CN102007217A - 生物活性基元的酶促共轭 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物活性基元与聚合物或可聚合化合物的选择性共轭的方法。所述方法更明确地涉及生物活性基元与悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基的选择性共轭，其中所述悬挂式基团是聚合物或可聚合化合物的一部分，其中所述方法包括使所述聚合物或可聚合化合物与水解酶接触，以催化生物活性基元和悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基之间的共轭。生物活性基元的共轭可在可聚合化合物的聚合作用之前、期间或之后发生。生物活性基元的共轭也可以在聚合物成形之后发生。

Description

生物活性基元的酶促共轭
本发明涉及生物活性基元与聚合物或可聚合化合物选择性共轭的方法。
与生物活性基元共轭的聚合物或可聚合化合物(如单体、大分子单体或预聚物)在生物药物应用中具有广泛用途。例如，生物活性基元可以通过官能团(例如羧酸)共轭，所述官能团是聚合物或可聚合化合物的一部分。然而，在共轭产物制备的一些阶段中期望或甚至需要保护羧酸基团，从而允许特定的加工步骤有效地发生和/或避免游离(即未受保护的)羧酸基团的存在引起的不想要的副反应。通常，羧酸通过用烃酯化来保护。
在能够使生物活性基元与受保护的羧酸化学共轭之前，需要去保护步骤。然而，这类去保护可能是麻烦的，尤其是当聚合物或可聚合化合物在除受保护的羧酸基团以外还包含一种或多种其它可水解基团如其它酯基或硫酯基时。
可水解基团如酯或硫酯基通常由水性环境中的酸或碱水解。然而，已知这类水解不是选择性的。在一些情况下需要选择性水解，尤其是例如当聚合物或可聚合化合物包含一种或多种其它可水解基团(例如多酯基)时。已知例如可以在无水有机溶剂中，在使用例如三氟乙酸(TFA)的化学方法中优先实现叔丁基酯相对于其它酯或硫酯基的选择性水解。然而，该方法具有若干缺点。对于酯的有效去保护而言，通常需要使用大幅过量的TFA(＞10当量)。高度酸性的条件使得这种去保护形式不适用于在强酸性条件下不稳定的化合物。所述反应在无水溶剂中进行，因为在TFA-介导的去保护期间，痕量水通常会足以引起分子中其它可水解基团、尤其是其它酯或硫酯功能的广泛水解。TFA的完全去除或几乎完全去除是费力(和昂贵)的，但是极其重要，尤其是在官能团(例如为生物活性基元一部分的官能团)要与羧酸偶合时，因为偶合步骤中TFA的存在对于偶合反应可以是有害的。
在生物活性基元与聚合物或可聚合化合物的化学共轭的情况下，生物活性基元的反应性基团应当至少部分被保护，从而避免与化学共轭剂的副反应。
此外，化学共轭剂是昂贵、不可循环和环境不友好的。
此外，受保护的生物活性基元的使用还在共轭反应后需要一个或多个其它的去保护步骤，这可能是一种挑战。
本发明的一个目的是克服上述一种或多种缺点。
本发明的另一个目的是提供使生物活性基元与聚合物或可聚合化合物有效共轭的方法。
本发明的又一个目的是提供一种上述方法，其中不需要对存在于聚合物或可聚合化合物中的羧酸基团进行去保护的步骤。
本发明的又一个目的是提供一种上述方法，所述方法在共轭过程中不需要昂贵的偶合试剂或多个步骤。
本发明的另一个目的是提供一种上述方法，其中生物活性基元在共轭之前在其反应性官能团上需要更少保护基或不需要保护基。
目前发现：可使生物活性基元与聚合物或可聚合化合物选择性地共轭。
因此，本发明涉及使生物活性基元与悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基选择性共轭的方法，其中所述悬挂式基团是聚合物或可聚合化合物的一部分，其中所述方法包括使聚合物或可聚合化合物与水解酶接触，以催化生物活性基元和悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基之间的共轭。
惊讶地发现，可能以相对于聚合物或可聚合化合物主链中可能存在的一种或多种其它基团(例如其它酯基、硫酯基、氨基甲酸酯基或脲基)而言高度的选择性，使生物活性基元与聚合物或可聚合化合物中存在的悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基共轭。
本发明方法的一个优点是根据本发明的酶促方法与化学共轭方法相比是环境友好的。
另一个优点是可以通过催化量的廉价和可再循环的酶，使生物活性基元与立体大聚合物或可聚合化合物选择性地共轭。
又一个优点是在共轭之前生物活性基元的反应性官能团仅需被部分保护或不需保护。
又一个优点是可以使生物活性基元选择性地共轭，使羧酸基团保护以及去保护，其中在保护的情况下不需要去保护步骤，例如在酯或硫酯基的情况下。
