克隆抗体(20/05-3A4；23/05-4C6)，其识别在h5B6转染子细胞表面上的天然蛋白质，如通过流式细胞术测量的(数据未显示)。来自人或来自猕猴的新鲜分离外周血细胞的染色指出5B6在DC子集上表达(图5)。特别地，HLADR+DC的小子集对于h5B6是阳性的(图5A)。大多数其他人血液细胞不显示阳性染色，但在人血液B细胞上获得低水平染色(图5B)。为了测定表达5B6的DC是否类似在小鼠血液中可见的那些，血液DC也用BDCA-1、BDCA-3和BDCA-4进行染色。用 mAb 3A4的染色限制于次要BDCA-3+DC子集(提出的小鼠CD8+cDC17的等价物)，并且在BDCA-4+子集中不存在(数据未显示)。这暗示h5B6存在于与小鼠CD24W、CD8+DC谱系相似的cDC类型上(Galibert等人，2005)，但与小鼠形成对比，不在pDC上。
可溶性5B6可以以交叉种属方式与膜结合的5B6相互作用
为了鉴定关于5B6分子的结合配偶体，本发明人产生可溶性FLAG标签的m5B6和h5B6，和对照可溶性FLAG标签的胞外域形式的C型凝集素Cire。用在pIresNeo载体中的全长未标签5B6构建体瞬时转染后，可溶性5B6就与293T细胞的结合进行筛选，所述293T细胞表达膜结合m5B6和h5B6。可溶性小鼠5B6能够与活293T细胞结合，所述293T细胞表达膜结合小鼠5B6和人5B6，但显示与模拟(无DNA)转染的293T细胞的最低限度结合或无结合(图6B)。相似地，可溶性人5B6能够与活293T细胞结合，所述293T细胞表达膜结合小鼠5B6和人5B6，但显示与模拟转染的293T细胞无结合。相比之下，对照可溶性分子Cire仅显示与对照或转染子细胞系的最低限度结合。因此，可溶性5B6可以以交叉种属方式与膜结合5B6相互作用。
实施例2——将死的和死亡的细胞所表达的5B6配体
材料和方法
专门命名
本实施例中5B6称为Clec9A。
小鼠
在The Walter and Eliza Hall Institute(WEHI)在无特异病原体条件下繁殖8-12周龄的雌性C57BL/6J Wehi小鼠。动物根据NationalHealth and Medical Research Council of Australia的指导进行处理。实验操作得到Animal Ethics Committee，WEHI批准。
可溶性Clec9A的重组表达
产生两种形式的可溶性Clec9A，全长的Clec9A胞外结构域(Clec9A-ecto；茎和CTLD)，以及仅Clec9A CTLD(Clec9A-CTLD)。在SEQ ID NO：40中提供可溶性胞外结构域小鼠Clec9A，如SEQ IDNO：41中提供可溶性胞外结构域人Clec9A，在SEQ ID NO：42中提供可溶性CTLD的单独小鼠Clec9A，如SEQ ID NO：43中提供可溶性CTLD的人Clec9A单独。
使用Advantage高保真度2聚合酶(Clontech)或HotStarHiFidelity聚合酶(Qiagen)以及如下引物从原始Clec9A cDNA序列(Caminschi等人，2008)扩增扩增含有所需胞外结构域区域的cDNA：mClec9A-ecto-forward：5’-TAGTAGACGCGTGAGCAGCAGGAAAGACTCATC-3’(SEQ ID NO：25)；mClec9A-CTLD-forward：5’-TAGTAGACGCGTGGTAGTGACTGCAGCCCTTGT-3’(SEQ IDNO：38)；mClec9A-reverse 5’-TAGTAGACGCGTTCAGATGCAGGATCCAAATGC-3’(SEQ ID NO：26).hCLEC9A-ecto-forward：5’-TAGTAGACGCGTCAGCAGCAAGAAAAACTCATC-3’(SEQ IDNO：27)；hCLEC9A-CTLD-forward：5’-TAGTAGACGCGTAACAGCAGTCCTTGTCCAAACAAT-3’(SEQ ID NO：39)；hCLEC9A-reverse：5’-TAGTAGACGCGTTCAGACAGAGGATCTCAACGC-3’(SEQ ID NO：28)。
将扩增的cDNA亚克隆至经修饰含有生物素化共有序列及FLAG  表位的pEF-Bos载体(肽共有序列NSGLHHILDAQKMVWNHR(SEQ ID NO：31)，其受大肠杆菌生物素全酶合成酶BirA特异性识别)。所得的融合构建体包括(按N-末端顺序)：IL3信号序列(确保分泌)，生物素化共有肽序列，FLAG-标签，以及Clec9A cDNA片段。在SEQ ID NO：44中提供标记的可溶性胞外结构域小鼠Clec9A，在SEQ ID NO：45中提供标签的可溶性胞外结构域人Clec9A，在SEQ ID NO：46中提供标记的可溶性CTLD的单独小鼠Clec9A，如SEQ ID NO：47中提供标记的可溶性CTLD的 单独人Clec9A。
