CN101971009B - 未结合的分析物的半胱氨酸-标记的荧光探针的开发和应用 - Google Patents

Abstract

本发明描述了高通量发现蛋白的方法，所述蛋白在半胱氨酸残基处荧光标记，并且在与未结合的分析物结合时经历两种波长下的荧光比例的改变。本发明公开了在半胱氨酸残基处标记的探针，以及在半胱氨酸和赖氨酸处用两种不同的荧光团标记的探针。这些探针有效用于流体样品中疏水物质的表征和测量，特别是未结合的脂肪酸水平的表征和测量。可以确定个体的未结合的游离脂肪酸的谱型，其可以用来确定所述个体的疾病相对危险度。

Description

未结合的分析物的半胱氨酸-标记的荧光探针的开发和应用

相关申请

本申请要求于2008年1月18日提交的临时美国申请号61/022,261的优先权，其通过引用结合于此。

关于联邦政府资助的研发的声明

本工作部分是由来自国立卫生研究院的Roadmap基金号R33DK070314和SBIR基金号R43DK073535支持的。因此，美国政府可以拥有对本发明的某些权利。

涉及序列表

在说明书最后包括一份序列表。

发明背景

发明领域

本发明领域涉及高通量发现在半胱氨酸残基处(探针)荧光标记的蛋白，所述在半胱氨酸残基处(探针)荧光标记的蛋白在与未结合的分析物结合时经历两种波长下的荧光比例变化，并且所述探针用来测量未结合的分析物的水平，所述未结合的分析物包括未结合的游离脂肪酸和其它未结合的代谢物。

相关领域描述

为了本公开内容的目的，“分析物”是分子量约为2000Da以下的分子，并且未结合的分析物是在水溶液中的这些分子。这些包括在人或动物生理或病理生理过程中天然存在的代谢物和生理学重要的分子，和药物分子及其代谢产物，以及营养分子及其代谢产物。取决于其溶解性，每种分析物级分在水溶液中作为单体存在(带电荷的或中性的)。该级分称为“未结合的分析物”级分，并且包括未结合的代谢物(METu)。

为了本公开内容的目的，“脂肪酸”，一种特定类型的代谢物，是1-30个碳原子的未酯化的羧化烷基链，其可以作为中性(例如，质子化的、钠或钾盐)或离子物种存在，这取决于水性介质的pH和条件。“游离脂肪酸(FFA)”等价于脂肪酸，并且这两个术语是指所有FFA，包括在水溶液中作为单体的那些和不处于溶液中的那些(例如，与其它大分子(蛋白、膜)结合的)、细胞或部分FFA聚集物(胶束、皂和其它更复杂的聚集物)。在水溶液中作为单体存在的FFA(带电荷的或中性的)称为“未结合的游离脂肪酸(FFAu)”。

为了本公开内容的目的，采用的术语“脂质”具有其通常和惯用的意思，并且定义为在有机溶剂中最可溶而在水相中具有某种程度的溶解性水平(作为未结合的级分)的化学化合物。因此，“脂质结合蛋白”包括能够结合脂质的任何蛋白，所述脂质如本文所定义。

未结合的分子的水平，诸如例如脂质、激素、和代谢产物，当在适当的人或动物流体中测量时，可以提供健康和疾病的诊断信息。越来越明显的是，确定所述分子的未结合(也叫作‘水相’或‘游离’)浓度提供关于生理平衡的重要信息。许多代谢物是疏水性分子，其具有低水溶性和比其“总”浓度低得多的未结合的浓度，其中所述“总的”大部分可以与蛋白或细胞结合。在生物流体中，通常调节未结合的分子的浓度以在正常生理条件下保持相对恒定的未结合浓度。这种调节通过所述分子与载体蛋白诸如例如白蛋白的相互作用而进行。因此，大部分所述分子通常与白蛋白或其它载体结合。然而，少部分分子可以与白蛋白解离(并且重新结合)进入水相，并且这些是未结合的分子。

胞内脂质结合蛋白(iLBP)是低分子量单链多肽家族。存在4种公认的亚族。亚族I包含对维生素A衍生物如视黄酸和视黄醇特异的蛋白。亚族II包含具有针对胆酸、类花生酸(eiconsanoids)、和血红素的特异性的蛋白。亚族III包含肠型脂肪酸结合蛋白(FABPs)，并且亚族IV包含所有其它类型的脂肪酸结合蛋白(Haunerland，等(2004)Progress in LipidResearch(脂质研究进展)卷43：328-349)。整个家族特征在于共有的三维折叠。不同亚族的配体结合特性极大地重叠。亚族I(Richieri等(2000)Biochemistry(生物化学)39：7197-7204)和亚族II两族的野生型蛋白结合脂肪酸及其天然配体。此外，单个氨基酸取代能够使亚族I和II蛋白的配体结合特性互换(Jakoby等(1993)Biochemistry(生物化学)32：872-878)。

美国专利号5,470,714和U.S.6,444,432，其通过引用结合于此，描述了用于确定未结合的游离脂肪酸(FFAu)的探针。这些探针使用来自iLBP家族的天然或突变形式蛋白构建。如上文所讨论，该家族包括FABPs(Banaszak等(1994)Adv.Protein Chem.(蛋白质化学进展)45：89-151；Bernlohr等(1997)Ann.Rev.Nutrition(营养学综述年鉴)，17：277-303)。FABPs是分子量约为15kDa的胞内蛋白，并且具有结合1个或2个FFA的结合位点。

为了本公开内容的目的，“探针”是在半胱氨酸残基处荧光标记的iLBPs，并且其在与分析物结合时经历以两种不同波长测量的荧光指数比例的改变。探针还可以是在一个半胱氨酸残基处用一种荧光团荧光标记且在另一个不同的残基处优选是赖氨酸残基处用不同的荧光团荧光标记的iLBP，以便如果在与分析物结合时仅一种荧光团的荧光变化，则在两种波长下的荧光指数比例是不同的。这样的探针可以用来确定特定的未结合的分析物的水性浓度，所述特定的未结合的分析物包括FFAu，METu和其它亲脂性激素，和药物，否则由于它们在水溶液中极差的溶解性特性，这是很难确定的。对于准确确定未结合的分析物的胞内以及胞外浓度，荧光响应的比例变化是很重要的。

然而，尽管蛋白结构和与目的配体的共同复合物结构是可以获得的，但是分子理论的现有技术不足以从头设计具有任何所需特异性和敏感性的探针。因此，典型地需要大量的实验，以找到不但以所需的特异性结合而且产生所需要的指示配体结合的信号比例变化的蛋白探针。通过完全的随机诱变策略提高特异性和信号传导即使对于小蛋白如FABP也是不切实际的，原因在于：a)对于131个残基的FABP存在20¹³¹种可能的突变体，和b)筛选甚至单个探针针对一定范围的METu和其它配体分子的结合特异性需要大量的时间进行纯化、反应化学和探针荧光响应表征。

因此，需要快速产生并且筛选数以千计所得到的突变体探针的方法。每种突变体需要产生，并且以充足的量与荧光基团化学反应，从而使其敏感性和选择性能够测量多种不同配体(也叫作未结合的分析物)。还重要的是，所述探针应该尽可能不含污染蛋白、未反应的荧光团、以及任何其它可能干扰敏感性荧光测量的化合物。用于测量和比较探针对配体的响应的快速、自动的方法的开发也是重要的。

先前，将通过这些方法发现的在产生指示配体结合的信号比例变化中最有效的探针用6-丙烯酰-2-二甲氨基萘(acrylodan)主要在具有SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO 4的突变的大鼠肠FABP的27位赖氨酸处标记(Huber等Biochemistry(生物化学)(2006)45：14263-14274和于2005年3月21日提交的美国申请号11/085,792，其通过引用结合于此)。尽管在赖氨酸位置处用环境敏感的荧光团如6-丙烯酰-2-二甲氨基萘进行标记形成产生对配体结合敏感的荧光比例变化的探针，但是我们发现荧光团标记的化学计量、标记的异质性以及荧光团-蛋白化学键的稳定性是突变体依赖性的。例如，SEQ ID NO：2或具有L72A置换的SEQ ID NO：2的6-丙烯酰-2-二甲氨基萘标记产生实质上完全在单个赖氨酸位置(Lys 27)处标记的探针(例如图2)。然而，其它SEQ ID NO：2突变蛋白(SEQ IDNO：4)的6-丙烯酰-2-二甲氨基萘标记可以形成不完全标记的和/或在多于单个位置处被标记的探针(例如图3)。

