CN102016590A - 荧光偏振hERG试验 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于筛选测试化合物引起受试者心脏中毒的能力的试验、方法和试剂盒。特别地，本发明公开了测试化合物是否具有延长Q-T间期的效果，所述Q-T间期由人类心电图测得。本文公开的试验、方法和试剂盒利用新型荧光示踪物与hERG K+通道之间的结合相互作用，以及测试化合物影响所述结合相互作用的倾向。

Description

荧光偏振hERG试验

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)，要求2008年2月28日提交的美国临时专利申请No.61/032,390、2008年2月29日提交的美国临时专利申请No.61/032,604，和2008年2月29日提交的美国临时专利申请No.61/032,809的权益，所述文献的公开以全文引用的方式并入本文。

技术领域

本发明涉及心血管安全试验领域，特别涉及用于筛选测试化合物引起受试者心脏中毒的能力的试验、方法和试剂盒。本文公开的试验、方法和试剂盒基于新型荧光示踪化合物与hERG K⁺通道的相互作用，该相互作用通过膜制剂进行利用，所述膜制剂来自设计具有高水平hERG K⁺通道表达的细胞系。本文公开的试验、方法和试剂盒可用于确认对人类心脏复极具有不利影响(特别是延长心电图的Q-T间期的倾向)的化合物。

背景技术

人类ether-a-go-go相关基因(hERG)编码深刻影响人类心室复极的快速延迟内向整流钾通道(I_Kr)(参见Curran，M.E.；Splawski，I.；Timothy，K.W.；Vincent，G.M.；Green，E.D.；Keating，M.T.，A molecular basis for cardiac arrhythmia：HERG mutations cause long QT syndrome.Cell 1995，80，(5)，795-803；Sanguinetti，M.C.；Jiang，C.；Curran，M.E.；Keating，M.T.，A mechanistic link between an inherited and an acquired cardiac arrhythmia：HERG encodes the IKr potassium channel.Cell 1995，81，(2)，299-307；Trudeau，M.C.；Warmke，J.W.；Ganetzky，B.；Robertson，G.A.，HERG，a human inward rectifier in the voltage-gated potassium channel family.Science1995，269，(5220)，92-5；以及Warmke，J.W.；Ganetzky，B.，A family of potassium channel genes related to eag in Drosophila and mammals.Proc Natl Acad Sci U S A1994，91，(8)，3438-42)。流经心室肌中的通道的I_Kr复极电流的阻滞可导致Q-T间期的延长，所述Q-T间期的延长为称作尖端扭转型室性心动过速(torsades de pointes)以及可能的致命性心律失常的特征心电图图案(参见Sanguinetti，M.C.；Tristani-Firouzi，M.，hERG potassium channels and cardiac arrhythmia.Nature 2006，440，(7083)，463-9；以及Haverkamp，W.；Breithardt，G.；Camm，A.J.；Janse，M.J.；Rosen，M.R.；Antzelevitch，C.，Escande，D.；Franz，M.；Malik，M.；Moss，A.；Shah，R.，The potential for QT prolongation and proarrhythmia by non-antiarrhythmic drugs：clinical and regulatory implications.Report on a policy conference of the European Society of Cardiology.Eur Heart J 2000，21，(15)，1216-31)。该通道(本文称作hERGK⁺通道)结合各种不同类型的化学结构的混杂性质(参见Cavalli，A.；Poluzzi，E.；De Ponti，F.；Recanatini，M.；Toward a pharmacophore for drugs inducing the long QTsyndrome：insights from a CoMFA study of HERG K(+)channel blockers.J Med Chem2002，45，(18)，3844-53)以及来自该相互作用的潜在致命后果已使得国际协调会议(International Congress of Harmonization)和美国食品和药物管理局推荐所有新的候选药物均进行在使用人类hERG蛋白质(天然形式或以重组形式表达)的功能膜片钳试验中的测试(参见Bode，G.；Olejniczak，K.，ICH topic：the draft ICH S7Bstep 2：note for guidance on safety pharmacology studies for human pharmaceuticals.Fundam Clin Pharmacol 2002，16，(2)，105-18)。尽管自动化的高通量膜片钳方法在近期得以发展，但这种体系需要专业操作者、活细胞和相当大的资本投资(参见Bridgland-Taylor，M.H.；Hargreaves，A.C.；Easter，A.；Orme，A.；Henthorn，D.C.；Ding，M.；Davis，A.M.；Small，B.G.；Heapy，C.G.；Abi-Gerges，N.；Persson，F.；Jacobson，I.；Sullivan，M.；Albertson，N.；Hammond，T.G.；Sullivan，E.；Valentin，J.P.；Pollard，C.E.，Optimisation and validation of a medium-throughput electrophysiology-based hERG assay using IonWorks  HT.J Pharmacol Toxicol Methods 2006，54，(2)，189-99；以及Dubin，A.E.；Nasser，N.；Rohrbacher，J.；Hermans，A.N.；Marrannes，R.；Grantham，C.；Van Rossem，K.；Cik，M.；Chaplan，S.R.；Gallacher，D.；Xu，J.；Guia，A.；Byrne，N.G.；Mathes，C.，Identifying modulators of hERG channel activity using the PatchXpress planar patch clamp.J Biomol Screen 2005，10，(2)，168-81)。此外，由于膜片钳测试较昂贵，并且由于许多化学上不同的构架(scaffolds)阻塞hERG K⁺通道，在早期药物开发过程中用于减轻潜在的心脏倾向性(liability)的策略通常利用结合试验来预测化合物在功能膜片钳试验中阻滞hERG电流的能力(参见Whitebread，S.；Hamon，J.；Bojanic，D.；Urban，L.，Keynote review：in vitro safety pharmacology profiling：an essential tool for successful drug development.Drug Discov Today 2005，10，(21)，1421-33；以及Diaz，G.J.；Daniell，K.；Leitza，S.T.；Martin，R.L.；Su，Z.；McDermott，J.S.；Cox，B.F.；Gintant，G.A.，The[3H]dofetilide binding assay is a predictive screening tool for hERG blockade and proarrhythmia：Comparison of intact cell and membrane preparations and effects ofaltering[K+]o.J Pharmacol Toxicol Methods 2004，50，(3)，187-99)。

使用[³H]-多非利特(参见Diaz，G.J.；Daniell，K.；Leitza，S.T.；Martin，R.L.；Su，Z.；McDermott，J.S.；Cox，B.F.；Gintant，G.A.，The[3H]dofetilide binding assay is a predictive screening tool for hERG blockade and proarrhythmia：Comparison of intact cell and membrane preparations and effects of altering[K+]o.J Pharmacol Toxicol Methods 2004，50，(3)，187-99；以及Finlayson，K.；Turnbull，L.；January，C.T.；Sharkey，J.；Kelly，J.S.，[3H]dofetilide binding to HERG transfected membranes：a potential high throughput preclinical screen.Eur J Pharmacol 2001，430，(1)，147-8)，[³H]-阿司咪唑(参见Chiu，P.J.；Marcoe，K.F.；Bounds，S.E.；Lin，C.H.；Feng，J.J.；Lin，A.；Cheng，F.C.；Crumb，W.J.；Mitchell，R.，Validation of a[3H]astemizolebinding assay in HEK293 cells expressing HERG K+channels.J Pharmacol Sci 2004，95，(3)，311-9)，或[³⁵S]-MK499(参见Wang，J.；Della Penna，K.；Wang，H.；Karczewski，J.；Connolly，T.M.；Koblan，K.S.；Bennett，P.B.；Salata，J.J.，Functional and pharmacological properties of canine ERG potassium channels.Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003，284，(1)，H256-67)的放射配体结合试验显示出对hERG K⁺通道阻滞的预测。然而，放射配体的制备、储存和处理增加了试验程序的时间和成本。此外，已描述评估化合物与hERG K⁺通道的结合的放射试验为非均质过滤结合试验，并需要通过使用真空歧管在滤纸上捕获放射配体结合的膜蛋白质而分离未结合的放射配体。该程序使得所述试验对于大规模筛选或常规化合物评价(profiling)难以自动化，因此限制了其实际用途。此外，在过去十年内，工业界和学术界中均力主开发非放射方法以取代这种试验。

荧光偏振(FP)试验提供了完全均质的混合读取形式以表征配体对受体的亲合性，在许多情况中其可用于取代许多放射结合试验(参见Burke，T.J.；Loniello，K.R.；Beebe，J.A.；Ervin，K.M.，Development and application of fluorescence polarization assays in drug discovery.Comb Chem High Throughput Screen 2003，6，(3)，183-94)。该技术基于化合物从受体置换荧光探针(“示踪物”)的能力，其通过光学信号的变化进行检测。在这种试验中，示踪物通常由已知的受体的高亲合性配体组成，所述配体化学已连接至荧光分子而不显著干扰受体-配体相互作用的亲合性(参见Huang，X.，Fluorescence polarizaion competition assay：the range of resolvable inhibitor potency is limited by the affinity of the fluorescent ligand.J BiomolScreen 2003，8，(1)，34-8)。在FP试验中，当示踪物分子用平面偏振光激发时，若在光子激发和发射之间的时间过程(通常为纳秒)中荧光团保持其取向，则发射光的偏振得以保持。在溶液中，当示踪物结合至如蛋白质的较大分子时，由于蛋白质-示踪物络合物相比于自由示踪物本身旋转更缓慢，因此该取向大量保持。当示踪物通过连接至受体的配体而从受体置换时，来自示踪物的光发射相对于激发源而被消偏振。

常规放射配体结合试验和FP试验之间的重要实际区别在于，与放射配体结合试验不同，FP试验得以优化设置，其使用有限量的示踪物，以及K_d值或K_d值以上的受体浓度用于受体-示踪物相互作用。这是因为所测量的光学信号取决于来自存在的所有示踪物(自由的或结合的)的信号，这不同于放射配体结合试验，在放射配体结合试验中(分离之后)，仅有的测量信号归因于结合的配体，而自由配体并不贡献该信号。因此，在FP试验中，任何未结合的示踪物贡献存在的消偏振光的含量，由此减少所测量的偏振信号，并减小试验窗口。通常，配置FP试验使得在不存在竞争配体下总示踪物的50至70％得以结合，从而在试验窗口(所测得的最大-最小偏振值)与试验灵敏度(IC₅₀值接近真实K_i值的能力)之间取得平衡(参见Huang，X.，Fluorescence polarization competition assay：the range of resolvable inhibitor potency is limited by the affinity of the fluorescent ligand.J Biomol Screen 2003，8，(1)，34-8)。当开发使用纯化的可溶性重组蛋白质的FP试验时，由于许多这种蛋白质易于以足够用于这种试验的量制得，因此这通常不是问题。然而，当开发用于如hERG的膜相关蛋白质(在大部分情况中所述蛋白质并未从它们的膜组分以功能形式纯化，其包含不可溶脂质组分以及其他蛋白质)的试验时，该需要构成了挑战。此外，大量膜组分的存在会通过散射光(参见Banks，P.；Gosselin，M.；Prystay，L.，Impact of a red-shifted dye label for high throughput fluorescence polarization assays of G protein-coupled receptors.J Biomol Screen 2000，5，(5)，329-34)或通过导致增加的示踪物(其经常含有亲脂性荧光团)与膜本身的非特异性结合而干扰试验。

因此，迄今为止仍未实现确认和表征小分子对hERG K⁺通道的亲合性，并说明与得自放射配体结合或膜片钳试验的数据的密切关联的均质FP基试验的开发。

发明内容

为了避免与放射试验相关的问题而评估hERG K⁺通道的结合，开发了用于这些试验的均质FP基替代物。首先使用常规的放射配体置换试验确认候选的高亲合性荧光示踪物。然而，由于在初始细胞系中的hERG K⁺通道表达水平(B_max)不足以配置FP试验，发展了通过使用编码两种蛋白质的双顺反子表达载体将细胞表面标志(CD8)的表达连接至hERG K⁺通道的表达从而增加hERG K⁺通道表达水平的策略。该策略允许使用流式细胞仪克隆分离高表达hERG K⁺通道细胞系，并能够发展FP试验(包括进一步的示踪物开发和试验优化)。所得FP试验可预测hERGK⁺通道结合，易于使用标准的板读取器(plate readers)进行，并良好适于取代常规的放射结合试验而用作hERG K⁺通道倾向性的化合物的分类方式。

本文描述了用于筛选小分子，即测试化合物，以表征它们对hERG K⁺通道的亲合性，以及它们引起受试者心脏中毒的能力的FP试验、方法和试剂盒。此外，本文描述了用于所公开的试验、方法和试剂盒的具有高的hERG K⁺通道表达水平的新型荧光示踪化合物和膜制剂的制备方法。