在聚合物或可聚合化合物具有任选的与生物活性基元结合的活性中心时，在共轭反应期间聚合物或可聚合化合物不发生外消旋化或发生更少外消旋化是又一优点。
在本文中使用时，术语“聚合物”表示基本包含下述单元的多个重复的结构，所述单元事实上或概念上衍生自低相对分子量的分子。这类聚合物可包括交联的网络、树状聚体和超分枝聚合物以及线性聚合物。低聚物被认为是聚合物的一类，即具有相对低数量下述单元重复的聚合物，所述单元事实上或概念上衍生自低相对分子量的分子。
聚合物可具有200Da或更高、400Da或更高、800Da或更高、1000Da或更高、2000Da或更高、4000Da或更高、8000Da或更高、10 000Da或更高、100 000Da或更高或1 000 000Da或更高的分子量。具有相对低质量(8000Da或更低，尤其是4000Da或更低，更尤其是1000Da或更低)的聚合物可以被称作低聚物。
悬挂式羧酸、酯或硫酯表示不位于聚合物主链中或者在随后的聚合步骤中不会位于得到的聚合物主链中的羧酸、酯或硫酯。
尤其令人惊讶的是本发明允许生物活性基元与下述化合物中悬挂式空间难以接近的羧酸基、酯基或硫酯基团的选择性共轭，所述化合物例如为聚合物或低聚物或大的可聚合化合物，例如为包含多于一个可聚合基元的化合物。
本发明尤其涉及下述方法，其中悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基是聚合物或可聚合化合物的一部分，所述聚合物或可聚合化合物包含(a)至少两个可聚合基元，和(b)至少一个氨基酸残基。
根据本发明的方法尤其适用于使生物活性基元与下述聚合物或可聚合化合物的悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基选择性共轭，所述聚合物或可聚合化合物包含(a)至少两个可聚合基元，和(b)包含至少两个氨基的氨基酸的至少一个氨基酸残基，所述至少两个氨基已形成脲基、硫脲基、氨基甲酸酯基或硫代氨基甲酸酯基。
因此本发明允许下述聚合物或可聚合化合物中悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基的选择性共轭，所述聚合物或可聚合化合物可得自商业上容易获得或容易合成的初始化合物。例如，可以从下述二氨基酸制备氨基甲酸酯，所述二氨基酸的羧酸功能被伯烷基酯如甲酯(例如L-赖氨酸甲酯)保护。
另外，能够实现与生物活性基元的高度选择性共轭而不需要化学计量的昂贵并且环境不友好的偶合剂是有利的。
聚合物或可聚合化合物除了悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基以外，还可包含选自脲基、硫脲基、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基、其它酯基、酰胺基、糖肽基、碳酸酯基、砜或碳水化合物基的基元。
根据本发明的方法更尤其适用于使生物活性基元与式I表示的聚合物或可聚合化合物选择性地共轭，其中：
Figure BPA00001235461800041
式I
-G是具有至少n个官能团的多功能化合物的残基或基元X。
-X表示包含可聚合基团的基元。
-当G＝X时，式I表示可聚合的化合物。
-当G与X不同时，式I表示聚合物或低聚物。
-每个Y独立地表示O、S或NR；
-每个W独立地表示O或S；
-Q表示O或S；
-每个R独立地表示氢或选自任选地含有一个或多个杂原子的经取代和未经取代的烃的基团；
-L表示任选地含有一个或多个杂原子的经取代或未经取代的烃基；
-n是数值至少为1的整数；和
原则上，G是任选地用-OH、-NH2、-RNH或-SH官能化的多功能聚合物或低聚物，其中反应得到式I的基团是-OH、伯胺、季胺或-SH。在G不是X的情况下，G可选自聚酯、聚硫酯、聚正酯、聚酰胺、聚硫醚和聚醚。
特别地，G可选自聚乳酸(PLA)；聚乙交酯(PGA)；聚酐；聚三亚甲基碳酸酯(polytrimethylenecarbonates)；聚正酯；聚二噁烷酮(polydioxanones)；聚-ε-己内酯(PCL)；聚氨基甲酸酯；聚乙烯醇(PVA)；聚亚烷基二醇，例如聚乙二醇(PEG)；聚环氧烷，优选地选自聚环氧乙烷或聚环氧丙烷；聚醚；poloxamines；聚羟酸；聚碳酸酯；聚氨基碳酸酯；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙基噁唑啉；羧甲基纤维素；羟烷基化的纤维素，如羟乙基纤维素和甲基羟丙基纤维素；和天然聚合物如多肽、多糖和碳水化合物，如聚蔗糖，透明质酸，葡聚糖及其衍生物，硫酸类肝素，硫酸软骨素，肝素，藻酸盐，和蛋白质如明胶、胶原蛋白、白蛋白或卵清蛋白；和共低聚物、共聚物及其包含任何这些基元的掺合物。