不完全标记的突变蛋白产生作为荧光标记的和未标记的突变蛋白的混合物的“探针”。如先前所述(Richieri等J.Biol.Chem.(生物化学杂志)(1992)267：23495-23501)，对于标记的和未标记的突变蛋白的配体(分析物)结合亲和性通常不同，并且对于荧光标记的突变蛋白的配体(分析物)结合亲和性通常小于未标记的突变蛋白。此外，赖氨酸标记反应条件中的典型的改变可能在标记的和未标记的突变蛋白的级分中产生批与批之间(lot-to-lot)的差异。这是由于使用作为标记的和未标记的突变蛋白的混合物的探针确定的未结合的配体或分析物的浓度可能依赖于未标记的突变蛋白级分而引起的问题。这可能发生，是因为大量的载体(例如白蛋白)结合的配体(分析物)级分与探针溶液的未标记的突变蛋白级分结合。在仅有少量突变蛋白级分被荧光标记的情形中，这种效应可能加剧，因此需要更大量的探针来产生足够强的荧光信号。靶向赖氨酸残基进行荧光标记也是潜在有问题的，因为大部分iLBPs具有可以被标记的数个赖氨酸残基以及游离的N端氨基。在多个位点被标记的情形下，探针针对分析物结合的响应的动力学范围将受到损害，并且响应可能不揭示单个等发射点。

使iLBP蛋白突变从而包含单个半胱氨酸并且使用仅荧光标记半胱氨酸的条件应该产生均质标记的蛋白。然而，用半胱氨酸置换SEQ ID NO：2位置27处的赖氨酸，然后与6-丙烯酰-2-二甲氨基萘反应形成在配体结合时不产生荧光比例变化的荧光标记的蛋白(例如，图1B或Kleinfeld美国专利5,470,714中的IANBDE)。而且，在Kleinfeld‘714中，发现用6-丙烯酰-2-二甲氨基萘标记I-FABP突变体Thr81Cys或Thr83Cys产生对FFAu结合无反应性的荧光蛋白。荧光标记的半胱氨酸iLBPs的其它研究产生如在大鼠肝脏FABP中完全缺失对配体结合的敏感性(Evans和Wilton，Mol.Cell.Biochem.(分子细胞生物化学)(2004)98：135-140)或者揭示如在CRABP蛋白中比例变化的缺失(Donato和Noy Anal Biochem(生物化学年鉴)(2006)137：249-256)。因此需要产生半胱氨酸标记的探针的方法，该探针表现出赖氨酸标记的探针的比例响应(Huber等Biochemistry(生物化学)(2006)45：14263-14274和于2005年3月21日提交的美国申请号11/085,792，其通过引用结合于此)。

此处所述的本发明的实施方案通过公开用于发现半胱氨酸置换的位置的方法而满足这些需求，所述方法允许：a)快速产生大量的半胱氨酸标记的突变蛋白探针(半胱氨酸标记的突变蛋白探针的文库)，和b)快速筛选这些探针，从而发现对多组未结合的分析物具有不同特异性且通过荧光比例改变而对分析物结合响应的探针。本发明的重要方面在于，其省略了先前表征配体与蛋白结合的必要且非常费时的步骤；仅表征探针本身。这很重要，不仅是为了避免蛋白表征步骤，而且因为探针的特性通常不可由配体-蛋白结合特征预测到。例如，不同的蛋白可能具有非常相似的结合亲和力，但是其衍生的探针的荧光响应可能是非常不同的。

此处所述的本发明的其它实施方案是通过将多组赖氨酸突变为精氨酸而减少在多个赖氨酸位点处荧光标记的可能性的方法，由此仅留下一个荧光团反应位点。还描述了产生用两种不同的荧光团标记的探针的方法。所述探针响应于分析物的结合，在两种不同波长处测量的荧光指数的比例发生改变。这通过用对分析物结合不表现出响应或表现出显著减少的响应的第二荧光团标记，使得响应于分析物结合不表现比例荧光指数改变的探针转化为比例探针。

发明概述

本发明的实施方案针对产生和筛选探针的高通量方法，其包括下述步骤的一个或多个：

(a)由多核苷酸模板产生编码具有各种iLBP突变蛋白的蛋白文库的多核苷酸，从而产生iLBP突变蛋白文库，所述iLBP突变蛋白具有半胱氨酸残基；

(b)表达所述iLBP突变蛋白；

(c)通过结合至固体基质而纯化iLBP突变蛋白；

(d)将基质结合的iLBP突变蛋白与单种荧光团或两种不同的荧光团缔合，以产生探针；

(e)由所述固体基质回收探针；

(f)在存在和不存在一组未结合的目的分析物的条件下，在荧光计中筛选每种探针，从而确定每种探针与该组未结合的目的分析物的结合，每种未结合的目的分析物具有确定的未结合浓度，；

(g)在存在和不存在未结合的分析物的条件下，观察在两种不同波长下测量的探针的荧光指数比例的改变；和

(h)依据每种探针针对该组目的分析物的一组荧光响应，表征每种探针。优选地，所述荧光指数是在该组目的分析物中存在和不存在每种分析物的条件下，探针的强度、偏振和/或寿命。在优选实施方案中，荧光团共价结合到半胱氨酸残基上。

在优选实施方案中，所述未结合的分析物是未结合的代谢物。更优选地，所述未结合的代谢物是未结合的游离脂肪酸。

在优选实施方案中，由模板编码的iLBP是脂肪酸结合蛋白(FABP)，或其保留了结合分析物的能力的变体。

优选地，所述多核苷酸模板编码具有可裂解或不可裂解的亲和标签的iLBP突变蛋白。更优选地，所述模板多核苷酸模板编码具有多-组氨酸亲和标签的iLBP突变蛋白，并且所述固体基质包括固定的金属螯合剂。

在优选实施方案中，所述iLBP突变蛋白在小于8的pH下用单种荧光团标记，以使该荧光团优先与半胱氨酸侧链反应。优选地，所述荧光团是6-丙烯酰-2-二甲氨基萘、丹磺酰氮丙啶、4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲基氨基]-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑酯(IANBDE)或4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲基氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(IANBDA)。

在备选的优选实施方案中，所述iLBP突变蛋白用第一荧光团和第二荧光团标记。优选地，一种荧光团为6-丙烯酰-2-二甲氨基萘、丹磺酰氮丙啶、4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲基氨基]-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑酯(IANBDE)或4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲基氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(IANBDA)。优选地，另一种荧光团是较长波长吸收和发射的荧光团，诸如Alexa Fluor染料、氟硼荧(Bodipy)、荧光素衍生物、若丹明衍生物或德克萨斯红(Texas Red)。在一些优选的实施方案中，标记包括使半胱氨酸在小于或等于8的pH下与第一荧光团反应；并且使赖氨酸在大于8的pH下与第二荧光团反应。在其它优选的实施方案中，标记包括使半胱氨酸在小于或等于8的pH下与第一荧光团反应；并且使iLBP突变蛋白的氨基端与第二荧光团反应。

在本发明的一些实施方案中，第二荧光团通过将接纳体蛋白或肽结构域添加到每个iLBP突变蛋白上而提供。优选地，所述接纳体蛋白或肽结构域选自由下列各项组成的组：SNAP-标签、CLIP-标签和ACP-标签等。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸突变体包含编码荧光蛋白的核苷酸区段。优选地，在与该组未结合的目的分析物中的分析物结合时，与探针的iLBP突变蛋白部分的荧光相比较，所述接纳体蛋白结构域或荧光蛋白在发射的荧光的强度和/或波长方面没有响应或具有显著减小的响应。

在优选实施方案中，分析物与载体大分子复合，所述载体大分子如白蛋白、脂质结合蛋白、脂囊泡或环糊精。分析物与载体大分子的复合物缓冲了未结合分析物的浓度，从而提供未结合的分析物的限制。在优选实施方案中，载体大分子是白蛋白。

在一些实施方案中，用下述步骤中的一个或多个替换步骤(d)和(e)：

洗涤结合的iLBP突变蛋白；

将所述iLBP突变蛋白从固体基质上去除；和

使未结合的iLBP突变蛋白与单种荧光团或两种不同的荧光团反应，以产生探针。

在优选实施方案中，所述方法还包括在iLBP突变蛋白与荧光团缔合之前使具有半胱氨酸残基的iLBP突变蛋白突变，以用任一种其它氨基酸优选精氨酸或丙氨酸替换所有表面可及的赖氨酸残基。

在备选的优选实施方案中，所述方法包括在iLBP突变蛋白与荧光团缔合之前使具有半胱氨酸残基的iLBP突变蛋白突变，以用任一种其它氨基酸优选精氨酸或丙氨酸替换除一个之外的所有表面可及的赖氨酸残基。在优选实施方案中，iLBP突变蛋白模板(SEQ ID NO：5)具有15个表面可及的赖氨酸。名称为KR14的突变蛋白在位置7、16、20、29、37、46、50、88、92、94、100、125、129和130处的赖氨酸突变为精氨酸。

优选实施方案针对通过经由下式来确定R的值而鉴定具有所需特征的探针：

R＝Fλ1/Fλ2

Fλ1是在第一发射波长处测量的荧光强度(存在分析物的探针的强度减去不存在探针的分析物的强度)，Fλ2是在第二发射波长处测量的荧光强度(存在分析物的探针强度减去不存在探针的分析物的强度)。在存在和不存在分析物的条件下R之间的差异由下式测量：