本发明的一个方面提供了一种新型的具有如下结构通式(I)的荧光示踪化合物：

或其药物可接受的盐，

其中：

Ar为选自苯并、噻吩并、呋或吡啶并的芳香环；

R¹和R²独立地选自：

1)氢，

2)C_1-6烷基，其为未取代的或由如下基团取代的：

a)-NR⁴R⁵，其中R⁴和R⁵独立地为氢或C_1-6烷基，

b)-N(R⁵)COC_1-6烷基，

c)-NHSO₂(C_1-6烷基)，

d)-CONR⁶R⁷，其中R⁶和R⁷独立地为：

i)氢，

ii)C_1-6烷基，或

iii)R⁶和R⁷以及与它们连接的氮原子一起表示5元或6元饱和杂环，所述杂环可含有选自N、S(O)_n或O的另外的杂原子，其中N、S(O)_n或O选自吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪或N-甲基哌嗪，

e)-CO(C_1-6烷基)，

f)-OH，

g)-O(C_1-6烷基)，

h)-O(C_1-6烷基)-O-(C_1-3烷基)，

i)-S(O)_n(C_1-6烷基)，

j)咪唑，

k)2-咪唑烷酮，

l)2-吡咯烷酮，

m)-NH-C(NHR⁵)＝N-CN，或

n)-NH-C(SR⁵)＝N-CN，

3)-OH，

4)C_1-3烷氧基，其为未取代的或由C_1-3烷氧基取代的，

5)-N(R⁵)SO₂(C_1-6烷基)，

6)-N(R⁵)SO₂(CH₂)_gCO₂H，其中g为1-5，

7)-N(R⁵)SO₂(CH₂)_gCO₂C_1-6烷基，

8)-NO₂，

9)-N(R⁵)COC_1-6烷基，

10)-N(R⁵)SO₂-C₆H₄-R⁴，

11)-N(R⁵)CO-C₆H₄-R⁴，

12)-NR⁴R⁵，

13)卤素，

14)-CO-C_1-6烷基，

15)-CONR⁶R⁷，

16)-CN，

17)-CO₂R⁵，

18)-C(R⁵)＝N-OR⁸，

19)苯甲酰基，其为未取代的或由C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素或羟基取代的，

20)-N(R⁵)COO(C_1-6烷基)，

21)-N(R⁵)COO-苯基，其为未取代的或由C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、羟基或卤素取代的，

22)-N(R⁵)CONR⁴R⁵，

23)-S(O)_nC_1-6烷基，

24)-S(O)_n-C₆H₄-R⁴，

25)-CF₃，

26)苯基，其为未取代的或由C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素或羟基取代的，

27)咪唑基，

28)-SO₂NR⁶R⁷，

29)-N[S(O)₂C_1-6烷基][(CH₂)_pCN]，其中p为2-5，

30)-N(R⁵)-C(NR⁴R⁵)＝N-CN，或

31)-N(R⁵)-C(SR⁵)＝N-CN；

包含W、X和Y的环体系为5元、6元或7元环体系，其中W、X和Y独立地为-O-、C＝O、-(CR⁴R⁵)_n-、C＝NOR⁸、CHOR⁹、-NR⁹-、CHNR¹⁰R¹¹、-S(O)_n-、＝CH-、＝N-或键；其中：

R⁴和R⁵如上所定义，

R⁸为

a)氢，或

b)C_1-6烷基，其为未取代的或由-COOR⁵取代的；

R⁹为

a)氢，

b)C_1-6烷基，

c)(CH₂)_n-C₆H₄-R¹²，其中R¹²为

i)-NO₂，

ii)C_1-3烷基，

iii)-O-C_1-3烷基，

iv)卤素，

v)-CF₃，或

vi)氢，

d)-CO-C_1-6烷基，

e)-CO-C₆H₄-R¹²，

f)-COO-C_1-6烷基，或

g)-CONR⁴R⁵；

R¹⁰和R¹¹独立地为

a)氢，

b)C_1-6烷基，其为未取代的或由-(CR⁴R⁵)_n-(CR⁴R⁵)_g-R¹³取代的，其中g为1-5，且R¹³为

i)氢，

ii)-OH，或

iii)-OC_1-6烷基，

c)-CO-C_1-6烷基，其为未取代的或由如下基团取代的：

i)-OH，

ii)-N(R⁴R⁵)，

iii)-OC_1-6烷基，或

iv)-CO₂R⁵，

d)-CO-C₆H₄-R¹³，或

e)R₁₀和R¹¹以及与它们连接的氮原子一起表示未取代的或由氧或羟基取代的5元或6元饱和杂环，所述杂环可含有选自N、S(O)_n或O的另外的杂原子，其中N、S(O)_n或O选自吡咯烷、吗啉、哌啶、吡咯烷酮、哌啶酮、哌嗪或N-甲基哌嗪；

n为0、1或2；

B为5元至7元含N环；

L为-(CR⁴R⁵)_m-Q-(CR⁴R⁵)_q-NH-[CZ-(CR⁴R⁵)_u-(D)_w]_z-，其中

R⁴和R⁵如上所定义，

m和q独立地为1至约5，

u为0至约7，

w为0或1，

z为1或2，

Q为键、-O-、C＝O、CHOH、-NR⁵-或-S(O)_n-，

Z为＝O或＝S，且

D为-O-、-S(O)_n-、-NR⁵-，或-NR⁵SO₂-；且

R³为荧光染料。

本发明的另一方面提供了筛选测试化合物的试验，其中所述试验为使用结合至hERG K⁺通道或其片段的源的本文所述的荧光示踪物的结合试验。

本发明的另一方面提供了一种表征测试化合物作为hERG K⁺通道阻滞剂的活度的方法，所述方法包括如下步骤：

a)在本文所述的荧光示踪物的存在下，在试验缓冲液中将测试化合物与含有hERG K⁺通道的膜制剂接触，所述hERG K⁺通道具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，所述膜制剂源自用包含编码hERG K⁺通道的核苷酸序列的核酸表达载体转染的细胞；

b)监测测试化合物是否影响荧光体示踪物与含有hERG K⁺通道的膜制剂的结合；以及

c)测定测试化合物的hERG K⁺通道阻滞剂活度。

本发明的另一方面提供了一种用于筛选测试化合物的试剂盒，所述试剂盒包含：

a)本文所述的荧光示踪物；

b)hERG K⁺通道或其片段的源；和

c)试验缓冲液。

本发明的另一方面提供了一种hERG K⁺通道表达细胞群，其中所述细胞群表达至少约100皮摩尔/毫克总膜蛋白质的hERG K⁺通道。

本发明的另一方面提供了一种制备具有如下结构式(I)的荧光示踪化合物的方法，

所述方法包括：

a)在室温下在二甲基甲酰胺/二异丙基乙胺中，使具有如下结构式(II)的化合物

与具有如下结构式(III)的化合物反应，

[R¹⁴O]_k-[CZ-(CR⁴R⁵)_u-(D)_w]_z-R³

(III)

其中：

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、Ar、B、D、L、Q、W、X、Y、Z、m、q、u、w和z如上所定义；

k为0或1；且

R¹⁴为活性酯的组分；

前提是若Z为＝O，则k为1，且

前提是若Z为＝S，则k为0，u为0，w为1，z为1，且D为＝N。

本发明的其他目的、特征和优点通过如下详细描述而变得显而易见。然而，应了解指出本发明的优选具体实施方案的详细描述和特定实施例仅以说明的方式提供，因为对于本领域技术人员而言，通过该详细描述，在本发明的实质和范围内的各种变化和修改是显而易见的。

附图说明

图1显示了首先通过IC₅₀值为30nM以下的置换[³H]-阿司咪唑的放射配体置换试验评估hERG K⁺通道亲合性的六种候选荧光示踪物(由它们的内部化合物标识号进行标识)。

图2显示了高表达hERG K⁺通道细胞系的克隆分离：(A)CD8+细胞的前10％通过FACS分离。(B)192个单细胞通过免疫细胞化学扩增和分析CD8表达。(C)六个克隆通过手动膜片钳分析，记录峰值尾电流。“T-REx”指所分析的原始可诱导hERG细胞系，“Pool”指高CD8表达细胞的原始类型。(D)来自克隆D的膜制剂通过放射配体结合进行分析。(o)总结合配体，(·)特异性结合配体，(×)非特异性结合配体。

图3显示了在存在(o)或不存在(·)30μM E-4031下结合至hERG-CD8膜的Predictor^TM hERG Tracer Red的观察偏振值。

图4显示了从hERG-CD8膜置换Predictor^TM hERG Tracer Red。(A)由E-4031(□)或阿司咪唑(o)置换。(B)在不存在(o)或存在(×)30μM E-4031下由阿司咪唑置换。校正数据(·)表示在存在E-4031下见到的非特异性置换。

图5显示了由涵盖了广泛的hERG K⁺通道亲合性的已知的hERG K⁺通道阻滞剂从CD8-hERG膜置换Predictor^TM hERG Tracer Red。原始数据由各自的标记显示。实线表示如本文所述校正的置换曲线。

图6(A)显示了测定信号稳定性(偏振移动和IC₅₀值)和试验有效性(robustness)(Z’值)随时间的时程研究。在将示踪物和膜加入E-4031稀释系列之后(■)30分钟、(□)1小时、(·)2小时、(o)4小时、(▲)6小时、(×)24小时读取试验板。除了30μM E-4031数据点含有28次重复以计算Z’值(表2)之外，每个数据点均表示二次测量的平均。显示了误差条，但其通常小于用于标识数据点的标记。在图6(B)中，在各种浓度的DMSO(■)、甲醇(·)或乙醇(▲)的存在下重复试验并在2小时之后读取，IC₅₀值由实线连接，Z’值由虚线连接。

具体实施方式

定义：

在详细描述本发明之前，应了解本发明不局限于特定的组合物或方法步骤，其可进行变化。应注意在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一种”(“a”，“an”)和“所述”(“the”)包括复数，除非上下文清楚另外指出。

除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语与在本发明相关的领域中的普通技术人员所通常理解的具有相同的含义。为了本发明的目的限定本文描述的如下术语：

“烷基”指具有1至10个碳原子，且优选1至6个碳原子的单价饱和脂族烃基。该术语包括例如线性和分支的烃基，如甲基(CH₃-)、乙基(CH₃CH₂-)、正丙基(CH₃CH₂CH₂-)、异丙基((CH₃)₂CH-)、正丁基(CH₃CH₂CH₂CH₂-)、异丁基((CH₃)₂CHCH₂-)、仲丁基((CH₃)(CH₃CH₂)CH-)、叔丁基((CH₃)₃C-)、正戊基(CH₃CH₂CH₂CH₂CH₂-)和新戊基((CH₃)₃CCH₂-)。

“烷氧基”指基团-O-烷基，其中烷基如本文所定义。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基和正戊氧基。

“芳基”或“Ar”指具有5至14个碳原子并具有单环(例如苯并)或多个缩合环(例如萘或蒽)的单价芳族碳环基团，其中缩合环可为或不为芳族的(例如2-苯并恶唑酮、2H-1，4-苯并噁嗪-3(4H)-酮-7-基等)，前提是连接点在芳族碳原子上。

“氨基”指基团-NH₂。

“烯基”指具有2至6个碳原子，且优选2至4个碳原子，并具有至少1个且优选1至2个烯属不饱和位点的烯基。这种基团例如乙烯基、烯丙基和丁-3-烯-1-基。

“羧基”(“Carboxyl”或“carboxy”)指-COOH或其盐。

“H”表示氢。

“卤素”(“Halo”或“halogen”)指氟、氯、溴和碘。

“羟基”(“Hydroxy”或“hydroxyl”)指基团-OH。

“杂芳基”指在环内具有1至10个碳原子和1至4个杂原子的芳族基团，所述杂原子选自氧、氮或硫。这种杂芳基可具有单环(例如吡啶基或呋喃基)或多个缩合环(例如氮茚基或苯并噻唑基)，其中缩合环可为或不为芳族的和/或含有杂原子，前提是连接点是通过芳族杂芳基的原子。在一个具体实施方案中，杂芳基的氮和/或硫环原子任选被氧化以提供N-氧化物(N→O)、亚磺酰基或磺酰基部分。

“杂环”或“杂环的”或“杂环烷基”或“杂环基”指具有单环或多个缩合环(包括稠环桥联和螺环体系)，且在环内具有1至10个碳原子和1至4个杂原子的饱和或不饱和基团，所述杂原子选自氮、硫或氧，其中在稠环体系中，一个或多个环可为环烷基、芳基或杂芳基，前提是连接点是通过非芳环。在一个具体实施方案中，杂环基团的氮和/或硫原子任选被氧化以提供N-氧化物、亚磺酰基、磺酰基部分。

“螺环基”或“螺环”指具有3至10个碳原子，并具有带有螺环结合(该结合由单个原子形成，该单个原子为环的仅有的共同成员)的环烷基或杂环基环的二价饱和环基团。

“盐”指化合物的可接受的盐，所述盐源自本领域公知的多种有机或无机反离子，其包括例如钠、钾、钙、镁、铵和四烷基铵；当分子含有碱性官能度时，有机或无机酸的盐，如氢氯酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、醋酸盐、马来酸盐和草酸盐。

本文所用的术语“染料”指发射光以产生可观察可检测信号的化合物。

本文所用的术语“荧光团”或“荧光的”指当结合至生物化合物或目标被分析物时显示荧光变化的组合物。本发明优选的荧光团包括在含水介质中具有高量子产率的荧光染料。示例性的荧光团特别地包括呫吨、吲哚、硼聚氮杂茚烯、呋喃和苯并呋喃。本发明的荧光团可被取代以改变荧光团的溶解度、光谱性质或物理性质。

本文所用的术语“连接体”指一系列的掺入选自C、N、O或S的原子的稳定共价键，其将荧光(fluorogenic或fluorescent)化合物共价连接至如化学反应性基团或生物和非生物组分的另一部分。示例性的连接成员包括含有-C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、-O-等的部分。