可以基于其生物稳定性和/或生物可降解特性来选择基元G。为了对化合物或聚合物或物品提供高生物稳定性，聚醚、聚硫醚、芳香族聚酯、芳香族硫酯一般是尤其合适的。赋予生物可降解性的低聚物和聚合物的优选的例子包括脂肪族聚酯、脂肪族聚硫酯、脂肪族聚酰胺和脂肪族多肽。
优选地，G选自聚酯、聚硫酯、聚正酯、聚酰胺、聚硫醚和聚醚。使用聚醚，尤其是使用聚亚烷基二醇，更尤其是使用聚乙二醇(PEG)时，尤其实现了良好的结果。
对疏水聚合物而言，G可适当地选自疏水聚醚，如聚环氧丁烷或聚四甲二醇(PTGL)。
聚亚烷基二醇(如PEG)在下述应用中是有利的，其中产物可与含有蛋白质的体液(例如血、血浆、血清或细胞外基质)接触。其可尤其显示低结垢(foul)趋势(低的非特异性蛋白质吸附)和/或对生物组织的粘附具有有利影响。当需要信号肽或生物分子与细胞通信时，低结垢是想要的。在这种情况下，信号肽或生物分子不被非特异性蛋白质吸附掩蔽或覆盖是重要的。
基元G的数均分子量(Mn)通常至少为200g/mol，尤其是至少为500g/mol。为了得到经改进的机械特性，Mn优选地至少为2000g/mol。基元G的数均分子量通常至多为100 000g/mol。数均分子量可通过尺寸排除色谱(SEC)来测定。
烃基Z原则上可以是任何经取代或未经取代的烷基或芳基，任选地包含一个或多个杂原子，如一个或多个选自N、S、O、Cl、F、Br和I。通常，C原子的数量为1-20，优选地为1-10，更优选地为1-6。烃可以是线性、分枝或环状的。最优选的是烷基，因为烷基高度适合用作保护基。烷基可以是未经取代的烷基或经取代的烷基，例如羟基烷基。
优选地，烷基可以是甲基、乙基或正丙基。最优选地，烷基为甲基。
原则上，可聚合化合物中的可聚合基元(如“X”，式I中)可以是允许形成聚合物的任何基元。其尤其可选自可以通过加成反应聚合的任何基元。已发现这类反应是简单和可充分控制的。另外，可以进行聚合反应而不形成不想要的副产物，如从离去基团形成的产物。
优选地，可聚合基元允许原子团的聚合作用。这已被发现是有利的，因为在存在光引发剂时，其允许通过电磁辐射如UV、可见光、微波、近-IR、γ辐射或通过电子束来起始聚合作用，代替热起始聚合反应。这允许快速聚合，不具有或至少有降低的下述风险：聚合物或可聚合化合物热变性或(部分)降解。可以使用热聚合，尤其是不存在可能受热影响的一种或多种生物基元的情况下。例如，当一种或多种寡肽和/或蛋白质形成下述生物活性基元或是所述生物活性基元的部分时，可以使用热聚合，所述生物活性基元的活性位点不受在提高的温度下进行聚合反应所需的高温的影响。
可聚合基元(式I中“X”)的优选的例子包括包含不饱和碳-碳键如C＝C键(尤其是乙烯基)或C≡C基(尤其是乙炔基)的基团，硫醇基，环氧化物，氧杂环丁烷，羟基，醚，硫醚，HS-，H2N-，-COOH，HS-(C＝O)-或其组合，尤其是硫醇和C＝C基的组合。
尤其优选的是选自下组的可聚合基元，所述组由以下组成：丙烯酸酯/盐，包括羟基(甲基)丙烯酸酯/盐；烷基(甲基)丙烯酸酯/盐，包括羟基烷基(甲基)丙烯酸酯/盐；乙烯醚；烷基醚；不饱和二酯和不饱和二酸或其盐(如延胡索酸盐)；和乙烯基砜，乙烯基磷酸酯/盐，烯烃，不饱和酯，延胡索酸酯/盐，马来酸酯/盐或其组合。更优选的是选自丙烯酸酯/盐、异丁烯酸酯/盐、亚甲基丁二酸酯/盐、乙烯醚、丙烯醚、烷基丙烯酸酯/盐和烷基异丁烯酸酯/醚的基元。最优选的是选自(甲基)丙烯酸酯/盐和烷基(甲基)丙烯酸酯/盐的基元，特别是羟基烷基异丁烯酸酯/盐和羟基烷基丙烯酸酯/盐。这类基元可以被引入从可容易获得的起始材料开始并显示良好的生物相容性的本发明的可聚合化合物中，这使得所述化合物尤其适用于体内或其它医学应用。
尤其在使用下述可聚合化合物时实现了良好的结果，所述化合物中X-Y基元表示羟乙基丙烯酸酯/盐或羟乙基异丁烯酸酯/盐。
在又一个优选的实施方案中，可聚合基元X由式-R1R2C＝CH2表示，其中R1选自经取代和未经取代的脂肪族、脂环族和芳香族烃基的组，所述烃基任选地含有一个或多个选自下组的基元，所述组由包含一个或多个杂原子，尤其是一个或多个选自S、O、P和N的杂原子的酯基元、醚基元、硫酯基元、硫醚基元、氨基甲酸酯基元、硫代氨基甲酸酯基元、酰胺基元和其它基元组成。R1可以是线性或分枝的。R1尤其可包含1-20个碳原子，更尤其可以是经取代或未经取代的C1到C20亚烷基；更尤其是经取代或未经取代的C2到C14亚烷基。R2选自氢和经取代与未经取代的烷基，所述烷基任选地含有一个或多个杂原子，尤其是一个或多个选自P、S、O和N的杂原子。R2可以是线性或分枝的。R2尤其可以是氢或经取代或未经取代的C1到C6烷基，尤其是经取代或未经取代的C1到C3烷基。
氨基酸基元(式I中的“L”)是经取代或未经取代的烃，其可含有杂原子，如N、S、P和/或O。
