CN102108403A - 带随机序列的茎环引物筛选微小rna的表达差异 - Google Patents

Abstract

本发明公开了带随机序列的茎环引物筛选微小RNA的表达差异,可用于对微小RNA(microRNAs)核苷酸片段进行表达差异分析和进行相对定量检测的一条带随机片段的茎环引物及多个配套的通用引物、反应程序和试剂盒。试剂盒包括试剂A：3’端带8个随机核酸序列的茎环引物；试剂B：M-MuLV逆转录酶；试剂C：5×逆转录缓冲液；试剂D：通用引物A；试剂E：通用引物B；试剂F：通用引物C；试剂G：Taq DNA聚合酶；试剂H：2×PCR缓冲液组成。本发明所提供的整套试剂盒可对组织、细胞等多种标本进行microRNAs差异性表达进行分析，同时也可用于microRNAs的相对定量分析。

Description

带随机序列的茎环引物筛选微小RNA的表达差异

技术领域

本发明涉及生物技术，是一种基于聚合酶链反应(PCR)的分子生物学方法，特别是涉及荧光定量的聚合酶链反应(Q-PCR)。通过在茎环引物3’端引入8个随机核苷酸序列可以一次性逆转录所有的微小RNA(microRNAs)，提高了microRNAs检测的效率。采用通用引物的设计可以避免短片段核苷酸难以检测的缺点，达到对microRNAs进行相对定量的目的。优化实验条件后，构建简单、准确的microRNAs筛选和microRNAs相对定量的检测试剂盒。

背景技术

microRNAs是机体对mRNA翻译成蛋白质的调节机制之一，成熟的microRNAs具有这种调节功能。microRNAs在细胞发育、肿瘤的发生、疾病进展等重要的生理、病理过程发挥了重要的作用。不同个体中microRNAs表达谱也不同，表现为个体差异，可影响药物治疗效果。microRNAs表达在个体的发育、肿瘤发生、疾病进展等生理、病理过程中发挥了重要作用。microRNAs的检测有可能成为诊断、治疗和预后判断的靶分子，在肿瘤、老年病、免疫性疾病等常见疾病的病理过程和分子机制中有突出的研究价值。

组织、细胞microRNAs的表达谱和差异表达检测是研究microRNAs的基础技术。通过对肿瘤和正常细胞的检测可以发现显著的microRNA表达差异，而分离出发挥重要作用的靶microRNAs才能对肿瘤的发生、发展、预后进行深入的研究。目前，在胰腺癌的研究中发现miR-21、miR-let7e、miR-199a、miR-31、miR-30、miR-96、miR-29b等与正常胰腺组织表达差异显著，进一步的功能研究依赖快速、准确、简单的筛选技术和定量检测技术。但是成熟microRNAs仅有21-23个碱

基片段，很难采用常规的核酸扩增技术进行表达差异分析和定量检测。通过芯片技术可以区分大量的microRNAs表达差异，但是需要大量的标本提取RNA。Q-PCR技术可以定量检测低拷贝的核酸片段，但是需要合成大量的茎环引物对每个microRNA进行逆转录，使其在表达差异研究上不能最大程度的发挥效用。

目前，还未开发出准确、快速、简单、费用低廉的microRNAs筛选技术和定量检测技术用于各种对microRNAs的研究。本发明基于Q-PCR技术，通过茎环引物3’端引入8个随机核苷酸，可以逆转录所有的成熟microRNA，并通过多条通用引物配套进行Q-PCR分析，对microRNAs进行差异表达的筛选并可进行相对定量的检测，解决目前microRNAs分析的技术瓶颈。