本文所用的术语“BSA”指牛血清白蛋白。

本文所用的术语“CMV”指巨细胞病毒。

本文所用的术语“D-MEM”指达尔伯克氏改良伊格尔培养基。

本文所用的术语“DMSO”指二甲基亚砜。

本文所用的术语“EDTA”指乙二胺四乙酸。

本文所用的术语“FACS”指荧光自动化细胞分类。

本文所用的术语“FBS”指胎牛血清。

本文所用的术语“FP”指荧光偏振。

本文所用的术语“HEPES”指4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。

本文所用的术语“hERG”指人类ether-a-go-go相关基因。

本文所用的术语“LQTS”指长Q-T综合症。

本文所用的术语“MEM NEAA”指具有非必需氨基酸的最小必需培养基。

本文所用的术语“PBS”指磷酸盐缓冲液。

本文所用的术语“TdP”指尖端扭转型室性心动过速。

本发明的特定方面：

评估hERG K⁺通道结合的FP试验的发展需要合成一系列的具有各种构架、取代基、连接体和荧光团的荧光示踪化合物(参见Singleton，D.H.；Boyd，H.；Steidl-Nichols，J.V.；Deacon，M.；Groot，M.J.；Price，D.；Nettleton，D.O.；Wallace，N.K.；Troutman，M.D.；Williams，C.；Boyd，J.G.，Fluorescently Labeled Analoguesof Dofetilide as High-Affinity Fluorescence Polarization Ligands for the Human Ether-a-go-go-Related Gene(hERG)Channel.J Med Chem 2007，50，(13)，2931-2941)。因此，本发明的一个方面提供了一种新型的具有如下结构通式(I)的荧光示踪化合物：

或其药物可接受的盐，

其中：

Ar为选自苯并、噻吩并、呋或吡啶并的芳香环；

R¹和R²独立地选自：

1)氢，

2)C_1-6烷基，其为未取代的或由如下基团取代的：

a)-NR⁴R⁵，其中R₄和R⁵独立地为氢或C_1-6烷基，

b)-N(R⁵)COC_1-6烷基，

c)-NHSO₂(C_1-6烷基)，

d)-CONR⁶R⁷，其中R⁶和R⁷独立地为：

i)氢，

ii)C_1-6烷基，或

iii)R⁶和R⁷以及与它们连接的氮原子一起表示5元或6元饱和杂环，所述杂环可含有选自N、S(O)_n或O的另外的杂原子，其中N、S(O)_n或O选自吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪或N-甲基哌嗪，

e)-CO(C_1-6烷基)，

f)-OH，

g)-O(C_1-6烷基)，

h)-O(C_1-6烷基)-O-(C_1-3烷基)，

i)-S(O)_n(C_1-6烷基)，

j)咪唑，

k)2-咪唑烷酮，

l)2-吡咯烷酮，

m)-NH-C(NHR⁵)＝N-CN，或

n)-NH-C(SR⁵)＝N-CN，

3)-OH，

4)C_1-3烷氧基，其为未取代的或由C_1-3烷氧基取代的，

5)-N(R⁵)SO₂(C_1-6烷基)，

6)-N(R⁵)SO₂(CH₂)_gCO₂H，其中g为1-5，

7)-N(R⁵)SO₂(CH₂)_gCO₂C_1-6烷基，

8)-NO₂，

9)-N(R⁵)COC_1-6烷基，

10)-N(R⁵)SO₂-C₆H₄-R⁴，

11)-N(R³)CO-C₆H₄-R⁴，

12)-NR⁴R⁵，

13)卤素，

14)-CO-C_1-6烷基，

15)-CONR⁶R⁷，

16)-CN，

17)-CO₂R⁵，

18)-C(R⁵)＝N-OR⁸，

19)苯甲酰基，其为未取代的或由C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素或羟基取代的，

20)-N(R⁵)COO(C_1-6烷基)，

21)-N(R⁵)COO-苯基，其为未取代的或由C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、羟基或卤素取代的，

22)-N(R⁵)CONR⁴R⁵，

23)-S(O)_nC_1-6烷基，

24)-S(O)_n-C₆H₄-R⁴，

25)-CF₃，

26)苯基，其为未取代的或由C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素或羟基取代的，

27)咪唑基，

28)-SO₂NR₆R⁷，

29)-N[S(O)₂C_1-6烷基][(CH₂)_pCN]，其中p为2-5，

30)-N(R⁵)-C(NR⁴R⁵)＝N-CN，或

31)-N(R⁵)-C(SR⁵)＝N-CN；

包含W、X和Y的环体系为5元、6元或7元环体系，其中W、X和Y独立地为-O-、C＝O、-(CR⁴R⁵)_n-、C＝NOR⁸、CHOR⁹、-NR⁹-、CHNR¹⁰R¹¹、-S(O)_n-、＝CH-、＝N-或键；其中：

R⁴和R⁵如上所定义，

R⁸为

a)氢，或

b)C_1-6烷基，其为未取代的或由-COOR⁵取代的；

R⁹为

a)氢，

b)C_1-6烷基，

c)(CH₂)_n-C₆H₄-R¹²，其中R¹²为

i)-NO₂，

ii)C_1-3烷基，

iii)-O-C_1-3烷基，

iv)卤素，

v)-CF₃，或

vi)氢，

d)-CO-C_1-6烷基，

e)-CO-C₆H₄-R¹²，

f)-COO-C_1-6烷基，或

g)-CONR⁴R⁵；

R₁₀和R¹¹独立地为

a)氢，

b)C_1-6烷基，其为未取代的或由-(CR⁴R⁵)_n-(CR⁴R⁵)_g-R¹³取代的，其中g为1-5，且R¹³为

i)氢，

ii)-OH，或

iii)-OC_1-6烷基，

c)-CO-C_1-6烷基，其为未取代的或由如下基团取代的：

i)-OH，

ii)-N(R⁴R⁵)，

iii)-OC_1-6烷基，或

iv)-CO₂R⁵，

d)-CO-C₆H₄-R¹³，或

e)R¹⁰和R¹¹以及与它们连接的氮原子一起表示未取代的或由氧或羟基取代的5元或6元饱和杂环，所述杂环可含有选自N、S(O)_n或O的另外的杂原子，其中N、S(O)_n或O选自吡咯烷、吗啉、哌啶、吡咯烷酮、哌啶酮、哌嗪或N-甲基哌嗪；

n为0、1或2；

B为5元至7元含N环；

L为-(CR⁴R⁵)_m-Q-(CR⁴R⁵)_q-NH-[CZ-(CR⁴R⁵)_u-(D)_w]_z-，其中

R⁴和R⁵如上所定义，

m和q独立地为1至约5，

u为0至约7，

w为0或1，

z为1或2，

Q为键、-O-、C＝O、CHOH、-NR⁵-或-S(O)_n-，

Z为＝O或＝S，且

D为-O-、-S(O)_n-、-NR⁵-，或-NR⁵SO₂-；且

R³为荧光染料。

尽管确认了前述荧光示踪物的子集显示出对hERG K⁺通道的最高亲合性结合(图1)，但发现表明至少一种这种荧光示踪物证实为可用于试验发展，标准的含hERG K⁺通道的膜不足以允许有效的(robust)FP试验。特别地，使用源自hERG-T-REx^TM 293细胞系的膜制剂检验最高亲合性荧光示踪物在FP试验中的效用。在存在或不存在已知的hERG K⁺通道阻滞剂(如E-4031或多非利特)下，这些初始实验未能显示出可测量的荧光偏振的差异。这些结果并不令人惊讶，因为有效的FP试验需要高亲合性示踪物以及在不存在置换化合物下足以结合～50％或更多示踪物的蛋白质浓度(参见Hung，X.，Fluoresence polarization competition assay：the range of resolvable inhibitor potency is limited by the affinity of the fluorescent ligand.J Biomol Screen 2003，8，(1)，34-8)。

因此，本发明的另一方面提供了增加hERG K₊通道膜制剂的比活(specific activity)(B_max)。由于配置FP试验所需的B_max水平远高于用于放射配体结合和膜片钳试验的细胞系所通常描述的那些，因此增加hERG K⁺通道膜制剂的比活(B_max)与确认具有足够亲合性的候选荧光示踪物同样重要。为了实现前一目的，使用CMV促进剂构建表达载体(SEQ ID NO：2)以驱动由编码hERG K⁺通道和CD8细胞表面标志的核苷酸序列组成的双顺反子元的转录，其中两种蛋白质的转译由内部核糖体进入位点序列(IRES)连接。嘌呤霉素抗性标记包含于表达载体上以提供选择其中已发生表达盒的稳定的基因并入的细胞的方式。在一个说明性的变体中，所述表达载体包含编码hERG K⁺通道的核苷酸序列，所述hERG K⁺通道具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在另一说明性的变体中，所述表达载体可包含编码hERG K⁺通道的核苷酸序列，所述hERG K⁺通道具有与SEQ ID NO：1至少80％同源的氨基酸序列。

在通过连续两轮FACS、单细胞克隆扩增和免疫细胞化学染色而进行的高表达细胞的转染和分离之后，获得B_max大于450皮摩尔/毫克总膜蛋白质的hERG K⁺通道的hERG K⁺通道表达细胞群。此外，如下的方法能够制得B_max值在广泛范围的hERG K⁺通道表达细胞群，即优选至少约100皮摩尔/毫克总膜蛋白质至大于450皮摩尔/毫克总膜蛋白质的hERG K⁺通道，更优选约200皮摩尔/毫克总膜蛋白质至大于约450皮摩尔/毫克总膜蛋白质的hERG K⁺通道，甚至更优选约300皮摩尔/毫克总膜蛋白质至大于约450皮摩尔/毫克总膜蛋白质的hERG K⁺通道，且最优选大于450皮摩尔/毫克总膜蛋白质的hERG K⁺通道的B_max值。

本发明的另一方面提供了一种制备具有结构式(I)的荧光示踪化合物的方法，

所述方法包括：

a)在室温下在二甲基甲酰胺/二异丙基乙胺中，使具有如下结构式(II)的化合物

与具有如下结构式(III)的化合物反应，

[R¹⁴O]_k-[CZ-(CR⁴R⁵)_u-(D)_w]_z-R³

(III)

其中：

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、Ar、B、D、L、Q、W、X、Y、Z、m、q、u、w和z如上所定义；

k为0或1；且

R¹⁴为活性酯的组分；

前提是若Z为＝O，则k为1，且

前提是若Z为＝S，则k为0，u为0，w为1，z为1，且D为＝N。

在一个说明性的具体实施方案中，化合物(III)为羧酸琥珀酰亚胺酯，使得R¹⁴为琥珀酰亚胺基。在另一说明性的具体实施方案中，化合物(III)为羧酸4-磺基-2，3，5，6-四氟苯基酯，使得R¹⁴为4-磺基-2，3，5，6-四氟苯基。在又一说明性的具体实施方案中，化合物(III)为异硫氰酸酯。

本发明的另一方面提供了一种筛选测试化合物的试验，其中所述试验为使用结合至hERG K⁺通道或其片段的源的本文所述的荧光示踪物的结合试验。说明性地，所述试验包括以下步骤：

a)在存在或不存在不同含量的测试化合物或测试化合物的混合物下在试验缓冲液中培养荧光示踪物或其盐以及hERG K⁺通道或其片段的源；以及

b)测量测试化合物或测试化合物的混合物对结合至hERG K⁺通道或其片段的荧光示踪物的含量的影响。

在一个说明性的具体实施方案中，所述试验缓冲液包含15mM至50mM的HEPES、5mM至20mM的KCl、0.5mM至2mM的MgCl₂，和0.02％至约0.1％的PLURONIC F-127，且所述hERG K⁺通道或其片段的源选自：

i)源自细胞的膜制剂，在所述细胞表面上表达hERG K⁺通道或其片段；

ii)细胞，在所述细胞表面上表达hERG K⁺通道或其片段；或

iii)源自组织的膜制剂，在所述组织表面上表达hERG K⁺通道或其片段。

在一个优选的具体实施方案中，所述hERG K₊通道或其片段的源为源自细胞的膜制剂，在所述细胞表面上表达hERG K⁺通道或其片段，且试验缓冲液包含25mM的HEPES、15mM的KCl、1mM的MgCl₂，和0.05％的PLURONIC F-127，其中所述试验缓冲液在室温下的pH为pH 7.2至pH 7.6。在最优选的具体实施方案中，细胞表达大于约450皮摩尔/毫克总膜蛋白质的hERG K⁺通道，且试验缓冲液为pH 7.4。

本发明的另一方面提供了一种表征测试化合物作为hERG K⁺通道阻滞剂的活度的方法。说明性地，所述方法包括如下步骤：

a)在本文所述的荧光示踪物的存在下，在试验缓冲液中将测试化合物与含有hERG K⁺通道的膜制剂接触，所述hERG K⁺通道具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，所述膜制剂源白用包含编码hERG K⁺通道的核苷酸序列的核酸表达载体转染的细胞；

b)监测测试化合物是否影响荧光体示踪物与含有hERG K⁺通道的膜制剂的结合；以及

c)测定测试化合物的hERG K⁺通道阻滞剂活度。

在一个说明性的具体实施方案中，所述核酸表达载体进一步包含编码内部核糖体进入位点蛋白质的核苷酸序列和编码CD-8细胞质膜蛋白质的核苷酸序列，其中编码内部核糖体进入位点蛋白质和CD-8细胞质膜蛋白质的核苷酸序列连续位于编码hERG K⁺通道的核苷酸序列的下游。在另一说明性的具体实施方案中，所述核酸表达载体具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列，且监测测试化合物是否影响荧光体示踪物与含有hERG K⁺通道的膜制剂的结合通过荧光偏振进行测量。在一个优选的具体实施方案中，试验缓冲液为pH 7.4并包含25mM的HEPES、15mM的KCl、1mM的MgCl₂，和0.05％的PLURONIC F-127，且hERG K⁺通道的表达通过编码内部核糖体进入位点蛋白质的核苷酸序列而连接至CD-8细胞质膜蛋白质的表达。

