CN101975849B - 一种浮游植物快速定性定量优化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种浮游植物快速定性定量优化方法，其分为定性优化过程和定量优化过程，在定性优化过程中，利用电子目镜对各藻种进行拍照，并将拍下的藻种照片存入计算机终端设备中，保证了藻种信息的再现，从而可提高藻类鉴定准确性；利用完整定性库的分类检索表可方便地确定未知藻种，从而能够更准确地实现藻类的鉴定工作；在定量优化过程中，集成了数据处理过程，只需在计算机终端设备上对水样中各藻种进行计数并填写采水体积、过滤浓缩获取的水样的体积、本次观察所测的视野体积三个参数，数据的分析工作是计算机终端设备自动完成的，不需要制表、编写公式和数据的分类汇总，数据处理过程简单，耗时少，且准确及时。

Description

一种浮游植物快速定性定量优化方法

技术领域

本发明涉及一种浮游植物鉴定技术，尤其是涉及一种浮游植物快速定性定量优化方法。

背景技术

近年来水华和赤潮现象日益频繁，引起了一系列环境和健康问题。国家水利部于2008年初启动了全国重点湖泊、水库、城市河湖的藻类监测工作；国家环境保护部也于2009年初开始加强我国环境监测系统的藻类监测队伍和监测水平；国家建设部亦要求全国自来水系统各水质监测中心加强源水的藻类及藻毒素监测工作。

我国的“水环境监测规范”要求：浮游植物(浮游藻类)定量计数必须鉴定到属；“近海污染生态调查和生物监测”规定：优势种、常见种、赤潮生物种应鉴定到种。而要精确评价藻类在水体中的含量状况，必须知道各藻种的细胞密度、各藻种的生物量、各藻门(一个门包含多个隶属于其下的藻种，例如绿藻门包含蛋白核小球藻、多线四鞭藻、齿牙栅藻等藻种，门的细胞密度即门下各藻种的细胞密度之和。)的细胞密度和生物量等；要精确评价藻类群落结构特征，则至少应计算马格里夫丰富度指数、香农威乐多样性指数、辛普森多样性指数、均匀性指数及各藻门占藻类总量的比例(包括细胞密度和生物量)。

当前藻类监测的主要手段有两种，分别是经典的显微鉴定计数法和利用进口的藻类在线分析仪进行检测的方法。

进口的藻类在线分析仪是基于藻的色素分析来确定藻的浓度，价格昂贵，且只能宏观地把藻分为四大类，根本无法精确的鉴定藻种并计算藻种的细胞密度。而经典的显微鉴定计数法，所需的调查成本相对较低，且能够精确地评价各藻种的细胞密度、藻种组成结构等一系列指标，但存在耗时较长等缺点，同时其要求检测人员需具备丰富的水生生物学知识，因此完善经典的显微鉴定计数法成为了提高水质调查效率的关键。

经典的显微鉴定计数法分为定性观察和定量观察两部分，定性观察的流程如图2a所示，其主要过程为：1)拖网取水样；2)水样镜检；3)发现藻类；4)翻阅图谱确定藻种，如果存在新的藻种，则重新镜检，并返回步骤3)继续操作，如果不存在新的藻种，则完成定性观察；定量观察的流程如图2b所示，其主要过程为：1)固定体积采水；2)过滤浓缩得水样；3)水样镜检观测，同时翻阅图谱识别出各藻种；4)在纸上画“正”计数各藻种的个体数量；5)将各藻种的个体数量数据制表；6)根据各藻种的个体数量分别统计各藻种的细胞密度；7)根据各藻种的细胞密度寻找最优藻种及其细胞密度、统计不同门(一个门包含多个隶属于其下的藻种，例如绿藻门包含蛋白核小球藻，多线四鞭藻，齿牙栅藻等藻种，门的细胞密度即门下各藻种的细胞密度之和。)的细胞密度、计算相关生物指数；8)根据某藻种的单位湿重和细胞密度计算该藻种的生物量；9)根据所有藻种的生物量分别统计出不同门的生物量和最优藻种的生物量；10)综合藻类相关生物指数、不同门的细胞密度、最优藻种的细胞密度、最优藻种的生物量和不同门的生物量等各项指标并制表，完成定量观察。

