CN101947097A - 一种适用于胰管成像的高分辨光学内窥系统 - Google Patents
一种适用于胰管成像的高分辨光学内窥系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及适用于胰管成像的高分辨光学内窥系统，结构如下：激光器发出的光依次经半波片、功率衰减器、光子晶体光纤入射胰管镜探头到达胰管上皮，产生二次谐波信号、双光子激发荧光信号，与白光照射产生的反射光信号一起经胰管镜探头输出；然后经二相色镜分离出反射光信号后，经CCD输入计算机控制处理单元；剩余混合信号经分束镜分为两束：一束经带通或高通滤光片分离出双光子激发荧光信号，进入一光电倍增管再输入计算机控制处理单元；另一束经窄带滤光片再经偏振分光棱镜分成两路偏振正交二次谐波信号分别进入另两个光电倍增管再输入计算机控制处理单元。本发明为胰腺癌的早期诊断提供新的方法，对降低胰腺癌的发病率和死亡率具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于光学显微内窥成像技术领域，特别涉及一种适用于胰管成像的高分辨光学内窥系统。
背景技术
胰腺癌是一种高度恶性的肿瘤，其发病率在国内外均呈上升趋势，2000年上海市胰腺癌的标化发病率和死亡率已达到6.0/10万和5.5/10万。极早期(直径＜1.0cm)的胰腺癌患者接受根治性手术治疗后，5年生存率可接近80％。然而，临床确诊的胰腺癌患者90％以上已属中晚期，根治性手术切除率仅为10-20％，即使进行了根治性切除的病人，5年生存率也低于20％。因此，发展有效的早期诊断和检测技术是提高胰腺癌治疗水平的关键。
临床上常用的胰腺癌早期诊断技术，如计算机断层成像(CT)、逆行胰胆管造影(ERCP)、超声成像(US)、正电子发射计算机断层显像(PET)等，由于受到分辨率的限制，不能检测到直径小于1cm的肿瘤。近年来，光学技术由于其极高的分辨率、灵敏度、精确度以及无损、安全、快速等优点而逐渐被应用于胰腺癌成像，如光学相干层析成像(OCT)和荧光光谱等。2005年Pier Alberto Testoni等人首次将OCT用于区分正常和病变的离体人胰腺组织(Testoni，P.A.，B.Mangiavillano，L.Albarello，et al.，Optical coherence tomography to detectepithelial lesions of themain pancreatic duct：An ex vivo study.American Journal ofGastroenterology，2005.100(12)：p.2777-2783.)，之后将其与ERCP相结合用于在体的管道内OCT成像(Testoni，P.A.，A.Mariani，B.Mangiavillano，et al.，Preliminary data on the use of intraductaloptical coherence tomography during ERCP for investigating mainpancreatic duct strictures.Gut，2006.55(11)：p.1680-1681.)，并对其诊断能力进行了评估(Testoni，P.A.，A.Mariani，B.Mangiavillano，et al.，Intraductal optical coherence tomography for investigatingmain pancreatic duct strictures.American Journal ofGastroenterology，2007.102(2)：p.269-274.)。目前OCT的分辨率可达到ERCP等传统诊断技术的10倍以上，但是该方法只能反应组织结构形态上发生的变化，缺乏特异性的光学标志物，无法获得分子和细胞水平的功能信息。