CN101932727A - 通过极光激酶a的荧光原位杂交非侵入性检测膀胱癌 - Google Patents

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Abstract

公开了检测患者中的膀胱癌的方法，其包括从患者的尿中分离膀胱细胞；使膀胱细胞与经标记的DNA探针杂交，其中探针识别极光激酶A基因的至少部分，以产生与经标记的DNA探针杂交的膀胱细胞样品；并且计数样品中的膀胱细胞数目、样品中的每个膀胱细胞中的极光激酶A基因拷贝数、和样品中具有极光激酶A基因的至少拷贝数第一阈值的膀胱细胞数目。

Description

通过极光激酶A的荧光原位杂交非侵入性检测膀胱癌
发明背景
本发明在由National Cancer Institute授予的授权号U01 CA85078下由美国政府支持进行。美国政府具有本发明中的特定权利。
本发明一般涉及癌症检测领域。更具体而言，它涉及膀胱癌的检测。
发明概述
在一个实施方案中，本发明涉及检测患者中的膀胱癌的方法，其包括从患者的尿中分离膀胱细胞；使膀胱细胞与经标记的DNA探针杂交，其中探针识别极光激酶A(aurora kinase A)基因的至少部分，以产生与经标记的DNA探针杂交的膀胱细胞样品；并且计数样品中的膀胱细胞数目、样品中的每个膀胱细胞中的极光激酶A基因拷贝数、和样品中具有极光激酶A基因的至少拷贝数第一阈值的膀胱细胞数目。
附图简述
下述附图构成本发明说明书的部分，并且包括在内以进一步证实本发明的特定方面。本发明通过参考与本文呈现的特定实施方案的详述组合的这些附图中的一个或多个可以得到更好地理解。
图1。极光激酶A在移行细胞癌(TCC)中的表达及其与DNA倍数性的关联。A，通过定量RT-PCR揭示的相邻尿道上皮和TCC的成对样品中的极光激酶A水平。B和C，分别通过显示近二倍体(2c)DNA含量和显著的非整倍体(6c)的肿瘤核的图像分析产生的DNA直方图。D，低级别(级别1-2)、浅表(Ta-Tla)和高级别(级别3)、侵入性(Tlb和更高的)TCC以及近二倍体和非整倍体TCC中的极光激酶A的平均表达水平。
图2。在膀胱癌细胞系中的极光激酶A表达和染色体拷贝数。A，通过定量RT-PCR，极光激酶A在膀胱癌细胞系中的表达与经培养的尿道上皮细胞(NU204)相比较。B，使用针对染色体3、7和17的着丝粒探针通过定量FISH揭示的染色体拷贝数。C，在3组膀胱癌细胞系中的极光激酶A的平均表达水平。D，在C中显示的3组膀胱癌细胞系中，用针对染色体3、7和17的着丝粒探针通过FISH揭示的癌细胞系中的平均染色体拷贝数。
图3。使用抗GFP抗体用包含野生型极光激酶A插入片段的腺病毒载体转染的SV40尿道上皮细胞中的极光激酶A-GFP融合蛋白的异位表达。A，显示极光激酶A-GFP融合蛋白的表达的Western印迹分析(上图)。用DAPI作为核复染剂显示极光激酶A-GFP融合蛋白的异位表达的免疫荧光分析(下图)。用不含极光激酶A插入片段的腺病毒载体感染的细胞的免疫荧光图像(a，b)。用红色滤光器获得的图像揭示2个中心体(a)。用绿色滤光器获得的图像揭示没有极光激酶A-GFP融合蛋白的异位表达(b)。用包含极光激酶A插入片段的腺病毒载体感染的细胞的免疫荧光图像(c，d)。用红色滤光器获得的图像显示用抗微管蛋白抗体揭示的中心体倍增(红色)(c)。用绿色滤光器获得的图像显示在中心体中异位表达的极光激酶A-GFP蛋白质(d)。B，通过异位表达的极光激酶A诱导的中心体和染色体拷贝数的定量评估。C，与用PI复染剂揭示的DNA含量(红色荧光)相关的异位表达的极光激酶A-GFP蛋白质(绿色荧光)的双重荧光FACS分析。在用包含野生型极光激酶A插入片段的腺病毒载体感染后的双重荧光分布图(右图)。用空腺病毒载体感染的细胞的对照分布图(右图)。与对照相比较(左图)，注意到在指定为A和B的分布图区域中的非整倍体(aneuploid)细胞的增加(右图)。D，通过C中显示的双重荧光FACS分析和软琼脂上的集落形成揭示的非整倍体细胞的定量评估。Ad/对照：用不含极光激酶A插入片段的腺病毒载体感染的细胞，Ad/极光激酶A GFP：用包含野生型极光激酶A的腺病毒载体转染的细胞，MOI：感染复数。