通过瞬时转染哺乳动物细胞表达重组蛋白质并在无蛋白质/无血清培养基中培养：转染293T细胞接着在X-Vivo-10培养基(BioWhittaker)中培养，或转染FreeStyle 293F细胞并在FreeStyleExpression Media(Invitrogen)中培养。使用抗-小鼠Clec9A mAb(24/04-10B4)的反应性测定含有分泌的重组蛋白质的培养基中可溶性mClec9A的存在情况。使用10,000mol wt截断的离心设备(Millipore)将分泌的重组蛋白质浓缩100-倍，然后直接使用或使用BIR酶(Avidity)将其酶法生物素化。如果需要，通过亲和色谱使用抗-FLAG M2琼脂糖树脂(Sigma)纯化Clec9A可溶性蛋白质，并以100μg/ml FLAG肽(Auspep)洗脱，然后进一步使用预-组装的Superdex 200柱子(GEHealthcare)。通过尺寸排阻色谱纯化。
小鼠胚胎成纤维细胞
提前一天接种表达Noxa的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)(van Delft等人，2006)并生长至大约80％的融合度，然后用2.5μM ABT-737处理将其诱导凋亡。16h后，使用Cell Dissociation Buffer(Enzyme-freePBS-based；Gibco)收获细胞。
使用可溶性Clec9A进行结合测定
在冰上于结合缓冲液(含有0.2％BSA/和0.02％叠氮钠的PBS)中进行结合测定。将细胞以PBS洗涤3次以移除血清蛋白质，然后再结合缓冲液中重悬。将细胞与(1)生物素化可溶性Clec9A及各种对照一并孵育并以SA-PE进行检测，或与(2)可溶性FLAG-标记的Clec9A，生物素化抗-FLAG mAb 9H10一并孵育，然后以SA-PE进行检测。以前向和侧向散射，或通过碘化丙啶(PI)排除门控活细胞，而以前向和侧向散射，或通过PI包含来门控死亡细胞。通过使用FACScan(Becton Dickinson)的流式细胞术进行可溶性Clec9A结合的分析。通过比较对其他可溶性FLAG-标记的C型凝集素，小鼠Cire/mDCSign (Caminschi等人，2001)和Clec12A(Pyz等人，2008)的结合证实结合的特异性。
来自淋巴器官的DC对死亡细胞的吞噬性摄取
如前文描述的分离脾脏DC(Caminschi等人，2008)并测定其对死亡细胞的摄取(改良自Schnorrer等人，2006)。简言之，将DC标记针对CD11c(N418-别藻蓝蛋白(APC))和CD8(YTS169.4-FITC)的抗体。对脾细胞进行两轮冻融(干冰上30s然后置于37℃ 30s)，然后用250ng/ml PI在4℃下标记10min并洗去多余的PI染料。在添加含有10％FCS，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，以及10-4M 2-ME的改良RPMI-1640培养基中的2.5x105个DC之前，将标记的冻融的脾细胞(1x106细胞/孔)与浓度为25μg/ml的可溶性蛋白质一并在4℃孵育30min，这些蛋白质为mClec9A-ecto，mClec9A-CTLD或对照蛋白质Cire，在37℃或4℃(用于对照)下孵育共培养物3h以进行吞噬作用，然后收获细胞用于流式细胞术分析，使用LSRII(BectonDickinson)。将DC门控为CD11c+CD8+或CD11c+CD8-细胞，计算PI+细胞的DC比例。4℃下的摄取为死亡脾细胞对DC表面结合的测量，而37℃下的另外的摄取为对吞噬性摄取的测量。
结果和讨论
可溶性Clec9A胞外结构域的产生
为了寻找Clec9A的配体，发明人首先产生了小鼠和人分子的胞外结构域的标记的可溶性形式。制造了编码全长的Clec9A胞外结构域(Clec9A-ecto；茎区域和Clec9A CTLD)或Clec9A单独CTLD(Clec9A-CTLD)的构建体，这些构建体还包括FLAG-标记以及生物素化共有序列(Brown等人，1998)(图7A)。在哺乳动物细胞中使用无蛋白质/无血清培养基表达重组可溶性mClec9A和hCLEC9A蛋白质。使用BirA(Avidity)酶(图7C)将其酶法生物素化并以Streptavidin-PE(SA-PE)进行检测，或使用抗FLAG试剂进行检测。作为对照，产生了其他C型凝集素——小鼠Cire/mDCSign(Caminschi等人，2001) 和Clec12A(Pyz等人，2008)的类似构建体。
小鼠和人Clec9A结合于死亡细胞