本发明的另一方面提供了一种用于筛选测试化合物的试剂盒。说明性地，所述试剂盒包含：

a)本文所述的荧光示踪物；

b)hERG K⁺通道或其片段的源；和

c)试验缓冲液。

在一个优选的具体实施方案中，所述hERG K⁺通道或其片段的源为源自细胞的膜制剂，在所述细胞表面上表达hERG K⁺通道或其片段，其中细胞表达至少约100皮摩尔/毫克总膜蛋白质的hERG K⁺通道，且试验缓冲液在pH 7.4下包含25mM的HEPES、15mM的KCl、1mM的MgCl₂，和0.05％的PLURONIC F-127。

本发明的详细描述已如上提供，如下实施例为了说明本发明的目的而提供，不应解释为对本发明或权利要求书的范围的限定。

实施例

化学合成

连接体(4)的制备

在装有10毫升滴液漏斗(addition funnel)、温度计、氩气入口和磁力搅拌子的100毫升三口圆底烧瓶中，将二甘醇(1，5.0毫升，53毫摩尔)和三乙胺(Et₃N，16.2毫升，116毫摩尔)溶解于40毫升二氯甲烷中。溶液在冰浴中冷却至0-5℃。甲基磺酰氯(MsCl，8.4毫升，108毫摩尔)经由滴液漏斗以保持反应溶液在15℃以下的速率逐滴加入。移去冰浴，反应在环境温度下搅拌过夜(～16小时)。加入水(25毫升)并搅拌混合物直至固体溶解。分离层，有机(较低)层连续用两部分20毫升的冰冷3M盐酸、25毫升的5％碳酸钠水溶液和25毫升饱和氯化钠水溶液洗涤。有机相(较低)用无水硫酸钠干燥，过滤，并在旋转蒸发器上蒸发至干，从而得到13克橙色固体。

该材料通过快速色谱在150克Silica Gel 60(230-400目)上用1∶1的乙酸乙酯-甲苯洗脱，并收集～125毫升级分而得以纯化。基于TLC(硅胶，4∶1乙酸乙酯-甲苯，钼酸铵铈显影；R_f(1)＝0.05-0.3，R_f(2)＝0.46-0.64)，合并级分并在减压下通过旋转蒸发浓缩至浆料。所述浆料在冰浴中冷却，固体通过真空过滤收集，用冰冷甲苯洗涤，并在25℃下真空干燥，从而得到作为白色固体的2，2’-氧基双(乙烷-2，1-二基)二甲基磺酸酯(2)(11.79克，产率85％)，其通过TLC是均质的。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ3.0(s，6H)，δ3.8(m，4H)，和δ4.4(m，4H).

2-(2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)乙基甲基磺酸酯(3)

在100毫升圆底烧瓶中，将2，2’-氧基双(乙烷-2，1-二基)二甲基磺酸酯(2，10克，38毫摩尔)、碳酸钾粉末(5.3克，38毫摩尔)和双(叔丁氧羰基)胺(9.1克，42毫摩尔)溶解于25毫升无水DMF中。该混合物在60-65℃下搅拌～3小时。加入另外10毫升无水DMF并继续在60-65℃下搅拌。在～24小时之后，TLC(硅胶，1∶1乙酸乙酯-甲苯，钼酸铵铈显影；R_f(2)＝0.3-0.4，R_f(3)＝0.6-0.7)仍然显示原料(2)，因此继续在60-65℃下搅拌。在另外～24小时之后，TLC不显示进一步的变化，因此将反应冷却至室温。加入水(30毫升)和乙酸乙酯(60毫升)，将混合物转移至分液漏斗。分离层，含水(较低)层用乙酸乙酯提取。合并乙酸乙酯提取物并连续用25毫升的1M盐酸水溶液、两部分25毫升的水和25毫升饱和氯化钠水溶液洗涤。乙酸乙酯溶液用无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下在旋转蒸发器上浓缩接着通过高真空得到13.72克极淡黄色的油。

该材料通过快速色谱在260克Silica Gel 60(230-400目)上连续用15∶85的乙酸乙酯-己烷、25∶75的乙酸乙酯-己烷和30∶70的乙酸乙酯-己烷洗脱，并收集～125毫升级分而得以纯化。基于TLC(硅胶，15∶85的乙酸乙酯-己烷，钼酸铵铈显影)，合并级分并在减压下通过旋转蒸发浓缩，从而得到7.21克澄清无色的油。通过TLC(硅胶，1∶1的乙酸乙酯-己烷，钼酸铵铈显影；R_f(2)＝0.08-0.2，R_f(3)＝0.65-0.75并带有少量杂质在R_f＝0.45-0.5和R_f＝0.55-0.65)该材料仍然不是均质的，因此其通过快速色谱在150克Silica Gel 60(230-400目)上用20∶80的乙酸乙酯-己烷洗脱，并收集～125毫升级分而再次纯化。基于TLC(硅胶，1∶1的乙酸乙酯-己烷，钼酸铵铈显影)，合并级分并在减压下在旋转蒸发器上浓缩接着通过高真空得到作为澄清无色的油的2-(2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)乙基甲基磺酸酯(3)(4.58克，产率31％)。TLC(硅胶，1∶1的乙酸乙酯-己烷，钼酸铵铈显影)显示3在R_f＝0.65-0.75并带有痕量杂质在R_f＝0.45-0.5。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.5(s，18H)，δ3.1(s，3H)，和δ3.5-3.9(m)+δ4.3(m)＝8H.

叔丁基2-(2-溴代乙氧基)乙基氨基甲酸酯(4)

将溴化锂(7.6克，87毫摩尔)加入化合物3(3.35克，8.74毫摩尔)在33毫升丙酮中的溶液并在55-60℃的油浴中加热。在～3小时之后TLC(1∶1的乙酸乙酯-己烷，钼酸铵铈显影)显示原料(3，R_f＝0.7-0.8)完全消失并出现主要的新产物(4，R_f＝0.8-0.9)。将反应混合物冷却至室温并加入水(～15毫升)。所得溶液用两部分25毫升乙酸乙酯提取。合并的乙酸乙酯提取物用水(15毫升)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下通过旋转蒸发浓缩，从而得到澄清无色的油(2.05克)。

该材料通过快速色谱在60克Silica Gel 60(230-400目)上用15∶85的乙酸乙酯-己烷洗脱，并收集～50毫升级分而得以纯化。基于TLC(硅胶，50∶50的乙酸乙酯-己烷，钼酸铵铈显影)，合并级分并在减压下在旋转蒸发器上浓缩接着通过高真空得到作为澄清无色的油的叔丁基2-(2-溴代乙氧基)乙基氨基甲酸酯(4)(1.92克，产率82％)，其通过TLC为均质的。质谱：m/z＝268.4(100％)，270.2(93％)[M+H]^+ 1H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.4(s，9H)，δ3.2-3.8(m，8H)，和δ4.9(br s，1H)。

连接至染料的螺哌啶酮(13)的制备

1’-苯甲酰基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-4-酮(7)

将2’-羟基苯乙酮(5，5.88毫升，48.85毫摩尔)、1-苯甲酰基-4-哌啶酮(6，10克，49毫摩尔)，和吡咯烷(4.1毫升，49毫摩尔)在55毫升甲醇中的溶液在65℃的油浴中加热。在～18小时之后移去油浴，使溶液冷却至室温。加入另外的1-苯甲酰基-4-哌啶酮(6，100毫克，0.5毫摩尔)并继续在65℃下加热。在另外～2.5小时之后移去油浴，使溶液冷却至室温。该混合物在减压下在旋转蒸发器上浓缩接着通过高真空得到粘稠的橙色油。该油用乙醚磨碎以提供固体，该固体通过真空过滤收集，用乙醚洗涤并在室温下真空干燥，从而得到作为灰白色固体的1’-苯甲酰基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-4-酮(7)(14.72克，产率93.8％)。将滤液蒸发至干，用乙醚磨碎，过滤，用乙醚洗涤，并在室温下真空干燥，从而得到作为灰茶色固体的另外的化合物7(0.54克，产率3.7％)。通过TLC(硅胶，二氯甲烷中1.5％的甲醇，UV显影；R_f(7)＝0.15-0.2)，两个样品均为均质的。

1’-苯甲酰基-6-硝基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-4-酮(8)

在剧烈搅拌下在氩气下将1’-苯甲酰基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-4-酮(7，12.6克，39.2毫摩尔)悬浮于120毫升乙酸酐中。该混合物在冰浴中冷却至0-5℃并逐滴加入发烟硝酸(15毫升)。当加入硝酸时悬浮的固体溶解。在完成添加之后，反应在冰浴温度下搅拌5分钟，然后变暖至室温。在室温下～45分钟之后，反应迅速变得放热，并再次在冰浴中冷却。在～1小时的总反应时间之后，一小份(在饱和碳酸钠水溶液中猝灭并提取至乙酸乙酯中)的TLC(硅胶，50∶50乙酸乙酯-己烷，碘和UV显影)显示多个产物，但完全消耗了原料7[R_f(7)＝0.3-0.4]。在～1.5小时的总反应时间之后，将反应混合物倒入300毫升冰冷饱和碳酸钠水溶液中。在搅拌该混合物几分钟之后，加入固体碳酸钠直至溶液达到pH 6-7。该溶液用三部分200毫升的乙酸乙酯提取。合并有机提取物，用无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下在旋转蒸发器上浓缩，从而得到橙棕色泡沫(16.6克)。

该材料与来自之前小量反应的0.62克材料合并，通过溶解于乙酸乙酯中，加入Silica Gel 60(70-230目，50克)，并通过在减压下旋转蒸发去除溶剂而预吸收至硅胶上。将所得粉末加至浆料填充(使用10∶90乙酸乙酯-己烷)的100克SilicaGel 60(70-230目)快速色谱柱的顶部，并连续用10∶90的乙酸乙酯-己烷、20∶80的乙酸乙酯-己烷和30∶70的乙酸乙酯-己烷、40∶60的乙酸乙酯-己烷和50∶50的乙酸乙酯-己烷洗脱，收集～125毫升级分。基于TLC(硅胶，50∶50的乙酸乙酯-己烷)，合并级分并在减压下在旋转蒸发器上浓缩，从而得到8.33克略不纯(通过如上TLC)的黄色固体。

该材料通过溶解于二氯甲烷，加入SilicaGel 60(70-230目，25克)，并通过在减压下旋转蒸发去除溶剂而再次预吸收至硅胶上。将所得粉末加至浆料填充(使用50∶50乙酸乙酯-己烷)的335克Silica Gel 60(70-230目)快速色谱柱的顶部，并连续用50∶50的乙酸乙酯-己烷和60∶40的乙酸乙酯-己烷洗脱，收集～125毫升级分。基于TLC(硅胶，1∶1的乙酸乙酯-己烷)，合并级分并在减压下在旋转蒸发器上浓缩，从而得到6.59克黄色泡沫状固体，其通过TLC(硅胶，50∶50乙酸乙酯-己烷或在二氯甲烷中3％甲醇，UV显影)仍然略微不纯。

该材料通过快速色谱在264克Silica Gel 60(70-230目)上连续用二氯甲烷、二氯甲烷中1％甲醇和二氯甲烷中2％甲醇洗脱，收集～125毫升级分而得以再纯化。基于TLC(硅胶，在二氯甲烷中3％甲醇，UV显影)，合并级分并在减压下在旋转蒸发器上浓缩，从而得到作为淡黄色泡沫状固体的1’-苯甲酰基-6-硝基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-4-酮(8，6.5克，产率45％)。通过TLC(硅胶，在二氯甲烷中3％甲醇，UV显影)，该材料包含一个主要组分(R_f＝0.2-0.3)和一个次要杂质(R_f＝0.14-0.17)。

6-氨基-1’-苯甲酰基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-4-酮(9)

在氩气气氛中将氯化锡(II)二水合物(25.4克，112毫摩尔)在152毫升浓盐酸中的溶液在～50分钟内逐滴加入1’-苯甲酰基-6-硝基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-4-酮(8，5.9克，16毫摩尔)在152毫升四氢呋喃中的溶液。然后在室温下搅拌该反应混合物。在总共～2小时之后，一小份(在过量氢氧化钠水溶液中猝灭，并提取至乙酸乙酯中)的TLC(硅胶，在二氯甲烷中10％甲醇，UV显影，R_f(8)＝0.75-0.85)显示反应完全。该反应混合物在冰浴中冷却至0-5℃，逐滴加入40％的氢氧化钠水溶液直至溶液达到pH 11-13。所得溶液用三部分150毫升乙酸乙酯提取，合并的乙酸乙酯提取物连续用50毫升的水和饱和氯化钠水溶液部分进行洗涤。有机提取物用无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下在旋转蒸发器上浓缩接着通过高真空得到8.2克粘稠黄色油，其在TLC[硅胶，二氯甲烷中10％甲醇(R_f 0.4-0.65)或二氯甲烷中3％甲醇(R_f0.2-0.35)，UV显影]上显示几个点(一个主要的)。

该材料通过快速色谱在220克Silica Gel 60(230-400目)上连续用二氯甲烷和二氯甲烷中2％甲醇洗脱，收集～200毫升级分而得以纯化。基于TLC(硅胶，在二氯甲烷中10％甲醇，UV显影)，合并级分并在减压下在旋转蒸发器上浓缩接着通过高真空得到4.2克橙色残余物，其通过TLC显示几个点。