图4。用极光激酶A FISH探针检测排泄尿中的癌细胞。A，双重荧光FISH证实，极光激酶A基因拷贝数(红色)和染色体特异性探针的短臂(绿色)。正常尿道上皮细胞中的极光激酶A的二倍体拷贝数(a)。在低级别(级别1-2)TCC中的低水平极光激酶A基因扩增(3个拷贝)(b)。在高级别(级别3)侵入性TCC中的高水平极光激酶A基因扩增(＞4个拷贝)(c)。在包含极光激酶A的多个拷贝和染色体20p探针的高级别(级别3)侵入性TCC中的染色体20的多体性polysomy(d)。B，来自具有膀胱TCC的23个患者(训练组)的排泄尿样品中的极光激酶A基因拷贝数的定量FISH分析。显示了在个别患者中显示极光激酶A的低(3-4个拷贝)和高(＞4个拷贝)扩增水平的细胞百分比。C，由来自具有膀胱癌的患者的23份尿样品组成的训练组和来自7个健康未受影响对照的7份尿样品中关于极光激酶AFISH测试的ROC曲线(n＝30)。D，由来自具有膀胱癌的患者的51份尿样品组成的测试组和来自健康未受影响对照的30份尿样品中关于极光激酶A FISH测试的ROC曲线(n＝81)。E，通过组织学级别的极光激酶A得分。
图5。来自具有膀胱TCC的74个患者和37个健康对照(组合的训练和测试组)的排泄尿样品中的极光激酶A基因拷贝数的定量FISH分析。显示了在个别患者中显示极光激酶A的低(3-4个拷贝)和高(＞4个拷贝)扩增水平的细胞百分比。
图6。AURKA 20q13探针的图。
举例说明性实施方案的描述
以非整倍性形式表现染色体不稳定性的恶性细胞经常显示额外的中心体和多极有丝分裂纺锤体，暗示在细胞器控制有丝分裂时的染色体分离的异常在非整倍性的发展中起作用。1-3
极光激酶A也称为STK15或BTAK，是丝氨酸苏氨酸激酶家族成员，其中包括果蝇(Drosophilia)极光和酿酒酵母(Saccharomycescervisiae)IPL1激酶。4-6这些激酶已鉴定为人细胞中的正常染色体分离和中心体功能(包括中心体分离和突变调节)的关键调节物。7此外，已显示位于染色体20q13上的极光激酶A基因的过表达与非整倍性和染色体不稳定性相关，促进哺乳动物细胞和几种人肿瘤(包括尿道上皮癌)中的致瘤性转化和进展。4，8
有趣的是，经诱导以经历体外转化的原代人尿道上皮细胞表现染色体20q13.2的扩增，暗示在这个染色体上的一种或多种基因的过表达可能在膀胱癌的发展中起显著作用。9这些观察连同在染色体20q13上的极光激酶A编码基因也已鉴定为小鼠和人中的肿瘤易感性基因座10以及极光激酶A诱导p53肿瘤抑制基因的功能灭活5的事实，暗示极光激酶A的表达增加可能是人尿道上皮细胞中的染色体不稳定性和转化的关键遗传决定因素。
在一个实施方案中，本发明涉及检测患者中的膀胱癌的方法，其包括从患者的尿中分离膀胱细胞；使膀胱细胞与经标记的DNA探针杂交，其中探针识别极光激酶A基因的至少部分，以产生与经标记的DNA探针杂交的膀胱细胞样品；并且计数样品中的膀胱细胞数目、样品中的每个膀胱细胞中的极光激酶A基因拷贝数、和样品中具有极光激酶A基因的至少拷贝数第一阈值的膀胱细胞数目。
从患者的尿中分离膀胱细胞(最通常地，尿道上皮细胞)可以通过本领域已知的任何技术来执行。在一个实施方案中，分离膀胱细胞可以通过下述来完成：收集来自患者的排泄尿样品(约100-200ml)，在够以使尿中的膀胱细胞形成团块的旋转速度和持续时间下离心，弃去上清液，并且使形成团块的膀胱细胞重悬浮于合适溶液中用于贮存或使用。在一个实施方案中，离心的持续时间和旋转速度是约15分钟和以约1000rpm。在一个实施方案中，使形成团块的膀胱细胞重悬浮于具有10％DMSO(二甲基亚砜)的2ml DMEM(Dulbecco/Vogt ModifiedEagle’s Minimal Essential Medium)中并且贮存于-70℃，直至在其在该方法的后续步骤中使用前使重悬浮的膀胱细胞解冻的时候。