发明内容

本发明的目的是克服现有分子诊断技术中对microRNAs差异表达分析耗时长、不能高通量、对标本要求高等缺陷，提供了一种茎环引物在3’端引入8个随机核苷酸，可以逆转录所有的成熟microRNA，并通过多条通用引物配套进行Q-PCR分析，对microRNAs进行差异表达的筛选并可进行相对定量的检测。提高microRNAs筛选和检测技术的效率和成功率。茎环引物包括来源于水稻序列的SEQ ID NO.1，其3’端含有8个随机核苷酸序列。茎环引物内包含多个通用引物位置包括SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。

本发明第二个目的是提供一种配套此引物进行microRNAs筛选和定量检测的特定的逆转录程序和PCR反应程序，达到快速分析的目的。逆转录程序为冰上放置5min，5℃5min，10℃10min，15℃15min，30℃30min，95℃5min。cDNA扩增程序如下：95℃预变性3min后，进行40-50个循环的95℃变性5sec，62℃退火延伸35sec(此步骤采集荧光值)；

本发明第三个目的是提供一种用于microRNAs差异性表达筛查和microRNAs相对定量检测的试剂盒。试剂盒包括试剂A：3’端带8个随机核酸序列的茎环引物；试剂B：M-MuLV逆转录酶；试剂C：5×逆转录缓冲液；试剂D：通用引物A；试剂E：通用引物B；试剂F：通用引物C；试剂G：Taq DNA聚合酶；试剂H：2×PCR缓冲液组成。

本发明的技术方案概述如下：

一套用于对微小RNA(microRNAs)核苷酸片段进行表达差异分析或进行相对定量检测的引物。一条3’端引入8个随机核苷酸的茎环引物SEQ ID NO.1针对所有成熟的microRNAs，用于进行逆转录。此茎环引物内包含3个配套的通用引物序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，用于定量PCR检测。

一种对微小RNA(microRNA)差异表达筛选和进行相对定量的一套试剂盒，由下述试剂组成：

试剂A：5μM 3’端带8个随机核酸序列的茎环引物，50μL；

试剂B：20U/μL M-MuLV逆转录酶，50μL；

试剂C：5×逆转录缓冲液，200μL含dNTP浓度为5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，Tris-HCl浓度为250mM，KCl浓度为250mM，MgCl₂浓度为20mM，50nM DTT。

试剂D：2μM通用引物A 1mL；

试剂E：2μM通用引物B 1mL；

试剂F：2μM通用引物C 1mL；

试剂G：5U/μL Taq DNA聚合酶；

试剂H：2×PCR缓冲液组成，包含600nM ROX、

Green I dye、2mMdNTPs(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris-HCl、80mM KCl、40mM(NH₄)₂SO₄、6mM MgSO₄。

逆转录程序为冰上放置5min，5℃5min，10℃10min，15℃15min，30℃30min，95℃5min。cDNA扩增程序如下：95℃预变性3min后，进行40-50个循环的95℃变性5sec，62℃退火延伸35sec(此步骤采集荧光值)；

本发明优点：

考虑到microRNA大约有800多种，而且目前通过Q-PCR筛选microRNAs需要分别进行逆转录获得cDNA后才能进行后续实验，使microRNAs筛选工作耗时长、成本高。通过引物3’端引入8个随机核苷酸的茎环引物可以一次性逆转录所有成熟的microRNAs，而且茎环内多个引物位点可在随后定量PCR扩增中能更好的与对侧microRNAs特异性引物相匹配，避免非特异性扩增和引物二聚体。使整个microRNAs差异表达的筛选更为简单，由于3个通用引物的灵活搭配，可以更好的选择microRNAs特异性引物使检测更为特异。通过优化实验反应体系和反应条件，组成检测灵敏、方便的试剂盒，为microRNAs研究提供可靠的检测技术。

