CN102102101A - 抑制Plk1表达的siRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了四种siRNA序列，它们能抑制Plk1基因的表达，并显著抑制肿瘤细胞的生长增殖。根据本发明公开的四种Plk1 siRNA序列，其用途是可用于设计与制备抗肿瘤基因治疗药物。

Description

抑制Plk1表达的siRNA及其应用

技术领域

本发明涉及四种抑制Plk1表达的siRNA及其应用。

背景技术

Plk1(Polo-like kinase 1)是一个从酵母到人类高度保守的真核生物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员。Plk1不仅参与参与细胞有丝分裂过程中多个步骤的调节，而且与各种类型肿瘤的发生发展关系密切。大量研究结果表明：Plk1在各种类型肿瘤中均呈现过表达，且其表达水平具有重要预后价值；将Plk1基因通过转染导入NIH3T3成纤维细胞表达后，可引起NIH3T3细胞的恶性转化，恶性转化细胞能在软琼脂上快速生长，并在裸鼠体内形成肿瘤；抑制肿瘤细胞中Plk1的表达后，可导致肿瘤细胞生长的显著抑制和大规模细胞凋亡；但Plk1表达的抑制却对正常细胞如乳腺上皮细胞的生长影响极小；最近的一项研究结果还表明，Plk1还可通过调节细胞外基质而参与肿瘤的侵袭与转移。这些研究结果不仅表明Plk1是一个新的促进肿瘤发生发展的癌基因，而且也毫无疑问地将Plk1确立为一个有良好应用前景的恶性肿瘤治疗新靶点。目前，以Plk1为靶点开发的多个新的抗肿瘤治疗药物已经在实验室和临床试验中显示了很强的抗肿瘤效应。

以Plk1为靶点的抗肿瘤药物开发目前主要有两种策略：(1)传统策略，即设计抑制Plk1酶活性的传统小分子化合物抑制剂，该策略的主要缺点是特异性较差；(2)新策略，即采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术设计抑制Plk1基因表达的基因治疗药物，该策略的最大优势是高效和特异性强。

通过RNA i技术来研究开发新的以Plk1为靶点的抗肿瘤药物又有两个主要实现途径：

(1)化学合成Plk1 siRNA；(2)载体介导的Plk1 siRNA表达。但这两种途径都需要首先获得有效的能抑制Plk1表达的siRNA序列，因此，发现新的有效Plk1 siRNA序列可直接用于制备新的抗肿瘤治疗药物。

发明内容

本发明的目的在于提供抑制Plk1表达的siRNA序列，以及进一步提供该siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。

为达上述目的，本发明的四种抑制Plk1表达的siRNA序列分别为：

Plk1-siRNA-607的序列：

正义链：5′-AUGAAGAUCUGGAGGUGAATT-3′，

反义链：5′-UUCACCUCCAGAUCUUCAUTT-3′；

Plk1-siRNA-778的序列：

正义链：5′-AUACCUUGUUAGUGGGCAATT-3′，

反义链：5′-UUGCCCACUAACAAGGUAUTT-3′；

Plk1-siRNA-838的序列：

正义链：5′-GGAUCAAGAAGAAUGAAUATT-3′，

反义链：5′-UAUUCAUUCUUCUUGAUCCTT-3′；

Plk1-siRNA-484的序列：

正义链：5′-GGAGGAAAGCCCUGACUGATT-3′，

反义链：5′-UCAGUCAGGGCUUUCCUCCTT-3′。

上述四种siRNA序列可用于制备抗肿瘤药物。

本发明首先根据公认的siRNA序列设计原则从Plk1的cDNA序列中选取候选siRNA序列，再通过BLAST同源比对排除一些特异性差的候选siRNA序列，最后选定4种新的Plk1siRNA序列，并采用体外化学合成法合成各组Plk1 siRNA。然后，将各组Plk1 siRNA和阴性对照siRNA同时分别转染HeLa细胞，采用RT-PCR和Western印迹方法分别检测各组Plk1siRNA在mRNA和蛋白质水平上对Plk1的表达抑制效果，同时通过倒置生物显微镜观察各组Plk1 siRNA对肿瘤细胞生长增殖的抑制效应。RT-PCR分析结果表明，在转染后48h，与对照组相比，Plk1 siRNA转染组的Plk1 mRNA水平显著降低，而GAPDH内参对照基因的表达则没有变化；蛋白质免疫印迹实验表明，瞬时转染后48h，Plk1的表达几乎100％完全受到抑制，而对照组无明显效应，同时Actin内参对照基因的表达没有变化，说明本发明提供的各组Plk1siRNA能够特异性的有效抑制Plk1的表达。倒置生物显微镜观察发现，在转染后24h，对照siRNA转染组中的肿瘤细胞仍为正常的贴壁生长，而各Plk1 siRNA转染组中大量细胞呈现规则的圆形，并脱离培养皿底壁，漂浮于培养液中。这表明，Plk1的表达被有效抑制后，肿瘤细胞的正常生长分裂受到显著抑制，被有效阻滞于有丝分裂期。在转染后48和72h，对照siRNA转染组中的细胞仍为正常的贴壁生长，并表现为密集汇合的生长特点，而各Plk1 siRNA转染组中大量细胞开始死亡、裂解，在显微镜下可观察到大量死亡的细胞碎片。说明各组Plk1siRNA能有效抑制肿瘤细胞的生长增殖，可直接用于制备新的以Plk1为靶点抗肿瘤治疗药物。