在解冻后和在杂交前，膀胱细胞可以在PBS(磷酸盐缓冲盐水)或适合于洗涤膀胱细胞的其它缓冲液中洗涤一次或多次，例如3次，随后为离心以使经洗涤的膀胱细胞形成团块。形成团块的经洗涤的膀胱细胞可以在甲醇/乙醇(3∶1)中固定，在2x SSC/0.5％NP-40，pH 7中在37℃下预处理30分钟，随后为在乙醇中在90℃下脱水5分钟。如对于本领域普通技术人员显而易见，适合于制备用于与经标记的DNA探针杂交的膀胱细胞的其他处理技术可以作为常规实验内容执行。
使膀胱细胞与经标记的DNA探针杂交可以通过本领域技术人员已知的任何技术来执行。经标记的DNA探针可以包括任何DNA序列和任何可检测部分，前提是探针识别极光激酶A基因的至少部分。在一个实施方案中，可检测部分包括荧光团。在一个实施方案中，可检测部分包括放射性同位素。
来自人(H.sapiens)的极光激酶A的cDNA序列显示为SEQ ID NO：1(GenBank登记号BC001280)，并且来自人的极光激酶A的基因组序列显示为SEQ ID NO：2。尽管在其他方面相同，但2个序列在位置301处不同，并且cDNA包含基因组序列缺乏的16聚体腺苷尾部。
“探针识别极光激酶A基因的至少部分”意指探针包括具有这样的序列的DNA分子，所述序列与极光激酶A基因的部分的至少一条DNA链基本上完全互补(即，至少约90％互补，例如至少约95％互补、至少约96％互补、至少约97％互补、至少约98％互补、至少约99％互补、至少约99.5％互补或至少约99.9％互补)，并且进一步地，探针的DNA分子足够长并且具有这样的序列，使得它将基本上仅与极光激酶A基因杂交，并且将基本上不与膀胱细胞的任何其他基因或不表达的基因组元件杂交。进一步希望探针的DNA分子不是那么长，以需要长时间与极光激酶A基因杂交。在一个实施方案中，经标记的DNA探针包括AURKA 20q13(MP Biomedicals/Qbiogene，Illkirch，France)。AURKA 20q13特异性DNA探针进行最佳化，以检测在中期/间期散布、血涂片和石蜡包膜组织切片上在区域20q13处在染色体20上的极光激酶A基因拷贝数。
可以使用可以与探针的DNA分子结合的任何荧光团。在一个实施方案中，荧光团选自若丹明和荧光素。在一个实施方案中，AURKA 20q13探针用若丹明(红色)直接进行标记，并且染色体20α-卫星探针用荧光素(绿色)直接进行标记。这种双色极光激酶A FISH探针可以用于检测排泄尿样品的剥落细胞中的极光激酶A基因拷贝数。
在一个实施方案中，杂交技术可以涉及脱水的膀胱细胞与10μlAURKA 20q13探针在37℃下温育约16小时(例如过夜)。为了去除未杂交的探针，细胞可以例如在0.5x SSC/0.1％SDS中在65℃下洗涤5分钟。在计数前细胞可以用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)进行复染并且在抗衰退溶液中进行固定。
在一个进一步的实施方案中，对于极光激酶A基因非特异性的第二种经标记的DNA探针可以与膀胱细胞杂交，以允许计数对于本领域普通技术人员可能感兴趣的其他DNA区域。
杂交步骤产生与经标记的DNA探针杂交的膀胱细胞样品。
计数样品中的膀胱细胞数目、样品中的每个膀胱细胞中的极光激酶A基因拷贝数、和样品中具有极光激酶A基因的至少拷贝数第一阈值的膀胱细胞数目，可以通过流式细胞术、荧光显微镜检查或放射性同位素检测领域的普通技术人员已知的任何合适技术来执行。流式细胞仪或荧光激活细胞分选器的使用是本领域众所周知的。当可检测部分是荧光团时，可以用任何合适的显微镜计数并且捕获荧光信号，例如Zeiss Axioplan 2(Carl Zeiss Microimaging GmbH，Jena，Germany)。
计数产生样品中的膀胱细胞数目、样品中的每个膀胱细胞中的极光激酶A基因拷贝数、和样品中具有极光激酶A基因的至少拷贝数第一阈值的膀胱细胞数目。拷贝数第一阈值可以选择为等于在膀胱癌细胞中通常发现的极光激酶A基因的最小拷贝数。在一个实施方案中，极光激酶A基因的拷贝数第一阈值是3。
在一个进一步的实施方案中，计数进一步包括计数具有极光激酶A基因的至少拷贝数第二阈值的膀胱细胞数目，其中拷贝数第二阈值大于拷贝数第一阈值。拷贝数第二阈值可以选择为等于在侵略性膀胱癌细胞中通常发现的极光激酶A基因的最小拷贝数。在一个实施方案中，极光激酶A基因的拷贝数第二阈值是5。