经典的显微鉴定计数法具体到定性观察存在以下问题：1、藻类无照片保存，再现存在非常大的困难(特别是含量较少且一时难以鉴定的藻种)，这影响了藻类鉴定的准确性；2、藻种较多时，不可避免会出现重复劳动(例如忘了当前的藻种是否已出现过，需要查书)，耗时长；具体到定量观察存在以下问题：1、在计数过程中，如果藻种较多，则确定藻种名称就需要不断翻书，对于新手要分辨100个左右的藻种还是有点困难的；2、数据记录及处理过程繁多，需要进行制表、填写藻种的单位湿重、编写公式等大量机械劳动，每个样品都得进行一次数据处理，100个样品就是100次数据处理，工作量大，容易使检测人员疲劳和出错，耗时长。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种浮游植物快速定性定量分析的优化方法，其能够大幅度缩短鉴定过程所需时间，且能够有效提高鉴定结果的准确率。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种浮游植物快速定性定量优化方法，其分为定性优化过程和定量优化过程，其特征在于所述的定性优化过程的具体步骤为：1a.拖网采集水样；2a.水样镜检；3a.利用电子目镜对水样中的各藻种进行拍照，并将拍下的藻种照片传输到计算机终端设备上，保存于预设于计算机终端设备中的照片数据库中；4a.在计算机终端设备上，打开预设的快捷定性库，对比拍下的藻种照片与快捷定性库中的藻种照片，如果在快捷定性库中找到与拍下照片中的藻种形态符合的藻种，则直接确定拍下照片中的藻种，并对拍下照片进行命名，完成定性优化过程；否则，打开预设的完整定性库，根据完整定性库的分类检索表，不断缩小拍下照片中的藻种在分类检索表中的分类位置，并根据所在分类位置对拍下的藻种照片进行命名，完成定性优化过程；

所述的定量优化过程的具体步骤为：1b.固定体积采水；2b.过滤浓缩获取水样；3b.水样镜检；4b.利用生物显微镜观察水样中的各藻种，并根据定性优化过程中保存于计算机终端设备的照片数据库中的藻种照片，通过计算机终端设备对所观察的水样中的所有藻种分藻种进行计数，得到各藻种的个体数，同时记下本次观察所测的视野体积；5b.计算机终端设备根据采水体积、过滤浓缩获取的水样的体积、藻种的单位质量、藻种的个体数及本次观察所测的视野体积，分别计算水样中各藻种的细胞密度和生物量，定义当前计算的是水样中第i种藻种的细胞密度和生物量，记第i种藻种的细胞密度为n_i，记第i种藻种的生物量为s_i，n_i＝(l_i×V1)/(V2×V0)(cell/L)，s_i＝(l_i×V1×k_i)/(V2×V0)(mg/L)，其中，V0表示采水体积，单位为L，V1表示过滤浓缩获取的水样的体积，单位为ml，V2表示本次观察所测的视野体积，单位为ml，l_i表示第i种藻种的个体数，单位为cell，k_i表示第i种藻种的单位质量，单位为(mg/cell)，1≤i≤M，M表示水样中的藻种数，在此，可预先将各种藻种的单位质量存储于计算机终端设备上，计算时直接调用；对于非常见藻种即未知藻种，其单位质量可根据生物显微镜观察时该藻种的体积和水的密度估算得到；6b.计算机终端设备根据水样中各藻种的细胞密度和生物量，计算水样中所有藻种的总细胞密度和总生物量，分别记为N和S， $N=\underset{j=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}[(l_j\×V1)/(V2\×V0)](\mathrm{cell}/L),$ $S=\underset{j=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}[(l_j\×V1\×k_j)/(V2\×V0)](\mathrm{mg}/L);$ 7b.计算机终端设备根据水样中的藻种数、水样中所有藻种的总细胞密度和水样中各藻种的细胞密度，分别计算马格里夫丰富度指数、香农威乐多样性指数、辛普森多样性指数、均匀性指数，记马格里夫丰富度指数为M arg alef，记香农威乐多样性指数为Shannon，记辛普森多样性指数为Simpon，记均匀性指数为Pilous，M arg alef＝(M-1)/InN， $\mathrm{Shannon}=-\underset{i=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}[(n_i/N)\×{\log }_2(n_i/N)],$ $\mathrm{Simpon}=N(N-1)/\underset{i=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}\left[n_i(n_i-1)\right],$ $\mathrm{Pilous}=[-\underset{i=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}(n_i/N)\mathrm{In}(n_i/N)]/\mathrm{InM},$ 其中，M表示水样中的藻种数，N表示水样中所有藻种的总细胞密度，n_i表示水样中第i种藻种的细胞密度；8b.计算机终端设备生成报表，完成定量优化过程。

