CN101990574A - 带空间可变电场的电穿孔样品池 - Google Patents

带空间可变电场的电穿孔样品池 Download PDF

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Abstract

一种电穿孔样品池，其被构造成包括电穿孔电极和一对定位电极，所述电穿孔电极按非平行关系排列以形成宽度随样品池内的位置而改变的间隔，所述定位电极被排列成使得样品池内的生物细胞根据细胞尺寸进行电泳迁移。一旦悬浮在浸渍剂的溶液中的细胞在样品池中被定位电极分布，则由非平行的电穿孔电极产生电场脉冲。由于在样品池中的细胞分布，因此不同的细胞跨细胞宽度的电压差接近均一而与细胞直径无关，由于较大的细胞被定位在电极间的间隔较大的位置，而较小的细胞被定位在间隔相对小的位置，跨整个间隔的电压降沿细胞长度是均一的。因此，跨细胞宽度的电压差与细胞直径粗略匹配，这会降低使用平行电极时不同尺寸的细胞发生的电压差的不一致。

Description

带空间可变电场的电穿孔样品池
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年2月20日提交的美国临时专利申请61/030074的优先权，通过引用将该申请的内容纳入本文。
技术领域
本发明涉及电穿孔领域，通过将膜状结构悬浮在外源性分子物质的液体溶液中并且对生成的悬浮液施加电场而使外源性分子物质插入膜状结构的方法。具体而言，本发明解决了电穿孔样品池(cuvettes)。
背景技术
电穿孔或电脉冲驱动的转染被广泛运用于利用外源性分子对膜状结构例如活体生物细胞、脂质体和囊泡进行浸渗。膜状结构一般悬浮在外源性物质的高导电性缓冲液的水溶液中。目前生理盐水常被用作缓冲液，除了提供相对较低的抗电流性之外，生理盐水还提供对大多数膜状结构存活有利的环境。悬浮液一般被置于装有电极的样品池中，在样品池中进行电穿孔。
在任何电穿孔方法中首要关心的是效率，其被定义为在该方法中被成功浸渗的膜状结构的数量。目标是为了在所给予的样品中浸渗尽可能多的膜状结构，以及使得每个结构尽可能接近地接受相同数量的浸渗剂分子。不过完全均匀是一种难以达到的目标，由于膜状结构相对于电场的不同位置和物理取向，因此，在任何电穿孔方法中一定程度的偏差是固有的。当膜状结构为生物细胞时，偏差的进一步根源在于细胞的成熟度，这是由于一个典型的细胞群包括在细胞生命周期中的不同阶段的细胞。一个单个细胞系因此可以具有不同直径的细胞。外加电压除以电极间的距离来确定电场强度，但是流过单个细胞的电压与细胞直径成比例。另外，对于给定的电场强度，小细胞的电压差相对较小，而大细胞的电压差相对较大。若电压差过小，则细胞壁便不会有充分的多孔性以使分子浸渗，而若电压差过大，则生成的偶极矩会导致细胞裂解。
发明内容
现开发了电穿孔样品池，解决单一悬浮液中不同直径的细胞或其他膜结构所经历的电压差的变化。为方便起见，在此所使用的术语“细胞”统指膜状物质。在样品池中产生电穿孔效果的电极被构造成能够产生电场强度随样品池的位置而改变的电场，将第二对电极引入样品池结构以施加使细胞根据在与场强变化相关排列中的尺寸进行自身定位的电场。在此涉及用于定位细胞的电极作为“定位电极”，而在此涉及用于电穿孔的电极作为“电穿孔电极”或“电击电极”。为了在电穿孔方法中利用样品池，依次对两组电极施加电压，首先对定位电极施加电压以实现细胞所需的空间尺寸分布，再对电穿孔电极施加电压以产生电穿孔，电场强度变化与细胞尺寸分布相关。在电穿孔期间可以保持对定位电极施加电压，但在本发明优选的实施方式中，在电穿孔开始之前中断经定位电极的电压。在电穿孔中使用的电场优选脉冲电场。在细胞定位步骤中使用的电压显著小于在电穿孔步骤中使用的电压，至少相差一个数量级，通常相差两至三个数量级。
作为细胞物理尺寸的差异的直接结果、或作为在细胞上的表面电荷数量的结果、或者这两种作用的组合，可实现细胞根据尺寸的分布。通过定位电极本身可以实现按照自身表面电荷数量的分布，而通过单独使用定位电极、或与其他方式联用例如使用一系列筛膜或筛基质可以实现按物理尺寸的分布。本发明的这些及其他方式、实施方式、目的和优点将在下面进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明的样品池和盖的一例的透视图。
图2是图1的样品池的截面图。
图3是本发明的样品池和盖的又一例的正视图。
具体实施方式
本发明所界定的特征可在各种构造中加以实现，可根据对具体实施方式的详细研究而最好地理解本发明整体。附图表示这些实施方式。
图1所示的样品池11具有开放的顶端以及可附连或分开的盖12。样品池11在水平截面上为矩形，四个面为平坦的壁面。
前壁13和后壁14平行，而端壁15、16成一角度以形成在顶端为最宽间距、在底部为最窄间距的锥状轮廓。
附着于这两个端壁且暴露于样品池内部的是一对相对的电极17、18，由于这一对电极17、18贴附在倾斜的壁面上，因此非平行。这些电极是电击电极，并且由于电极的非平行排列，靠近样品池顶端的这些电极间的间距比靠近样品池底部的间距大。附着于样品池的底部19或底板的是另一个电极21，盖12的底侧的是又一个电极22。底部电极和盖电极是定位电极。