ΔR＝R_+分析物-R₀

R_+分析物是在存在分析物的条件下完成的测量的比值，R₀是在不存在分析物的条件下完成的测量的比值。探针的ΔR与标准物的ΔR_参照进行比较。

在一些优选实施方案中，所述标准物是由用于产生进行高通量筛选的突变的多核苷酸模板所编码的蛋白制成的荧光探针。在一些优选的实施方案中，所述标准物是ADIFAB或ADIFAB2。

在一些优选实施方案中，探针的ΔR是正的，且标准物的ΔR_参照是正的，即R_+分析物＞探针和参照的R₀。在一些优选实施方案中，探针的ΔR是负的，即R_+分析物＜探针的R₀。

在优选实施方案中，探针用n种未结合的分析物筛选，并且寻找这样的探针，其|ΔR|/ΔR_参照对于所述n种未结合的分子中的一种或多种是最大的且＞0.1并且对于其余未结合的分子至少小于0.1，其中|ΔR|是ΔR的绝对值。优选地，未结合的分析物是未结合的代谢物。更优选地，未结合的代谢物是未结合的脂肪酸。

本发明的实施方案涉及具有用荧光染料标记的单个半胱氨酸的iLBP突变蛋白。优选地，将在半胱氨酸-特异性标记条件下具有荧光团(fluor)标记活性的任何表面赖氨酸替换为另一种氨基酸，优选为丙氨酸。在优选实施方案中，使用与SEQ ID NO：5相对应的iLBP突变蛋白模板，27位处的赖氨酸是高度反应性的，并且被突变，典型地突变为丙氨酸。

在一些优选实施方案中，iLBP突变蛋白具有分别用荧光染料标记的单个半胱氨酸和单个赖氨酸。

优选地，所述荧光染料是6-丙烯酰-2-二甲氨基萘。优选地，所述iLBP是脂肪酸结合蛋白。

在优选实施方案中，所述iLBP突变蛋白对应于SEQ ID NO：5，其具有在选自8、11、14、17、18、21、23、24、26、27、30、31、34、36、38、40、47、49、51、53、55、56、58、60、62、68、70、71.72、73、74、75、76、78、80、82、89、91、93、95、102、104、106、113、115、117、119和126的位置处的至少一个突变或对应于SEQ ID NO：5的同源物，其具有在与选自SEQ ID NO：5的8、11、14、17、18、21、23、24、26、27、30、31、34、36、38、40、47、49、51、53、55、56、58、60、62、68、70、71.72、73、74、75、76、78、80、82、89、91、93、95、102、104、106、113、115、117、119和126的位置同源的位置处的至少一个突变。

在优选实施方案中，所述iLBP突变蛋白对应于SEQ ID NO：5，其具有在选自SEQ ID NO：5的21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、55、74、73、和76位的位置处或在与选自SEQ ID NO：5的21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、55、74、73、和76位的位置同源的位置处插入的半胱氨酸。

在优选实施方案中，所有表面可及的赖氨酸残基替换为不是赖氨酸的氨基酸残基，优选精氨酸或丙氨酸。在其它优选实施方案中，除一个外的所有表面可及的赖氨酸残基被替换为不是赖氨酸的氨基酸，优选为精氨酸或丙氨酸。

本发明的优选实施方案涉及iLBP突变蛋白，其为L10P7A4-L30C、L11P7B3-V26C、L13EP16E11、L18P5G12-K27C、L50BP4E2、L50BP9D5、L61P8B12、L68P3H10、或L71AP22B3。其它优选实施方案涉及作为胆红素特异性探针的iLPP突变蛋白，诸如L2P14F7-MGCFD-TR和L2P 14F7-KR14-MGCFD-TR。

本发明的实施方案涉及融合蛋白，其包含与荧光蛋白融合的具有用荧光染料标记的单个半胱氨酸的iLBP。

本发明的实施方案涉及蛋白嵌合体，其包含具有用荧光染料标记的单个半胱氨酸的iLBP和接纳体蛋白或肽结构域。优选地，所述接纳体蛋白或肽结构域是SNAP-标签、CLIP-标签、ACP-标签或生物素化标签。然后，将这些标签用第二目的荧光团标记。

本发明的其它方面、特征和优点将通过下述优选实施方案的详细描述变得清楚。

附图简述

现在将参考意欲举例说明而不是限制本发明的优选实施方案的附图来描述本发明的这些和其它特征。

图1是在132-133位具有末端arg-gly和his6X标签的SEQ 2突变体ADIFAB(图1A)，K27C(图1B)和V26C K27A(图1C)在22℃随油酸的增加而变化的荧光光谱。Ex＝386nm。

图2是ADIFAB(图2A)和V26C K27A突变体(图2B)的HPLC色谱。280nm和375nm迹线分别对应于蛋白和6-丙烯酰-2-二甲氨基萘。

图3显示6-丙烯酰-2-二甲氨基萘标记的由赖氨酸(图3A，3C，3E)转化为半胱氨酸(图3B，3D，3F)的探针的HPLC色谱的吸收结果的实例。上部迹线是关于蛋白的(280nm)，下部迹线是关于6-丙烯酰-2-二甲氨基萘的(375nm)。

图4显示赖氨酸(图4A，4C)和半胱氨酸(图4B，4D)探针的荧光发射谱。L2探针是棕榈酸盐特异性的，并且显示了棕榈酸钠滴定光谱。L11探针是硬脂酸盐特异性的，并且显示了硬脂酸钠滴定光谱。

图5显示对方框中列出的分别为10nM的9种FFAu(花生四烯酸盐(arachidonate)(AA)、亚麻酸盐(LNA)、亚油酸盐(LA)、油酸盐(OA)、棕榈酸盐(PA)、棕榈油酸盐(POA)、硬脂酸盐(SA)、二十二碳六烯酸盐(docosahexanoate)(DHA)、和二十碳五烯酸盐(EPA)的探针响应，表示为ΔR/Ro。包括ADIFAB2响应作为参照。L58文库是POA特异性的，L69文库是DHA特异性的。图5A显示L30C K27A文库的探针响应谱。图5B显示V26C K27A文库的探针响应谱。

图6显示比较无或有突变为精氨酸的14个表面可及的赖氨酸的探针的HPLC色谱。显示了这些探针的两个实例，其中探针保留其表面赖氨酸侧链的完全互补体(图6A，6C)，对应的探针中，14个表面赖氨酸被突变为精氨酸(图6B，6D)。原始探针表现出明显的多个标记位点，而这在KR14突变体中显著减小为近乎同质(图6B，6D)。如预测的，KR14突变体的Ro显著更小，并且因此具有比原始探针更大的动力学范围。每个图片的上部迹线反映蛋白的280nm吸光度，下部迹线反映6-丙烯酰-2-二甲氨基萘在375nm处的吸光度。

图7显示通过用6-丙烯酰-2-二甲氨基萘和德克萨斯红标记合成的两种双荧光团胆红素比例探针的胆红素结合等温线。图7A显示N端Ala替换为GC的双标记(6-丙烯酰-2-二甲氨基萘和德克萨斯红)的L2P14F7对增加浓度的胆红素的比例响应。图7B显示具有N端MGCFD接头的双标记(6-丙烯酰-2-二甲氨基萘和德克萨斯红)的L2P14F7KR14对增加浓度的胆红素的比例响应。

优选实施方案详述

尽管所述的实施方案代表了本发明的优选实施方案，但是应该理解本领域的技术人员可以在不背离本发明精神的条件下修改该方法。

本发明的优选实施方案涉及开发可以用来确定未结合的分析物的浓度的荧光蛋白分子。更具体地，本发明涉及：1)发现所述探针的高通量方法，2)所述探针用于临床医学、药物开发和基础科学的应用，3)开发用于确定特定的游离脂肪酸的未结合浓度的探针的实例，4)所述探针在提供用于监测健康和疾病的状态以早期诊断人类疾病以及用于监测治疗干预对病症或疾病的病程的作用的未结合代谢物谱中的应用。其它应用包括药物筛选和监测营养素的作用。值得注意的是，对于所述的每种探针，在各种种类的代谢物之间存在交叉反应性。例如，探针可以与视黄酸强结合，但是仍具有一些针对脂肪酸的亲和性。本发明实施方案所述的探针可以用于鉴定和量化宽泛范围的代谢物。

探针是通过共价添加一个或多个荧光分子(荧光团)而已经被标记的蛋白，其表现出在两种不同波长下测量的荧光指数比例的改变。在优选实施方案中，探针包含单个半胱氨酸，其上共价结合荧光团。在其它优选的实施方案中，探针包括结合代谢物的蛋白上的结合于半胱氨酸的一个荧光团和结合于不同位点优选赖氨酸位点上的第二荧光团。在其它优选的实施方案中，探针包括结合代谢物的蛋白上的结合于半胱氨酸上的一个荧光团和结合于不同位点优选末端氨基上的第二荧光团。探针具有这样的特征：当其结合代谢物时，其荧光以可测量的方式经历荧光指数比例的改变。