所述的快捷定性库为一图片检索库，所述的快捷定性库的建立过程为：利用电子目镜拍摄各种常见藻种的显微照片，然后将各种常见藻种的显微照片存储于计算机终端设备的空的快捷定性库中。

所述的完整定性库为一电子检索表，所述的完整定性库的建立过程为：在计算机终端设备中录入浮游植物的分类检索表构成电子检索表。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、在定量优化过程中，集成了数据处理过程，只需在计算机终端设备上对水样中各藻种进行计数并填写采水体积、过滤浓缩获取的水样的体积、本次观察所测的视野体积三个参数，数据的分析工作是计算机终端设备自动完成的，不需要制表、编写公式和数据的分类汇总(如计算各藻门的相关指标，前5位优势种的相关指标)，数据处理过程简单，耗时少，且准确及时。

2、在定性优化过程中，利用电子目镜对各藻种进行拍照，并将拍下的藻种照片存入计算机终端设备中，保证了藻种信息的再现，从而可提高藻类鉴定准确性；利用完整定性库的分类检索表可方便地确定未知藻种，从而能够更准确地实现藻类的鉴定工作。

3、本发明的定性优化过程可方便地检查出当前藻种是否重复，即在定性过程中发现某藻种，往往会因为藻种较多而忘记该藻种是否已经出现过，而本发明通过在计算机终端设备中建立一个照片数据库，这样只要搜索照片数据库就可以知道该藻种是否已经拍照，而如果采用经典的显微鉴定计数法则需要对照已发现的藻种翻书验证，这样耗时较长；本发明的定量优化过程可方便地确定当前藻种对应的名称，即在定量过程中要计数某藻种，往往会因为藻种较多而记不住该藻种的名称，而本发明通过在计算机终端设备中建立一个照片数据库，这样只要搜索照片数据库就可以找到该藻种，确定该藻种的名称，再进行计数；而如果采用经典的显微鉴定计数法则需要对照已发现的藻种翻一遍书，以确定那个要计数的藻种的名称，耗时较长。

附图说明

图1a为本发明方法的定性优化过程图；

图1b为本发明方法的定量优化过程图；

图2a为经典的显微鉴定计数法的定性观察流程图；

图2b为经典的显微鉴定计数法的定量观察流程图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明提出的一种浮游植物快速定性定量优化方法，其分为定性优化过程和定量优化过程。

在此具体实施例中，定性优化过程如图1a所示，定性优化过程的具体步骤为：

1a.拖网采集水样。在此具体实施例中，浮游植物定性采样采用25^#浮游生物网(网孔直径为64μm)在水面表层呈“∞”字形缓慢来回捞取，然后将浮游生物网内浓缩液置于250ml的塑料水样瓶中，现场用现有的鲁哥氏液固定，为带回实验室进行水样镜检做准备。

2a.水样镜检。

3a.利用电子目镜对水样中的各藻种进行拍照，并将拍下的藻种照片通过有线或无线的方式传输到计算机终端设备上，再保存于预设于计算机终端设备中的照片数据库中。其中，照片数据库为在计算机终端设备上预设的一个空数据库，拍下的藻种照片传输至计算机终端设备时被保存于照片数据库中，以便再现或后续操作调用。

4a.在计算机终端设备上，打开预设的快捷定性库，对比拍下的藻种照片与快捷定性库中的藻种照片，如果在快捷定性库中找到与拍下照片中的藻种形态符合的常见藻种，则直接确定拍下照片中的藻种名称，并对拍下的照片进行命名，完成定性优化过程；否则，打开预设的完整定性库，根据完整定性库的分类检索表不断缩小拍下照片中的藻种在分类检索表中的分类位置，并根据所在分类位置对拍下的藻种照片进行命名，完成定性优化过程。

