背景技术
甘蓝型油菜游离小孢子的分离技术简单,通过游离小孢子培养技术获得胚状体和再生苗的效率高,而且小孢子培养是研究花粉细胞分化条件、胚胎发生和形态建成机理的一种较为理想的方法,因此该技术一直受到各国油菜育种家的普遍青睐。多年来,许多学者对小孢子培养的培养基成份、蕾的大小、小孢子培养过程中温度的变化、提高再生苗频率等诸方面进行了广泛的研究,使得小孢子培养技术逐步成熟并得到了广泛的应用。
在常规杂交育种中,获得稳定遗传的后代或株系一般要经过5~8代性状选择。如果对F1代植株进行小孢子培养,再生植株为单培体,经染色体加倍后产生纯合二倍体单株(double haploid,简称DH),这种二倍体单株各种遗传性状已纯合,不会发生分离,因此可以快速使性状纯合;在小孢子培养形成的DH系后代中,没有显性基因掩盖隐性基因表现的干扰,有利于对隐性基因的筛选;DH系后代的性状理论上是按照配子体基因型(花粉基因型)分离的,即以2n分离,而F2代的性状理论上是按照胞质体基因型分离的,即以4n分离,为了得到目标性状单株,前者群体远远小于后者,因此甘蓝型油菜小孢子培养技术在许多油菜育种计划中得到应用。
20118A是上海市农业科学院孙超才研究员于1997年选育的一种新的隐性细胞核雄性不育,其不育株花药空瘪,无花粉,套袋自交不结实,且不育性稳定,不受环境条件的影响。通过普通遗传学研究证明20118A为隐性上位互作遗传模式,即其不育性受两对重叠隐性不育基因(a和b)与一对隐性上位抑制基因(rf)互作控制,隐性上位基因纯合时对隐性不育基因起作用。不育系可通过兄妹交保持,不育株的基因型有纯合型aabbRfRf和杂合型aabbRfrf两种,三对基因为隐性(aabbrfrf)时可作临保系,与纯合型不育系杂交能够生产全不育群体,然后利用全不育系与恢复系杂交生产杂交种(参见图1)。目前由该系统选育的三个国审双低杂交油菜品种“沪油杂1号”、“向农03”和“沪油杂4号”正在生产上大面积的推广,说明该不育系统具有广阔的应用前景与生产利用价值。
但是由于隐性核不育系是受到三对基因控制(aabbRfRf),分离群体大,基因型多且复杂,导致测交与测交种鉴定的工作量大,选育难度很大。利用常规育种技术,隐性核不育系是以隐性核不育纯合两型系的形式应用于杂交种生产的,即隐性核不育系需要借助于纯合两型系兄妹交来繁殖和保存(图2),为了使得纯合两型系中的不育株和可育株遗传背景一致,必须经过5代以上兄妹交,因此导致其选育周期长,而且在生产全不育系时需要在母本行中拔除纯合两型系中50%的可育株,影响全不育系的产量与质量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用甘蓝型油菜小孢子培养技术选育隐性核不育系的方法,通过甘蓝型油菜小孢子培养技术,寻找一种简单、可行、高效技术能够快速获得隐性核不育系(基因型为aabbRfRf)。
由于通过甘蓝型油菜小孢子培养技术获得的DH隐性核不育株不能自交保存,需借助于甘蓝型油菜无性克隆技术保存并大量繁殖所得到的DH不育株。因此,本发明利用无性克隆技术,保存与扩繁依据本发明技术方案得到的DH隐性核不育系,直接将其用于隐性核不育杂交油菜育种中,从而摆脱了原有隐性核不育三系法制种时对隐性核不育纯合两型系的依赖,同时减少了全不育系生产时母本行中拔除纯合两型系内可育株的步骤,简化了生产步骤,提高了全不育系种子的纯度。
本发明所述的利用小孢子培养技术选育甘蓝型油菜隐性核不育系的方法,首先以优良的品种/系与隐性核不育系或临保系杂交,获得F1代;然后以甘蓝型油菜小孢子培养技术对F1代植株的游离小孢子进行诱导培养而获得DH株系;再以表现为不育的DH株系与临保系测交,测交种为100%不育,则对应的不育DH株系为本发明所述的隐性核不育系;然后借助于无性克隆技术保存并扩繁不育的DH株系,应用于杂交种生产。
所述方法具体包括以下步骤:
a、以F1代植株为供体,在花蕾期,每次从油菜花序上取3~4mm大小的蕾,表面消毒后用无菌水清洗3次;加入B5培养液研磨,用40μm尼龙网过滤,滤液经过100g离心5-8min,吸去上清液后,再向离心管中加含秋水仙碱的NLN-16培养液密封,置于32℃的恒温箱中暗培养48h,然后重复上述步骤离心,吸去上清液,加入NLN-13培养液分装到培养皿中,密封,置于25℃的恒温箱中暗培养,当肉眼可见到胚状体后转到25℃摇床上继续暗培养1-2周。
b、将上述a步中的胚状体转移到固体B5培养基上,在10℃的光照培养室中诱导形成小植株,然后置于25℃的光照培养室中培养,并将每个不同基因型的小植株扩繁多个拷贝,以保证每个基因型都能存活。
c、将上述b步中的小植株分不同基因型种植到田间,到花期,将加倍成功的不育DH株系与隐性核不育临保系测交。
d、将上述c步中测交种进行鉴定,若测交种为全部不育,则对应的单株即为本发明的隐性核不育系。
f、将上述d步中鉴定的优良隐性核不育系进行无性克隆,并扩繁得到生产上需要的大量不育株,用于生产全不育系,进而生产商用杂交种。
由于甘蓝型油菜种子的繁殖系数为1∶1000左右,所以利用无性克隆扩繁不育株的方法无论是在理论上还是实践中都有可行性,利用小孢子培养和无性克隆技术快速获得甘蓝型油菜隐性核不育系在甘蓝型油菜隐性核不育杂交育种体系中的应用价值很高。
所述F1代是以优良的品种/系为母本,以隐性核不育临保系为父本杂交而成。
所述优良的品种/系母本为沪油15,系上海市农业科学院孙超才研究员选育而成,是上海市第一个通过国家油菜品种审定和获得国家植物新品种保护的甘蓝型双低油菜品种,被国家科技部和农业部列为国家级成果重点推广品种之一,含油率为42.43%,芥酸含量为0.38%,硫苷含量为19.01μmol/g,农艺性状优良。
所述隐性核不育临保系为临保系M-6029,基因型为aabbrfrf,可育,与隐性核不育20118A(aabbRfRf)杂交,其后代基因型为aabbRfrf,仍不育,但是该不育性只能保持一代,其后代会发生育性分离,故称基因型aabbrfrf的M-6029为甘蓝型油菜隐性核不育20118A的临保系,系上海市农业科学院孙超才于1999年在隐性核不育20118A的测交组合中通过连续的自交,测交选育而成。
利用上述隐性核不育临保系M-6029对不育株的DH株系进行基因型鉴定。
其中,上述方法中所用到的B5培养液为B5基本组份+130g蔗糖/L;固体B5培养基为B5基本组份+25g蔗糖+7g琼脂粉/L;NLN-13培养液为NLN基本组份+130g蔗糖/L;NLN-16培养液为NLN基本组份+160g蔗糖+100mg秋水仙素/L。B5基本组份和NLN基本组份的配方如下表1所示。
表1B5基本组份和NLN基本组份的配方(mg/L)
本发明与原有隐性核不育系(原有的隐性核不育系是以隐性核不育纯合两型系的形式应用于杂交种生产的)的选育相比具有以下优势:
1.与原有隐性核不育系的选育相比效率更高:从原有的以优良的品种(系)与隐性核不育临保系或不育系杂交,获得F1代,以基因型为AaBbRfrf为例,利用常规的育种方法自交,从F2代植株中获得不育系的概率为1/64(参见表2),而利用甘蓝型油菜小孢子技术选育不育系,其DH后代实际上为8种雄配子基因型中的一个,故不育系的出现频率为1/8,因此选育效率更高。
表2F1自交后代的表现型
2.与原有隐性核不育系的选育相比缩短了育种周期:利用甘蓝型油菜小孢子培养获得DH不育系,因其为单倍体直接加倍而成的,遗传背景完全纯合,故可以直接利用该DH不育系进行油菜杂交育种。利用原有的常规方法选育隐性核不育纯合两型系,需要5-8代自交、兄妹交和测交,才能使纯合两型系的不育株和可育株的基因型完全纯合,因此,相对传统的选育方法,本发明的育种周期大为缩短。
3.与原有的全不育系生产技术相比有如下几点优势:
1)摆脱了原有的全不育系生产时对隐性核不育两型系的依赖