氨基酸基元L可基于氨基酸的D-异构体或L-异构体。优选地，L是C1-C20烃，更优选地，L是线性或分枝的C1-C20亚烷基，进一步更优选地是C2-C12亚烷基，最优选地是C3-C8亚烷基，其中所述亚烷基可以是未经取代或经取代的，和/或任选地含有一个或多个杂原子。碳原子的数量优选地相对低，如8个或更少。
在聚合物或可聚合化合物旨在被用于医学应用中时，更尤其在旨在被体内使用的情况下，优选地，氨基酸基元以天然氨基酸为基础。在化合物或聚合物是生物可降解的情况下这是尤其想要的。考虑到这种情况，优选的氨基酸基元是赖氨酸、羟基赖氨酸、甲基化的赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、二氨基丁酸和谷氨酰胺的基元，其为L-或D-构型，或者作为外消旋化合物，或者作为D或L-异构体的任何混合物。优选地，氨基酸基元为L-构型。使用L-赖氨酸时尤其实现了良好的结果。
本发明更尤其涉及一种方法，其中可聚合化合物由式I表示，其中：
-G为X；
-每个Y为O，且每个X代表包含羟基亚烷基、羟乙基丙烯酸酯/盐或羟乙基异丁烯酸酯/盐的基元，
-每个R代表氢，
-L代表氨基酸基元，
-n＝1，
-W为O，
-Q为O，
-Z为H或具有1-6个C原子的烷基。
还更优选地，本发明涉及一种方法，其中可聚合化合物由式I表示，其中：
-G为X；
-每个X代表包含羟乙基丙烯酸酯/盐或羟乙基异丁烯酸酯/盐的基元，
-每个Y代表O，
-每个R代表氢，
-L代表氨基酸基元，
-n＝1，
-W为O，
-Q为O，
-Z是甲基、乙基或正丙基。
生物活性基元例如选自药物、稳定剂、抗血栓药基元、提高亲水性的基元或提高疏水性的基元。
生物活性基元可例如选自细胞信号转导基元，能够促进细胞与化合物粘附的基元，聚合物或物品，能够控制细胞生长(例如刺激或阻抑增殖)的基元，抗血栓药基元，能够促进伤口愈合的基元，能够影响神经系统的基元，对特定组织或细胞类型具有选择性亲和力的基元，和抗微生物基元。基元与化合物、聚合物或物品的剩余部分结合时和/或从中释放时可展示活性。可共轭的生物活性基元的例子包括全氟烃，聚环氧烷，如环氧乙烷和环氧丙烷(提高亲水性和/或降低结垢)；聚噁唑啉；氨基酸；肽，包括环状肽，寡肽，多肽，糖肽和蛋白质，包括糖蛋白；核苷酸，包括单核苷酸，寡核苷酸和多核苷酸；和碳水化合物。优选地，共轭氨基酸、肽或蛋白质。
可以使氨基酸共轭，来刺激伤口愈合(精氨酸、谷氨酰胺)或调控神经系统的功能化(天冬酰胺)。
肽可以是增强或阻抑生物应答(例如细胞生长增殖或增强的细胞粘附)的表位。在例如需要增强的抗体结合的情况下，表位是最明显的选择。
肽的例子包括表I中给出的序列，所述序列由氨基酸组成，所述氨基酸的缩写是本领域技术人员已知的。
表I
Figure BPA00001235461800091
Figure BPA00001235461800101
环状肽的一个优选的例子是短杆菌肽S，其为抗微生物剂。
合适的肽的其它例子尤其包括：血管内皮生长因子(VEGF)，转化生长因子β(TGF-β)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，成骨蛋白(OP)，单核细胞趋化蛋白(MCP 1)，肿瘤坏死因子(TNF)。可尤其形成本发明化合物一部分的蛋白质的例子包括生长因子、趋化因子、细胞因子、细胞外基质蛋白、葡萄糖胺聚糖、angiopoetins、ephrins和抗体。
一种优选的碳水化合物是肝素，其为抗血栓药。
核苷酸可尤其选自治疗性核苷酸，如用于基因疗法的核苷酸和能够与细胞或病毒蛋白质结合，尤其以高选择性和/或亲和力结合的核苷酸。
优选的核苷酸包括适配体。基于DNA和RNA的两种适配体的例子描述于Nimjee et.al.Annu.Rev.Med.2005，56，555-583中。结合病毒TAT蛋白或细胞蛋白质细胞周期蛋白T1来抑制HIV复制的RNA配体TAR(反式激活应答)是适配体的一种例子。另外，优选的核苷酸包括VA-RNA和调节细胞增殖的转录因子E2F。
水解酶优选地选自羧酸酯水解酶(E.C.3.1.1)、硫酯水解酶(E.C.3.1.2)或肽酶(E.C.3.4)的组。
优选地，水解酶是选自下组的肽酶：丝氨酸型羧肽酶(E.C.3.4.16)、金属羧基肽酶(E.C.3.4.17)、半胱氨酸型羧肽酶(E.C.3.4.18)、丝氨酸内肽酶(E.C.3.4.21)、半胱氨酸内肽酶(E.C.3.4.22)、天冬氨酸内肽酶(E.C.3.4.23)或金属内肽酶(E.C.3.4.24)。最优选的酶是丝氨酸内肽酶如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)，优选地为枯草杆菌蛋白酶Carlsberg或半胱氨酸内肽酶如木瓜蛋白酶(E.C.3.4.22.2)。酶也可以选自羧酸酯水解酶，优选地选自Candida antarctica脂肪酶B(CALB)、lypozyme RM、Piccantase A 