通过计数样品中的膀胱细胞数目、和样品中具有极光激酶A基因的至少拷贝数第一阈值的膀胱细胞数目，后面一个数目可以除以膀胱细胞数目，以计算具有极光激酶A基因的至少拷贝数第一阈值的膀胱细胞百分比。
在一个实施方案中，如果大于或等于第一阈值百分比的膀胱细胞具有极光激酶A基因的至少拷贝数第一阈值，那么该方法进一步包括假定患者具有膀胱癌的步骤。具有极光激酶A基因的至少拷贝数第一阈值的膀胱细胞的百分比任何值可以用作第一阈值百分比。在一个实施方案中，第一阈值百分比是15％。
在一个进一步的实施方案中，如果大于或等于第二阈值百分比的膀胱细胞具有极光激酶A基因的至少拷贝数第一阈值，其中第二阈值百分比大于第一阈值百分比，那么该方法进一步包括假定患者具有侵略性膀胱癌的步骤。“侵略性(aggressive)”膀胱癌指具有特征在于呈现侵入性肿瘤、非乳头状肿瘤、或具有组织学级别3的肿瘤中的一种或多种的膀胱癌。在一个实施方案中，第一阈值百分比是15％，并且第二阈值百分比是20％。
通过执行该方法，在假定患者是否具有膀胱癌以及如果具有膀胱癌，那么侵略性是如何中有用的因素可以由医生通过非侵入性技术进行定量。通过对因素定量，医生可以决定是否应执行或考虑执行其他诊断或治疗方法，例如膀胱镜检查、手术切除、BCG滴注到膀胱内、其他化学治疗分子滴注到膀胱内、辐照处理或胆囊切除术。通过在目前对膀胱癌进行治疗(例如通过化学治疗或辐射)的患者的复发基础上执行该方法，可以监控治疗的功效。通过在先前对膀胱癌进行治疗的患者的复发基础上执行该方法，可以监控可能存在的复发的程度。
我们已发现该方法具有高特异性(在下文实施例中，当n＝81时，特异性是1.0，意指假阳性率是0％)和高灵敏度(在下文实施例中，灵敏度是0.86，意指假阴性率是14％)。就我们所知，没有其他同事报告了在至少80名个体的样本大小上测试的非侵入性膀胱癌筛选方法，具有超过0.85的特异性和超过0.85的灵敏度，更不必说1.0的特异性和至少0.86的灵敏度。
包括下述实施例以证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解在下述实施例中公开的技术代表由本发明人发现在本发明的实践中工作良好的技术，并且因此可以被视为构成用于其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解可以在所公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍获得相同或相似结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1
概括
背景：导致非整倍性的染色体错误分离是瘤形成中的常见体细胞遗传改变，并且调节染色体分离的基因可能是潜在的癌症检测标记。有丝分裂的关键调节物——极光激酶A的扩增/过表达已在人癌症(包括膀胱癌)中频繁检测出，并且扩增程度与非整倍性程度相关。
方法：我们测量了在膀胱癌细胞中的极光激酶A表达的水平，并且使之与3种所选择的染色体的拷贝数和核DNA总含量相关联。极光激酶A对中心体倍增和染色体拷贝数的影响在体外使用腺病毒表达构建体进行测量。为了评估该基因作为关于膀胱癌的生物标记的适用性，还在来自膀胱癌患者的排泄尿的脱落细胞上使用荧光原位杂交(FISH)测量了极光激酶A基因拷贝数。
发现：极光激酶A在人尿道上皮细胞中的过表达诱导中心体的扩增、染色体错误分离和非整倍性。此外，极光激酶A基因的过表达在肿瘤发生的早期发生，并且可以在原位损伤中以及在具有膀胱癌的患者的排泄尿中检测出。在由来自具有膀胱癌的患者的51份排泄尿样品和30份未受影响的健康对照中组成的不知情验证测试上执行的关于极光激酶A基因拷贝数的FI SH测试，以特异性1.0和灵敏度0.86检测出膀胱癌。
解释：我们的发现指出过表达的极光激酶A可以引起尿道上皮细胞的非整倍性，并且是用于检测膀胱癌的有希望的生物标记。
前言
