CN102121920A - 利用蛋白质分子标记选择高解舒性状家蚕茧的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及家蚕辅助育种选育技术，旨在提供一种利用蛋白质分子标记选择高解舒性状家蚕茧的方法。该方法包括：(1)制备SDSPAGE凝胶，凝胶上设加样孔；(2)在种茧上剪取茧层，加入含有尿素、巯基乙醇、SDS的水溶液，80℃水浴处理；吸取上样进行电泳；(3)将电泳凝胶与染色液一起放入密闭容器内，60℃温育后水洗凝胶，加入脱色液振荡，更换脱色液再振荡；(4)凡是在电泳结果中显示110kDa蛋白条带的，即是有Sericin2蛋白质分子标记的样品个体。用丝胶蛋白质Sericin2为分子标记，可以准确有效的选择高解舒个体，从而大幅度的改进家蚕茧解舒性状，提高育种效率。只要有标记蛋白质Sericin2存在的个体，其蚕茧解舒率就在90％以上，选种个体饲养规模可以减少30～50％。

Description

利用蛋白质分子标记选择高解舒性状家蚕茧的方法

技术领域

本发明涉及家蚕辅助育种选育技术，特别涉及利用蛋白质分子标记选择高解舒性状家蚕茧的方法。

技术背景

生丝和丝织品是我国出口商品中唯一占世界主要贸易份额的产品。随着世界经济持续发展带来社会生活的深刻变化，人们对服饰等消费品的要求越来越个性化、舒适化、高质化和环保化。蚕丝是天然蛋白质纤维，其织物有良好的吸湿性和透气性，真丝绸具有非常良好的保健作用，临床试验发现并证明，特别是对皮肤搔痒症，小儿丘疹性荨麻症等常见而又难以治愈的疾病具有明显止痒和治疗作用，使真丝绸有“纤维医学”之称，这与其它纺织品无可比拟。因此，丝绸制品仍然会成为充满魅力和希望的产品，我国的蚕业生产将继续保持其优势地位。随着经济的发展，劳动力价格上涨，导致养蚕成本的增加，蚕桑生产比较效益下降，随之创立了省力化的蚕茧生产技术体系，其支撑点是适合省力、高效饲养技术的蚕品种创新。

据日本上田悟的研究，茧的解舒对出丝率有明显影响，茧的解舒率是制丝工业的一项极为重要的经济指标，提高蚕茧解舒率是提高丝绸产品质量的关键环节。蚕茧解舒的好坏，直接关系到出丝率、台时产量、生丝品质、原料消耗的高低。凡解舒好的蚕茧，出丝率高、质量好、消耗低；凡解舒不好，缫丝时落绪多、出丝率低、质量差、消耗大。影响蚕茧解舒率的因素是多方面的，其中以品种的性状起主要作用。然而，蚕茧的解舒是一个遗传力很低的数量性状，易受环境条件的影响，传统的育种技术很难准确选择解舒率高的个体。因此选育适合省力化养蚕技术并能在不良的上蔟环境条件下保持优良解舒的实用家蚕品种成为当前育种的主要目标。

据Kludkiewicz，B.，Takasu，Y.，Fedic，R.，Tamura，T.，Sehnal，F.，Zurovec，M.，2009报道的家蚕粘性丝蛋白Ser2的结构和表达(Structure and expression of the silk adhesive protein Ser2 in Bombyx mori.Insect Biochemistry and Molecular Biology 39，938-946.)；以及Takasu，Y.，Hata，T.，Uchino，K.，Zhang，Q.，2010报道的家蚕非茧层中的主要丝胶成分Ser2蛋白的鉴定(Identification of Ser2proteins as major sericin components in the non-cocoon silk of Bombyx mori.Insect Biochemistry and Molecular Biology 40，339-344.)，Sercin2蛋白(即Ser2)是一种粘性蛋白，在普通品种中，Sericin2蛋白只在家蚕幼虫五龄中期前表达，是家蚕非茧层丝胶的主要成分，在蜕皮过程中起到固定蚕体的作用。通过大量重复实验发现，Sericin2蛋白是在家蚕茧层丝胶中与蚕茧解舒密切相关的蛋白质高分子，具体表现为含有Ser2蛋白的茧层易于吸水溶胀，缫丝时落绪次数少，解舒率特别高。证明含有Sericin2的蚕茧其解舒性状特别优异，因此可以作为解舒性状选择的蛋白质分子标记。

但是，如何便利快捷地实现Sericin2蛋白的检出，以便于挑选含有Sericin2蛋白质分子标记的样品个体，其方法并未见任何报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种利用蛋白质分子标记选择高解舒性状家蚕茧的方法。该方法主要涉及用SDS-PAGE蛋白质电泳技术，检测与家蚕茧丝解舒相关分子标记。