Figure BPA00001235461800111
Rhizomucor miehei脂肪酶、热稳定酯酶或lilipase。
水解酶可以得自或衍生自任何生物，尤其是动物、植物、细菌、霉菌、酵母或真菌。涉及来自聚体来源的酶时，来源于第一生物、但是实际上在(经遗传修饰的)第二生物中生产的重组酶旨在作为来自所述第一生物的酶被明确包括在内。
水解酶可以被固定，尤其是上样在支持物例如丙烯酸支持物上，或者以其未被支持(即游离)的形式使用。合适的固定技术是本领域普遍已知的。
使用肽酶，特别是使用内肽酶，更优选地使用木瓜蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶实现了尤其良好的结果，从而使悬挂式羧酸、酯或硫酯共轭，更尤其使悬挂式甲酯共轭。
所述工艺中存在或使用的酶量难以用绝对值(例如克)测定，因为其纯度通常低并且一部分可以处于无活性或部分活性的状态。更相关的参数是酶制剂的活性和任何污染性酶的活性。这些活性通常用活性单位(U)来测量，所述活性单位被定义为在标准条件下，每分钟催化1微摩底物转化的量。典型地，这表示10-6-10-11kg的纯酶和10-4-10-7kg的工业酶制剂。每克聚合物或可聚合化合物的水解酶量原则上不是关键性的，并且可例如取决于悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基的反应性和酶成本价。典型的酶量范围为每克聚合物或可聚合化合物0.01-1000U。优选地使用0.1-100U/g，最优选地使用1-10U/g。
生物活性基元与聚合物或可聚合化合物的共轭通常可以在温和和/或环境友好的条件下进行。例如，不需要高度酸性或碱性条件，所述条件会水解聚合物或可聚合化合物中存在的任何可水解基团。通常，共轭可以在约中性的pH、轻度碱性或轻度酸性pH(例如4-10之间的pH)下进行。本领域技术人员可以容易地确定具体pH，其取决于聚合物或可聚合化合物、酶和反应条件。
原则上还也可以使用更加碱性或酸性的pH，尤其是当酶显示足够的选择性活性时。可以基于已知或可凭经验测定的作为pH函数的酶活性曲线和本文公开的信息，选择有利的pH。
可以在水中，水和一种或多种可与水混溶的有机溶剂的混合物中，水和一种或多种不与水混溶的有机溶剂的混合物中，或一种或多种有机溶剂中，进行根据本发明的方法。使用一种或多种有机溶剂的情况下，所述溶剂可选自低级醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇和己醇)的组。醇可以是伯醇、仲醇或叔醇。尤其优选的是叔醇，如叔丁醇或叔戊醇。有机溶剂也可选自乙腈、二甲基酰胺(DMF)、甲苯、二噁烷、丙酮、乙酸乙酯、甲基-叔丁基醚(MBTE)。
水含量取决于聚合物或可聚合化合物、酶和反应条件。
酶共轭反应的温度通常可以在广阔范围内选择，所述选择考虑下述因素，如作为温度函数的酶活性和特定温度下酶的稳定性。通常所述温度为至少0℃，尤其是至少10℃，更优选地至少为15℃。通常所述温度至多为80℃，更优选地至多60℃。
在可聚合化合物的情况下，生物活性基元的共轭可以在聚合之前、期间或之后发生。共轭甚至可以在聚合物成形(form)之后发生。所述的形式(form)可以例如是涂层、膜、多孔支架、微粒、微球、纳米颗粒、脂质体、纤维、凝胶、棒(rod)或polymerosome。
与生物活性基元共轭的聚合物被广泛使用，不仅用于药物领域(其中在化学疗法中使用高分子药物共轭物并用于使用生物制品的受控和定向的药物递送)，而且也用于聚合物-肽或抗体共轭物用于定向药物递送的用途中。另外，聚合物-肽共轭物也可以被用作进行组织改造工程的材料。
本发明接着通过以下实施例阐述，但不限于此。
材料和方法
HPLC方法
在40℃下使用Inertsil ODS-3(150mm长，4.6mm内径)，在HP 1090液相色谱上记录分析型HPLC图谱。使用UVVIS 204 Linear光谱仪在220nm下进行UV检测。梯度程序为：0-25分钟从5％到98％缓冲液B和从25.1-30分钟到5％缓冲液B的线性梯度斜度(缓冲液A：H2O中0.5ml/L甲磺酸(MSA)，缓冲液B：乙腈中0.5ml/L MSA)。流速在0-25.1分钟为1mL/min，在25.2-29.8分钟为2ml/min，然后返回1ml/min并在第30分钟停止。注射体积为20μL。使用与分析型HPLC相同的柱和同样的流动条件，在Agilent 1100系列系统上记录HPLC-MS图谱。
保留时间：
LDI-(HEMA)2-OMe：17.02分钟，
LDI-(HEMA)2-OH：15.10分钟
LDI-(HEMA)2-Gly-NH2：13.56分钟
LDI-(HEMA)2-Gly-Gly：13.61分钟
LDI-(HEMA)2-Gly-Phe：16.24分钟