人膀胱癌是研究染色体不稳定性机制的理想系统，因为它经由乳头状和非乳头状途径从原位肿瘤前状态发展，这显示侵略性和非整倍性程度之间的强关联。11源于尿道上皮增生的大多数低级别、浅表乳头状肿瘤是近二倍体。尽管它们经常复发，但它们不太可能侵入膀胱壁且转移。相比之下，通过由严重发育异常癌原位进展而发展的基本上所有高级别、非乳头状肿瘤显示显著的非整倍性，并且具有侵入膀胱壁且转移的高倾向。
在本文研究中，评估了极光激酶A在来自原位尿道上皮增生的膀胱癌发展中的作用。我们研究了在人膀胱肿瘤样品和膀胱癌细胞系中的极光激酶A扩增和过表达水平，并且使之与非整倍性程度相关联。极光激酶A过表达的功能牵涉通过体外转染研究进行验证。最后，鉴定极光激酶A作为用于在尿中进行膀胱癌的非侵入性检测的潜在生物标记。
材料与方法
肿瘤样品和细胞系。如先前所述从21份人胆囊切除术样品中获得膀胱和相邻尿道上皮的移行细胞癌(TCC)的成对样品的细胞悬浮液。12简言之，刮下与肿瘤相邻的粘膜表面，并且将细胞转移到包含磷酸盐缓冲溶液(PBS)的锥形管内。肿瘤从冷冻块中切开，以使由非肿瘤细胞的污染降到最低，并且类似地转移至包含PBS的锥形管。通过机械搅动组织片段将肿瘤细胞释放到PBS溶液内。仅产生超过90％显微镜可识别肿瘤细胞或完整尿道上皮的那些样品用于这个研究。在肿瘤的经尿道切除前收集来自具有膀胱镜检查明显的膀胱癌的74个患者的排泄尿样品(约100-200ml)，并且在1000RPI下离心15分钟。使尿样品重悬浮于具有10％DMSO的2ml DMEM中并且贮存于-70℃。将尿道上皮内癌前病变分类为轻度、中度和重度发育异常或原位癌。肿瘤根据三层世界卫生组织(World Health Organization)组织学分级系统和生长模式(乳头状与非乳头状)进行分类。侵入深度根据TNM(肿瘤-结节-转移)分期系统进行记录。来自37个无膀胱癌证据的未受影响的健康个体的排泄尿样品作为对照。人膀胱癌细胞系UM-UC-1、UM-UC-2、UM-UC3、UM-UC-6、UM-UC-9、UM-UC-10、UM-UC-12、UM-UC-13、UM-UC-15、UM-UC-16和UM-UC-17，以及正常人尿道上皮细胞由我们建立，并且SV40永生化人尿道上皮细胞系SVHUC得自Dr.C.A.Reznikoff，并且如先前所述进行培养。13
用于极光激酶A的表达测定法。如先前所述定量RT-PCR用于分析相邻尿道上皮/膀胱肿瘤和细胞系的成对样品中的极光激酶A的表达水平。12简言之，对于RT-PCR，使用TaqMan RT试剂根据制造商的方案(Applied Biosystems，Foster City，CA)从2μg总RNA中合成cDNA。根据由Applied Biosystems提供的Assays-by-Design Service设计关于每种基因的引物和荧光探针。在PerkinElmer/AppliedBiosystems 7700Prism仪器上执行RT-PCR分析，使用持家基因18S作为内部标准化标准。由不含尿道上皮瘤形成的来自肾切除术样品的输尿管制备的尿道上皮悬浮液用作标准，根据其计算来自相邻尿道上皮和膀胱肿瘤的极光激酶A的相对表达。NU204人尿道上皮细胞如先前所述在体外生长14，并且用作参考以计算在体外生长的膀胱癌细胞系中的极光激酶A的相对表达水平。
极光激酶A基因拷贝数分析。购自MP Biomedicals/Qbiogene(Illkirch，France)的双色极光激酶A FISH探针(AURKA 20g13/a-卫星20DNA探针)用于检测排泄尿样品的脱落细胞中的极光激酶A基因拷贝数。AURKA 20813探针用若丹明(红色)直接进行标记，并且染色体20α-卫星探针用荧光素(绿色)直接进行标记。杂交条件根据制造商的建议。15简言之，使排泄尿样品解冻，并且在PBS中洗涤3次，随后离心。使细胞离心(cystospin)制备物在甲醇/乙醇(3∶1)中固定，并且在2x SSC/0.5％NP-40，pH 7中在37℃下预处理30分钟，随后在梯度增加的乙醇中脱水。在90℃下变性5分钟后，使细胞与10μl AURKA 20q13探针在37℃下杂交过夜。在0.5x SSC/0.1％SDS中在65℃下洗涤5分钟后，细胞用DAPI进行复染并且在抗衰退溶液中进行固定。用Zeiss Axioplan 2显微镜计数并且捕获荧光信号。