美国Michigan大学的Mary-Ann Mycek小组使用了发射和荧光光谱的方法对新鲜分离的人胰腺组织进行了分析(Chandra，M.，D.Simeone，B.Mckenna，et al.，Probing pancreatic disease using tissueoptical spectroscopy.Journal of Biomedical Optics，2007.12(0605016).)。通过检测荧光光谱变化的方法同样缺乏特异性的光学标志物，无法获得分子和细胞水平的变异，因而仍然不能有效地检测早期的病变。
基于双光子吸收和二次谐波产生的光学显微术是三维空间分辨率最高的一种成像技术(可达亚微米)，且具有固有的光学层析能力、厚组织成像等优点，近年来在生物医学领域得到了广泛的应用。基于内源性光学标志物(包括主要的自发荧光物质NADH和FAD、弹性蛋白以及主要的二次谐波信号来源胶原蛋白等)的双光子激发荧光和二次谐波成像，在避免繁琐的标记步骤及其对生物样本功能和活性可能产生的影响的同时，可以实现新鲜的离体厚组织和活体组织的高分辨率成像，同时获得其胞外基质中胶原纤维结构和代谢功能的互补信息。目前该技术已被广泛应用于乳腺癌组织(Provenzano，P.P.，D.R.Inman，K.W.Eliceiri，et al.，Collagendensity promotes mammary tumor initiation and progression.BmcMedicine，2008.6)、卵巢癌组织(Kirkpatrick，N.D.，M.A.Brewer andU.Utzinger，Endogenous optical biomarkers of ovarian cancerevaluated with multiphoton microscopy.Cancer EpidermiologyBiomarkers&Prevention，2007.16(10)：p.2048-2057.)、膀胱癌组织(Cicchi，R.，A.Crisci，A.Cosci，et al.，Time-andSpectral-resolved two-photon imaging of healthy bladder mucosa andcarcinoma in situ.Optics Express，2010.18(4)：p.3840-3849.)、皮肤瘢痕组织(Chen，G.，J.Chen，S.Zhuo，et al.，Nonlinear spectralimaging of human hypertrophic scar based on two-photon excitedfluorescence and second-harmonic generation.British Journal ofDermatology，2009.161(1)：p.48-55.)、细胞核细胞外间质成分(专利号：200710085330.5)以及视网膜(专利号：200920136665.X)等各种生物组织和器官，但尚未有将其应用于胰腺癌成像的报道。
内窥镜是一种光学仪器，可经由人体自然腔道送入体内，直接观察生物表皮组织和脏器内腔的病变。胰管镜是近年来兴起的一种内窥检查手段，通过对胰管形态及粘膜的观察达到诊断胰腺疾病的目的。然而，现有的胰管镜通过单纯的光反射原理成像，缺乏特异的成像对比机制，分辨率仅为亚毫米，只能检测胰管粘膜组织形态发生显著改变的病变而无法检测更为早期的病变。大量研究表明85％以上的肿瘤来源于上皮细胞的病变，且在癌症发生发展过程中会发生分子和细胞水平的变异。因此，利用新型光纤和微纳器件，开发出基于双光子荧光和二次谐波等高分辨率光学技术的内窥成像系统，可以与传统的十二指肠镜兼容，实现无损、实时、在体地监测分子和细胞水平的代谢失常和功能障碍，从而能有效地检测微小肿瘤性病变，大大地提高肿瘤的早期诊断率。此外，在该光学内窥系统的基础上，还可以利用荧光光谱仪作为探测器，通过检测荧光光谱的变化可以反映组织荧光团的分布与差异，为胰腺癌的早期诊断提供更为丰富的信息。目前未见有将基于双光子荧光和二次谐波的光学内窥方法用于胰腺癌的成像，因此，发展高分辨光学内窥系统是当前临床的迫切需求。