样品池11沿中心线23对称成形，每个电击电极17、18为平面且具有中心线24、25。三条中心线23、24、25共平面，如样品池本身那样，电击电极在样品池中心线23的两侧对称排列。图2是样品池和电击电极沿这些中心线的平面的截面图。尽管最佳角度取决于细胞群和样品池的尺寸，但由电击电极中心线形成的角度α可以改变且对本发明来说并不关键。一般而言，优选的角度是在从大约1度至大约45度范围内的角度，最优选是在从大约5度至大约30度范围内的角度。电击电极的非平行排列也可根据电极间最大宽度的间隔26与最小宽度的间隔27的比率加以说明。这个比率也可以大范围改变，但在最大多数情况下，较理想的比率是在从大约1.2至大约3.0的范围内的比率，且优选从大约1.3至大约2.0。由于细胞按尺寸定位，因此细胞迁移的方向通常遵循样品池的中心线23，其是由定位电极所施加的电势的方向。电击电极的间隔宽度同样在样品池中心线的方向上减小，并且如下所述，定位后的细胞尺寸的梯度方向与细胞尺寸减小方向相同，细胞尺寸减小方向与在电击电极的间隔宽度的减小方向相同。
在利用图1和图2的样品池的电穿孔方法中，样品池填充有DNA缓冲水溶液、蛋白质或一般用作浸渗剂的外源性物质，要被浸渗的细胞被置于溶液的暴露表面，该暴露表面是在样品池11最大宽度的一端。接着，通过顶端开口将样品池盖12放置到样品池中，并且向下推足够远以确保证盖子电极22与溶液接触。在盖电极22与底部电极21之间产生电势。由于生物细胞一般具有负表面电荷，因此通过使盖电极22带负极性且使底部电极带正极性可实现沿样品池中心线23方向向下的细胞迁移。随着电极进一步带电，细胞以朝底部电极21电泳迁移进入样品池内部的方式向下迁移。由于细胞质量较低，小细胞能比大细胞以更快的速率迁移。电势在任何细胞到达样品池底部之前或在最小细胞到达底部之后的短时间内中断，其结果是在样品池内实现细胞的尺寸梯度，较小的细胞由于其质量较低而从顶部移动越远的距离。接着，对电击电极17、18施加脉冲，由于电极间距较窄，因而在样品池底部产生较大的电场强度。由于电场强度本身具有朝样品池底部升高的梯度(该方向于细胞尺寸梯度方向相反)，因此跨细胞宽度的电势降在细胞尺寸范围内接近统一。
在图1的样品池11和盖12中形成细胞尺寸梯度的另一种方式、或进一步控制梯度的方式是在样品池中放置筛基质。琼脂糖是筛基质的一个例子，珠的悬浮液是另一个例子。一般而言，任何提供阻止细胞移动但仍保持充分尺寸的间隙或孔以供细胞通过的基质可起到筛基质的作用。基质被浸入浸渗剂的缓冲液中，并且作为如上所述的方法，首先将细胞放置在饱和的或悬浮的基质的暴露表面上并对定位电极施加电压以诱导细胞电泳迁移至基质内。在电场的影响下，细胞迁移至基质内并将根据自身尺寸实现跨基质分布，较小的细胞由于它们受到来自基质的阻力较小，因而以更快的速率迁移。迁移速率的不同也可能源于小细胞较低的质量，因而为克服电泳力的惯性较低。当迁移在缺少筛基质的情况下进行时，本方法中的迁移时间不是很重要，但时间仍是实现从样品池顶端至底端的大致连续的梯度的因素。适当的或是最佳的迁移时间可根据通过观察最终细胞分布的常规实验容易确定。一旦获得希望的分布，则中断施加至定位电极的电势，接着对电击电极17、18施加脉冲，由于电极间距较窄，因此在样品池底部产生较大的电场强度。如上述方法所述，由于电场强度本身具有朝样品池底部升高的梯度，因此跨细胞宽度的电势降与细胞尺寸大致成反比。
产生和控制细胞尺寸梯度的又一方式是通过示于图3的样品池结构加以实现。这个样品池31和盖32除了另外引入横跨样品池的水平截面的筛膜33、34之外，与图1和图2的样品池和盖是相同的。本实施方式中示出两个筛膜，但数量可根据系统需求、特别希望的细胞尺寸范围和样品池的尺寸而改变。尽管在大多数情况下采用二至五个筛膜，但在一些情况下用单个筛膜就可实现充分的尺寸分离。筛膜沿样品池的纵轴线35间隔开，且以具有最大孔尺寸的膜最接近样品池的顶端的形态排列，膜的孔尺寸朝样品池的底部连续减小。如实施方式所示，两个膜将样品池内部分成垂直排列的三个小室36、37、38。如参照图1说明的第一方法所述，将浸渗剂的缓冲水溶液放入样品池以占据所有的筛膜上下的样品池的所有部分，将细胞放在样品池顶端的溶液的暴露表面上。接着，将盖32放在样品池上以使负极定位电极39与溶液接触，在负极定位电极39与在样品池底部的正极定位电极40之间施加电势，使得细胞通过电泳方式迁移至样品池内部。最大的细胞被留在上室36，中等尺寸的细胞穿过上筛膜33而被留在中室37，最小的细胞穿过两个筛膜而迁移至下室38。维持电势直到细胞到达它们合适的室，在本方法中分离对时间的敏感度比参照图1说明的上述两个方法要小。接着，中断定位电势，然后对电击电极41、42施加脉冲，从而产生在上室最弱而在中室37和下室38不断增强的电场强度。所产生的跨细胞宽度电势降如上述实施方式所述根据细胞尺寸反向变化。
通往两组电极的电路是常规的，并能够以与在截止至本申请提交之日在商业上可利用的任意一种基因脉冲器中的常规样品池的电击电极同样的方式对电击电极施加脉冲。