DNA倍数性分析。如先前所述用关于染色体3、7和17的着丝粒FISH探针(Vysis Abbott；Park，IL)并且通过用SAMBA 4000系统(Ampersand Medical；Chicago，IL)的图像分析通过测量核总DNA来分析间期核的倍数性。6来自切除的肾切除术样品的正常人尿道上皮细胞都用于测试正常人二倍体组织中的FISH探针的表现和充当阴性对照。
在用Feulgen反应染色的相邻尿道上皮/膀胱肿瘤和膀胱癌细胞系的成对样品的细胞离心制备物上执行DNA倍数性测量。DNA指数计算为肿瘤细胞的平均核DNA含量与二倍体标准(人外周血淋巴细胞)的平均核DNA含量的比。具有DNA指数为0.9-1.2的肿瘤分类为二倍体/近二倍体，而其中在直方图上具有独特峰的超过20％细胞的DNA指数超过1.2的肿瘤分类为非整倍体。
体外转染测定法。如先前所述使用pcDNA3野生型极光激酶A和猿猴病毒40(SV40)永生化人尿道上皮细胞来执行体外转染研究。4简言之，用不含极光激酶A的腺病毒GFP载体转染的细胞充当对照。仅接受显示大于或等于80％转染率的那些实验用于分析。通过western印迹分析使用抗GFP抗体且通过RT-PCR使用靶向极光激酶A-GFP融合序列的引物，验证极光激酶A-GFP异位表达的程度。随后在转染后第1-4天时收获细胞并且用于：分析中心体拷贝数的分析、DNA总含量和极光激酶A表达水平的同时流式细胞术测量、用关于染色体3、7和17的着丝粒FISH探针的染色体拷贝数、和软琼脂集落形成测定法。
如先前所述对于中心体拷贝数，使甲醇固定的细胞暴露于抗-y-微管蛋白小鼠抗体(1∶2000稀释，Sigma Chemical Corp.，St.Louis，MO)共1小时。4简言之，使用DAPI作为复染剂用Texas Red缀合的抗小鼠抗体(1∶500稀释，Vector Labora tories，Burlingame，CA)检测结合的一抗。
使用荧光激活细胞分选器(EPICS XL-MCL，Beckman Coulter，Inc，Miami，FL.)执行DNA含量(碘化丙啶的红色荧光；PI)和极光激酶A(GFP的绿色荧光)的表达水平的同时流式细胞术分析。具有异常DNA含量的细胞群体计算为具有DNA指数＜2c和＞4c的GFP阳性细胞数目。
对于软琼脂集落形成测定法，用包含用GFP标记的野生型极光激酶A的腺病毒载体或仅包含GFP的对照腺病毒感染SV40永生化尿道上皮细胞。在病毒感染后1天，将细胞以10,000细胞/平板的浓度铺平板在包含UM-UC-3条件培养基的软琼脂上。在铺平板后2周记录集落数目/平板。
统计分析。对于FISH的定量分析，在来自每个尿样品的至少20个细胞中计数绿色和红色信号，并且记录关于每个细胞的绿色和红色信号数目。将包含异常极光激酶A信号的细胞分成2个亚组，由具有低(3-4个拷贝)和高(＞4个拷贝)水平的极光激酶A基因扩增的细胞组成。对于每个样品，通过将具有升高水平(3个或更多拷贝)的细胞数目除以检查的总细胞数目，计算极光激酶A得分。极光激酶A得分＞0.15被视为是升高的，并且与一组20个中具有至少3个红色FISH信号的＞3个细胞相对应。这个得分用于产生关于7份对照和23份膀胱癌尿样品的训练组的ROG曲线(n＝30)。极光激酶A FISH测试的表现在30份对照和51份膀胱癌尿样品的测试组上进一步进行验证(n＝81)。曲线下面积(AUC)用于评估标记的表现。AUC等价于使案例和对照组相比较的Wilcoxon-Mann-Whi tney秩和检验，16并且后面一种检验用于衍生p值。对来自癌症样品的数据使用卡方检验，以评估极光激酶A得分和肿瘤的病理学特征(例如组织学级别、生长模式和分期之间的关系。在其中列联表计数很小的情况下，p值通过用固定的边缘计数模拟进行评估(p＜-0.05被视为显著的)。
结果