筛选多种小鼠和人细胞以确定可溶性Clec9A是否能够结合至细胞表面；对于正常细胞观察到低的或者最小的结合，但我们观察到Clec9A对死亡细胞的结合(判断死亡是基于一旦细胞膜受损伤对细胞核染色的细胞核染料碘化丙啶(PI)即可染上色)。因此，发明人研究了mClec9A对使用γ-放射诱导凋亡的胸腺细胞的结合。
以Annexin V，一种凋亡的早期标记物，以及标记在具有破坏的细胞膜的损伤细胞的PI对胸腺细胞进行染色。mClec9A-ecto强烈结合于一些凋亡的小鼠胸腺细胞，但不结合其存活的对等物；显著地，结合限制于晚期凋亡/次级坏死细胞(Annexin V+PI+)，但不结合于早期Annexin V+凋亡细胞(图8A)。
本发明人进一步研究了由拟BH3药物ABT-737诱导凋亡的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。他们发现mClec9A和hCLEC9A二者都强烈地结合于晚期凋亡的MEF，但不结合于其活的对等物(图8B)。使用蛋白酶(胰蛋白酶，蛋白酶K)而不是核酸酶对凋亡细胞进行预处理剂量依赖式地减少Clec9A结合，表明配体为蛋白质或蛋白质-相关分子(图8C)。对死亡细胞结合水平比所测试的任何可溶性形式的其他C型凝集素，即Cire(图8A、B和C)和Clec12A(数据未显示)中的“非特异性”结合要高。
通过在冻融细胞之后立刻用Clec9A染色作为初级坏死的模型测试细胞膜破裂是暴露出配体的充分条件这一可能性。Clec9A结合于冻融过的3T3细胞(图9A)，结合于其他冻融过的小鼠细胞，也结合于固定并通透的细胞以及冰冻的小鼠组织切片(数据未显示)。结合包括了死亡细胞暴露的外表面，因为在使用mClec9A代替可溶性mClec9A包被的荧光珠子的时候在荧光显微镜下也可以看见(数据未显示)。在冻融之前用胰蛋白酶处理存活的细胞未消除Clec9A的结合(数据未显示)，表明配体一开始就存在于细胞之内。
总之，数据表明Clec9A的配体正常包含于存活的细胞之内，只在细胞膜破坏后暴露出来，如发生在凋亡晚期或坏死时。
对死亡细胞的结合经由C型凝集素结构域
为研究Clec9A结合于死亡细胞所需条件，将较短形式的可溶性重组蛋白质(单独CTLD)与可溶性全长的胞外结构域(茎+CTLD)相比较。相比于同二聚体的Clec9A胞外结构域，mClec9A-CTLD和hCLEC9A-CTLD都是单体的，表明茎区域为同二聚体化所需要(图7)。然而，mClec9A-CTLD和hCLEC9A-CTLD二者都显示出与全长胞外结构域类似的结合死亡细胞的水平，表明单体的CTLD足以进行结合(图9A)。甚至在使用有限稀释的Clec9A时，mClec9A-ecto和mClec9A-CTLD都显示了类似的结合水平，表明胞外结构域和CTLD对死亡细胞的结合是类似的。
由于EDTA不影响结合(图9B)，所以结合不需要二价的金属离子如钙离子。
Clec9A对死亡细胞结合的种属保守性
如图8和9A中表明的，小鼠和人Clec9A都结合死亡的小鼠细胞。对测试的所有死亡的小鼠细胞类型都可见结合，无论是来自培养的细胞系还是新鲜分离的细胞。小鼠和人Clec9A对死亡的人细胞(图9B)以及仓鼠和猴细胞(数据未显示)也结合得一样好。对于冻融过的昆虫细胞也可见结合，但对于细菌或酵母没有结合(图9C)。因此，Clec9A对死亡细胞的识别是在进化中保守的，大多数动物甚至昆虫都表达配体。
Clec9A是否介导DC对死亡细胞的摄取？
如先前报道的(Caminschi等人，2008；Sancho等人，2008)，CD8+DC但不是CD8-DC上有Clec9A表达，这在图10A中得到确认。先前报道CD8+DC在对死亡细胞的吞噬作用中更有效(Iyoda等人.， 2002；Schulz等人，2002；Schnorrer等人，2006)。发明人因此研究了使用多余的可溶性Clec9A是否能阻断死亡细胞的摄取。如先前报道的(Iyoda等人，2002；Schulz和Sousa，2002)，CD8+DC比其CD8-对等物在对死亡脾细胞的吞噬作用上更有效，所述脾细胞已经以细胞核染料PI标记PI(图10B)。然而，添加可溶性mClec9A时，是添加了全长胞外结构域(mClec9A-ecto；图10B)或单独CTLD(数据未显示)，对CD8+DC摄取死亡细胞没有显著影响。在使用已经以亲脂性膜染料PKH26标记的死亡脾细胞观察到类似的结果(数据未显示)。
结论
Clec9A强烈结合于凋亡晚期或坏死细胞；其识别多种来源和组织类型的细胞表达的一种或多种组分，但直到具有破坏的细胞膜才能接近。Clec9A因此能够起到将早期凋亡与坏死细胞区分的作用。人们认为这是DC生物学的一个重要区分，因为已经报道对早期凋亡细胞的摄取促进对自身-Ag的免疫抑制环境，而有报道坏死或不能清除凋亡细胞会促进免疫原性应答。Clec9A在CD8+DC上选择性表达，这些DC专门用于摄取和加工来自死亡细胞的Ag，因此Clec9A可能在此过程中有作用。