该材料通过快速色谱在200克Silica Gel 60(230-400目)上连续用40∶60的乙酸乙酯-甲苯、50∶50的乙酸乙酯-甲苯和70∶30的乙酸乙酯-甲苯洗脱，收集～125毫升级分而得以再纯化。基于TLC(硅胶，1∶1乙酸乙酯-甲苯，UV显影)，合并级分并在减压下在旋转蒸发器上浓缩接着通过高真空得到2.15克作为黄色固体的6-氨基-1’-苯甲酰基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-4-酮(9)(产率39％)，其通过TLC[R_f(9)＝0.25-0.3，硅胶，1∶1乙酸乙酯-甲苯，UV显影]为几乎均质的。

N-(1’-苯甲酰基-4-氧基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-6-基)甲基磺酰胺(10)

将甲基磺酰氯(0.51毫升，6.6毫摩尔)加入6-氨基-1’-苯甲酰基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-4-酮(9，1.85克，5.50毫摩尔)在18.5毫升吡啶中的溶液中。反应混合物在室温下搅拌。在～1.5小时之后，一小份(在冰冷3M盐酸水溶液中猝灭并提取至乙酸乙酯中)的TLC(硅胶，1∶1乙酸乙酯-甲苯，UV显影)显示反应完全[R_f(9)＝0.25-0.3，R_f(10)＝0.15-0.25]。在总共～2小时之后，将反应混合物倒入75毫升冰冷3M盐酸水溶液中并搅拌十分钟。固体通过真空过滤收集，用水洗涤，并在环境温度下真空干燥，从而得到2.17克粉色固体。将该材料悬浮于甲醇(50毫升)和乙醇(50毫升)的混合物中并加热至沸腾。加入另外的甲醇直至溶解完全，过滤(重力)热溶液。将所得溶液冷却至室温(一些沉淀)，然后在0-5℃的冰箱中冷却。沉淀的固体通过真空过滤收集，用冰冷1∶1甲醇-乙醇洗涤，并在环境温度下真空干燥，从而得到0.86克作为浅粉色固体的N-(1’-苯甲酰基-4-氧基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-6-基)甲基磺酰胺(10)(产率38％)。该材料通过TLC(硅胶，二氯甲烷中5％甲醇，UV显影，R_f(10)＝0.3-0.35)为均质的。

另外0.42克作为浅粉色固体的N-(1’-苯甲酰基-4-氧基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-6-基)甲基磺酰胺(10)(产率18％)通过在减压下由旋转蒸发将母液蒸发至干并接着在2∶1甲醇-乙醇中重结晶残余物而获得。该材料通过TLC(硅胶，二氯甲烷中5％甲醇，UV显影，R_f(10)＝0.3-0.35)为均质的。

N-(4-氧基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-6-基)甲基磺酰胺盐酸盐(11)

将N-(1’-苯甲酰基-4-氧基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-6-基)甲基磺酰胺(10，0.81克，1.95毫摩尔)悬浮于无水乙醇(10毫升)和6M盐酸水溶液(10毫升)的混合物中，并在85-90℃的油浴中搅拌。在1小时之后将油浴温度增加至95℃。在95℃下～3.5小时之后使反应冷却至室温。TLC(硅胶，二氯甲烷中10％甲醇，UV显影)显示无剩余原料[R_f(10)＝0.65-0.7]。溶剂在减压下在旋转蒸发器上去除。将乙醇加入残余物然后在减压下在旋转蒸发器上蒸发至干。乙醇添加和蒸发至干再次重复两次。残余物真空干燥从而得到0.77克作为淡黄色固体的N-(4-氧基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-6-基)甲基磺酰胺盐酸盐(11)(产率114％)，其通过TLC[硅胶，含有少量浓缩氢氧化铵水溶液的二氯甲烷中10％甲醇，UV显影，R_f(11)＝0.12-0.19]为均质的。质谱：m/z＝311.2[M+H]⁺

叔丁基2-(2-(6-(甲基磺酰胺基)-4-氧基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-1’-基)乙氧基)乙基氨基甲酸酯(12)

N，N-二异丙基乙胺(1.3毫升，7.5毫摩尔)、叔丁基2-(2-溴代乙氧基)乙基氨基甲酸酯(4，0.59克，2.2毫摩尔)和N-(4-氧基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-6-基)甲基磺酰胺盐酸盐(11，0.5克，1.4毫摩尔)在10毫升无水DMF中的溶液在60-65℃下搅拌。在～24小时之后TLC(硅胶，二氯甲烷中10％甲醇，UV显影)显示起始胺11(R_f＝0.02-0.06)几乎完全消失，并出现一个主要的新产物(R_f＝0.35-0.45)。使反应冷却至室温并加入10毫升水。在乙酸乙酯的协助下将所得混合物转移至分液漏斗并分离层。含水层用20毫升乙酸乙酯提取。合并有机提取物，用10毫升水和饱和氯化钠水溶液部分连续进行洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下在旋转蒸发器上浓缩接着通过高真空得到0.94克橙棕色油。

将该材料与得自在先较小反应的94毫克合并，并通过快速色谱在43克SilicaGel 60(230-400目)上用二氯甲烷中5％甲醇洗脱，并收集～40毫升级分而纯化。基于TLC(硅胶，二氯甲烷中10％甲醇，UV显影)合并级分并在减压下在旋转蒸发器上浓缩，从而得到0.51克作为黄色泡沫的叔丁基2-(2-(6-(甲基磺酰胺基)-4-氧基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-1’-基)乙氧基)乙基氨基甲酸酯(12)(合并产率59％)，其通过TLC为均质的(R_f＝0.4-0.5)。质谱：m/z＝498.18[MH]^+ 1H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ1.4(s，9H)，δ1.9-2.6(m，8H)，δ2.65(s，2H)，δ2.9(s，3H)，δ3.1-3.6(m，8H)，δ5.1(br s，1H)，δ6.9-7.6(m，4H)。

荧光示踪物(13)

叔丁基2-(2-(6-(甲基磺酰胺基)-4-氧基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-1’-基)乙氧基)乙基氨基甲酸酯(12，5.0毫克，0.010毫摩尔)在二氯甲烷(0.9毫升)和三氟乙酸(TFA，0.1毫升)的混合物中的溶液在室温下搅拌～3小时。该溶液在减压下在＜35℃的旋转蒸发器上蒸发至干。加入甲苯(～1毫升)，溶液在减压下在＜35℃的旋转蒸发器上蒸发至干。甲苯添加/蒸发顺序再重复一次或两次。

将残余物溶解于4.0毫升无水DMF中，将1.0毫升一小份溶液转移至含有～1毫克“胺反应性”[异硫氰酸酯、羧酸琥珀酰亚胺酯，或羧酸STP(4-磺基-2，3，5，6-四氟苯基)酯]荧光染料的5毫升圆底烧瓶中。将无水二异丙基乙胺(0.2毫升)加入每个烧瓶中。将烧瓶包裹铝箔以阻挡光线，反应在氩气下在室温下搅拌过夜(16-20小时)。将甲醇(0.5毫升)加入每个烧瓶中，溶液在室温下搅拌1-3小时。溶剂在减压下在＜35℃的旋转蒸发器上去除。加入甲苯(～1毫升)，溶液在减压下在＜35℃的旋转蒸发器上蒸发至干。甲苯添加/蒸发顺序再重复一次或两次。所得材料通过制备HPLC纯化。(使用相同的一般程序由中间化合物14制备另外的具有通式13的荧光示踪物；由中间化合物17制备具有通式20的荧光示踪物；由中间物19制备具有通式21的荧光示踪物，所有的示踪物列于表1)。

代表性HPLC纯化条件：

柱子：Zorbax RX，C-8，5微米，4.6毫米x 25厘米

缓冲液A：0.1％TFA，10％乙腈

缓冲液B：0.085％TFA，90％乙腈

梯度：2-25分钟10-50％B；35-45分钟50-100％B

流速：1.0毫升/分钟

注入：在缓冲液A中，100微升1.4mM

N-(1’-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-4-氧基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-6-基)甲基磺酰胺二盐酸盐(14)

将十滴浓盐酸加入叔丁基2-(2-(6-(甲基磺酰胺基)-4-氧基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-1’-基)乙氧基)乙基氨基甲酸酯(12，0.51克，1.02毫摩尔)在5毫升冰醋酸中的溶液，所得溶液在室温下搅拌。在～1.5小时之后，TLC(硅胶，二氯甲烷中10％甲醇，UV显影)显示起始化合物12(R_f＝0.2-0.3)的完全消失和在原处(atthe origin)的新点。挥发性组分在减压下在旋转蒸发器上去除。加入甲苯(～10毫升)并在减压下在旋转蒸发器上蒸发。甲苯添加和蒸发再重复两次，残留物在高真空下干燥。所得残留物用3毫升乙醚磨碎，导致褐色固体的形成。乙醚在减压下在旋转蒸发器上去除并接着通过高真空得到褐色固体。

(R)-叔丁基2-(2-(4-羟基-6-(甲基磺酰胺基)螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-1’-基)乙氧基)乙基氨基甲酸酯(16)

将叔丁基2-(2-(6-(甲基磺酰胺基)-4-氧基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-1’-基)乙氧基)乙基氨基甲酸酯(12，0.25克，0.50毫摩尔)溶解于含有0.038毫升(0.5毫摩尔)2-丙醇的5毫升二氯甲烷中，将溶液冷却至-20℃。逐滴加入硼烷二甲硫醚络合物(Me₂S·BH₃，0.126毫升，～1.26毫摩尔)，溶液在-20℃下搅拌1小时。以一部分(in a single portion)加入(S)-四氢-1-甲基-3，3-二苯基-1H，3H-吡咯-[1，2-c][1，3，2]噁唑硼烷-硼烷络合物(15，15毫克，0.05毫摩尔；如Xavier，L.C.等人的Org.Syn.1998，Coll.Vol.9，676所述由(S)-四氢-1-甲基-3，3-二苯基-1H，3H-吡咯[1，2-c][1，3，2]噁唑硼烷制得)，混合物在-20℃下搅拌30分钟。使反应混合物缓慢(在～30分钟内)变暖至0℃，然后在0℃下搅拌2.5-3小时。TLC(硅胶，二氯甲烷中10％甲醇，UV显影)显示起始酮12(R_f＝0.4-0.5)完全消失。加入甲醇(4.5毫升)，使反应变暖至室温。将反应烧瓶配备短程蒸馏头，置于油浴中，并加热去除挥发性组分直至馏出物温度达到62℃。加入另外5毫升甲醇，烧瓶在～75℃的油浴中加热30分钟，约一半的甲醇通过蒸馏去除。将烧瓶冷却至室温，加入乙腈(5毫升)，混合物在减压下在旋转蒸发器上蒸发至干接着通过环境温度下的高真空得到黄色固体(粗产物16)，其通过TLC[硅胶，二氯甲烷中10％甲醇或含有少量氢氧化铵水溶液的二氯甲烷中10％甲醇，碘显影；在10％MeOH/CH₂Cl₂中R_f(12)＝0.35-0.4，R_f(主要组分)＝0.03-0.17；在含有NH₄OH的10％MeOH/CH₂Cl₂中R_f(12)＝0.47-0.53，R_f(主要组分)＝0.25-0.35]显示多个组分。

该材料(粗产物16)通过快速色谱在10克Silica Gel 60(230-400目)柱上用含有0.2％氢氧化铵水溶液的二氯甲烷中7％的甲醇洗脱并收集～10毫升级分而得以纯化。基于TLC(硅胶，二氯甲烷中10％甲醇，碘显影)合并级分并在减压下在旋转蒸发器上浓缩，从而得到195毫克作为泡沫状白色固体的(R)-叔丁基2-(2-(4-羟基-6-(甲基磺酰胺基)螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-1’-基)乙氧基)乙基氨基甲酸酯(16)(产率77％)。¹H NMR：与所需产物(16)一致。质谱：m/z＝500.1551(预期[M+H]⁺＝500.2425)

N-(1’-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-6-基)甲基磺酰胺二盐酸盐(17)

将(R)-叔丁基2-(2-(4-羟基-6-(甲基磺酰胺基)螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-1’-基)乙氧基)乙基氨基甲酸酯(16，193毫克，0.386毫摩尔)溶解于5毫升冰醋酸中。溶液在冷水浴中冷却，加入8滴浓盐酸。移去水浴，使反应变暖至室温。在3小时之后，TLC(硅胶，含有少量氢氧化铵水溶液的二氯甲烷中10％甲醇，碘显影)显示起始化合物16(R_f＝0.3-0.35)完全消失，并出现一个新化合物(17，R_f＝0.18-0.25)。反应混合物在减压下在旋转蒸发器上浓缩至干。加入甲苯，并在减压下在旋转蒸发器上蒸发至干。该甲苯添加和蒸发再重复两次，残余物在环境温度的高真空下干燥，从而得到粘稠黄色残余物。该材料用乙醚磨碎，得到210毫克作为浅黄色固体的N-(1’-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-6-基)甲基磺酰胺二盐酸盐(17)(产率120％)。质谱：m/z＝382.13[M+H]⁺

叔丁基2-(2-(4-(羟基亚氨基)-6-(甲基磺酰胺基)螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-1’-基)乙氧基)乙基氨基甲酸酯(18)