发明内容
本发明针对现有技术的不足和缺陷，综合集成和应用了光纤光学、微纳制造、医学影像学等多个学科领域的最新成果，发展了基于双光子激发荧光、二次谐波、偏振敏感二次谐波的光学显微内窥成像技术的一种适用于胰管成像的高分辨光学内窥系统，以实现胰腺组织的在体高分辨光学成像。同时，基于上述系统可面向胰腺疾病获取高分辨率图像数据库，提取并分析肿瘤早期转化模型和临床研究成果的光学多参量，并结合现有诊断方法进行融合研究，揭示癌变过程中的光学表征规律，为胰腺癌的早期诊断提供新的依据和方法，对于降低胰腺癌发病率和死亡率以及提高人类健康和医疗水平具有重要的意义。
本发明的技术方案为：
适用于胰管成像的高分辨光学内窥系统，主要由高重复频率的超短脉冲激光器1(重复频率可达80MHz、超短脉冲为15fs-1ps)、半波片2、功率衰减器3、光子晶体光纤4、胰管镜探头5、二相色镜7、图像传感器CCD8、分束镜10、带通或高通滤光片11、窄带滤光片14、偏振分光棱镜15、光电倍增管(12、16、18)、计算机控制处理单元20组成，胰管镜探头5由单根光子晶体光纤、小型扫描器件和微型成像透镜组成，其特征在于：高重复频率的超短脉冲激光器1发出的近红外超短脉冲光经半波片2改变其偏振方向后再经功率衰减器3进行衰减，然后经光子晶体光纤4压缩激发脉冲的宽度，入射胰管镜探头5，经胰管镜探头的单根光子晶体光纤、小型扫描器件和微型成像透镜到达胰管上皮6，激发产生二次谐波信号和双光子激发荧光信号，与由白光照射产生的反射光信号一起从胰管镜探头5输出；小型扫描器件的扫描控制单元19与计算机控制处理单元20相连，控制其对胰管进行逐点扫描成像；反射光信号经二相色镜7从混合信号中分离出来，采用高灵敏度的CCD8进行探测，探测到的信号输入计算机控制处理单元20，实现白光照射反射成像9；剩余的混合信号经分束镜10分为两束，一束经带通或高通滤光片11分离出双光子激发荧光信号由一光电倍增管12进行探测，探测到的信号输入计算机控制处理单元20，实现双光子激发荧光成像13；另一束经窄带滤光片14分离出二次谐波信号，再经偏振分光棱镜15分成平行与垂直于激发光偏振方向的两路偏振正交信号由另两个光电倍增管18和16分别进行探测，探测到的信号输入计算机控制处理单元20，实现二次谐波或偏振敏感二次谐波成像17；切换半波片2可以使激发光的偏振方向与原激发光的偏振方向平行或垂直，再加上偏振分光棱镜15的作用，一共可以得到四幅二次谐波图像，实现二次谐波或偏振敏感二次谐波成像17。
本发明采用高重复频率的超短脉冲激光器，如锁模钛宝石飞秒激光器或其他高重复频率的飞秒或皮秒激光器或超快锁模激光器作为双光子激发荧光和谐波成像的光源，波长可调范围为720-990nm。根据胰管上皮细胞的特点选择合适的波长进行成像，一般选择750nm。
本发明利用半波片改变入射激光的偏振方向，使其能在相互垂直的两个方向进行切换。
本发明利用功率衰减器对从高重复频率的超短脉冲激光器如锁模钛宝石飞秒激光器输出的激光功率进行衰减，使输入胰管的光功率符合激光安全应用的美国国家标准ANSI。
本发明利用光子晶体光纤提高成像信号水平，实现激发和信号收集效率的最大化。
本发明采用集成了单根光子晶体光纤、小型扫描器件和微型成像透镜，具有良好的物理特性和生物兼容性，直径小于现有十二指肠镜的工作通道(4mm)的新型胰管镜探头实现胰管的扫描成像。探头的设计与集成适用于胰管的解剖结构和活体成像环境，兼顾内窥成像过程中的实用性和安全性。
本发明利用二相色镜实现胰管上皮反射光信号和二次谐波信号、双光子激发荧光信号的分离。到达二相色镜的反射光信号完全反射，而二次谐波信号和双光子激发荧光信号完全透射。