为解决上述技术问题，本发明提供的利用蛋白质分子标记选择高解舒性状家蚕茧的方法，包括下述步骤：

(1)制备丙烯酰胺浓度为T％＝5％、C％＝2.6％和尺寸为8×8×0.1cm³的SDSPAGE凝胶，凝胶上设加样孔；

(2)在待测种茧样品上剪取10mg茧层，加入300μL含有48％(m/v)尿素、4％(v/v)巯基乙醇、4％(m/v)SDS的水溶液，80℃水浴处理5～15min；吸取2μL上样，以20mA/gel进行电泳，持续20min后结束；

(3)将电泳凝胶与50mL经60℃预热的染色液一起放入密闭容器内，将容器浸入60℃水浴中；温育15min后，将染色液倒出，水洗凝胶一遍，加入经60℃预热的脱色液，振荡10min，更换脱色液再振荡10min；

所述染色液含有0.1％(m/v)考马斯亮蓝R250、10％(v/v)乙酸和20％(v/v)乙醇，余量为水；所述脱色液含5％(v/v)乙酸和10％(v/v)乙醇，余量为水；

(4)凡是在电泳结果中显示110kDa蛋白条带的，即是有Sericin2蛋白质分子标记的样品个体。

本发明的有益效果在于：

用丝胶蛋白质Sericin2为分子标记，可以准确有效的选择高解舒个体，从而大幅度的改进家蚕茧解舒性状，提高育种效率。传统的方法需要活蛹个体缫丝，由于易受环境的影响，选择效率不高。而应用本技术只要有标记蛋白质Sericin2存在的个体，其蚕茧解舒率就在90％以上，选种个体饲养规模可以减少30～50％。

附图说明

图1解舒分子标记Sericin2的SDSPAGE(T＝5％，C＝2.6％)蛋白电泳示意图。图中，泳道1为分子量Marker，2为含有Sericin2的高解舒茧层样品，3-5为普通茧层样品。

图2为图1中各批次蚕茧丝胶蛋白SDSPAGE电泳图谱，图中显示了Sericin2存在情况。

具体实施方式

本实施例提供的家蚕解舒性状分子标记辅助育种技术包括下述步骤：

(1)家蚕按常规育种技术饲养至上蔟结茧；

(2)按选种需要选取需要留种的种茧，每个样茧编号，剪一小块约0.5×0.5cm的茧层，对应编号作为茧层丝胶蛋白SDSPAGE电泳的样茧；

(3)SDSPAGE丝胶蛋白电泳准备：制备丙烯酰胺浓度为T％＝5％、C％＝2.6％和尺寸为8×8×0.1cm3的SDSPAGE凝胶，每块凝胶上制作至少10个加样孔；

(4)样品处理：每个剪取10mg茧层，加入300μL含有48％(m/v)尿素、4％(v/v)巯基乙醇、4％(m/v)SDS的水溶液，80℃水浴处理5-15min。吸取2μL(丝胶蛋白含量大于10μg)上样，以20mA/gel进行电泳，20min后结束。

(5)凝胶染色：准备大小合适的密闭容器，将电泳凝胶与50mL含有0.1％(m/v)考马斯亮蓝R250、10％(v/v)乙酸，20％(v/v)乙醇的染色液(60℃预热)一起放入容器内，将容器浸入60℃水浴中，温育15min后，将染色液倒出(收集，可重复使用)，水洗凝胶一遍，加入含5％(v/v)乙酸，10％(v/v)乙醇的脱色液(60℃预热)，振荡10min，更换脱色液再振荡10min。

(6)凡是在电泳结果中显示110kDa蛋白条带的，即是有Sericin2蛋白质分子标记的样品个体，其解舒性能优秀，可以作为高解舒个体留种。

各批次的茧层丝胶SDSPAGE电泳结果如图2所示。

需要指出的是以上列举仅是本发明的若干具体实施例，本发明不限于以上实例，还可有许多变形，若从本发明公开的内容中导出或联想到的所有变形均应认为是本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种利用蛋白质分子标记选择高解舒性状家蚕茧的方法，包括以下步骤：

(1)制备丙烯酰胺浓度为T％＝5％、C％＝2.6％和尺寸为8×8×0.1cm³的SDSPAGE凝胶，凝胶上设加样孔；

(2)在待测种茧样品上剪取10mg茧层，加入300μL含有48％(m/v)尿素、4％(v/v)巯基乙醇、4％(m/v)SDS的水溶液，80℃水浴处理5～15min；吸取2μL上样，以20mA/gel进行电泳，持续20min后结束；

(3)将电泳凝胶与50mL经60℃预热的染色液一起放入密闭容器内，将容器浸入60℃水浴中；温育15min后，将染色液倒出，水洗凝胶一遍，加入经60℃预热的脱色液，振荡10min，更换脱色液再振荡10min；

所述染色液含有0.1％(m/v)考马斯亮蓝R250、10％(v/v)乙酸和20％(v/v)乙醇，余量为水；所述脱色液含5％(v/v)乙酸和10％(v/v)乙醇，余量为水；

(4)凡是在电泳结果中显示110kDa蛋白条带的，即是有Sericin2蛋白质分子标记的样品个体。

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