在此具体实施例中，还可进一步利用台微尺对拍下照片中的藻种的细胞长度进行测量，作为与完整定性库的分类检索表进行对比的条件。

在此具体实施例中，定量优化过程如图1b所示，定量优化过程的具体步骤为：

1b.固定体积采水。在此具体实施例中，浮游植物定量采样采用2.5L的有机玻璃采水器采集，表层水样采集为自表层以下0.5m处的水10L；然后用25^#浮游植物网进行过滤浓缩，浓缩液置于250ml的塑料水样瓶中，现场用现有的鲁哥氏液固定。

2b.过滤浓缩获取水样。用鲁哥氏液固定后的水样带回实验室后静置沉淀，浓缩定容获取50ml的水样。

3b.水样镜检。

4b.利用生物显微镜观察水样中的各藻种，并根据定性优化过程中保存于计算机终端设备的照片数据库中的藻种照片，通过计算机终端设备对所观察的水样中的所有藻种分藻种进行计数，得到各藻种的个体数，同时记下本次观察所测的视野体积。

5b.计算机终端设备根据采水体积、过滤浓缩获取的水样的体积、藻种的单位质量、藻种的个体数及本次观察所测的视野体积，分别计算水样中各藻种的细胞密度和生物量，定义当前计算的是水样中第i种藻种的细胞密度和生物量，记第i种藻种的细胞密度为n_i，记第i种藻种的生物量为s_i，n_i＝(l_i×V1)/(V2×V0)(cell/L)，s_i＝(l_i×V1×k_i)/(V2×V0)(mg/L)，其中，V0表示采水体积，单位为L，V1表示过滤浓缩获取的水样的体积，单位为ml，V2表示本次观察所测的视野体积，单位为ml，l_i表示第i种藻种的个体数，单位为cell，k_i表示第i种藻种的单位质量，单位为(mg/cell)，1≤i≤M，M表示水样中的藻种数。在此，可预先将各种藻种的单位质量存储于计算机终端设备上，计算时直接调用；对于非常见藻种即未知藻种，其单位质量可根据生物显微镜观察时该藻种的体积和水的密度估算得到。

6b.计算机终端设备根据水样中各藻种的细胞密度和生物量，计算水样中所有藻种的总细胞密度和总生物量，分别记为N和S， $N=\underset{j=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}[(l_j\×V1)/(V2\×V0)](\mathrm{cell}/L),$ $S=\underset{j=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}[(l_j\×V1\×k_j)/(V2\×V0)](\mathrm{mg}/L).$

7b.计算机终端设备根据水样中的藻种数、水样中所有藻种的总细胞密度和水样中各藻种的细胞密度，分别计算马格里夫丰富度指数、香农威乐多样性指数、辛普森多样性指数、均匀性指数，记马格里夫丰富度指数为M arg alef，记香农威乐多样性指数为Shannon，记辛普森多样性指数为Simpon，记均匀性指数为Pilous，M arg alef＝(M-1)/InN， $\mathrm{Shannon}=-\underset{i=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}[(n_i/N)\×{\log }_2(n_i/N)],$ $\mathrm{Simpon}=N(N-1)/\underset{i=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}\left[n_i(n_i-1)\right],$ $\mathrm{Pilous}=[-\underset{i=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}(n_i/N)\mathrm{In}(n_i/N)]/\mathrm{InM},$ 其中，M表示水样中的藻种数，N表示水样中所有藻种的总细胞密度，n_i表示水样中第i种藻种的细胞密度。

8b.计算机终端设备生成报表，完成定量优化过程。在此，报表通常包含Magalef、Shannon、Simpson、Pielou、藻类总密度、藻类总生物量、前五位的优势种名称、前五位的优势种细胞密度、前五位的优势种细胞密度比、前五位的优势种生物量比、各藻门的藻种数、细胞密度、生物量及其所占比例等数据。

表1给出了在采水体积V0＝10L、过滤浓缩获取的水样的体积V1＝50ml及观察藻种时的视野体积V2＝0.02ml下，定量优化得到的各个技术指标的报表。

表1  定量优化得到的各个技术指标值

表1中第1优势种即表示细胞密度最大的藻种，第2优势种即表示细胞密度第二大的藻种，依次类推；第1优势种密度比表示第1优势种的细胞密度与所有藻种的总细胞密度之比，其他依次类推；第1优势种量比表示第1优势种的生物量与所有藻种的总生物量之比，其他依次类推；绿藻种比表示绿藻藻种数与总藻种之比，其他依次类推；绿藻密度比表示绿藻门藻种的细胞密度之和与所有藻种的总细胞密度之比，其他依次类推；绿藻生物量比表示绿藻门藻种的生物量之和与所有藻种的总生物量之比，其他依次类推。