附图说明

图1为RT-PCR方法检测各组siRNA在mRNA水平上对Plk1表达的抑制效果图

图2为Western印迹方法检测各组siRNA在蛋白质水平上对Plk1表达的抑制效果图

图3为倒置生物显微镜观察各组Plk1 siRNA对肿瘤细胞生长增殖抑制的结果图

具体实施说明

实施例1：Plk1 siRNA的合成

从公共免费基因数据库GenBank获取Plk1的eDNA序列，然后根据公认的siRNA序列设计原则从Plk1的cDNA序列中选取候选siRNA序列，再通过BLAST同源比对排除一些特异性差的候选siRNA序列，最后选定四种Plk1 siRNA序列，序列分别为：

Plk1-siRNA-607的序列：

正义链：5′-AUGAAGAUCUGGAGGUGAATT-3′，

反义链：5′-UUCACCUCCAGAUCUUCAUTT-3′；

Plk1-siRNA-778的序列：

正义链：5′-AUACCUUGUUAGUGGGCAATT-3′，

反义链：5′-UUGCCCACUAACAAGGUAUTT-3′；

Plk1-siRNA-838的序列：

正义链：5′-GGAUCAAGAAGAAUGAAUATT-3′，

反义链：5′-UAUUCAUUCUUCUUGAUCCTT-3′；

Plk1-siRNA-484的序列：

正义链：5′-GGAGGAAAGCCCUGACUGATT-3′，

反义链：5′-UCAGUCAGGGCUUUCCUCCTT-3′。

委托上海吉玛制药技术有限公司以化学合成法体外合成上述siRNA序列。

实施例2：RT-PCR方法检测各组siRNA在mRNA水平上对Plk1表达的抑制效果

1、转染实验：收集对数生长期的HeLa或Hep-2细胞，以合适的密度接种至6孔培养板，分别设置空白对照组、阴性对照siRNA转染组、Plk1 siRNA转染组，置于CO2培养箱培养。培养24h后，细胞密度达到约60％，开始进行siRNA转染实验。转染实验采用Invitrogen公司的Lipofectamine RNAiMax试剂，具体方法参照试剂使用说明书进行。

2、总RNA提取：转染后48h，收集各组细胞。使用Invitrogen公司的Trizol试剂提取细胞总RNA，具体方法参照试剂使用说明书进行，各组总RNA样品利用紫外分光光度计定量和变性琼脂糖凝胶电泳检测以确保总RNA的质量和完整性。

3、RT-PCR：(1)反转录：采用TAKARA公司的PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，具体方法参照试剂盒使用说明书进行。(2)PCR：以GAPDH作为内参对照，检测Plk1基因的mRNA表达水平变化。Plk1的上下游引物分别为，上游引物：5′-GGCAACCTTTTCCTGAATGA-3′，下游引物：5′-AATGGACCACACATCCACCT-3′。GAPDH的上下游引物分别为，上游引物：5′-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。PCR扩增反应体系组成为1μL 10×PCR缓冲液、1μL 2.5mmol/L dNTPs、20×cDNA模板1μL、0.1μL Taq酶(5U/μl)、10μmol/L上下游引物混合液1μL，双蒸水补足至10μL。扩增程序为：95℃变性2min，然后用逐步程序95℃ 15sec、60℃ 15sec、72℃ 20sec完成19～35个循环，最后于72℃延伸7min。2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，EB染色，凝胶成像系统照相。

4、结果：见图1，RT-PCR分析结果表明，在转染后48h，与对照组相比，各Plk1 siRNA转染组的Plk1 mRNA水平显著降低，而GAPDH内参对照基因的表达则没有变化，说明各组siRNA均能有效抑制Plk1在mRNA水平上的表达。

实施例3：Western印迹方法检测各组siRNA在蛋白质水平上对Plk1表达的抑制效果

1、转染实验：参见实施例2。

2、细胞蛋白质裂解液制备：吸去培养皿中的培养基，用1×PBS将细胞洗涤2次，用细胞刮收集细胞，混悬于RACK1裂解缓冲液(25mM Tris-HCl，pH8.0，137mM NaCl，2.7mMKCl，1％Triton X-100，使用前临时添加适量蛋白酶抑制剂)，冰上放置30min，超声处理进一步破碎细胞和DNA。4℃ 14000rpm离心10min，收集上清作为细胞裂解液。采用Bradford法检测细胞裂解液中的蛋白质浓度，具体方法参见Bio-Rad公司的Bio-Rad ProteinAssay试剂盒使用说明。