在一些实施方案中，使用两种不同的荧光团，优选结合在半胱氨酸和赖氨酸上或结合在半胱氨酸和N端氨基上。两种荧光团中的一种是环境敏感性的，即，当与分析物结合时表现出荧光指数的改变。第二荧光团可以是环境敏感的，但是对于第二荧光团不必是环境敏感的。第二荧光团提供参照点，从而在分析物结合时，观察到在两种不同波长下的荧光比例的差异。第二荧光团可以不与配体结合反应或者可以以与第一荧光团不同的方式反应。优选地，相对于第一荧光团，第二荧光团具有在较长波长处的发射点。按照本发明可以用作第二荧光团的化学染料的实例包括但不限于，Alexa Fluor染料、氟硼荧染料、荧光素衍生物、若丹明衍生物和德克萨斯红。在优选的实施方案中，第二荧光团是德克萨斯红染料。

在有利于作为靶标结合位点的侧链或N端的条件下，进行要结合荧光团的氨基酸侧链的反应。例如，当标记半胱氨酸时，反应在小于或等于8的pH下进行，优选在4-8，更优选约5.8-7.2的pH下进行。当标记赖氨酸时，反应在大于8、优选在8.8-9.5的碱性pH下进行。

通过突变起始(模板)蛋白并且用荧光团标记突变的蛋白(突变蛋白)可以产生不同的探针。在优选实施方案中，起始蛋白被突变为包括用于结合荧光团的半胱氨酸残基，优选包括单个半胱氨酸残基。在一些优选实施方案中，进一步突变起始蛋白，从而删除表面可及的赖氨酸残基或将一个或多个表面可及的赖氨酸残基替换为另一种氨基酸残基，优选为精氨酸或丙氨酸，由此减少在多于一个位点处引入荧光团的可能性。表面可及的位点可以由iLBP已知且可获得的结构信息确定。在其它优选实施方案中，至少保留一个表面可及的赖氨酸，用于将第二荧光团结合到赖氨酸侧链上。然后，可以通过测量在添加确定浓度的未结合的代谢物时的荧光变化而评估每种这样的探针响应特定代谢物(或分析物)的能力。

生成文库

代表可能的探针的蛋白文库可以通过本领域已知的任何方式产生。在优选实施方案中，能够结合一种或多种未结合的代谢物的蛋白可以用作诱变模板。在所述优选的实施方案中，能够结合一种或多种未结合的代谢物的蛋白来自iLBP蛋白家族，包括视黄醇/视黄酸结合蛋白、胆酸盐结合蛋白、和脂肪酸结合蛋白(FABP)。所述蛋白可以结合脂肪酸、其它代谢物或脂肪酸和其它代谢物二者。除游离脂肪酸外，可能的代谢物包括但不限于，分子，诸如药物、药物代谢物、激素、前列腺素、白三烯、鞘氨醇、鞘脂、磷脂、糖脂、胆固醇和胆固醇衍生物以及其它类固醇、脂溶性维生素、胆酸盐、酶辅因子、类视黄醇如视黄酸和视黄醛、血红素和血红素代谢物、氨基酸、肽、碳水化合物和多价离子。

在更优选的实施方案中，野生型或突变的FABP基因用作诱变的初始模板或起点。由该模板产生突变FABP克隆的集合。在优选实施方案中，突变包括在FABP结合腔或螺旋帽中的一个或多个氨基酸替换。在优选实施方案中，具有131个氨基酸残基的突变的大鼠肠脂肪酸结合蛋白(rI-FABP)用作诱变的起点。

在更优选的实施方案中，改变配体结合的位点主要是在结合腔中或在形成FABP蛋白“帽”的α螺旋上的那些位点。不改变配体结合的位点主要是在蛋白表面上的那些位点。在一些实施方案中，可以通过选择改变配体结合的位点，然后对这些位点进行随机诱变，而构建文库。在所述“腔”或“帽”中的一些单一位点突变体可能不产生可溶蛋白，或者可能不能显著影响结合。然而，当与其它突变组合时，同一突变体可以在配体结合特异性方面引起显著且有利的改变。这样的位点也可以实验性地选择作为多位点诱变或文库构建的候选。

可以利用多种诱变方法来产生突变体集合或“文库”。诱变方法包括但不限于，易错PCR、利用确定的或简并的寡核苷酸的位点定向诱变、通过重叠延伸的剪接(SOE)、基因改组、或使用增变基因宿主株系。在优选实施方案中，利用基于PCR的诱变的低聚体定向方法来产生突变体集合或“文库”。然而，就筛选而言，不管文库是否包括已知的、特定的位点定向的突变体或“未知的”随机突变体种类。两种类型的文库以同样的效率筛选。

在优选实施方案中，规定所需突变的低聚体引发包含模板基因的载体的酶学复制。所述低聚体，因此所述所需的突变，掺入在新的基因拷贝中。在优选实施方案的多位点诱变文库中突变的位点是发现在单点突变体文库中改变配体-结合特性的那些位点。

将突变基因引入到能够由所述突变基因产生可溶蛋白的生物体中。可以使用任何类型的生物体，只要可以从裂解细胞或细胞生长培养基中收集到可溶蛋白。例如，在优选实施方案中，可以使用细菌进行蛋白表达，但是本领域技术人员还可以在酵母、昆虫或其它真核细胞中表达蛋白。

生产探针

蛋白纯化通过将来自每个克隆的裂解物与固体支持体温育而实现，所述蛋白可以以高亲和力特异性结合所述固体支持体。存在两种使蛋白与固体支持体缔合的方法：a)可以改变蛋白，以增加其针对固体支持体的亲和性，或b)可以改性所述支持体，以增加其针对蛋白的亲和性。例如，后者可以通过将抗体固定在固体支持体上而实现，所述抗体具有针对目的蛋白的高结合亲和性。

备选地，可以“标记”蛋白，从而其以高亲和力与固体支持体结合。这包括但不限于，用下列各项标记：生物素、Flag-表位或c-myc表位或HA-标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、壳多糖结合结构域(CBD)、硫氧还蛋白、β-半乳糖苷酶、VSV-糖蛋白、钙调蛋白结合蛋白、或金属亲和性标签如6X His标签。优选地，融合伴侣不改变FABP脂肪酸结合特性。亲和性标签与固体支持体材料的特异性缔合允许从裂解物中一步纯化目的蛋白，所述裂解物包含数以千计的其它污染蛋白和其它物质。亲和性标签可以在NH2-或COOH-端或同时在两端融合。在优选实施方案中，6X组氨酸标签融合到FABP NH₂-或COOH-端或者同时融合到两端，而没有显著改变该蛋白的脂肪酸结合特性。这些融合蛋白可以可逆地固定在固体支持体上用于蛋白纯化、脱脂(delipidation)和探针生产。

在本文所述的方法中，突变蛋白被亲和纯化，并且留在亲和纯化基质中，主要制成固相的蛋白部分。脱脂、标记、和去除未反应标记所需要的化学官能性通过蛋白/固相。由于直接测定探针，而不是间接的未标记蛋白的测定，信号非常强，并且需要非常少量的探针(＜8μg)。

通过这种方法，可以构建、纯化、荧光标记的大量的突变蛋白，并且以高通量形式筛选探针的配体结合。在优选实施方案中，细胞生长、细胞裂解、蛋白纯化、荧光标记、和探针纯化在多孔板中完成。优选地，所述板具有1-1536个孔，并且每个孔的体积为0.002ml-10ml。通过这种方法，可以产生在与模板响应相比具有针对不同脂肪酸或其它代谢物的不同荧光响应的探针。例如，与母体模板相比较，当与特定脂肪酸结合时，探针变体的每一种可以在给定的发射波长处具有不同的荧光光谱和/或不同的荧光强度。

在优选实施方案中，蛋白变体在半胱氨酸残基处用6-丙烯酰-2-二甲氨基萘标记，同时仍然与固体支持体结合。可以使用响应于环境变化而经历荧光指数改变的任何其它荧光团来代替6-丙烯酰-2-二甲氨基萘。所述荧光团包括但不限于，丹磺酰氮丙啶、4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲基氨基]-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑酯(IANBDE)，和4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲基氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(IANBDA)。如果使用第二荧光团，则第二荧光团在标记第一荧光团后与蛋白变体反应。如果第一荧光团是环境敏感性的，那么第二荧光团荧光对环境变化是相对惰性的，并且应该具有可测量到的与第一荧光团不同的荧光发射。

在一些优选实施方案中，一种荧光团与突变iLBP结构域反应，并且通过将荧光蛋白(FP)融合到iLBP结构域上或通过特异性标记已经融合到突变iLBP结构域上的‘靶标’或‘接纳体’蛋白结构域或肽而提供第二荧光团。现在，通常的实践是通过构建用于生产目的蛋白和荧光蛋白如绿色或红色荧光蛋白(GFP或RFP)之间的融合蛋白(也称作蛋白嵌合体)的基因而在细胞内部生产荧光标记的蛋白。荧光蛋白不需要化学合成的标记。本领域的任何普通技术人员可以进行最少的实验而将iLBP融合到许多可用的荧光蛋白或其突变体之一上。优选地，一种已公布的具有红移光谱的荧光突变蛋白作为探针构建中的第二标记。FP上任何不参与二硫键形成的表面半胱氨酸将被突变为不同的氨基酸。