本发明采用高灵敏度的CCD探测胰管上皮反射光信号，并将探测到的信号输入计算机控制处理单元，实现传统胰管镜检，获得胰管粘膜组织形态的直观信息。
本发明利用带通或高通滤光片将双光子激发荧光信号从经过分束镜以后的混合信号中分离出来。
本发明利用窄带滤光片将二次谐波信号从经过分束镜以后的混合信号中分离出来。
本发明利用偏振分光棱镜将二次谐波信号分成平行与垂直于激发光偏振方向的两个偏振正交信号。
本发明采用高灵敏度的光电倍增管探测二次谐波、偏振敏感二次谐波和双光子激发荧光信号，并将探测到的信号输入计算机控制处理单元，实现光学成像。
本发明可对反射光、双光子激发荧光、偏振敏感二次谐波(平行与垂直于激发光偏振方向的两路偏振正交信号)共四个通道的信号进行同时探测，实现传统胰管镜检的同时获得胰管上皮的在体高分辨成像结果，从而在获得胰管组织形态直观信息的同时检测胰腺上皮细胞及亚细胞水平的形态及代谢改变。
本发明发展了双光子激发荧光、二次谐波、偏振敏感二次谐波成像装置，主要针对胰腺上皮细胞进行二次谐波、偏振敏感二次谐波、双光子激发荧光复合成像。可对二次谐波和双光子激发荧光图像，偏振敏感二次谐波和双光子激发荧光图像，二次谐波和偏振敏感二次谐波图像，双光子激发荧光、二次谐波和偏振敏感二次谐波图像进行组合，获得胰腺组织结构和功能的互补信息，并在此基础上进一步利用计算机控制处理单元得到胰腺上皮细胞代谢水平和形态学特征相关的参量。
本发明发展了基于光学成像技术的内窥成像装置，即利用双光子激发荧光和二次谐波成像的光纤成像系统，集成基于光子晶体光纤和小型扫描器件的胰管镜探头，在确保良好的信号水平、物理特性和生物兼容性的基础上实现胰管在体高分辨光学成像，从而满足对主胰管及周围肿瘤性病变早期诊断的需求。
本发明结合荧光光谱仪，直接反映生物组织的荧光物质来源，获得各种荧光团的分布与差异信息，通过检测光谱学变化为光学显微内窥成像提供更为丰富的信息。
附图说明
图1为基于光学成像技术进行胰管光学显微内窥成像装置示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细说明：
参照图1，本发明主要由高重复频率的超短脉冲激光器1、半波片2、功率衰减器3、光子晶体光纤4、胰管镜探头5、二相色镜7、图像传感器CCD 8、分束镜10、带通或高通滤光片11、窄带滤光片14、偏振分光棱镜15、光电倍增管(12、16、18)、计算机控制处理单元20组成，胰管镜探头5由单根光子晶体光纤、小型扫描器件和微型成像透镜组成，高重复频率的超短脉冲激光器1发出的近红外超短脉冲光经半波片2改变其偏振方向后再经功率衰减器3进行衰减，然后经光子晶体光纤4压缩激发脉冲的宽度，入射胰管镜探头5，经胰管镜探头的单根光子晶体光纤、小型扫描器件和微型成像透镜到达胰管上皮6，激发产生二次谐波信号和双光子激发荧光信号，与由白光照射产生的反射光信号一起从胰管镜探头5输出；小型扫描器件的扫描控制单元19与计算机控制处理单元20相连，控制其对胰管进行逐点扫描成像；反射光信号经二相色镜7从混合信号中分离出来，采用高灵敏度的CCD 8进行探测，探测到的信号输入计算机控制处理单元20，实现白光照射反射成像9；剩余的混合信号经分束镜10分为两束，一束经带通或高通滤光片11分离出双光子激发荧光信号由一光电倍增管12进行探测，探测到的信号输入计算机控制处理单元20，实现双光子激发荧光成像13；另一束经窄带滤光片14分离出二次谐波信号，再经偏振分光棱镜15分成平行与垂直于激发光偏振方向的两路偏振正交信号由另两个光电倍增管18和16分别进行探测，探测到的信号输入计算机控制处理单元20，实现二次谐波或偏振敏感二次谐波成像17；切换半波片2可以使激发光的偏振方向与原激发光的偏振方向平行或垂直，再加上偏振分光棱镜15的作用，一共可以得到四幅二次谐波图像，实现二次谐波或偏振敏感二次谐波成像17。