表1所列报表是计算机终端设备根据采水体积、过滤浓缩获取的水样的体积、本次观察所测的视野体积及藻种的个体数自动生成的，快捷方便、耗时少，且准确率高。而如果采用经典的显微鉴定计数法，则一般在Excel中制作数据表来获得各项指标，由于每瓶水样都要进行一次制表工作，因此当样品量很大时，经典的显微鉴定计数法工作量就变得很大。

Claims (1)

1.一种浮游植物快速定性定量优化方法，其分为定性优化过程和定量优化过程，其特征在于所述的定性优化过程的具体步骤为：1a.拖网采集水样；2a.水样镜检；3a.利用电子目镜对水样中的各藻种进行拍照，并将拍下的藻种照片传输到计算机终端设备上，保存于预设于计算机终端设备中的照片数据库中；4a.在计算机终端设备上，打开预设的快捷定性库，对比拍下的藻种照片与快捷定性库中的藻种照片，如果在快捷定性库中找到与拍下照片中的藻种形态符合的藻种，则直接确定拍下照片中的藻种，并对拍下照片进行命名，完成定性优化过程；否则，打开预设的完整定性库，根据完整定性库的分类检索表，不断缩小拍下照片中的藻种在分类检索表中的分类位置，并根据所在分类位置对拍下的藻种照片进行命名，完成定性优化过程；所述的快捷定性库为一图片检索库，所述的快捷定性库的建立过程为：利用电子目镜拍摄各种常见藻种的显微照片，然后将各种常见藻种的显微照片存储于计算机终端设备的空的快捷定性库中；所述的完整定性库为一电子检索表，所述的完整定性库的建立过程为：在计算机终端设备中录入浮游植物的分类检索表构成电子检索表； 

所述的定量优化过程的具体步骤为：1b.固定体积采水；2b.过滤浓缩获取水样；3b.水样镜检；4b.利用生物显微镜观察水样中的各藻种，并根据定性优化过程中保存于计算机终端设备的照片数据库中的藻种照片，通过计算机终端设备对所观察的水样中的所有藻种分藻种进行计数，得到各藻种的个体数，同时记下本次观察所测的视野体积；5b.计算机终端设备根据采水体积、过滤浓缩获取的水样的体积、藻种的单位质量、藻种的个体数及本次观察所测的视野体积，分别计算水样中各藻种的细胞密度和生物量，定义当前计算的是水样中第i种藻种的细胞密度和生物量，记第i种藻种的细胞密度为n_i，记第i种藻种的生物量为s_i，n_i=(l_i×V1)(V2×V0)(cell/L)，s_i=(l_i×V1×k_i)(V2×V0)(mg/L)，其中，V0表示采水体积，单位为L，V1表示过滤浓缩获取的水样的体积，单位为ml，V2表示本次观察所测的视野体积，单位为ml，l_i表示第i种藻种的个体数，单位为cell，k_i表示第i种藻种的单位质量，单位为(mg/cell)，1≤i≤M，M表示水样中的藻种数；6b.计算机终端设备根据水样中各藻种的细胞密度和生物量，计算水样中所有藻种的总细胞密度和总生物量，分别记为N和S， 

7b.计算机终端设备根据水样中的藻种数、水样中所有藻种的总细胞密度和水样中各藻种的细胞密度，分别计算马格里夫丰富度指数、香农威乐多样性指数、辛普森多样性指数、均匀性指数，记马格里夫丰富度指数为Margalef，记香农威乐多样性指数为Shannon，记辛普森多样性指数为Simpon，记均匀性指数为Pilous，Margalef=(M-1)/InN，

其中，M表示水样中的藻种数，N表示水样中所有藻种的总细胞密度，n_i表示水样中第i种藻种的细胞密度；8b.计算机终端设备生成报表，完成定量优化过程，在此，报表包含以下数据：Magalef、Shannon、Simpson、Pielou、藻类总密度、藻类总生物量、前五位的优势种名称、前五位的优势种细胞密度、前五位的优势种细胞密度比、前五位的优势种生物量比、各藻门的藻种数、细胞密度、生物量及其所占比例。 

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