实施例3——对m5B6配体的鉴定
CD8+DC比其他DC类型更有效地消化死亡细胞(Iyoda等人，2002)。在CD8+DC上表达的m5B6特异性地结合死亡细胞，但不结合早期凋亡细胞。CD8+DC所使用的在早期凋亡细胞和坏死细胞之前区分的分子最为重要，因为DC细胞摄取早期凋亡细胞诱导耐受，而摄取坏死细胞诱导免疫(Sauter等人，2000)。因此DC上受体对这些状态的差异化识别对免疫系统至关重要。重要地，只有CD8+DC能够诱导对外源Ag的有效CD8T细胞应答(Belz等人，2004)。
已经鉴定出一些相关的C型凝集素的配体，有一些具有多重配体(例如LOX-1/Clec8a，Dectin-1/Clec7a)。使用一组免疫化学和蛋白质组 学技术可以确定5B6配体的身份。
在第一个方法中，使用35S代谢式地标记细胞，诱导细胞死亡，然后与可溶性FLAG-标记的m5B6一并孵育。洗去多余的游离Clec9A，将细胞在存在或不存在化学交联物时孵育。裂解细胞，并使用抗-FLAG M2或抗-5B6-亲和树脂亲和纯化复合体。以多余的FLAG或5B6肽洗脱结合的蛋白质。
在补充的方法中，将纯化一大批sol-5B6并缀合到NHS-活化的琼脂糖凝胶树脂。将来自至少5x107个EL4细胞的裂解物与5B6亲和树脂一并孵育，洗脱结合的蛋白质。用SDS-PAGE分析洗脱的蛋白质，将其转移至PVDF膜并使用磷光显像仪显像。为鉴定阳性条带，按比例扩大此步骤并通过SDS-PAGE和Sypro Ruby/考马斯亮蓝染色分析洗脱物。切下条带但并使用质谱术鉴定蛋白质。简言之，使用胰蛋白酶消化蛋白质条带(Moritz等人，1996)，通过毛细管色谱分离条带(Moritz等人，1992)并使用在线电喷射离子化离子陷阱质谱仪测序(Simpson等人，2000)。
在一个进一步的互补方法中，以死亡细胞免疫大鼠并通过标准操作流程进行融合以产生杂交瘤。用流式细胞术测定，就结合于死亡细胞并阻断sol-5B6结合的Ab筛选杂交瘤。发明人将克隆并纯化阻断性Ab，并用其免疫沉淀配体以使得能够通过质谱术得到鉴定。
将产生潜在配体的Myc-标签的表达构建体，将其瞬时转染入293T细胞并与5B6+DC或5B6转染子细胞一并孵育之前诱导细胞死亡。发明人将裂解细胞，使用抗-Clec9A mAb免疫沉淀5B6-复合体并通过蛋白质印迹分析myc-标签配体的共沉淀。备选地，发明人将进行5B6复合体的直接的Western印迹。在一个补充的方法中，发明人将以重组可溶性分子形式表达潜在的候选物并确认其对5B6转染子的结合。
将使用标准操作产生结合5B6配体的抗体。
本领域技术人员应当理解，可以对如具体实施方式中显示的本发 明进行众多改变和/或修饰，而不背离如广泛描述的本发明的精神或范围。呈现的实施方式因此视为在所有方面中是举例说明性的而不是限制性的。
本文讨论和/或参考的所有出版物整体合并入本文。
本申请要求来自US 61/052,983和US 61/120,801的优先权，其完整内容通过引用合并入本文。
在本说明书中已包括的文件、行为、材料、装置、物品等的任何讨论仅用于提供关于本发明的背景的目的。不被理解为承认任何或所有这些物质构成现有技术基础的部分，或如在本申请的每项权利要求的优先权日期前存在的在与本发明相关领域中的共同一般知识。
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Figure IDA0000043338030000011
Figure IDA0000043338030000021
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Claims (65)

1.在受试者中调节对具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的摄取和/或清除的方法，该方法包括施用调节多肽对所述多肽的配体结合的化合物，其中所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
2.在受试者中调节对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的抗原识别、加工和/或呈递的方法，该方法包括施用调节多肽对所述多肽的配体的结合的化合物，其中所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
3.在受试者中调节针对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的免疫应答的方法，该方法包括施用调节多肽对所述多肽的配体的结合的化合物，其中所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