我们首先研究了膀胱的TCC样品及其相邻原位肿瘤发生前尿道上皮中的极光激酶A的表达水平。通过定量RT-PCR揭示的极光激酶AmRNA水平在相邻尿道上皮和TCC中都是升高的(图1A)。极光激酶A的表达水平与肿瘤级别、分期和非整倍性相关(图1B-D)。与正常尿道上皮相比较，显示与其核DNA总含量的正常二倍体的最低限度偏差并且分类为近二倍体的低级别、浅表TCC显示极光激酶A表达的轻微升高(约2倍)。相比之下，具有显著的非整倍性的高级别、侵入性TCC显示极光激酶A表达的显著升高(约7倍)。
为了测定染色体不稳定性的程度是否与极光激酶A的过表达程度相关，我们分析了膀胱癌细胞系中的极光激酶A表达水平和染色体拷贝数(图2A，B)。使用极光激酶A的表达水平，将膀胱癌细胞系分成3个组(图2C)。第一组由不具有极光激酶A表达升高的6个细胞系组成。第二组由具有轻微极光激酶A升高(2至5倍)的4个细胞系组成。其余3个细胞系显示明显升高水平的极光激酶A(6至14倍)。使用关于所选择的染色体(3、7、17)的着丝粒FISH探针的染色体拷贝数分析显示在具有明显升高水平的极光激酶A的细胞系中明显增加的染色体数目(图2D)。
这些相关研究暗示通过扩增和过表达获得的极光激酶A的功能产生在膀胱癌发展期间的非整倍体细胞表型。通过体外转染研究，使用SV40永生化尿道上皮细胞和包含野生型极光激酶A-GFP插入片段的腺病毒构建体验证这个假设。经转染的尿道上皮细胞显示与中心体的扩增和非整倍性的发展相关的明显升高的异位表达的极光激酶A，以及通过存在中心体信号、染色体拷贝数、DNA总含量和在软琼脂上的集落形成能力的获得的数目增加而揭示的经转化的细胞表型(图3A-D)。
为了测定极光激酶A是否可以用作用于膀胱癌检测的标记，我们使用FISH技术就极光激酶A的扩增分析具有膀胱癌的患者的排泄尿样品(图4A)。分析以不知情方式进行；即，对FISH结果评分的观察者不知道样品得自具有膀胱癌的患者还是未受影响的对照。初始测试在来自具有膀胱癌的23个患者和7个健康对照的排泄尿样品的训练组上执行。它揭示在具有膀胱癌的所有23个患者中至少低水平的基因扩增(3-4个拷贝)。来自具有低级别TCC的患者的排泄尿样品包含具有极光激酶A的3-4个拷贝的原代细胞，而来自具有高级别TCC的患者的基本比例的细胞(＞20％)具有＞4个拷贝的极光激酶A(图4B)。在一个对照中检测出具有极光激酶A信号的3个拷贝的2个细胞。在其余6个对照的尿样品中未检测出极光激酶A的异常拷贝数。来自使用＞15％细胞具有极光激酶A的至少3个拷贝作为关于测试阳性的截止的训练组的数据分析得到1.0的特异性、0.91的灵敏度和0.997的ROCAUC(p＝1x10-4)。
在由来自51个膀胱癌患者和30个健康对照的排泄尿样品组成的其他不知情的测试组上验证用于膀胱癌的极光激酶A FISH测试的表现。使用用于测试的阳性的相同截止点分析数据，即＞15％细胞具有极光激酶A的至少3个拷贝。测试在具有膀胱癌的患者的44份样品中是阳性的。在具有膀胱癌的7个患者中未鉴定出异常极光激酶A基因拷贝数。在30份对照样品中的5份中，鉴定出具有极光激酶A基因的3个拷贝的1-3个细胞。测试组的分析得到1.0的特异性、0.84的灵敏度和0.925的ROC AUC(p＝6.79x10-11)。在关于具有膀胱癌的74个患者和37个健康对照的排泄尿中的细胞的定量FISH分析结果概括于图5中。如通过极光得分测量的极光激酶A扩增的程度与肿瘤的组织学级别强相关。高组织学级别(级别3)的膀胱癌具有比低级别(级别1-2)肿瘤(0.13±0.15)明显更高的极光激酶A得分(0.60±0.29)。在得分和肿瘤生长模式(乳头状与非乳头状)、或分期(浅表与侵入)之间不存在显著关联(数据未显示)。
讨论
根据早期公开的那些的目前发现提供了支持极光激酶A扩增过表达是膀胱癌发生中的早期事件的强烈证据，这与中心体扩增和非整倍体基因组含量的发展相关。这些观察假定就我们较早报告的发现而言的重要生物学意义：极光激酶A促进肿瘤抑制蛋白质p53的降解，并且具有极光激酶A的升高表达的人膀胱肿瘤样品揭示极低的细胞p53含量，模拟关键的肿瘤抑制途径的丧失。17