将无水吡啶(40微升，0.5毫摩尔)和羟胺盐酸盐(8毫克，0.11毫摩尔)加入叔丁基2-(2-(6-(甲基磺酰胺基)-4-氧基螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-1’-基)乙氧基)乙基氨基甲酸酯(12，50毫克，0.10毫摩尔)在5毫升无水甲醇中的溶液中。该溶液在室温下搅拌～1小时，然后在～60℃下搅拌～1小时。加入另外的羟胺盐酸盐(6.2毫克，0.09毫摩尔)和无水吡啶(40微升，0.5毫摩尔)，搅拌在60-65℃下持续～1小时。加入更多的羟胺盐酸盐(13.9毫克，0.20毫摩尔)，搅拌在60-65℃下持续～80分钟。加入羟胺盐酸盐(7毫克，0.10毫摩尔)，搅拌在60-65℃下持续～2小时。TLC(硅胶，二氯甲烷中10％甲醇，UV显影)显示起始酮12(R_f＝0.35-0.4)完全消失，以及一个新点(18，R_f＝0.18-0.27)。反应混合物在减压下在旋转蒸发器上浓缩至干。将残余物溶解于5毫升乙酸乙酯中，连续用10毫升0.5M盐酸水溶液、5毫升水和5毫升饱和氯化钠水溶液提取。TLC(如上)显示产物(18)在合并的含水提取物中，其通过加入氢氧化钠小球调节至pH～13，然后通过加入3M盐酸水溶液调节至pH～4。水溶液用三部分20毫升乙酸乙酯提取。合并的乙酸乙酯提取物用无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下在旋转蒸发器上蒸发至干接着通过高真空过夜得到50.3毫克叔丁基2-(2-(4-(羟基亚氨基)-6-(甲基磺酰胺基)螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-1’-基)乙氧基)乙基氨基甲酸酯(18)(产率98％)。

N-(1’-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-4-(羟基亚氨基)螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-6-基)甲基磺酰胺二盐酸盐(19)

将叔丁基2-(2-(4-(羟基亚氨基)-6-(甲基磺酰胺基)螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-1’-基)乙氧基)乙基氨基甲酸酯(18，50.3毫克，0.10毫摩尔)溶解于1毫升冰醋酸中。溶液在冷水浴中冷却，加入2滴浓盐酸。移去水浴，使溶液变暖至室温。在45分钟之后，TLC(硅胶，二氯甲烷中10％甲醇，UV显影)显示起始化合物(R_f(18)＝0.15-0.25)完全消失，并出现一个R_f＝0的新产物。加入甲苯(5毫升)，然后在减压下在旋转蒸发器上蒸发。该甲苯添加和蒸发再重复两次，残余物在高真空下干燥～1小时，从而得到39.2毫克N-(1’-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-4-(羟基亚氨基)螺[苯并二氢呋喃-2，4’-哌啶]-6-基)甲基磺酰胺二盐酸盐(19)(产率82％)。

表1：具有通式13、20和21的荧光示踪物

材料和方法

膜制剂

使用hERG-T-REx^TM 293细胞系(Invitrogen，Carlsbad，CA)制备用于测试荧光示踪物分子的亲合性的膜制剂。依照制造商推荐的方案在37℃下在5％CO₂大气中维持细胞，并通过加入1微克/毫升强力霉素(MP biomedicals，Solon，OH)诱导细胞表达hERG通道。接着24小时的诱导，细胞用二价离子自由PBS(Invitrogen)洗涤，采集，用Versene(Invitrogen)洗涤一次，然后在～500g下沉淀5分钟。将细胞团球保持在冰上，并用含有20mM HEPES(pH 7.4)、5mM KCl、1mM EDTA、1mM PMSF、0.01mM E-64和10微克/毫升亮抑酶肽的冰冷均质化缓冲液再悬浮。然后将细胞用Bio Polytron手持均质器(Brinkmann，Westbury，NY)均质化，在4℃下在40,000g下沉淀10分钟，然后丢弃上清液。将膜团球再悬浮于冰冷均质化缓冲液，然后均质化并再次离心。丢弃上清液，将膜团球再悬浮于含有20mM HEPES(pH 7.4)、5mM KCl、1mM MgCl₂和1mM EGTA的储存缓冲液。膜团球通过移液破碎，并超声直至获得均匀悬浮体。将所得膜制剂等分并在-80℃下储存。在试验优化过程中，均质化和储存缓冲液替换为含有25mM HEPES(pH 7.5)、15mMKCl、1mM MgCl₂和0.05％Pluronic F-127的实验确定的试验缓冲液。

放射配体结合试验

对于饱和结合试验，将hERG膜稀释至含有60mM KCl、71.5mM NaCl、1mMCaCl₂、2mM MgCl₂、0.1％BSA和10mM HEPES，pH 7.4的试验缓冲液中。接着，将80微升膜/缓冲液混合物加入含有5微升20X未标记阿司咪唑(以测定非特异性结合)或空孔(总结合)的96孔深孔试验板(Corning，Lowell.，MA)的每个孔中。将标记[³H]-阿司咪唑作为20微升的具有适当浓度的5X原料加入。平行测定测试的每个标记浓度的非特异性结合。所有试验使用一式三个孔进行，试验中膜蛋白质的最终浓度为20微克/孔。

为了测定测试化合物的IC₅₀值，将hERG膜稀释至试验缓冲液中，将膜/缓冲液混合物以80微升/孔加入含有5微升20X未标记阿司咪唑(非特异性结合)、5微升20X对照化合物或空孔(总结合)的96孔深孔试验板中。将[³H]-阿司咪唑作为20微升的5X原料加入。测试化合物通常在一式两个孔中使用八个浓度进行测试。试验中膜蛋白质的最终浓度为10微克/孔，且[³H]-阿司咪唑的最终浓度为1.5nM。

在温和涡流混合之后，试验板用封口膜覆盖，并在室温下培养两小时。反应通过经过GF/B Unifilters(PerkinElmer，Waltham，MA)过滤终止，其中GF/BUnifilters已在0.3％的聚乙烯亚胺溶液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中预浸泡两小时。然后过滤板用6-8体积的含有131.5mM NaCl、1mM CaCl₂、2mM MgCl₂、10mM HEPES和0.1％BSA的冷(4℃)洗涤缓冲液洗涤，然后在85℃的热块上干燥1-2小时。密封板的底部，将50微升Microscint 20(PerkinElmer)加入每个孔。板的顶部用TopSeal(PerkinElmer)密封，在最少2小时之后在TopCount闪烁记数器(PerkinElmer)上分析板。

膜片钳记录

将表达hERG的细胞覆盖在55毫米圆形盖玻片上，并使其粘附于培养箱中过夜。将盖玻片置于浴槽(bath chamber)中的显微镜载物台上并用PBS或等同物以1毫升/分钟灌注。在获得GΩ封接之后，使用全细胞记录模式记录电流(参见Hamill，O.P.；Marty，A.；Neher，E.；Sakmann，B.；Sigworth，F.J.，Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.Pflugers Arch 1981，391，(2)，85-100)。将细胞保持在-90毫伏下，电流在667赫兹下过滤，并使用EPC 10/2放大器(HEKA，Oberkochen，德国)在2.0千赫下取样。如下获得电压依赖性活化曲线：将指令电位变为-70毫伏50毫秒，然后将指令电位以10毫伏的增幅在2秒的持续时间内由-70毫伏变为+40毫伏，将指令电位返回至-70毫伏2秒，然后返回至-90毫伏的保持电位(每5秒)。

细胞工程

使用CMV促进剂驱动由编码hERG通道和CD8细胞表面标志的核苷酸序列组成的双顺反子元的转录以构建表达载体。两种蛋白质的转译由内部核糖体进入位点序列(IRES)连接。嘌呤霉素抗性标记包含于表达载体上以提供选择其中已发生表达盒的稳定的基因并入的细胞的方式。293细胞的培养在5％CO₂中在37℃下在由补充FBS(10％)，MEM-NEAA、HEPES和P/S的高葡萄糖D-MEM+丙酮酸钠(Na-pyruvate)+GlutaMAX^TM组成的293生长培养基中保持。在转染的前一天，将细胞以～80％融合覆盖在6孔皿(Corning)中。根据制造商的方案，使用Lipofectamine^TM LTX和Plus^TM试剂(Invitrogen)用质粒DNA转染细胞。第二天，采集细胞，扩增至T175烧瓶(Corning)中，通过将嘌呤霉素(Sigma)加入培养基至0.3微克/毫升的最终浓度而搁置细胞待选择。保持并分裂细胞待选择～3星期以产生hERG-CD8表达293细胞的稳定池。

免疫细胞化学和FACS

对于单细胞FACS，细胞用PBS洗涤并用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)采集，然后用至少相等体积的293生长培养基使胰蛋白酶-EDTA失活。对细胞进行计数，在1000xg下沉淀5分钟，以10x10⁶细胞/毫升的密度再悬浮于补充0.1％BSA的PBS中。依照制造商建议的方案，每2x10⁶细胞(200微升)加入10微升小鼠抗人(mouse anti-human)CD8 Alexa

488单克隆抗体(Invitrogen)，并在室温下培养30-60分钟。然后在将细胞再悬浮于2毫升PBS+0.1％BSA中并过滤以获得用于分类的～1x10⁶细胞/毫升的分散单细胞悬浮体之前，重复(3次)进行在1000xg下沉淀5分钟并在PBS+0.1％BSA中洗涤。然后，在使用488纳米激光线并用中心为530纳米的发射滤波片进行收集的FACSVantage(BD Biosciences，San Jose，CA)上操作细胞悬浮体。将来自染色群体的前10％的单细胞分离至96孔微板并扩增～3星期。

免疫细胞化学在96孔微板(Corning)中通过用PBS洗涤细胞，并在PBS中的4％多聚甲醛中固定10分钟而进行。细胞用在PBS中的0.25％TritonX-100渗透3分钟，用PBS洗涤三次，并用在PBS中的1％BSA阻滞30分钟。然后细胞用在PBS中的原代小鼠抗人(primary mouse anti-human)CD8单克隆抗体(2微克/毫升)在室温下染色60分钟。一级抗体用在PBS中的1％BSA洗涤三次，细胞用二级羊抗小鼠Alexa

488(1∶500)在室温下染色30分钟，然后用在PBS中的1％BSA洗涤三次，用PBS洗涤一次。然后在使用488纳米激发和520纳米发射(10纳米带宽)的Tecan Safire²板读取器(Tecan Instruments，Raleigh-Durham，NC)上测量免疫荧光。

荧光偏振试验

示踪物评估通过在存在或不存在10μM多非利特(Sequioa Research Products，Pangbourne，UK)下培养稀释的膜制剂和荧光示踪物而进行，从而评估hERG-特异性(和可置换)示踪物结合的程度。实验在各种缓冲液(数据未显示)中进行，最佳FP试验缓冲液组合物实验测定为由25mM HEPES(pH 7.5)、15mM KCl、1mM MgCl₂和0.05％Pluronic F-127组成。如下进行化合物置换试验：首先将具有或不具有测试化合物的10微升试验缓冲液分配至未处理的384孔聚苯乙烯试验板(Corning#3677)的孔中，然后加入10微升浓度两倍于最终试验浓度的膜制剂与示踪物的混合物。反应培养2至4小时，然后在使用适用于待评估示踪物的偏振激发和发射滤光片或单色器设置的Tecan InfiniTE F500或Tecan Safire²微板读取器上读取。用于FP试验的最佳条件通过在存在或不存在30μM E-4031(TocrisBioscience，Ellisville，MO)下随不同的荧光示踪物浓度滴定膜蛋白质基体而确定。然后将这些实验确定的总膜蛋白质和荧光示踪物浓度用于进行随已知的阻塞hERG通道的一系列稀释化合物的竞争试验。使用最终优化的示踪物(Predictor^TMhERG Tracer Red)，最终优化的试验条件在20微升最终试验体积中含有1nM示踪物和85微克/毫升膜蛋白质(膜制剂的B_max～450皮摩尔/毫克)。使用Tecan Safire2微板读取器在530纳米下激发试验孔，并在585纳米(20纳米带宽)处测量发射。在设计用于测量可被置换的非hERG特异性示踪物的含量的实验中，试验也含有30μM E-4031。

数据分析

数据使用

Office Excel 2003和用于Windows的Prism 4(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)进行分析。

高亲合性荧光示踪物的确认

合成一系列候选示踪物以制备对bERG K⁺通道亲合性不同的化合物。化合物变化通过结合多种化学构架与各种功能成分、连接体和荧光团实现(参见Singleton，D.H.；Boyd，H.；Steidl-Nichols，J.V.；Deacon，M.；Groot，M.J.；Price，D.；Nettleton，D.O.；Wallace，N.K.；Troutman，M.D.；Williams，C.；Boyd，J.G.，Fluorescently Labeled Analogues of Dofetilide as High-Affinity Fluorescence Polarization Ligands for the Human Ether-a-go-go-Related Gene(hERG)Channel.J Med Chem 2007，50，(13)，2931-2941)。示踪物亲合性最初使用放射配体置换试验进行评估以测量示踪物对hERG K⁺通道的亲合性。测得这些化合物的子集以高亲合性结合hERG K⁺通道，该发现表明其中之一可证明用作试验发展的荧光示踪物分子(图1)。