用iLBP突变蛋白和接纳体蛋白结构域或肽产生的蛋白嵌合体也将非常适用。如在iLBP-FP融合的情形中，嵌合体的标记的接纳体部分提供荧光信号，所述荧光信号对分析物结合显示没有响应或显著减少的响应，但是的确允许产生荧光比例探针。对分析物结合的显著减少的响应意指大于0但是小于由与蛋白嵌合体的iLBP突变蛋白部分结合产生的响应的1/10，优选小于1/20且大于由分析物与蛋白嵌合体的iLBP突变蛋白部分结合所观察到的响应的1/100的荧光强度的变化。

对于以特定顺序将荧光团添加到接纳体蛋白或肽结构域存在数种标记技术。三种系统，SNAP-标签，CLIP-标签，ACP-标签，由纽英伦生物实验室(New England Biolabs)(Ipswich，MA)出售。SNAP-标签是DNA修复蛋白O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的20kDa的突变体。SNAP-标签与苄基鸟嘌呤的荧光衍生物特异性且迅速反应。CLIP-标签也利用O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶突变体。CLIP-标签与O²-苄基胞嘧啶的荧光衍生物特异性反应。ACP-标签利用磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferase)(典型地来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或大肠杆菌(E.coli))将来自辅酶A(CoASH)的4’-磷酸泛酰巯基乙胺基共价结合到特定的丝氨酸残基上。包含丝氨酸的接纳体肽序列可以少至12个残基，并且该酶提供大量的不同基团结合到CoASH的游离巯基上。因此，通过使CoASH与半胱氨酸-反应性荧光团反应，然后使用磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶将荧光团转移到包含接纳体肽的蛋白嵌合体上而直接产生荧光CoASH衍生物。一种概念上非常类似的酶标记方案使用大肠杆菌生物素连接酶(BirA)将生物素的酮等排物转移到15个氨基酸的接纳体肽上。然后，共价偶联的酮特异性缀合到酰肼-或羟胺-官能化的荧光团上。

在优选实施方案中，模板FABP是具有半胱氨酸突变的重组大鼠肠脂肪酸结合蛋白(rI-FABP)突变蛋白。用6-丙烯酰-2-二甲氨基萘标记该蛋白使用基本上如先前所述的已知方法进行(美国专利号5,470,714&Richieri，G.V，等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，(1992)276：23495-23501)。由荧光标记的FABP发射的波长取决于所用的标记和蛋白。在不存在FFA时由这些6-丙烯酰-2-二甲氨基萘-标记的I-FABP′s发射的最大强度处的波长为约420-480nm。由FFA结合的这些6-丙烯酰-2-二甲氨基萘-标记的I-FABP′s发射的最大强度处的发射波长为约495-580nm。实验典型地包括测量两个最大发射内或在可以消除干扰分子如血红蛋白的影响的波长处的荧光响应，如在美国申请10/670958和PCT/US2004/030521中所述，其通过引用结合于此，并且计算两种荧光强度的比例‘R’。在不存在分析物时测量的这一比例的基线值指定为Ro。

相对于由优选的模板制备的ADIFAB和ADIFAB2探针，按照本发明的一些实施方案生产的探针具有针对不同FFAu或不同的未结合代谢物的改变的特异性。改变的特异性是指当探针暴露于不同的未结合代谢物或FFAu的不同分子物种(例如，不同链长和/或不同的双键数和/或给定双键周围的不同的旋转异构体和/或不同的双键位置)时发生的荧光变化的改变。例如，当暴露于浓度为[FFAu1]的特定的FFAu1时，ADIFAB2可能表现出变化(ΔR1)，其为R相对于Ro的比例值。将ADIFAB2暴露于n种不同的所述FFAu将表现出一系列的响应，{ΔRi}＝ΔR1i，ΔR2i，....ΔRni。该系列的响应{ΔRi}定义为“探针i的响应谱”，也称为“探针i响应谱”。具有改变的特异性的不同探针针对同一组n种FFAu和浓度具有不同系列的响应；{ΔRj}＝ΔR1j，ΔR2j，....ΔRnj。因此，{ΔRj}是针对探针j的响应谱。使用充分数目的具有不同响应的不同探针，其将可能通过测量每种探针针对包含不同FFAu和/或不同未结合代谢物的混合物的样品的响应来确定每种不同FFAu和/或不同未结合代谢物的浓度。由于不同的健康和疾病状态可能改变多种体液中不同FFAu和/或不同未结合代谢物的分布，所述体液包括但不限于全血、血浆、血清、尿、CSF、唾液、胃液、肠液、滑液或淋巴，可以预测所述确定将提供关于健康状况的有价值的信息。另外，这样的测量将为基础研究和药物发现提供有价值的工具。

筛选探针

在一些实施方案中，将如上述制备的探针的等分试样放置在适用于荧光测量的多孔板中。向每孔中加入确定量的未结合的分析物，并且将来自包含探针和分析物的孔的荧光信号与仅包含探针的孔进行比较。获得的值与“参照”探针的那些值进行比较。所述分析物可以是脂肪酸或其它未结合代谢物。优选地，多孔板中的孔的数目为1-1536。优选地，用荧光板读数仪测量来自每个孔的荧光信号，从而确定每种探针的信号是否显著不同于亲本探针的那些信号。对于多种分析物，重要的是将它们以与载体分子如白蛋白的复合物添加到每个孔中，以缓冲未结合的分析物并且由此将其浓度限制在充分确定的值。限制确保每个孔中处于水相的分析物的浓度不受与孔表面结合的影响或探针本身的影响。限制对于发现探针是重要的，因为分析物具有不同的溶解性，并且因此具有不同的针对表面的亲和性。在没有正确限制的条件下添加的高度不溶的分析物可以与表面结合，并且不可用于与探针结合。在该实例中，探针可能不正确地产生对所述不溶分析物无响应的表现。因此，为了确定每种探针的正确响应谱(特异性)，必须限制每种分析物的浓度。

确定对于给定探针的荧光强度比例(″R″值)。该比例利用下式计算：

R＝F_λ1/F_λ2

其中，F_λ1是在波长1处测量的荧光强度(存在分析物的探针强度减去不存在探针的分析物的强度)，F_λ2是在波长2处测量的荧光强度(存在分析物的探针强度减去不存在探针的分析物的强度)。然后，对于给定的探针，按下述计算ΔR，即，在存在每种分析物的条件下和不存在每种分析物的条件下进行的测量之间的R值的差异：

ΔR＝R_+分析物-R₀

然后通过ΔR/ΔR_参照将对于给定探针的ΔR值与参照探针如ADIFAB或ADIFAB2进行比较。该值是新探针(由模板突变衍生)与参照如何不同的指示。通过这种方法，可以鉴定具有新的和有用特征的探针。荧光强度的测量使用标准技术获得。

优选地，在每个孔中测量在两种或多种波长处的荧光强度，并且评价在所述两种或多种波长的所有组合处的强度比例，以确定每种探针对于一组分析物的比例是否显著不同于参照探针的那些比例。通过这种方法，可以鉴定与参照探针相比较在其针对不同分析物的荧光响应中具有不同特异性的探针。在优选实施方案中，所述分析物是未结合的游离脂肪酸。也可以使用其它用于比较有或无分析物的荧光变化的方法。

使用探针

可以使用具有不同信号传导特性的探针集合来确定混合物中不同未结合代谢物的浓度，例如，混合物中不同未结合的游离脂肪酸的浓度。因此，可以对个体确定未结合的代谢物和/或未结合的游离脂肪酸谱型。所述确定用来产生关于任何个体的未结合的FFA谱，其有效用于疾病诊断和疾病风险因子的确定。

脂肪酸结合蛋白(FABPs)的DNA和蛋白序列显示在序列表中。SEQID NO：1显示野生型大鼠肠脂肪酸结合蛋白(rIFABP)的cDNA序列。大鼠脂肪酸结合蛋白在大鼠中进行翻译后修饰，所述修饰包括去除N端蛋氨酸以及“新的”N端残基Ala的乙酰化。由成熟蛋白的第一个残基开始编号蛋白序列。因此，在SEQ ID NO：2所示的对应蛋白中，Ala是1号残基。

SEQ ID NO：3显示本发明所述的优选的模板rI-FABP-L72A cDNA序列。SEQ ID NO：4显示相对应的蛋白序列。在这一优选的实施方案中，该蛋白在72位处具有丙氨酸置换。由SEQ ID NO：5所示的蛋白衍生的优选的物种在表1中列出。

本发明的优选实施方案包括基于SEQ ID NO：5的大鼠肠FABP的蛋白，其具有其中用半胱氨酸替换在位置21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、55、74、73、或76之一处的氨基酸残基的一个突变，并且具有在位置8、11、14、17、18、21、23、24、26、27、30、31、34、36、38、40、47、49、51、53、55、56、58、60、62、68、70、71、72、73、74、75、76、78、80、82、89、91、93、95、102、104、106、113、115、117、119、或126处的0个或多个突变。优选地，所述突变是置换、插入或缺失。