LDI-(HEMA)2-Gly-Phe-NH2：15.70分钟
LDI-(HEMA)2-Ser-Trp：15.46分钟
LDI-(HEMA)2-Gly-Arg：10.41分钟
LDI-(HEMA)2-Gly-Ala-Gly：13.15分钟
LDI-(HEMA)2Gly-Arg-Gly-Asp-Ser：9.81分钟
LDI-(HEMA)2-Gly-Arg-(Pmc)-Gly-Asp-(OtBu)-Ser-(OtBu)2：23.82分钟
LDI-(HEMA)2-Leu-NH2：15.7分钟
LDI-(HEMA)2-Leu-OtBu：21.5分钟
LDI-(HEMA)2-Val-NH2：14.8分钟
LDI-(HEMA)2-Leu-Phe：18.3分钟
LDI-(HEMA)2-Leu-Pro-Pro：15.9分钟
LDI-(HEMA)2-Ile-Pro-Pro：15.8分钟
LDI-(4-戊烯)2-OMe：20.5分钟
LDI-(4-戊烯)2-OH：17.4分钟
LDI-(4-戊烯)2-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser：10.9分钟
LDI-(4-戊烯)2-Gly-Arg-(Pmc)-Gly-Asp-(OtBu)-Ser-(OtBu)2：25.0分钟
LDI-(4-戊烯)2-Leu-Leu-OtBu：23.8分钟
LDI-(4-戊烯)2-Leu-Pro-Pro：18.2分钟
LDI-(4-戊烯)2-Ser-Trp：18.4分钟
LDI-(4-戊烯)2-Gly-NH2：14.74分钟
材料
I.合成LDI-(HEMA) 2 -OMe(图1)
如下制备Nα，Nε-二-(2-甲基丙烯酰氧-乙氧基羰基)-L-赖氨酸甲基酯(LDI-(HEMA)2-OMe)；
在受控的温度(＜5℃)下干燥的空气中，向L-赖氨酸-二异氰酸甲酯(251mmol)、2-乙基己酸锡(II)(0.120g)和Irganox 1035(150mg)中逐滴添加2-羟乙基-异丁烯酸酯(HEMA，502mmol)。将反应混合物在40℃下搅拌18小时。在这期间，ν＝2260cm-1处的IR NCO振动带已消失。真空蒸发溶剂得到作为油的产物。
1H-NMR(300MHz，CDCl3，22℃，TMS)：δ6.13-6.10(m，2H)，5.57(q，J＝1.5Hz，2H)，5.36(d，J＝8.0Hz，1H)，4.85(bs，1H)，4.35-4.27(m，9H)，3.73(s，3H)，3.16(q，J＝6.4Hz，2H)，1.93(s，6H)，1.88-1.76(m，1H)，1.74-1.61(m，1H)，1.55-1.44(m，2H)，1.42-1.30(m，2H)。
Figure BPA00001235461800151
图1
II.合成LDI-(4-戊烯) 2 -OMe(图2)
如下制备Nα，Nε-di-(4-戊烯-1-氧羰基)-L-赖氨酸甲酯(LDI-(4-戊烯)2-OMe)(图2)；
将L-赖氨酸-二异氰酸酯-甲酯(5.3g，25mmol)溶于无水四氢呋喃(30mL)中。向得到的溶液中添加2-乙基己酸锡(II)(25mg，0.061mmol)并将溶液冷却至0℃，耗时30分钟逐滴添加4-戊烯醇(4.3g，50mmol)。通过IR光谱法(2260cm-1，-N＝C＝O)监测反应。2小时后添加37.5mg 2-乙基己酸锡(II)(0.092mmol)。将反应在0℃下再保持1小时，然后在室温下搅拌18小时。最后真空去除有机溶剂获得呈无色油的9.6g(25mmol，100％产率)标题化合物。
1H-NMR(300MHz，CDCl3，22℃，TMS)：δ(ppm)＝5.80-5.66(m，2H，-CH＝CH2)；5.16(m，1H，-NH-CH2)；4.95-5.02(m，4H，-CH＝CH2)；4.62(m，1H，-CH-)；4.26(m，1H，-NHCH-)；4.0(m，4H，-(C＝O)OCH2-)；3.69(s，3H，-CH3)；3.10(m，2H，-CH2CH2NH-)；2.05(m，4H，CH2＝CHCH2-)；1.82-1.41(m，10H，CH2＝CHCH2CH2-，-NHCH2CH2CH2CH2-)。
图2
实施例1
通过枯草杆菌蛋白酶使肽与LDI-(HEMA) 2 -OMe和与LDI-(4-戊烯) 2 -OMe 偶合(图3)
向1.5mL乙腈中110μmol LDI-(HEMA)2-OMe或LDI-(4-戊烯)2-OMe的经搅拌的溶液中，添加溶于2.6mL DMF中2-4当量氨基酸或肽衍生物和2-4当量哌啶的溶液，如表II和III中所示。随后，添加溶于0.2mL蒸馏H2O中的22mg枯草杆菌蛋白酶-A(批次号8356056，活性7-15单位每mg，来自Novozyme)，并将反应混合物在室温下搅拌。通过HPLC分析监测反应。