具有高比活的膜制剂的制备

使用源自hERG-T-REx^TM 293细胞系的膜制剂检测显示于图1中的最高亲合性示踪物在FP试验中的表现。来自该细胞系的膜制剂具有大约7皮摩尔hERG蛋白质/毫克总蛋白质的比活(B_max值)。在存在或不存在已知的hERG通道阻滞剂(如E-4031或多非利特)以及任何候选示踪物下，甚至当在试验中使用高如6001毫克/毫升的总膜浓度时，初始FP实验未能得到可测量的偏振值的差异。这些结果并不令人惊讶，因为有效的FP试验需要高亲合性示踪物以及在不存在置换化合物下足以理想地结合至少～50％或更多示踪物的蛋白质浓度(参见Huang，X.，Fluoresence polarization competition assay：the range of resolvable inhibitor potency is limited by the affinity of the fluorescent ligand.J Biomol Screen 2003，8，(1)，34-8)。为了最小化与膜或其他膜蛋白质的非特异性相互作用，感兴趣的蛋白质的高比含量也是合意的。因此，我们通过生成293细胞的稳定池以寻求增加hERG通道膜制剂的B_max，所述293细胞的稳定池通过使用将hERG通道的表达经由IRES元连接至CD8受体的双顺反子载体产生。在这种细胞中，预期高水平的CD8标志与高水平的hERG通道相关。高表达细胞通过FACS分离，将来自CD8+群体的前10％的细胞(图2，幅A)分类并作为单细胞分离至96孔板中。扩增单细胞克隆，然后染色以确认具有最高CD8表达水平的单克隆(图2，幅B)。在如此检测的～192个克隆中，分离六个用于进一步的研究并通过膜片钳记录检测以确定在质膜(plasma membrane)上的功能hERG通道表达的程度(图2，幅C)。为了确保真正的克隆群体并确保含hERG通道的膜的最好细胞底物，将这些克隆之一(克隆D)扩增，然后经受第二轮的FACS分离、克隆扩增和免疫细胞化学染色。制得来自最高表达克隆的膜蛋白质并通过放射配体结合表征，其中测得＞450皮摩尔/毫克的B_max(图2，幅D)。相比于源自hERG-T-REx^TM 293细胞系的膜制剂，这是＞50倍的增加。

荧光偏振试验优化

使用最初在放射配体置换试验中确认的六个候选高亲合性示踪物，通过用增加浓度的膜制剂滴定固定含量的每个示踪物(1nM)评估来自hERG-CD8293细胞系的膜制剂在FP试验中的使用。试验在存在或不存在10μM多非利特下进行以区别非特异性结合和特异性结合。在抽出(elicit)～70％结合的示踪物所需的膜浓度下，在六个候选示踪物中仅有一个(IM-0107)提供了＞100mP的特异性和非特异性结合之间的试验窗口。尽管使用该示踪物可能进行进一步的试验优化，但所用的荧光团的激发和发射光谱类似于Texas Red，其落入普通“红”(TAMRA型)或“远红”(Cy5型)荧光团之间。因此，在板读取器(Tecan InfiniTE F-500)中需要非标准滤光片和定制(custom)双色镜以获得最佳性能。为了使试验易于在多种可商购的板读取器上进行，基于初始评估的结果进行另一轮的重复示踪物合成。在该第二轮的合成中，通过使用FP试验而不是更麻烦的放射配体置换试验表征示踪物性能而促进示踪物评估。

该第二轮的合成导致Predictor^TM hERG Tracer Red的确认，其为具有TAMRA型激发和发射光谱的示踪物，且在示踪物的75％特异性结合所需的膜浓度下其在结合和被置换的示踪物之间具有大的偏振移动，显示出对hERG-CD8膜的强的特异性结合(85微克/毫升总蛋白质，图3)。对于所有评估的示踪物，观察到相当大的示踪物的非特异性结合，这通过在饱和E-4031存在下mP值的膜依赖增加看出。由于来自膜的散射光，该偏振信号不是假象，因为当使用Satire²板读取器时对于所有测量的平行和垂直发射通道中，在膜的存在下来自示踪物的特定信号是单独的膜的信号的＞40倍。

使用1nM Predictor^TM hERG Tracer Redand 85微克(总蛋白质)/毫升CD8_hERG膜的初始示踪物置换试验通过使用两种良好表征的hERG结合配体，阿司咪唑和E-4031进行，所述两种配体分别显示以在低的单数至低的双数nM范围内的K_i值结合hERG(参见Finlayson，K.；Turnbull，L.；January，C.T.；Sharkey，J.；Kelly，J.S.，[3H]dofetilide binding to HERG transfected membranes：a potential high throughput preclinical screen.Eur J Pharmacol 2001，430，(1)，147-8；Chiu，P.J.；Marcoe，K.F.；Bounds，S.E.；Lin，C.H.；Feng，J.J.；Lin，A.；Cheng，F.C.；Crumb，W.J.；Mitchell，R.，Validation of a[3H]astemizole binding assay in HEK293 cellsexpressing HERG K+channels.J Pharmacol Sci 2004，95，(3)，311-9；和Finlayson，K.；Pennington，A.J.；Kelly，J.S.，[3H]dofetilide binding in SHSY5Y and HEK293cells expressing a HERG-like K+channel？Eur J Pharmacol 2001，412，(3)，203-12)。用E-4031置换产生与单-位点竞争模型一致的数据以及11nM的IC₅₀值(图4)。然而，通过阿司咪唑置换产生似乎与双-位点结合模型一致的数据，其中示踪物仅在高浓度(＞1μM)的阿司咪唑的存在下结合至被置换的第二位点。当使用缺少过度表达的hERG K⁺通道的来自亲本293细胞的对照膜重复实验时，也见到这种相同的低亲合性置换，表明膜中的非hERG组分，或膜本身会结合示踪物，且该相互作用可由特定的化合物置换。为了校正该非hERG结合组分，在存在或不存在30μM E-4031下重复通过阿司咪唑的示踪物置换，预计E-4031会竞争示踪物的所有hERG特异性结合。当数据通过去除置换曲线(图4，幅B)的非hERG组分进行校正时，获得2.7nM的IC₅₀值。作为在存在或不存在E-4031下进行的阿司咪唑置换试验的更简单的另一选择，可舍弃提供比在良好含有饱和E-4031的对照物中观察到的更小的偏振值的置换数据，然后将阿司咪唑数据拟合至具有最小mP值(其固定为在良好含有饱和E-4031的对照物中观察到mP值)的曲线。

然后随一系列文献中报导的具有广泛亲合性的已知阻塞hERG K⁺通道的化合物(具有nM至μM K_i或IC₅₀值)对使用Predictor^TM hERG Tracer Red的FP试验进行验证(图5)。如同阿司咪唑，几种化合物能够在高化合物浓度下置换示踪物的非hERG结合组分，但这容易校正，校正的IC₅₀值和文献中已报导的值之间存在极好的相关性(表2)。然后我们在加入所有试验组分之后在不同的时间点评估信号稳定性(IC₅₀值)和试验有效性(测定Z’值；参见Zhang，J.H.；Chung，T.D.；Oldenberg，K.R.，A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.J Biomol Screen 1999，4，67-73)。如图6和表3所示，试验报告在30分钟和6小时之间IC₅₀值变化小于25％，然后在24小时内略微增加(大约2倍)。尽管总偏振移动在该实验过程中持续增加，在检测的所有时间点Z’值极好(≥0.87)。而且，当在增加浓度的DMSO、乙醇或甲醇的存在下(以测定试验对常用于化合物储存的溶剂的耐受性)重复试验时，在高至10％溶剂下观察到对Z’或E-4031 IC₅₀值的可忽略的影响(图6，幅B)。在分开的实验中，观察到试验提供与使用聚丙烯板(Matrical MP101-1-PP)类似质量的数据，但当使用NBS涂布的聚苯乙烯板(Corning 3676)时性能略微折衷。

表2：由膜片钳或放射配体置换试验报导的以及本文所述的FP试验中的IC₅₀值(以nM计)的比较。

放射配体置换或膜片钳试验的文献值可见于Diaz，G.J.；Daniell，K.；Leitza，S.T.；Martin，R.L.；Su，Z.；McDermott，J.S.；Cox，B.F.；Gintant，G.A.，The[3H]dofetilide binding assay is a predictive screening tool for hERG blockade andproarrhythmia：Comparison of intact cell and membrane preparations and effects of altering[K+]o.J Pharmacol Toxicol Methods 2004，50，(3)，187-99；Deacon，M.；Singleton，D.；Szalkai，N.；Pasieczny，R.；Peacock，C；Price，D.；Boyd，J.；Boyd，H.；Steidl-Nichols，J.V.；Williams，C.，Early evaluation of compound QT prolongation effects：a predictive 384-well fluorescence polarization binding assay for measuring hERG blockade.J Pharmacol Toxicol Methods 2007，55，(3)，238-47；和Wible，B.A.；Hawryluk，P.；Ficker，E.；Kuryshev，Y.A.；Kirsch，G.；Brown，A.M.，HERG-Lite：a novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk.JPharmacol Toxicol Methods 2005，52，(1)，136-145。

表3：随时间变化的本文所述的FP试验的试验信号稳定性和有效性。

IC₅₀值为对于E-4031；Z’值由含有DMSO(对照)或30μM E-4031的28个重复孔计算得到。

使用阿司咪唑置换示踪物的FP试验结果表明了在由本文所述的高表达hERG细胞系制得的膜中和非转染的293细胞中第二较低亲合性的结合位点的存在。多非利特(参见Finlayson，K.；Turnbull，L.；January，C.T.；Sharkey，J.；Kelly，J.S.，[3H]dofetilide binding to HERG transfected membranes：a potential high throughput preclinical screen.Eur JPharmacol 2001，430，(1)，147-8)或阿司咪唑(参见Chiu，P.J.；Marcoe，K.F.；Bounds，S.E.；Lin，C.H.；Feng，J.J.；Lin，A.；Cheng，F.C.；Crumb，W.J.；Mitchell，R.，Validation of a[3H]astemizole binding assay in HEK293 cellsexpressing HERG K+channels.J Pharmacol Sci 2004，95，(3)，311-9)的第二较低亲合性的结合位点已在放射配体结合研究中在先确认。这些位点在放射配体研究中未表征，但不妨碍测试化合物的hERG亲合性的正确测定。对于本发明的hERG K⁺通道，本文描述了校正得自测试化合物的数据的两种直接的程序，所述测试混合物显示出超过在30μM E-4031存在下所观察到的明显阻滞。

尽管常常认为任何hERG体外试验的可预测性的终极测量与动物模型中的Q-T间期的延长相关(参见Lynch，J.J.，Jr.；Wallace，A.A.；Stupienski，R.F.，3rd；Baskin，E.P.；Beare，C.M.；Appleby，S.D.；Salata，J.J.；Jurkiewicz，N.K.；Sanguinetti，M.C.；Stein，R.B.；等等，Cardiac electrophysiologic and antiarrhythmic actions of two long-acting spirobenzopyran piperidine class III agents，L-702,958和L-706,000[MK-499].J Pharmacol Exp Ther 1994，269，(2)，541-54；和Gintant，G.A.；Su，Z.；Martin，R.L.；Cox，B.F.，Utility of hERG assays as surrogate markers of delayed cardiac repolarization and QT safety.Toxicol Pathol 2006，34，(1)，81-90)，本文所述的hERG K⁺通道试验获得了次终极结果，即与具有经证明的阻滞hERG电流的能力的化合物的膜片钳IC₅₀值的文献数据极好相关。试验与文献膜片钳IC₅₀值一致，并在整个膜片钳数据集具有不超过3倍的差异，且当FP结果与膜片钳和放射配体结合数据比较时，FP数据落入这些技术报导的范围之内。试验是完全均质的，使用红移示踪物以减少化合物干涉的问题，并在至少24小时的试验读取窗口内具有＞0.8的Z’值。尽管我们观察到一些化合物比标准物E-4031产生更大的FP信号的位移，该信号并非是hERG依赖的，并在IC₅₀检测(profiling)过程中易于确认和校正。总之，这些特征使得该试验良好适用于常规的甚至自动化的化合物检测。

每个如上引用的文献，以及美国专利No.5,206,240和本文公开的所有合成方法以引用方式并入本文，如同本文已完全说明一样。

Claims (50)

1.一种具有如下结构式的荧光示踪化合物：

或其药物可接受的盐，其中：

Ar为选自苯并、噻吩并、呋或吡啶并的芳香环；

R¹和R²独立地选自：

1)氢，

2)C_1-6烷基，其为未取代的或由如下基团取代的：

a)-NR⁴R⁵，其中R⁴和R⁵独立地为氢或C_1-6烷基，

b)-N(R⁵)COC_1-6烷基，

c)-NHSO₂(C_1-6烷基)，

d)-CONR⁶R⁷，其中R⁶和R⁷独立地为：

i)氢，

ii)C_1-6烷基，或

iii)R⁶和R⁷以及与它们连接的氮原子一起表示5元或6元饱和杂环，所述杂环可含有选自N、S(O)_n或O的另外的杂原子，其中N、S(O)_n或O选自吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪或N-甲基哌嗪，

e)-CO(C_1-6烷基)，

f)-OH，

g)-O(C_1-6烷基)，

h)-O(C_1-6烷基)-O-(C_1-3烷基)，

i)-S(O)_n(C_1-6烷基)，

j)咪唑，

k)2-咪唑烷酮，

l)2-吡咯烷酮，

m)-NH-C(NHR⁵)＝N-CN，或

n)-NH-C(SR⁵)＝N-CN，

3)-OH，

4)C_1-3烷氧基，其为未取代的或由C_1-3烷氧基取代的，

5)-N(R⁵)SO₂(C_1-6烷基)，

6)-N(R⁵)SO₂(CH₂)_gCO₂H，其中g为1-5，

7)-N(R⁵)SO₂(CH₂)_gCO₂C_1-6烷基，

8)-NO₂，

9)-N(R⁵)COC_1-6烷基，

10)-N(R⁵)SO₂-C₆H₄-R⁴，

11)-N(R⁵)CO-C₆H₄-R⁴，

12)-NR⁴R⁵，

13)卤素，

14)-CO-C_1-6烷基，

15)-CONR⁶R⁷，

16)-CN，

17)-CO₂R⁵，

18)-C(R⁵)＝N-OR⁸，

19)苯甲酰基，其为未取代的或由C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素或羟基取代的，

20)-N(R⁵)COO(C_1-6烷基)，

21)-N(R⁵)COO-苯基，其为未取代的或由C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、羟基或卤素取代的，