4.根据权利要求1-3中任何一项的方法，其中化合物是多肽。
5.根据权利要求1-4中任何一项的方法，其中化合物是抗体或其抗原结合片段。
6.权利要求5的方法，其中抗体是单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体、双抗体、三抗体或四抗体。
7.权利要求5或权利要求6的方法，其中抗体是24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4或23/05-4C6，或包含24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4或23/05-4C6的至少一个互补决定区的抗体。
8.根据权利要求1-4中任何一项的方法，其中化合物包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段。
9.权利要求8的方法，其中生物学活性、可溶性和/或抗原性片段结合配体。
10.根据权利要求1-9中任何一项的方法，其中化合物缀合至治疗剂。
11.权利要求10的方法，其中治疗剂为细胞毒性试剂。
12.权利要求10的方法，其中治疗剂为药物和/或药学试剂。
13.在受试者中调节对具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的摄取和/或清除的方法，该方法包括施用调节多肽的生产的化合物，所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
14.在受试者中调节对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的抗原识别、加工和/或呈递的方法，该方法包括施用调节多肽的生产的化合物，所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
15.在受试者中调节对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的免疫应答的方法，该方法包括施用调节多肽的生产的化合物，所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
16.根据权利要求13-15中任何一项的方法，其中化合物为多核苷酸。
17.根据权利要求16的方法，其中多核苷酸可操作地连接于能够在动物细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子。
18.权利要求16或权利要求17的方法，其中所述多核苷酸下调来自编码多肽多肽的基因的mRNA水平。
19.权利要求18的方法，其中所述多核苷酸选自：反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化多核苷酸、微小RNA和双链RNA。
20.权利要求19的方法，其中所述多核苷酸为在生理条件下与包括如SEQ ID NO 9至16中提供的任何一个或多个核苷酸序列的多核苷酸杂交的反义多核苷酸。
21.权利要求19的方法，其中多核苷酸是能够裂解包括如SEQ IDNO 9至16中提供的任何一个或多个核苷酸序列的多核苷酸的催化多核苷酸。
22.权利要求19的方法，其中多核苷酸为双链RNA(dsRNA)分子，包括含有如SEQ ID NO 9至16中提供的核苷酸序列中任何一条或多条中至少19个连续核苷酸的寡核苷酸，其中分子双链部分长度至少为19碱基对，并含有所述的寡核苷酸。
23.权利要求22的方法，其中由单一的启动子表达所述多核苷酸，其中双链部分的链由单链部分相连。
24.权利要求16或权利要求17的方法，其中多核苷酸上调来自编码所述多肽的基因的mRNA水平。
25.根据权利要求1，4-13及16-24中任何一项的方法，其中对具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的摄取和/或清除有所增加。
26.根据权利要求1，4-13及16-24中任何一项的方法，其中对具有破坏的细胞膜细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的摄取和/或清除有所减少。
27.根据权利要求2，4-12，14及16-24中任何一项的方法，其中对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的抗原识别、加工和/或呈递有所增加。
28.根据权利要求2，4-12，14及16-24中任何一项的方法，其中对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的抗原识别、加工和/或呈递有所减少。