附图说明

图1为miR的筛选效果。

图2为miR-155的检测效果。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1

一种对microRNAs进行表达差异进行筛选的试剂盒，试剂A：5μM 3’端带8个随机核酸序列的茎环引物，50μL；试剂B：20U/μL M-MuLV逆转录酶，50μL；试剂C：5×逆转录缓冲液，200μL含dNTP浓度为5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，Tris-HCl浓度为250mM，KCl浓度为250mM，MgCl₂浓度为20mM，50nM DTT；试剂D：2μM通用引物A 1mL；试剂E：2μM通用引物B 1mL；试剂F：2μM通用引物C 1mL；试剂G：5U/μL Taq DNA聚合酶；试剂H：2×PCR缓冲液组成，包含600nM ROX，

Green I dye，2mM dNTPs(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，80mM Tris-HCl，80mM KCl，40mM(NH₄)₂SO₄，6mM MgSO₄。

实施例2

一种配套此方法检测microRNAs的逆转录操作程序。20μL体系中含2μLmRNA(0.5pg-1μg)，3’端带8个随机核酸序列的茎环引物2μL(终浓度为500nM)，逆转录缓冲液4μL(终浓度dNTP为1mM，M-MuLV逆转录酶浓度为40U，Tris-HCl浓度为50mM，KCl浓度为50mM，MgCl₂浓度为4mM)。逆转录程序为冰上放置5min，5℃5min，10℃10min，15℃15min，30℃30min，95℃5min。逆转录完成后，试管内加入180μL水，进行10倍的稀释。

实施例3

一种配套此方法检测microRNAs的Q-PCR的操作程序。在96孔板的筛选程序中，每孔体系为10μL。在10μL Q-PCR体系中，首先加入1μL稀释后的cDNA和1μL microRNA特异性引物(适应于各种microRNAs，终浓度200nM)。其他试剂混合后共同加入，其中通用引物A 100μL(终浓度200nM，根据情况可选B、C)，Q-PCR 500μL缓冲液(终浓度为300nM ROX，

Green I dye，1mMdNTPs，40mM Tris-HCl、40mM KCl，20mm(NH₄)₂SO₄，3mm MgSO₄)，Taq酶10μL(终浓度0.05U/μL)，加入水290μL。混匀试剂后，每孔加入8μL混合试剂，盖上盖子或贴膜后在ABI 7500上进行检测。对cDNA扩增及定量程序如下：95℃预变性3min后；进行40-50个循环的95℃变性5sec，62℃退火延伸35sec(此步骤采集荧光值)。通过常规方法对各PCR管的Ct值进行统计分析，经与内对照进行比较后得出结果。

Claims (3)

1.一种用于微小RNA(microRNA)筛选和相对定量的茎环引物。其特征是一条3’端带8个随机核酸序列的茎环引物SEQ ID NO.1，可用于一次性逆转录所有microRNAs，通过荧光定量核酸扩增技术(Q-PCR)用于microRNA的表达差异分析和相对定量，茎环引物内包含多个高质量的引物位置用于Q-PCR包括SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。

2.根据权利要求1所述的用于微小RNA(microRNA)差异表达筛选和相对定量检测，对microRNA进行分析的PCR反应程序，其特征在于设定特定的PCR反应温度和时间，达到快速分析和结果特异的目的。

3.根据权利要求1所述的对微小RNA(microRNA)差异表达筛选和相对定量的一套试剂盒，其特征包括1，由下述试剂组成：

试剂A：5μM 3’端带8个随机核酸序列的茎环引物，50μL；

试剂B：20U/μL M-MuLV逆转录酶，50μL；

试剂C：5×逆转录缓冲液，200μL含dNTP浓度为5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，Tris-HCl浓度为250mM，KCl浓度为250mM，MgCl₂浓度为20mM，50nM DTT。

试剂D：2μM通用引物A 1mL；

试剂E：2μM通用引物B 1mL；

试剂F：2μM通用引物C 1mL；

试剂G：5U/μL Taq DNA聚合酶；

试剂H：2×PCR缓冲液组成，包含600nM ROX，

Green I dye，2mMdNTPs(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris-HCl、80mM KCl、40mM(NH₄)₂SO₄、6mM MgSO₄。

Images