22)-N(R⁵)CONR⁴R⁵，

23)-S(O)_nC_1-6烷基，

24)-S(O)_n-C₆H₄-R⁴，

25)-CF₃，

26)苯基，其为未取代的或由C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、卤素或羟基取代的，

27)咪唑基，

28)-SO₂NR⁶R⁷，

29)-N[S(O)₂C_1-6烷基][(CH₂)_pCN]，其中p为2-5，

30)-N(R⁵)-C(NR⁴R⁵)＝N-CN，或

31)-N(R⁵)-C(SR⁵)＝N-CN；

包含W、X和Y的环体系为5元、6元或7元环体系，其中W、X和Y独立地为-O-、C＝O、-(CR⁴R⁵)_n-、C＝NOR⁸、CHOR⁹、-NR⁹-、CHNR¹⁰R¹¹、-S(O)_n-、＝CH-、＝N-或键；其中：

R⁴和R⁵如上所定义，

R⁸为

a)氢，或

b)C_1-6烷基，其为未取代的或由-COOR⁵取代的；

R⁹为

a)氢，

b)C_1-6烷基，

c)(CH₂)_n-C₆H₄-R¹²，其中R¹²为

i)-NO₂，

ii)C_1-3烷基，

iii)-O-C_1-3烷基，

iv)卤素，

v)-CF₃，或

vi)氢，

d)-CO-C_1-6烷基，

e)-CO-C₆H₄-R¹²，

f)-COO-C_1-6烷基，或

g)-CONR⁴R⁵；

R¹⁰和R¹¹独立地为

a)氢，

b)C_1-6烷基，其为未取代的或由-(CR⁴R⁵)_n-(CR⁴R⁵)_g-R¹³取代的，其中g为1-5，且R¹³为

i)氢，

ii)-OH，或

iii)-OC_1-6烷基，

c)-CO-C_1-6烷基，其为未取代的或由如下基团取代的：

i)-OH，

ii)-N(R⁴R⁵)，

iii)-OC_1-6烷基，或

iv)-CO₂R⁵，

d)-CO-C₆H₄-R¹³，或

e)R¹⁰和R¹¹以及与它们连接的氮原子一起表示未取代的或由氧或羟基取代的5元或6元饱和杂环，所述杂环可含有选自N、S(O)_n或O的另外的杂原子，其中N、S(O)_n或O选自吡咯烷、吗啉、哌啶、吡咯烷酮、哌啶酮、哌嗪或N-甲基哌嗪；

n为0、1或2；

B为5元至7元含N环；

L为-(CR⁴R⁵)_m-Q-(CR⁴R⁵)_q-NH-[CZ-(CR⁴R⁵)_u-(D)_w]_z-，其中

R⁴和R⁵如上所定义，

m和q独立地为1至约5，

u为0至约7，

w为0或1，

z为1或2，

Q为键、-O-、C＝O、CHOH、-NR⁵-或-S(O)_n-，

Z为＝O或＝S，且

D为-O-、-S(O)_n-、-NR⁵-，或-NR⁵SO₂-；以及

R³为荧光染料。

2.一种用于筛选测试化合物的试验，其中所述试验为使用结合至hERG K⁺通道或其片段的源的如权利要求1所述的荧光示踪物或其药物可接受的盐的结合试验。

3.根据权利要求2所述的试验，其中筛选测试化合物提供了该测试化合物延长人类心电图的Q-T间期并由此引起人类受试者的心脏中毒或心律失常的倾向的指示。

4.根据权利要求2所述的试验，其包括如下步骤：

a)在存在或不存在不同含量的测试化合物或测试化合物的混合物下在试验缓冲液中培养荧光示踪物或其盐以及hERG K⁺通道或其片段的源；以及

b)测量测试化合物或测试化合物的混合物对结合至hERG K⁺通道或其片段的荧光示踪物的含量的影响。

5.根据权利要求4所述的试验，其中所述试验缓冲液为含有KCl、MgCl₂和PLURONIC F-127的HEPES基缓冲液。

6.根据权利要求5所述的试验，其中所述试验缓冲液包含15mM至50mM的HEPES、5mM至20mM的KCl、0.5mM至2mM的MgCl₂，和0.02％至约0.1％的PLURONIC F-127。

7.根据权利要求6所述的试验，其中所述试验缓冲液包含25mM的HEPES、15mM的KCl、1mM的MgCl₂，和0.05％的PLURONIC F-127。

8.根据权利要求7所述的试验，其中所述试验缓冲液在室温下的pH为pH 7.2至pH 7.6。

9.根据权利要求8所述的试验，其中所述试验缓冲液为pH 7.4。

10.根据权利要求9所述的试验，其中测试化合物或测试化合物的混合物的影响通过荧光偏振测得。

11.根据权利要求4所述的试验，其中步骤b)包括如下步骤：

i)测定每个样品的特定结合的荧光示踪物；和

ii)计算由测试化合物或测试化合物的混合物所抑制的荧光示踪物结合。

12.根据权利要求2所述的试验，其中hERG K⁺通道或其片段的源选自：

i)源自细胞的膜制剂，在所述细胞表面上表达hERG K⁺通道或其片段；

ii)细胞，在所述细胞表面上表达hERG K⁺通道或其片段；或

iii)源自组织的膜制剂，在所述组织表面上表达hERG K⁺通道或其片段。

13.根据权利要求12所述的试验，其中hERG K⁺通道或其片段的源为源自细胞的膜制剂，在所述细胞表面上表达hERG K⁺通道或其片段。

14.根据权利要求13所述的试验，其中细胞表达至少约100皮摩尔/毫克总膜蛋白质的hERG K⁺通道。

15.根据权利要求13所述的试验，其中细胞表达hERG电流为约1500pA至约2500pA的hERG K⁺通道，所述hERG电流通过使用完全自动化的高通量膜片钳体系的膜片钳技术测定。

16.根据权利要求13所述的试验，其中所述细胞为HEK 293细胞或CHO细胞。

17.根据权利要求13所述的试验，其中所述细胞用选自如下的表达载体转染：

i)包含编码hERG K⁺通道的核苷酸序列的分离并纯化的核酸，所述hERG K⁺通道具有与SEQ ID NO：1或其片段至少80％同源的氨基酸序列；或

ii)包含编码hERG K⁺通道的核苷酸序列的分离并纯化的核酸，所述hERG K⁺通道具有SEQ ID NO：1或其片段的氨基酸序列。

18.根据权利要求17所述的试验，其中所述核酸进一步包含编码内部核糖体进入位点蛋白质的核苷酸序列和编码CD-8细胞质膜蛋白质的核苷酸序列。

19.根据权利要求18所述的试验，其中编码内部核糖体进入位点蛋白质和CD-8细胞质膜蛋白质的核苷酸序列连续位于编码hERG K⁺通道的核苷酸序列的下游。

20.根据权利要求19所述的试验，其中hERG K⁺通道的表达通过编码内部核糖体进入位点蛋白质的核苷酸序列而连接至CD-8细胞质膜蛋白质的表达。

21.一种表征测试化合物作为hERG K⁺通道阻滞剂的活度的方法，所述方法包括如下步骤：

a)在权利要求1的荧光示踪物或其药物可接受的盐的存在下，在试验缓冲液中将测试化合物与含有hERG K⁺通道的膜制剂接触，所述hERG K⁺通道具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列，所述膜制剂源自用包含编码hERG K⁺通道的核苷酸序列的核酸表达载体转染的细胞；

b)监测测试化合物是否影响荧光体示踪物与含有hERG K⁺通道的膜制剂的结合；以及

c)测定测试化合物的hERG K⁺通道阻滞剂活度。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞为HEK 293细胞或CHO细胞。

23.根据权利要求21所述的方法，其中细胞表达至少约100皮摩尔/毫克总膜蛋白质的hERG K⁺通道。

24.根据权利要求21所述的方法，其中细胞表达hERG电流为约1500pA至约2500pA的hERG K⁺通道，所述hERG电流通过使用完全自动化的高通量膜片钳体系的膜片钳技术测定。

25.根据权利要求21所述的方法，其中所述核酸表达载体进一步包含编码内部核糖体进入位点蛋白质的核苷酸序列和编码CD-8细胞质膜蛋白质的核苷酸序列。

26.根据权利要求25所述的方法，其中编码内部核糖体进入位点蛋白质和CD-8细胞质膜蛋白质的核苷酸序列连续位于编码hERG K⁺通道的核苷酸序列的下游。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述核酸表达载体具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

28.根据权利要求26所述的方法，其中hERG K⁺通道的表达通过编码内部核糖体进入位点蛋白质的核苷酸序列而连接至CD-8细胞质膜蛋白质的表达。

29.根据权利要求21所述的方法，其中所述试验缓冲液包含25mM的HEPES、15mM的KCl、1mM的MgCl₂，和0.05％的PLURONIC F-127。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述试验缓冲液在室温下的pH为pH 7.2至pH 7.6。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述试验缓冲液为pH 7.4。

32.根据权利要求31所述的方法，其中监测测试化合物是否影响荧光体示踪物与含有hERG K⁺通道的膜制剂的结合通过荧光偏振进行测量。

33.一种用于筛选测试化合物的试剂盒，所述试剂盒包含：

a)权利要求1所述的荧光示踪物或其药物可接受的盐；

b)hERG K⁺通道或其片段的源；和

c)试验缓冲液。

34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述hERG K⁺通道或其片段的源为源自细胞的膜制剂，在所述细胞表面上表达hERG K⁺通道或其片段。

35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中细胞表达至少约100皮摩尔/毫克总膜蛋白质的hERG K⁺通道。

36.根据权利要求34所述的试剂盒，其中细胞表达hERG电流为约1500pA至约2500pA的hERG K⁺通道，所述hERG电流通过使用完全自动化的高通量膜片钳体系的膜片钳技术测定。

37.根据杁利要求34所述的试剂盒，其中所述细胞为HEK 293细胞或CHO细胞。

38.根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述细胞用具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的表达载体转染。

39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中hERG K⁺通道的表达通过编码内部核糖体进入位点蛋白质的核苷酸序列而连接至CD-8细胞质膜蛋白质的表达。

40.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述试验缓冲液包含25mM的HEPES、15mM的KCl、1mM的MgCl₂，和0.05％的PLURONIC F-127。

41.根据权利要求40所述的试剂盒，其中所述试验缓冲液在室温下的pH为pH 7.2至pH 7.6。

42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中所述试验缓冲液为pH 7.4。

43.一种hERG K⁺通道表达细胞群，其中所述细胞群表达至少约100皮摩尔/毫克总膜蛋白质的hERG K⁺通道。

44.根据权利要求43所述的hERG K⁺通道表达细胞群，其中所述细胞表达hERG电流为约1500pA至约2500pA的hERG K⁺通道，所述hERG电流通过使用完全自动化的高通量膜片钳体系的膜片钳技术测定。

45.根据权利要求43所述的hERG K⁺通道表达细胞群，其中所述细胞为HEK 293细胞或CHO细胞。

46.根据权利要求43所述的hERG K⁺通道表达细胞群，其中所述细胞用选自如下的表达载体转染：

i)包含编码hERG K⁺通道的核苷酸序列的分离并纯化的核酸，所述hERG K⁺通道具有与SEQ ID NO：1或其片段至少80％同源的氨基酸序列；或

ii)包含编码hERG K⁺通道的核苷酸序列的分离并纯化的核酸，所述hERG K⁺通道具有SEQ ID NO：1或其片段的氨基酸序列。

47.根据权利要求46所述的hERG K⁺通道表达细胞群，其中所述核酸进一步包含编码内部核糖体进入位点蛋白质的核苷酸序列和编码CD-8细胞质膜蛋白质的核苷酸序列。

48.根据权利要求47所述的hERG K⁺通道表达细胞群，其中编码内部核糖体进入位点蛋白质和CD-8细胞质膜蛋白质的核苷酸序列连续位于编码hERG K⁺通道的核苷酸序列的下游。

49.根据权利要求48所述的hERG K⁺通道表达细胞群，其中hERG K⁺通道的表达通过编码内部核糖体进入位点蛋白质的核苷酸序列而连接至CD-8细胞质膜蛋白质的表达。

50.一种制备具有结构式(I)的荧光示踪化合物的方法，

所述方法包括：

a)在室温下在二甲基甲酰胺/二异丙基乙胺中，使具有如下结构式(II)的化合物

与具有如下结构式(III)的化合物反应，

[R¹⁴O]_k-[CZ-(CR⁴R⁵)_u-(D)_w]_z-R³

(III)

其中：

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、Ar、B、D、L、Q、W、X、Y、Z、m、q、u、w和z如权利要求1所定义；

k为0或1；且

R¹⁴为活性酯的组分；

前提是若Z为＝O，则k为1，以及

前提是若Z为＝S，则k为0，u为0，w为1，z为1，且D为＝N。

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