本发明的优选实施方案包括基于SEQ ID NO：5的大鼠肠FABP的功能改造的蛋白，其具有在被荧光标记的残基位置21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、55、74、73、或76之一处的半胱氨酸侧链处的荧光标记，并且具有在位置8、11、14、17、18、21、23、24、26、27、30、31、34、36、38、40、47、49、51、53、55、56、58、60、62、68、70、71、72、73、74、75、76、78、80、82、89、91、93、95、102、104、106、113、115、117、119、或126处的0个或多个突变，并且具有大于0.1的与未结合分析物的ΔR/ΔRADIFAB2值。优选地，所述突变是置换、插入或缺失。

本发明的某些实施方案涉及多核苷酸，其包括编码功能改造的蛋白的核苷酸序列，所述功能改造的蛋白为：

(a)包括大鼠肠FABP的氨基酸序列的蛋白，其用半胱氨酸替换SEQID NO：5所示的残基位置21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、55、74、73、或76之一，并且具有在位置8、11、14、17、18、21、23、24、26、27、30、31、34、36、38、40、47、49、51、53、55、56、58、60、62、68、70、71、72、73、74、75、76、78、80、82、89、91、93、95、102、104、106、113、115、117、119、或126处的0个或多个突变；或

(b)可以在替换SEQ ID NO：5的残基位置21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、55、74、73、或76之一的半胱氨酸处进行荧光标记的蛋白，并且具有大于0.1的与未结合的分析物的ΔR/ΔR_ADIFAB2值。本发明还包括表达载体，所述表达载体包括与至少一种表达控制序列可操作连接的本发明所述的多核苷酸，并且本发明包括包含所述表达载体的重组宿主细胞。所述重组宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。

本发明的某些实施方案涉及多核苷酸，其包括编码功能改造的蛋白的核苷酸序列，所述功能改造的蛋白为：

(a)这样的蛋白，其包括脂质结合蛋白家族之一的氨基酸序列(所述脂质结合蛋白家族包括但不限于脂肪酸结合蛋白、胆酸结合蛋白和类视黄醇结合蛋白)，具有与大鼠肠FABP相似的三维结构，并且具有在与大鼠肠FABP SEQ ID NO：2的位点21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、55、74、73、或76同源的位点之一处替换的半胱氨酸，并且在与大鼠肠FABP SEQ ID NO：2的位置8、11、14、17、18、21、23、24、26、27、30、31、34、36、38、40、47、49、51、53、55、56、58、60、62、68、70、71、72、73、74、75、76、78、80、82、89、91、93、95、102、104、106、113、115、117、119、或126同源的位置处具有0个或多个另外的突变；或

(b)脂质结合蛋白，其可以在与大鼠肠FABP SEQ ID NO：2的位点21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、55、74、73、或76同源的位点之一处替换的半胱氨酸处进行荧光标记，并且在大鼠肠FABP SEQID NO：2的位置11、14、17、18、21、23、31、34、36、38、40、47、49、51、53、55、60、62、68、70、72、73、74、78、80、82、89、91、93、102、104、106、113、115、117、119、和126位处与大鼠肠FABP SEQ ID NO：2同源的位点处具有0个或多个突变，并且其具有大于0.1的与未结合的代谢物的ΔR/ΔR_ADIFAB2值。基于对于LBP已知的和可用的结构信息，本领域的技术人员可以容易地确定同源位点。本发明还包括表达载体，所述表达载体包括与至少一种表达控制序列可操作连接的本发明所述的多核苷酸，并且本发明包括包含所述表达载体的重组宿主细胞。所述重组宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。

在本发明的优选实施方案中，用于确定未结合的FFA的样品是来源于人、动物或植物的流体样品。优选地，所述流体是全血、血浆、血清、尿、CSF、唾液、胃液、肠液或淋巴。在一些实施方案中，未结合的代谢物如未结合的FFA通过本领域已知的方式由组织样品提取。在其它实施方案中，未结合的代谢物如未结合的FFA的确定通过显微注射或另外将探针转染至细胞中而在细胞的细胞质内进行。未结合的代谢物包括但不限于未结合的FFA、药物、药物代谢物、激素、前列腺素、白三烯、鞘氨醇、鞘脂、磷脂、糖脂、胆固醇和胆固醇衍生物以及其它类固醇、脂溶性维生素、胆酸盐、酶辅因子、类视黄醇如视黄酸和视黄醛、血红素和血红素代谢物、氨基酸、肽、碳水化合物和多价离子。未结合的游离脂肪酸的种类包括饱和的、不饱和的、单饱和的、多饱和的、短链、中链和长链的。

由健康群体确定对于给定的未结合代谢物的正常范围，并且偏离该正常范围可以指示疾病。例如，升高的未结合FFA的水平指示心脏病。在一些实施方案中，利用多于一种探针来确定多于一种未结合的代谢物的水平，从而确定个体的代谢谱。确定来自正常、健康群体的代谢谱。偏离正常的代谢谱指示疾病、营养素缺乏、暴露于毒素或致癌物质等。

在一些实施方案中，如上述产生的探针用于确定药物为已知的代谢谱的影响。对于可以是正常的或非正常群体如患病群体的测试群体确定代谢谱。例如，可以为患病的测试群体确定代谢谱。然后，可以用药物治疗患病的测试群体一段预先确定的时间。然后，在药物治疗后，重新确定所述测试群体的代谢谱，从而观察药物对代谢谱的影响。在一些情形中，代谢谱的改变可以是不理想的，例如，如果是检测药物的毒性和/或不需要的副作用。在其它实施方案中，代谢谱的改变可以指示所检测的药物的效力。

在一些实施方案中，使用一种或多种按照本发明制备的探针监测在患病患者中的药物治疗。例如，可以由所述患者抽取体液。指示疾病的未结合代谢物的结合可以使用至少一种如本文所述制备的探针进行检测。一种或多种未结合的代谢物的异常水平是疾病状态的指征。例如，升高的游离脂肪酸是心血管疾病的危险因子和指征；缺乏维生素B6和叶酸也与心血管疾病和癌症相关。按照本发明，可以使用如本文所述产生的探针测量或监测这些代谢物的未结合形式的水平。

在一些实施方案中，代谢谱可以用来确定特定的营养素对个体的作用。代谢谱可以用来指示营养素缺乏。

在一些实施方案中，代谢谱可以用来将个体分成具有针对不同药物和/或营养素的不同敏感性的不同种类。在优选实施方案中，可以利用主成分分析将未结合代谢物谱归类为确定的组别。

实施例1

ADIFAB，其为在赖氨酸27用6-丙烯酰-2-二甲氨基萘标记的大鼠肠FABP(SEQ ID NO：2)，当结合FFA时在其荧光发射光谱表现出红移(图1a)。这种揭示等发射点的响应可以用来使在两种波长处如505nm和432nm处的荧光强度的比例与未结合的FFA的浓度相关联(Richieri等J.Biol.Chem.(生物化学杂志)(1992)267：23495-23501)。这是作为探针的必要特征的荧光响应类型的实例。相反，将SEQ ID NO：2的赖氨酸27突变为半胱氨酸并且用6-丙烯酰-2-二甲氨基萘标记半胱氨酸形成荧光蛋白，所述荧光蛋白尽管通过表现出荧光猝灭而响应于FFA结合，但是其在FFA结合时不表现出发射波长的变化，并且因此不可以被视为探针(图1B)。然而，如果不将赖氨酸27突变为半胱氨酸，而是将赖氨酸27突变为丙氨酸，并且将26位的缬氨酸突变为半胱氨酸并将该半胱氨酸用6-丙烯酰-2-二甲氨基萘标记，则所形成的荧光蛋白在结合FFA时表现出红移(图1c)。SEQ ID NO：2的这种V26C K27A突变体在结合FFA时产生比例响应，并且因此是探针。本实施例举例说明改变特异性位点可以产生有效的探针。

6-丙烯酰-2-二甲氨基萘标记赖氨酸残基在pH 9.3进行(如在美国申请号11/085,792中所述，其通过引用结合于此)，而标记半胱氨酸残基在pH 7.0进行。简言之，蛋白变体优选用6-丙烯酰-2-二甲氨基萘标记，同时仍然结合固体支持体作为蛋白纯化过程的一部分。然而，在其它实施方案中，可以利用使用荧光团反应缓冲液进行的缓冲液交换方法然后通过层析步骤去除未反应的荧光团而标记纯化的和脱脂的蛋白。也可以使用其它荧光标记，诸如但不限于，丹磺酰氮丙啶、4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲基氨基]-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑酯(IANBDE)、和4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲基氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(IANBDA)。利用基本上如先前所述的已知方法进行使用6-丙烯酰-2-二甲氨基萘的衍生化(美国专利号5,470,714和Richieri，G.V，等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，(1992)276：23495-23501)。