3、Western印迹：取适量细胞裂解液，加入SDS上样缓冲液(62.5mM Tris-HCl，pH6.8，2％β-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)于100℃加热变性处理5min。10％SDS-PAGE分离样品中各蛋白质。采用Tank法进行转膜，具体方法参见Millipore公司的ImmobilonTM-P膜使用说明。用封阻液(含5％牛奶的TBS-T)将转印后的蛋白膜于室温封阻1h或4℃封阻过夜。TBS-T洗膜三次，每次5min；加入适量稀释的一抗(Plk1抗体购自Zymed公司，Actin抗体购自Sigma公司)，室温温育1h；TBS-T洗膜三次；加入1∶2000稀释的偶联辣根过氧化物酶的二抗(购自Cell Signaling公司)，室温温育1h；TBS-T洗膜三次。最后采用化学发光法进行检测，具体操作参见Amersham公司的ECL Western blotting detection reagents and analysissystem试剂盒说明，KODAK显像系统进行显影。

4、结果：见图2，Western印迹分析结果表明，在转染后48h，各Plk1 siRNA转染组的Plk1蛋白质表达几乎100％完全受到抑制，而对照组无明显效应，同时Actin内参对照基因的表达没有变化，说明各组siRNA均能有效抑制Plk1在蛋白质水平上的表达。

实施例4：倒置生物显微镜观察各组Plk1 siRNA对肿瘤细胞生长增殖的抑制效应

1、转染实验：参见实施例2。

2、细胞生长增殖观察：使用尼康公司的倒置生物显微镜，分别在转染后的24h、48h和72h观察Plk1表达抑制后对肿瘤细胞生长分裂和细胞形态的影响。

3、结果：见图3，在转染后24h，对照siRNA转染组中的肿瘤细胞仍为正常的贴壁生长，而各Plk1 siRNA转染组中大量细胞呈现规则的圆形，并脱离培养皿底壁，漂浮于培养液中。这表明，Plk1的表达被有效抑制后，肿瘤细胞的正常生长分裂受到显著抑制，被有效阻滞于有丝分裂期。在转染后48和72h，对照siRNA转染组中的细胞仍为正常的贴壁生长，并表现为密集汇合的生长特点，而各Plk1 siRNA转染组中大量细胞开始死亡、裂解，在显微镜下可观察到大量死亡的细胞碎片。说明各组Plk1 siRNA能有效抑制肿瘤细胞的生长增殖并诱发细胞死亡和/或凋亡。

实施例5：Plk1 siRNA在制备抗肿瘤治疗药物中的应用

本发明所得的四组Plk1 siRNA序列的可用于设计和制备抗肿瘤治疗药物。用于人类体内给药，可单独使用或与其它药物联合使用。在具体实施时，可以参照目前通用的RNAi基因治疗方案进行设计和实施。目前主要有两种设计和制备策略，简述如下：

第一种，直接合成法。即根据本发明提供的Plk1 siRNA序列，直接采用化学合成的方法合成相应的Plk1 siRNA双链分子。其中正义链和反义链自5′端开始的19个核苷酸为靶向Plk1mRNA的序列，必须使用；而正义链和反义链自3′末端的游离的两个连续的脱氧核苷酸(TT)悬垂修饰则可以替换为两个连续的尿嘧啶核苷酸(UU)。另外，为了增加Plk1 siRNA双链分子在细胞内和体内的稳定性，可进一步使用常用的siRNA修饰方法对其进行修饰。

第二种，载体介导法。即根据本发明提供的Plk1 siRNA序列的正义链和反义链自5′端开始的19个核苷酸序列(注：该序列即靶向Plk1 mRNA的序列)，进一步设计相应的短发夹样核苷酸序列，插入相应的各种基因治疗载体，制备能表达Plk1 shRNA的基因治疗药物。

Claims (3)

1.四种抑制Plk1表达的siRNA，其序列分别为：

Plk1-siRNA-607的序列：

正义链：5′-AUGAAGAUCUGGAGGUGAATT-3′，

反义链：5′-UUCACCUCCAGAUCUUCAUTT-3′；

Plk1-siRNA-778的序列：

正义链：5′-AUACCUUGUUAGUGGGCAATT-3′，

反义链：5′-UUGCCCACUAACAAGGUAUTT-3′；

Plk1-siRNA-838的序列：

正义链：5′-GGAUCAAGAAGAAUGAAUATT-3′，

反义链：5′-UAUUCAUUCUUCUUGAUCCTT-3′；

Plk1-siRNA-484的序列：

正义链：5′-GGAGGAAAGCCCUGACUGATT-3′，

反义链：5′-UCAGUCAGGGCUUUCCUCCTT-3′。

2.如权利要求1所述的任意一种Plk1 siRNA序列，其序列特征为：正义链和反义链的长度均为21个核苷酸，两条链的5′端的19个核苷酸序列互补配对，3′末端均为游离的两个连续的脱氧核苷酸(TT)悬垂修饰，其中正义链和反义链自5′端开始的19个核苷酸为靶向Plk1 mRNA的序列。

3.如权利要求1和2所述的任意一种Plk1 siRNA序列及其自5′端开始的19个核苷酸序列在设计和制备抗肿瘤治疗药物中的应用。

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