以规律的时间间隔从反应混合物中取出10μL样品。将10μL样品用0.5mL乙腈或甲醇稀释，在注射滤器(Agilent Technologies，再生纤维素膜，0.45μm孔径，13mm直径)上过滤，并通过HPLC分析。
使用未经修饰的反应混合物通过HPLC-MS鉴定产物，或者通过将HPLC图谱与化学合成的参照化合物的HPLC图谱进行比较来鉴定产物。使用与分析型HPLC相同的柱和同样的流动条件，在Agilent 1100系列体系上记录HPLC-MS图谱。结果在表II和表III中给出。
Figure BPA00001235461800161
图3
反应期间，通过与肽(或氨基酸)亲核体的酶促偶合，将LDI-(HEMA)2-OMe起始材料转化成想要的产物LDI-(HEMA)2-肽。由于所选择的酶的水解活性，LDI-(HEMA)2-OMe被部分水解成相应的LDI-(HEMA)2-OH(如果存在水的话)。
在一种典型的最终反应混合物中，存在的化合物是：初始LDI-(HEMA)2-OMe材料，肽(或氨基酸)，产物LDI-(HEMA)2-肽(或LDI-(HEMA)2-氨基酸)和经水解的LDI-(HEMA)2-OH。
对于LDI-(4-戊烯)2-OMe的偶合而言，相同的反应流程图适用。
实施例2
通过木瓜蛋白酶与LDI-(HEMA) 2 -OMe和与LDI-(4-戊烯) 2 -OMe的肽偶合
向1.2mL乙腈中的110μmol LDI-(HEMA)2-OMe或LDI-(4-戊烯)2-OMe的经搅拌的溶液中添加2-8当量氨基酸或肽衍生物的溶液。在氨基酸或肽衍生物作为盐酸盐被使用的情况下，添加相同当量的三乙胺(见表II)。随后添加如表II和III中所示的10mg二硫苏糖醇(DTT)、100mg木瓜蛋白酶(来自Merck，来自Carica papaya，30000USP-U/mg，art.7144，批号333 F677044)，和0.8mL 100mM的缓冲液，并在37℃下搅拌反应混合物。
通过HPLC分析监测反应。以规则的时间间隔从反应混合物中取出10μL样品。用0.5mL乙腈稀释10μL样品，在注射滤器(Agilent Technologies，再生纤维素膜，0.45μm孔径，13mm直径)上过滤并通过HPLC分析。
使用未经纯化的反应混合物通过HPLC-MS鉴定产物，或者通过将HPLC图谱与化学合成的参照化合物的HPLC图谱进行比较来鉴定产物。使用与分析型HPLC相同的柱和同样的流动条件，在Agilent 1100系列体系上记录HPLC-MS图谱。
结果在表II和表III中给出。
表II使用LDI-(HEMA) 2 -OMe作为起始材料的反应
*Sub＝枯草杆菌蛋白酶；Pap＝木瓜蛋白酶
*nd＝未测定
Figure BPA00001235461800171
Figure BPA00001235461800181
通过HPLC分析，作为面积百分比测定反应产率，所述面积百分比如下定义：
在肽或氨基酸含有Pmc基团的情况下；通过HPLC作为面积百分比测定反应产率，所述面积百分比如下定义：
Figure BPA00001235461800183
如表II和III中设定的反应时间与期望产物的最大转化相关。
表III使用LDI-(4-戊烯) 2 -OMe作为初始材料的反应
Figure BPA00001235461800184
 Leu-Pro-Pro   2   Pap/CH3CN/磷酸盐  9   2   100#   是
 Ser-Trp   2   Pap/CH3CN/磷酸盐  9   2   5#   否
通过HPLC分析作为面积百分比测定反应产率，所述面积百分比如下定义：
Figure BPA00001235461800191
在肽或氨基酸含有Pmc基团的情况下，通过HPLC作为面积百分比测定反应产率，所述面积百分比如下定义：
Figure BPA00001235461800192
从表II和表III可以清楚看出，如果氨基酸或肽在N-端具有Gly，则优选地使用枯草杆菌蛋白酶。如果在N端使用另一氨基酸或肽亲核体，则优选地使用木瓜蛋白酶。
实施例3
通过Cal-B与LDI-(4-戊烯) 2 -OMe的肽偶合
向2.0mL乙腈中的0.5mmol LDI-(4-戊烯)2-OMe经搅拌的溶液中，添加4当量H-Gly-NH2.HCl(220mg)和4当量哌啶(0.20mL)。随后添加220mg Cal-B(来自Novozyme，来自Candida Antarctica的脂肪酶Novozym 435，批号LC200204)，并将反应混合物在50℃下搅拌。3天后15％的初始材料已经被转化为LDI-(4-戊烯)2-Gly-NH2)产物。
使用未经修饰的反应混合物通过HPLC-MS鉴定产物，或者通过将HPLC图谱与化学合成的参照化合物的HPLC图谱进行比较来鉴定产物。使用与分析型HPLC相同的柱和同样的流动条件，在Agilent 1100系列体系上记录HPLC-MS图谱。