在本文背景中相关提及特定肿瘤抑制蛋白质(最显著地是p53)的丧失或灭活突变引起中心体扩增18，并且p53突变和细胞周期蛋白E过表达的伴随发生与膀胱癌中的染色体不稳定性和中心体扩增强相关。19极光激酶A和粘着斑支架蛋白质HEF1之间的相互作用和反馈调节的近期发现指出，极光激酶A的升高表达可能协同地干扰控制细胞附着、迁移和细胞存活的整联蛋白依赖性信号过程，连同表现为非整倍性的染色体不稳定性的诱导。20这些观察不仅提供关于极光激酶A在尿道上皮细胞的恶性转化中的关键作用的强烈证据，还暗示它可能是用于膀胱癌的新生物标记。
总的来说，我们的数据指出极光激酶A在尿道上皮细胞中过表达时，引起中心体扩增和染色体的错误分离，导致非整倍性和经转化的表型。在具有膀胱癌的患者的排泄尿样品上的目前FISH研究连同先前公开的数据指出，极光激酶A的过表达和扩增在膀胱癌中是频繁的，并且可以在来自排泄尿样品的脱落尿道上皮细胞中检测出。关于极光激酶A基因和α-卫星着丝粒染色体20DNA的双色FISH探针以高特异性和灵敏度检测膀胱癌。此外，极光激酶A扩增的程度与高级别临床侵略性的膀胱癌相关。这暗示关于在尿中通过FISH技术的这种极光激酶A拷贝数的测试是用于膀胱癌的有希望的非侵入性测试。
此外，就我们所知，我们的工作是首先超越相关研究的，暗示通过扩增和过表达获得的极光激酶A的功能产生在膀胱癌发展期间的非整倍体细胞表型，以显示极光激酶A在尿道上皮细胞中的过表达引起中心体扩增和染色体的错误分离，导致非整倍性和经转化的表型。
本文公开且请求保护的所有方法可以根据本公开内容无需过度实验而进行且完成。尽管本发明的组合物和方法已就优选实施方案而言进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本文描述的方法和方法的步骤或步骤的顺序应用变化，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体而言，显而易见的是化学和生理学相关的特定试剂可以取代本文描述的试剂，同时仍达到相同或相似结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类相似取代物和修饰被认为在如由附加权利要求限定的本发明的精神、概念和范围内。
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下述参考文献特别通过引用合并入本文，至它们提供本文描述的那些的补充的示例性操作或其他细节的程度。
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Claims (10)

1.检测患者中的膀胱癌的方法，其包括
从所述患者的尿中分离膀胱细胞；
使所述膀胱细胞与经标记的DNA探针杂交，其中所述探针识别极光激酶A基因的至少部分，以产生与所述经标记的DNA探针杂交的膀胱细胞样品；和
计数所述样品中的膀胱细胞数目、所述样品中的每个膀胱细胞中的极光激酶A基因拷贝数、和所述样品中具有极光激酶A基因的至少拷贝数第一阈值的膀胱细胞数目。
2.权利要求1的方法，其中极光激酶A基因的拷贝数第一阈值是3。
3.权利要求1的方法，其中计数进一步包括计数具有极光激酶A基因的至少拷贝数第二阈值的膀胱细胞数目，其中所述拷贝数第二阈值大于所述拷贝数第一阈值。
4.权利要求3的方法，其中极光激酶A基因的拷贝数第二阈值是5。
5.权利要求1的方法，如果大于或等于第一阈值百分比的膀胱细胞具有极光激酶A基因的至少拷贝数第一阈值，那么所述方法进一步包括假定所述患者具有膀胱癌。
6.权利要求5的方法，其中第一阈值百分比是15％。
7.权利要求5的方法，如果大于或等于第二阈值百分比的膀胱细胞具有极光激酶A基因的至少拷贝数第一阈值，其中第二阈值百分比大于第一阈值百分比，那么所述方法进一步包括假定所述患者具有侵略性膀胱癌。
8.权利要求7的方法，其中第一阈值百分比是15％，并且第二阈值百分比是20％。
9.权利要求1的方法，其中经标记的DNA探针包括AURKA 20q13。
10.权利要求1的方法，其中极光激酶A基因包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的DNA序列。
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