29.根据权利要求3-12，及15-24中任何一项的方法，其中针对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的免疫应答有所增加。
30.根据权利要求3-12，及15-24中任何一项的方法，其中针对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的免疫应答有所减少。
31.根据权利要求1-30中任何一项的方法，其中受试者患有选自移植物抗宿主病(GVHD)、自身免疫疾病、感染、神经退行性疾病、系统性炎症反应综合征(SIRS)、癌症及创伤的疾病。
32.检测具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞的方法，此方法包括：
i)将细胞与结合多肽的配体的化合物相接触，所述多肽包括：
a)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
c)a)或b)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段，以及
ii)确定是否存在化合物对配体的结合，
其中化合物结合于配体表明细胞具有破坏的细胞膜，受到病原体的感染，是将死的或死亡的。
33.诊断、预测和/或监测与具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞相关疾病的状态的方法，所述方法包括
i)将细胞与结合多肽的配体的化合物相接触，所述多肽包括：
a)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
c)a)或b)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段，以及
ii)确定是否存在此配体，
其中配体的存在提供了诊断、预测和/或疾病的状态。
34.权利要求32或权利要求33的方法，其中化合物是多肽。
35.权利要求34的方法，其中化合物是多肽，其包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段。
36.权利要求32或权利要求33的方法，其中化合物为抗体或其抗原结合片段。
37.权利要求36的方法，其中抗体是单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体、双抗体、三抗体或四抗体。
38.权利要求36或权利要求37的方法，其中抗体是24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4或23/05-4C6，或包括24/04-10B4、42/04-42D2、20/05-3A4或23/05-4C6的至少一个互补决定区的抗体。
39.根据权利要求32-38中任何一项的方法，其中化合物是可检测标记的。
40.根据权利要求32-39中任何一项的方法，其是在受试者中体内进行的。
41.根据权利要求32-39中任何一项的方法，其是在获自受试者的样品上体外进行的。
42.根据权利要求33-41中任何一项的方法，其中疾病选自：移植物抗宿主病(GVHD)、自身免疫疾病、感染、神经退行性疾病、系统性炎症反应综合征(SIRS)、癌症及创伤。
43.监测疗法的方法，此方法包括：
i)使细胞经历疗法中，并
ii)使用权利要求32-42中任何一项的方法检测具有破坏的细胞膜的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞。
44.权利要求43的方法，其中疗法用于杀死细胞，并且存在具有破坏的细胞膜的细胞，将死的细胞或死亡的细胞表明疗法有效。
45.权利要求43的方法，其中疗法不用于杀死细胞，并且存在具有破坏的细胞膜的细胞，将死的细胞或死亡的细胞表明疗法具有不想要的副作用。
46.根据权利要求43-45中任何一项的方法，其中步骤i)中的细胞是在体内进行的。
47.根据权利要求43-45中任何一项的方法，其中步骤i)是在体内进行的。
48.权利要求43的方法，其中受试者患有癌症或感染。
49.根据权利要求43-48中任何一项的方法，其中步骤ii)是在获自受试者的样品上进行的。
50.根据权利要求43-49中任何一项的方法，其中疗法为药物疗法或放射疗法。
51.鉴定多肽的配体的方法，此方法包括：
a)获得具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，
b)将所述多肽与获自细胞或其部分的候选化合物相接触，
c)确定化合物是否结合所述多肽，
其中多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段。
52.鉴定多肽的配体的方法，此方法包括：