数据是HPLC面积百分比：

Claims (20)

1.将生物活性基元与悬挂式(pendant)羧酸基、酯基或硫酯基选择性共轭的方法，其中所述悬挂式基团是聚合物或可聚合化合物的一部分，其中所述方法包括使所述聚合物或可聚合化合物与水解酶接触，以催化所述生物活性基元和所述悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基之间的共轭。
2.根据权利要求1的方法，其中所述悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基是聚合物或可聚合化合物的一部分，所述聚合物或可聚合化合物包含(a)至少两个可聚合基元和(b)至少一个氨基酸残基。
3.根据权利要求1或2中任一项的方法，其中所述聚合物或可聚合化合物除了所述悬挂式羧酸基、酯基或硫酯基以外，还包含选自脲基、硫脲基、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基、酯基、酰胺基、糖肽基、碳酸酯基、砜或碳水化合物基的基元。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述可聚合化合物由式I表示：
Figure FPA00001235461700011
其中
-G是具有至少n个官能团的多功能化合物的残基或是基元X；
-每个X独立地表示包含可聚合基团的基元；
-每个Y独立地表示O、S或NR；
-每个R独立地表示氢或选自任选地含有一个或多个杂原子的经取代和未经取代的烃的基团；
-L表示任选地含有一个或多个杂原子的经取代或未经取代的烃；
-n是数值至少为1的整数；
-W是O或S；
-Q是O或S；
-Z是H或经取代或未经取代的烃基。
5.根据权利要求4的方法，其中
-G是X；
-每个Y＝O，且每个X表示包含羟基亚烷基、羟乙基丙烯酸酯或羟乙基异丁烯酸酯的基元；
-每个R表示氢；
-L表示氨基酸；
-n＝1；
-W是O；
-Q是O；
-Z是H或具有1-6个C原子的烷基。
6.根据权利要求5的方法，其中所述氨基酸基元选自赖氨酸基元、二氨基丙酸基元、羟基赖氨酸基元、N-α-甲基化的赖氨酸基元或二氨基丁酸基元。
7.根据权利要求5或6的方法，其中所述氨基酸残基具有L-构型。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述聚合物是由根据权利要求5-7中任一项的化合物组成的聚合物。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述聚合物或可聚合化合物含有一个或多个赖氨酸-甲基酯基元。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述水解酶选自羧酸酯水解酶、硫酯水解酶或肽酶的组。
11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述水解酶是选自丝氨酸型羧肽酶、金属羧肽酶、半胱氨酸型羧肽酶、丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、天冬氨酸内肽酶和金属内肽酶的组的肽酶。
12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中所述酶是丝氨酸内肽酶。
13.根据权利要求12的方法，其中所述酶是枯草杆菌蛋白酶。
14.根据权利要求13的方法，其中所述酶是枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。
15.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中所述酶是半胱氨酸内肽酶。
16.根据权利要求15的方法，其中所述酶是木瓜蛋白酶。
17.根据权利要求10的方法，其中所述酶是选自Candida antarctica脂肪酶B(CALB)、lypozyme RM、Piccantase A
Figure FPA00001235461700031
Rhizomucor miehei脂肪酶、热稳定酯酶或lilipase的羧基酯水解酶。
18.根据权利要求1-17中任一项的方法，其中所述生物活性基元的共轭可在所述可聚合化合物的聚合作用之前、期间或之后发生。
19.根据权利要求1-18中任一项的方法，其中所述生物活性基元的共轭发生在所述聚合物成形之后。
20.根据权利要求1-19中任一项的方法，其中所述生物活性基元选自氨基酸、肽或蛋白质。
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