对于ADIFAB，SEQ ID NO：5的K27C(未显示)和V26C K27A突变体，标记很大程度上是均质的，如图2的HPLC结果所示。

实施例2

一些赖氨酸标记的探针，表现出针对特定FFAu的高敏感性和特异性，但是由于缺少标记均质性和/或较差的标记化学计量性而表现出不利的标记谱，将它们转化为半胱氨酸标记的探针。这通过根据探针突变，用半胱氨酸替换在来自组M21、I23、N24、V25、V26、K27、R28、K29、L30、G31、F55、D74、A73或T76的一些位点处的野生型侧链而进行。显示在图3中的HPLC迹线举例说明对这样的3个实例的标记改进(Huber等Biochemistry(生物化学)(2006)45：14263-14274)。这些半胱氨酸替换的每一种导致具有与赖氨酸探针非常相似的FFAu谱的响应性探针(图4)。

实施例3

利用美国申请号11/085,792所述的方法，使用来源于SEQ ID NO：5的模板，已经产生了多于40个半胱氨酸-标记的突变探针文库，其中在各个文库中不同突变探针的数目在2000-2,000,000范围内，所述申请通过引用结合于此。在这些文库中，在来自组M21、I23、N24、V25、V26、K27、R28、K29、L30、G31、F55、D74、A73或T76的一个位点处引入单个半胱氨酸残基。来自这些文库的突变探针表现出针对不同FFAu的高度敏感性和特异性，并且表现出高度的标记均质性和标记化学计量性。来自两种所述文库的两组实例显示在图5中，以举例说明可能的探针的多样性。在筛选突变探针的本实施例中，FFA作为与白蛋白的复合物添加以限制FFAu的水平。

实施例4

开发了第二种方法来获得均质的标记同时保留探针响应特征。在该方法中，将除SEQ ID NO：5的27位外的表面可及的赖氨酸侧链突变为精氨酸，并且将这样的突变体用作模板，由其产其中在iLBP蛋白的结合位点和/或螺旋帽中引入另外的突变的文库。在SEQ ID NO：5的7、16、20、29、37、46、50、88、92、94、100、125、129、130位处的表面赖氨酸到精氨酸突变的重要特征在于，它们不显著影响探针的结合亲和性和特异性。此外，在大部分表面位点处的6-丙烯酰-2-二甲氨基萘标记的荧光不响应于FFAu结合。然而，这种荧光通常有助于6-丙烯酰-2-二甲氨基萘光谱中红色部分中的相对弱的荧光。因此，与不存在表面赖氨酸位点相比，当表面赖氨酸位点被标记时Ro值更大。其中存在表面赖氨酸且通过将14种所述赖氨酸突变为精氨酸而将其去除的探针的HPLC迹线的两个实例显示在图6中。这些结果表明在初始探针中显著的多个位点标记和在KR14形式中显著减少的额外标记。如期望的那样，KR14突变体的Ro显著更小，超过两倍以上，因此这些KR14探针具有比初始探针更大的动力学范围。此外，这些棕榈酸盐特异性的探针具有实质上相同的结合亲和性和FFAu谱。

实施例5

许多标记位点响应于分析物结合，但是没有所需的光谱迁移来产生比例探针(例如，SEQ NO：2的K27C突变体)。由于这样的荧光蛋白可能具有其它有价值的特征，重要的将是能够将所述荧光蛋白转化为探针，即，以使它们通过比例的改变而响应于分析物结合。这可以通过在不同位点处引入第二而不同的荧光团而实现，从而第二荧光团的荧光对分析物结合不敏感或不同地响应。另外，第二荧光团的荧光指数应该在与第一荧光团不同的波长处测量。这样的双荧光团探针的实例显示在图7中。第一个实例包括胆红素特异性荧光蛋白L2P14F7(SEQ ID NO 4的M18G、G31M突变)，其通常在赖氨酸27处用6-丙烯酰-2-二甲氨基萘标记。为了将这转化为荧光比例探针，利用位点特异性诱变产生新的突变蛋白(L2P14F7-MGCFD)，其中成熟L2P14F7突变蛋白的N端丙氨酸残基替换为甘氨酸-半胱氨酸。因此，成熟L2P14F7-MGCFD突变蛋白的N端具有序列甘氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸，而不是如在L2P14F7模板中的丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸。将这种置换以克隆名“MGCFD”命名，并且有时描述为“N-端MGCFD接头”。然后，在仅标记半胱氨酸的条件下，L2P14F7-MGCFD与德克萨斯红(TR)马来酰亚胺在pH 6反应。在去除未反应的TR后，L2P14F7-MGCFD-TR与6-丙烯酰-2-二甲氨基萘在pH 9.3反应以标记K27。在第二个实例中，如上述将L2P14F7-MGCFD的14个表面赖氨酸突变为精氨酸，并且用TR和6-丙烯酰-2-二甲氨基萘标记蛋白。所形成的探针，即L2P14F7-MGCFD-TR-6-丙烯酰-2-二甲氨基萘和L2P14F7-KR14-MGCFD-TR-6-丙烯酰-2-二甲氨基萘当在375nm处激发时表现出在608nm(TR)和525nm(6-丙烯酰-2-二甲氨基萘)处的双重荧光。如在图7中所证明，两种探针表现出比例(I608/I525)胆红素结合等温反应，其由具有与初始L2P14F7相似的Kds(80nM)的单位点平衡结合而充分说明。因此，该方法可以有效地将非比例响应性荧光蛋白转化为探针。在MGCFD探针中，成熟(无M)蛋白在N端具有多余的G，并且因此在这些探针中，第一残基位于相对于SEQ ID 4的-1位。

实施例6

通过在SEQ ID NO：5的21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、55、74、73、或76位处引入半胱氨酸突变，并且在SEQ ID NO：5的11、14、17、18、21、23、31、34、36、38、40、47、49、51、53、55、60、62、68、70、72、73、74、78、80、82、89、91、93、102、104、106、113、115、117、119、和126位处引入一个或多个突变，已经产生了这样的探针，所述探针相对于ADIFAB2和/或其它模板探针，具有表现出针对未结合的FFA和其它未结合的分析物的改变的特异性的响应谱。将这些蛋白用6-丙烯酰-2-二甲氨基萘在pH 7.0进行标记，并且所形成的探针表现出均质标记。表1中显示了具有针对花生四烯酸(AA)、二十二碳六烯酸盐(DHA)、亚油酸盐(LA)、棕榈酸盐(PA)、棕榈油酸盐(PAO)、油酸盐(OA)和硬脂酸盐(SA)的提高的特异性的数种探针的实例。

表1：特异性半胱氨酸标记的探针的序列及其FFA特异性

在L19CP10C7、L83P5G8和L85P1C2中，成熟蛋白在N端具有多余的G，并且因此在这些探针中，第一残基位于相对于SEQ ID 4的-1位。

实施例7

通过在SEQ ID NO：5的21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、55、74、73、或76位处引入半胱氨酸突变，并且在SEQ ID NO：5的11、14、17、18、21、23、31、34、36、38、40、47、49、51、53、55、60、62、68、70、72、73、74、78、80、82、89、91、93、102、104、106、113、115、117、119、和126位处引入一个或多个突变，已经产生了这样的探针，所述探针相对于ADIFAB2和/或其它模板探针，表现出逆响应谱(ΔR＜0)和针对未结合的FFA和其它未结合的分析物的改变的特异性。将这些蛋白用6-丙烯酰-2-二甲氨基萘在pH 7.0进行标记，并且所形成的探针表现出均质标记。表2中显示了在27位处具有半胱氨酸且具有针对SA/OA和DHA/AA/EPA的提高的特异性的数种所述探针的实例。

表2：产生逆(负)响应并且产生FFAu特异性的半胱氨酸标记的探针的实例。除了图5的FFA外，还显示了这些探针针对肉豆蔻酸盐(MA)和vaccinate(VA)的响应。每种探针和FFA的荧光响应为ΔR/Ro值。

本领域技术人员应该理解，在不背离本发明的精神的条件下，可以进行大量的和各种的修改。因此，应该清楚地理解，本发明的形式仅是举例说明性的，并不意欲限制本发明的范围。

Claims (45)

1.用于产生和筛选探针的高通量方法，所述方法包括下列步骤：

(a)由多核苷酸模板产生编码包括各种iLBP突变蛋白的蛋白文库的多核苷酸突变体文库，所述多核苷酸模板编码包括半胱氨酸残基的iLBP或iLBP突变蛋白；

(b)表达由所述多核苷酸文库编码的iLBP突变蛋白；

(c)通过结合至固体基质而纯化所述iLBP突变蛋白；

(d)用单种荧光团在pH小于8下标记iLBP突变蛋白由此所述荧光团优先与半胱氨酸侧链反应，或用第一种荧光团和第二种不同的荧光团标记iLBP突变蛋白，以产生探针，所述探针通过在两种波长下荧光比例的变化而响应于分析物结合；

(e)由所述固体基质回收所述探针；

(f)在存在和不存在一组未结合的目的分析物的条件下，在荧光计中筛选回收的每种探针，从而确定每种探针与该组未结合的目的分析物的结合，所述每种未结合的目的分析物具有确定的未结合浓度；