a)获得具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，
b)将多肽暴露于结合所述多肽的结合伙伴，以及获自细胞或其部分的候选化合物，并且
c)评估候选化合物与结合伙伴竞争结合于多肽的能力，
其中所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段。
53.权利要求52的方法，其中结合伙伴是抗体。
54.权利要求52或权利要求53的方法，其中结合伙伴是可检测标记的。
55.在早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞、坏死细胞或死亡的细胞之间进行区分的方法，此方法包括，
i)将细胞与结合多肽的配体的化合物接触，所述多肽包括：
a)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
c)a)或b)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段，以及
ii)确定是否存在此化合物与配体的结合，
其中化合物与配体结合表明细胞为晚期凋亡细胞、坏死细胞或死亡的细胞。
56.在受试者中调节针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括
i)获得一群树突状细胞或其前体，
ii)调节多肽的产生和/或活性，所述多肽包括：
a)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
c)a)或b)的生物学活性、可溶性和/或抗原性片段，
iii)将树突状细胞或其前体与所述抗原接触，以及
iv)对受试者施用树突状细胞或其前体。
57.权利要求56的方法，其中步骤iii)包括将树突状细胞或其前体与包括所述抗原的下列相接触：具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，和/或其一部分。
58.权利要求56或权利要求57的方法，其中步骤iii)包括
a)获得包括所述抗原的细胞，
b)破坏此细胞的细胞膜，以及
c)将步骤b)的产物与树突状细胞或其前体接触。
59.根据权利要求56-58中任何一项的方法，其进一步包括，在步骤ii)之前富集表达多肽的细胞群体。
60.调节多肽对所述多肽的配体的结合的化合物在制备用于在受试者中调节对具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的摄取和/或清除的药物中的用途，其中的多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
61.调节多肽对所述多肽的配体的结合的化合物在制备用于在受试者中调节对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的抗原识别、加工和/或呈递的药物中的用途，其中的多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
62.调节多肽对所述多肽的配体的结合的化合物在制备用于在受试者中调节针对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的免疫应答的药物的用途，其中所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
63.调节多肽的生产的化合物在制备用于在受试者中调节对具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的摄取和/或清除的药物中的用途，所述多肽包括：
i)如SEQ ID NO 1至8中任何一个中提供的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO 1至8中任何一个或多个至少50％等同的氨基酸序列；和/或
iii)i)或ii)的生物学活性和/或抗原性片段。
64.调节多肽的生产的化合物在制备用于在受试者中调节对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的抗原识别、加工和/或呈递的药物中的用途，所述多肽包括：
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65.调节多肽的生产的化合物在制备用于在受试者中调节针对源自具有破坏的细胞膜的细胞，受病原体感染的细胞，将死的细胞或死亡的细胞，或其一部分，或周围细胞的物质的免疫应答的药物中的用途，所述多肽包括：
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