采用甘蓝型油菜隐性核不育纯合两型系、临保系、恢复系三系配套生产商用杂交种时,最关键的一步是全不育系的生产,即用纯合两型系与临保系杂交生产全不育系。纯合两型系内50%的植株表现为不育,另外50%表现为可育,到了花期时人工拔除50%可育株,保留50%不育株与临保系杂交生产全不育系。
利用甘蓝型油菜小孢子培养获得的DH不育系,因其为单倍体直接加倍而成的,遗传背景完全纯合,然后利用无性克隆技术扩繁获得大量的DH不育株,移栽至隔离大棚的母本行中用于全不育系的生产,不需要借助纯合两型系兄妹交繁殖和保存。
2)优化了全不育系制种程序
利用本发明的无性克隆技术扩繁可获得大量的DH不育系,减少了甘蓝型油菜纯合两型系兄妹交繁殖的步骤,同时在全不育系生产时不需要拔除母本行中50%的可育株,简化隐性核不育杂交制种体系,尤其是全不育系的生产步骤。
3)提高了全不育系制种的产量和纯度
利用原有的隐性核不育纯合两型系生产全不育系,需要在临近开花前,将母本行中纯合两型系的可育株拔除,纯合两型系内的不育株与可育株没有形态差异二者随机交融成一个整体。只有在开花后,通过观察雄蕊退化与否才能将二者区分。因此在生产实践中不可能将纯合两型系内的可育株及时、彻底地拔除,也就是个别或少数可育株没有被及时拔除或没有被拔除。迟拔或漏拔的可育株不仅会对不育株授粉,而且漏拔的可育株会自花授粉,其后代中出现不同数量可育株,其结果是全不育系的不育株率低,纯度差。同时,因不育株只占母本行的50%,且不育株上前期花蕾需摘除,导致产量也降低。
利用本发明无需拔除可育株,可有效增加不育株数,且全不育系生产时可进行全封闭式管理,无需摘除不育株上的前期花蕾,因此制种产量高,纯度优。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案,但实施例并不限制于本发明的技术方案。
实施例1
F1的配置
临保系M-6029,其基因型为aabbrfrf,是隐性核不育20118A的临保系,系上海市农业科学院孙超才研究员于1999年在隐性核不育20118A的测交组合中通过连续的自交,测交选育而成,芥酸含量为0.89%,硫苷含量为25.36μmol/g,农艺性状优良,一般配合力与特殊配合力高。
沪油15,系上海市农业科学院孙超才研究员选育而成,是上海市第一个通过国家油菜品种审定和获得国家植物新品种保护的甘蓝型双低油菜品种,被国家科技部和农业部列为国家级成果重点推广品种之一,含油率为42.43%,芥酸含量为0.38%,硫苷含量为19.01μmol/g,农艺性状优良。
以上述沪油15为母本,临保系M-6029为父本杂交获得F1代种子。
实施例2
隐性核不育系DH203A的选育
1.供体F1材料的小孢子培养
在2005年3月油菜花期,对供体材料F1(沪油15×临保系M-6029)进行小孢子培养,共获得了379个胚状体,经过诱导培养获得了282个单株,其中加倍植株为76个DH株系,通过测交鉴定,发现有11个DH株系的基因型为aabbRfRf。
2.DH隐性核不育系的鉴定
因油菜主要的品质性状为母本效应,因此利用以上11个基因型为aabbRfRf不育DH株系的测交种进行品质性状检测,获得了一个芥酸含量和硫苷含量符合国家双低标准,含油量≥40%的DH株系,通过田间表现观察其农艺性状较好,将其命名为隐性核不育系DH203A。
3.利用隐性核不育系DH203A配置杂交种的区试表现
上海市农业科学院2009年利用上述隐性核不育系DH203A配置了杂交组合“向农05”,该杂交组合在2009~2010年度上海市油菜区试中平均亩产203.33kg,比对照增产10.96%,增产达极显著水平(5个试点全部表现增产);产油量88.06kg,增10.35%。含油量为43.31%,芥酸与硫甙含量符合国家油菜双低标准。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。