Claims (12)

1.一种用于非均一尺寸的膜状结构的电穿孔的样品池，所述样品池包括：具有一纵轴线的容器；沿所述纵轴线分隔开的一对定位电极；以及在所述纵轴线的相对侧分隔开的一对电穿孔电极，所述电穿孔电极是长形且非平行的，以限定宽度沿所述纵轴线减小的间隔。
2.如权利要求1所述的样品池，其特征在于，所述电穿孔电极中的每一个具有笔直的中心线，所述中心线均与所述纵轴线共平面并且彼此间形成一个从大约1度至大约45度的角度。
3.如权利要求2所述的样品池，其特征在于，所述角度形成为从大约5度至大约30度。
4.如权利要求1所述的样品池，其特征在于，还包括横跨所述样品池且与所述纵轴线横交的筛膜。
5.如权利要求1所述的样品池，其特征在于，还包括多个横跨所述样品池的不同孔尺寸的筛膜，每个所述筛膜均横向于所述纵轴线取向，所述筛膜沿所述纵轴线分隔开并且在与所述减小的间隔宽度方向相同的方向上沿所述纵轴线减小孔尺寸。
6.如权利要求5所述的样品池，其特征在于，包括二至五个所述筛膜。
7.一种用于用外源性物质转染不均一尺寸的膜状结构的群体的方法，所述方法包括：
(a)将所述群体在溶解有所述外源性物质的液体介质中的悬浮液装入样品池，所述样品池包括：具有纵轴线的容器；沿所述纵轴线分隔开的一对定位电极；以及在所述纵轴线的相对侧分隔开的一对电穿孔电极，所述电穿孔电极是长形且非平行的，从而限定宽度沿所述纵轴线减小的间隔，
(b)对所述定位电极施加电压以使所述样品池内的所述膜状结构大致根据尺寸在所述纵轴线方向上分布，与所述减少的间隔宽度相同的方向上尺寸减小，
(c)以这样分布的所述膜状结构，对所述电穿孔电极施加电压，以使所述外源性物质转染至所述膜状结构中。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(a)之前在样品池中填充缓冲液，步骤(a)包括在所述间隔宽度最大的所述纵轴线的一端加载所述膜状结构，并且所述步骤(b)包括在所述电穿孔电极之间施加一定量级的电势，所述量级的电势通过引起经过所述缓冲液的所述膜状结构的不同迁移速率而影响所述分布。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述样品池包括筛基质，步骤(a)包括在所述间隔宽度最大的所述纵轴线的一端将所述膜状结构放置在所述筛基质上，并且所述步骤(b)包括在所述电穿孔电极之间施加一定量级的电势，所述量级的电势通过引起经过所述筛基质的所述膜状结构的不同迁移速率而影响所述分布。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述样品池中横向于所述纵轴线横跨所述样品池安装筛膜，步骤(a)包括在所述间隔宽度最大的所述纵轴线的一端加载所述膜状结构，并且所述步骤(b)包括在所述电穿孔电极之间施加一定量级的电势，所述量级的电势通过筛分经过所述筛膜的所述膜状结构而影响所述分布。
11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述样品池中安装多个筛膜，所述筛膜横向于所述纵轴线横跨所述样品池并且沿所述纵轴线分隔开，所述筛膜的孔尺寸伴随着所述降低的间隔宽度相继减小，步骤(a)包括在所述间隔宽度最大的所述纵轴线的一端加载所述膜状结构，并且所述步骤(b)包括在所述电穿孔电极之间施加一定量级的电势，所述量级的电势通过使所述膜状结构只迁移与具有足够小到可阻挡进一步迁移的孔的筛膜一样远的距离而影响所述分布。
12.如权利要求7所述的样品池，其特征在于，所述电穿孔电极中的每个均具有笔直的中心线，所述中心线与所述纵轴线共平面且彼此间形成一个从大约1度至大约45度的角度。
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