结合荧光光谱仪，直接反映生物组织的荧光物质来源，可获得各种荧光团的分布与差异信息，通过检测光谱学变化为光学显微内窥成像提供更为丰富的信息。基于所获得的双光子荧光和谐波信号的光学图像，可建立信息整合与分析方法及相应软件，提取和计算胰腺肿瘤不同阶段的荧光和谐波强度、细胞代谢水平、细胞核尺寸、胶原和弹性蛋白的分布等多个参数信息。同时，结合病理切片的结果，可研究胰腺肿瘤不同阶段的光学表征规律，建立胰腺肿瘤在体高分辨率成像数据库，为研究胰腺肿瘤的光学辨识标准提供信息。
目前诊断肿瘤的“金标准”是组织病理(细胞)学检查，其检查结果最为准确、可靠。通常对恶性肿瘤进行病理学诊断的依据是形态学特征，其中核增大、核大小形态不一、核与胞质比例失常和结缔组织增生(主要是I型胶原纤维和糖蛋白等)是胰腺癌中存在的显著病理特征。基于胰管组织的成像结果提取出胰腺肿瘤不同阶段的多个参数信息，不仅可以通过荧光图像和二次谐波图像分别获得细胞核尺寸、形态、核质比大小以及胶原纤维增生的信息，从而与传统的组织病理学诊断结果相联系，而且还能获得各种荧光团的分布和组织代谢水平差异等更为丰富的信息，并在此基础上对多种参数进行定量分析可以实现更准确的早期诊断。此外，病理学诊断方法需要从患者体内取材才能确定肿瘤的性质，如取患病器官的分泌物、组织表面的刮片制成细胞学涂片或直接取病灶组织制成切片或印片，同时因其属抽样检查，不能代表整个病变，且受到取材部位、肿瘤组织是否存活以及医师的取材技术等多方面因素的影响。相比之下，利用高分辨光学内窥系统可以在无损的情况下对活体胰管组织进行成像，避免了对生物体的损伤和取材等因素对诊断的影响。
综上所述，本发明所阐述的适用于胰管成像的高分辨光学内窥系统结合了双光子激发荧光成像、二次谐波成像和偏振敏感二次谐波成像，为胰腺癌的病理研究和早期诊断提供了新的方法和依据，对有效治疗胰腺癌、改善预后有着重要的意义，可广泛应用于医学研究领域和临床医学诊断方面。
该实例是以本发明的技术方案为前提进行实施的，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于上述实施例。
Claims (2)
1.适用于胰管成像的高分辨光学内窥系统，主要由高重复频率的超短脉冲激光器、半波片、功率衰减器、光子晶体光纤、胰管镜探头、二相色镜、图像传感器CCD、分束镜、带通或高通滤光片、窄带滤光片、偏振分光棱镜、光电倍增管、计算机控制处理单元组成，所述的胰管镜探头由单根光子晶体光纤、小型扫描器件和微型成像透镜组成，其特征在于：高重复频率的超短脉冲激光器发出的近红外超短脉冲光依次经半波片、功率衰减器、光子晶体光纤入射胰管镜探头的单根光子晶体光纤、小型扫描器件和微型成像透镜到达胰管上皮，激发产生二次谐波信号和双光子激发荧光信号，与由白光照射产生的反射光信号一起经胰管镜探头的微型成像透镜输出；胰管镜探头中小型扫描器件的控制单元与计算机控制处理单元相连；反射光信号经二相色镜从混合信号中分离出来，采用CCD进行探测，探测到的信号输入计算机控制处理单元，实现白光照射反射成像；剩余的混合信号经分束镜分为两束，一束经带通或高通滤光片分离出双光子激发荧光信号由一光电倍增管进行探测，探测到的信号输入计算机控制处理单元，实现双光子激发荧光成像；另一束经窄带滤光片分离出二次谐波信号，再经偏振分光棱镜分成平行与垂直于激发光偏振方向的两路偏振正交信号由另两个光电倍增管分别进行探测，探测到的信号输入计算机控制处理单元，实现二次谐波或偏振敏感二次谐波成像，所述的高重复频率达80MHz，超短脉冲为15fs-1ps。
2.根据权利要求1所述的适用于胰管成像的高分辨光学内窥系统，其特征在于：所述的高重复频率的超短脉冲激光器为锁模钛宝石飞秒激光器、锁模钛宝石皮秒激光器或超快锁模激光器，波长范围为720-990nm。
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