(g)在存在和不存在所述未结合的分析物的条件下，观察在两种不同波长下测量的所述探针的荧光指数比例的改变；和

(h)依据所述每种探针针对该组目的分析物的一组荧光响应，表征所述每种探针，其中荧光团共价结合在所述半胱氨酸残基上。

2.权利要求1的方法，其中所述未结合的分析物是未结合的代谢物。

3.权利要求2的方法，其中所述未结合的代谢物是未结合的游离脂肪酸。

4.权利要求1的方法，其中由所述模板编码的iLBP是脂肪酸结合蛋白(FABP)，或其保留了结合分析物的能力的变体。

5.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸模板编码包括可裂解的或不可裂解的亲和标签的iLBP突变蛋白。

6.权利要求5的方法，其中所述多核苷酸模板编码包括多-组氨酸亲和标签的iLBP突变蛋白，并且所述固体基质包括固定的金属螯合剂。

7.权利要求1的方法，其中所述优先与半胱氨酸侧链反应的荧光团选自由下列各项组成的组：6-丙烯酰-2-二甲氨基萘、丹磺酰氮丙啶、4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲基氨基]-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑酯(IANBDE)、和4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲基氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(IANBDA)。

8.权利要求1的方法，其中所述iLBP突变蛋白用第一荧光团和第二荧光团标记。

9.权利要求8的方法，其中所述第一荧光团选自由下列各项组成的组：6-丙烯酰-2-二甲氨基萘、丹磺酰氮丙啶、4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲基氨基]-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑酯(IANBDE)、和4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲基氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(IANBDA)，并且其中所述第二荧光团选自由下列各项组成的组：Alexa Fluor染料，氟硼荧、荧光素衍生物、若丹明衍生物和德克萨斯红。

10.权利要求8的方法，其中所述标记包括使半胱氨酸与所述第一荧光团在小于或等于8的pH下反应；并且使赖氨酸与所述第二荧光团在大于8的pH下反应。

11.权利要求8的方法，其中所述标记包括使半胱氨酸与所述第一荧光团在小于或等于8的pH下反应；并且使所述iLBP突变蛋白的氨基端与所述第二荧光团反应。

12.权利要求1的方法，其中所述第二荧光团通过将接纳体蛋白或肽结构域添加到所述每个iLBP突变蛋白上而提供，并且其中将所述蛋白或肽结构域然后用第二目的荧光团标记。

13.权利要求12的方法，其中所述接纳体蛋白或肽结构域选自由下列各项组成的组：SNAP-标签、CLIP-标签、ACP-标签或生物素化标签。

14.权利要求1的方法，其中所述文库中的所述多核苷酸突变体还包括编码荧光蛋白的核苷酸区段。

15.权利要求12或14的方法，其中与所述探针的iLBP突变蛋白部分的荧光相比，当与该组未结合的目的分析物中的分析物结合时，所述接纳体蛋白或肽结构域或所述荧光蛋白在发射的荧光的强度和/或波长方面没有响应或具有显著减少的响应。

16.权利要求1的方法，其中所述分析物与载体大分子复合，所述载体大分子选自由白蛋白、脂质结合蛋白、脂囊泡和环糊精组成的组，由此所述分析物和所述载体大分子的复合物缓冲所述未结合分析物的浓度，从而提供对未结合分析物的水平的限制。

17.权利要求16的方法，其中所述载体大分子是白蛋白。

18.权利要求1的方法，其中步骤(d)和(e)替换为下述步骤：

洗涤结合的iLBP突变蛋白；

将所述iLBP突变蛋白从所述固体基质上去除；和

使未结合的iLBP突变蛋白与单种荧光团或两种不同的荧光团反应，以产生探针。

19.权利要求1的方法，其中所述荧光指数是在存在和不存在该组目的分析物中的每种分析物的条件下探针的强度、极性和/或寿命。

20.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸模板编码包括半胱氨酸的iLBP突变蛋白，并且所述方法还包括在所述iLBP突变蛋白与所述荧光团缔合之前替换所有表面可及的赖氨酸残基。

21.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸模板编码包括半胱氨酸的iLBP突变蛋白，并且所述方法还包括在所述iLBP突变蛋白与所述荧光团缔合之前替换除一个以外的所有表面可及的赖氨酸残基。

22.权利要求20的方法，其中所述表面可及的赖氨酸残基替换为精氨酸或丙氨酸。

23.权利要求21的方法，其中所述除一个以外的所有表面可及的赖氨酸残基替换为精氨酸或丙氨酸。

24.权利要求1的方法，其还包括鉴定具有所需特征的探针，包括：

通过下式确定R值：

R＝Fλ1/Fλ2

其中Fλ1是在第一发射波长处测量的荧光强度，所述第一发射波长处测量的荧光强度是存在分析物的探针强度减去不存在探针的分析物的强度，Fλ2是在第二发射波长处测量的荧光强度，所述第二发射波长处测量的荧光强度是存在分析物的探针强度减去不存在探针的分析物的强度；

通过下式测量在存在和不存在所述分析物的条件下R之间的差异：

ΔR＝R_+分析物-R₀

其中R_+分析物是在存在所述分析物的条件下完成的测量的比值，R₀是在不存在所述分析物的条件下完成的测量的比值；和

比较所述探针的ΔR与标准物的ΔR_参照。

25.权利要求24的方法，其中所述标准物是由用来产生进行高通量筛选的突变的多核苷酸模板所编码的蛋白制备的荧光探针。

26.权利要求24的方法，其中所述标准物是ADIFAB或ADIFAB2。

27.权利要求24的方法，其中探针用n种未结合的分析物筛选，并且寻找这样的探针，其^*ΔR^*/ΔR_参照对于所述n种未结合的分子中的一种或多种是最大的且＞0.1并且对于其余未结合的分子至少小0.1，其中^*ΔR^*是ΔR的绝对值。

28.权利要求27的方法，其中所述未结合的分析物是未结合的代谢物。

29.权利要求28的方法，其中所述未结合的代谢物是未结合的脂肪酸。

30.包含iLBP突变蛋白的探针，所述iLBP突变蛋白包括用荧光染料标记的单个半胱氨酸，其中在相对应的天然脂质结合蛋白中的至少一个赖氨酸残基被替换。

31.权利要求30的探针，其中至少一个赖氨酸被替换为精氨酸或丙氨酸。

32.权利要求30所述的探针，其中所述iLBP突变蛋白包括分别用荧光染料标记的单个半胱氨酸和单个赖氨酸。

33.权利要求32的探针，其中所述荧光染料中的一种为6-丙烯酰-2-二甲氨基萘。

34.权利要求30的探针，其中所述iLBP是脂肪酸结合蛋白。

35.权利要求30的探针，其中所述脂质结合蛋白对应于SEQ ID NO：5，其包括在选自由8、11、14、17、18、21、23、24、26、27、30、31、34、36、38、40、47、49、51、53、55、56、58、60、62、68、70、71、72、73、74、75、76、78、80、82、89、91、93、95、102、104、106、113，115、117、119、和126组成的组的位置处的至少一个突变，或对应于SEQ ID NO：5的同源物，其包括在与选自由SEQ ID NO：2的8、11、14、17、18、21、23、24、26、27、30、31、34、36、38、40、47、49、51、53、55、56、58、60、62、68、70、71、72、73、74、75、76、78、80、82、89、91、93、95、102、104、106、113、115、117、119、和126组成的组的位置同源的位置处的至少一个突变。

36.权利要求35的探针，其中所有表面可及的赖氨酸残基替换为不是赖氨酸的氨基酸残基。

37.权利要求35的探针，其中除一个外所有表面可及的赖氨酸残基替换为不是赖氨酸的氨基酸残基。

38.权利要求36的探针，其中所述氨基酸残基是精氨酸或丙氨酸。

39.权利要求37的探针，其中所述氨基酸残基是精氨酸或丙氨酸。

40.权利要求30的探针，其中所述iLBP突变蛋白对应于SEQ ID NO：5，其包括在选自由SEQ ID NO：5的21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、55、74、73、和76组成的组的位置处插入的半胱氨酸，或对应于其同系物，其包括在与选自由SEQ ID NO：5的21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、55、74、73、和76组成的组的位置同源的位置处插入的半胱氨酸。

41.包含iLBP突变蛋白的探针，所述探针选自由L10P7A4-L30C、L11P7B3-V26C、L13EP16E11、L18P5G12-K27C、L50BP4E2、L50BP9D5、L61P8B12、L68P3H10、和L71AP22B3组成的组。

42.包含iLBP突变蛋白的探针，所述探针选自胆红素特异性探针L2P14F7-MGCFD-TR和L2P14F7-KR14-MGCFD-TR。

43.融合蛋白，其包括iLBP和荧光蛋白，所述iLBP包括用荧光染料标记的单个半胱氨酸。

44.蛋白嵌合体，其包括iLBP和接纳体蛋白或肽结构域，所述iLBP包括用荧光染料标记的单个半胱氨酸，所述接纳体蛋白或肽结构域用不同的荧光染料标记。

45.权利要求44的蛋白嵌合体，其中所述接纳体蛋白或肽结构域选自由SNAP-标签、CLIP-标签、ACP-标签和生物素化-标签组成的组。

Images