CN101915790B - 植酸胶束修饰的过氧化氢传感器的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物传感器技术，植酸胶束修饰的过氧化氢传感器的制备方法。已有技术检测H₂O₂含量的方法缺点是：检测麻烦、灵敏度低。本发明步骤为：将0.001mol/L的植酸钠溶液90℃条件下加热回流20分钟，室温冷却；在抛光处理后的7mm²玻碳电极表面，滴涂5μL植酸胶束溶液，室温下晾干；将3μL 5mg/mL的辣根过氧化物酶溶液固定到植酸胶束-玻碳电极上；放入4℃冰箱内，干燥；将全氟磺酸稀释液3μL，滴加至植酸胶束-玻碳电极上制得植酸胶束辣根过氧化物酶传感器。本发明的优点是：制备方法简单，成本低；能够直接实现电子转移，测定过氧化氢准确；检测限低，灵敏度高，生物亲和性好。

Description

植酸胶束修饰的过氧化氢传感器的制备方法

技术领域

本发明属于生物传感器技术，具体地说是一种植酸胶束修饰的过氧化氢传感器的制备方法。

背景技术

过氧化氢H₂O₂具有氧化、漂白、消毒和杀菌等多种功效；对H₂O₂含量的测定在工业分析、环境监测、生物制药、食品科学和临床化学等领域具有重要的意义。现有H₂O₂含量检测的方法有滴定法、光谱法、荧光法、化学发光法和电化学法等。现有技术的缺点是：检测麻烦、灵敏度低。近年来，电化学方法，尤其是基于酶的直接电化学的无媒介体生物传感器得到了迅速的发展，这是因为用电化学方法制备的H₂O₂生物传感器制备工艺简单、成本低；具有很高的灵敏度和选择性。酶在生物体内以及食物和药物中有极为重要的作用，H₂O₂作为生物体内许多过氧化酶参与酶促反应。生物传感器具有对酶的分子识别和催化选择功能，使用它来检测H₂O₂浓度不但能体现出响应迅速，操作便捷的特点，而且只需要很少量的试样就可以检测出试液中H₂O₂的浓度。对H₂O₂进行精确检测时充分发挥生物传感器的反应高度专一性和信号检测高灵敏性等优势，是十分重要的。

植酸类化合物，作为植物中磷元素的主要储存载体，具有较好的生物亲和性，植酸分子含有6个非共平面的磷酸酯键，加热后能够自组装成胶束，一些磷酸酯键在胶束球内部，另一些暴露在胶束球外面。这些独特的性质为酶在生物传感器的固定提供了良好的微环境，实现酶与电极之间的直接电子转移，用于高灵敏度检测过氧化氢具有良好的效果。

迄今为止，国内外尚未有利用植酸胶束制备检测过氧化氢的生物传感器的实例。所以发明一种响应时间短，检测限低，灵敏度高，米氏常数较小，稳定性好，利用植酸胶束制备检测过氧化氢的生物传感器是一个迫切需要解决和十分有意义的重要技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种响应时间短，检测限低，灵敏度高，米氏常数较小，稳定性好的检测过氧化氢的植酸胶束过氧化氢传感器的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：

一种植酸胶束修饰的过氧化氢传感器制备方法，包括以下步骤：

(1)将0.001mol/L的植酸钠溶液90℃条件下加热回流20分钟，室温冷却；

(2)在抛光处理后的7mm²玻碳电极表面，滴涂5μL植酸胶束溶液，室温下晾干；

(3)将3μL 5mg/mL的辣根过氧化物酶溶液固定到步骤(2)制备的植酸胶束-玻碳电极上；

(4)将步骤(3)产物置于4℃冰箱内，干燥；

(5)制备全氟磺酸溶液：室温条件下，取5％全氟磺酸溶液，用5倍体积的pH 7.0磷酸缓冲液稀释；

(6)将步骤(5)制备的全氟磺酸稀释液3μL，滴加至步骤(3)产物上制得植酸胶束修饰的过氧化氢传感器。

步骤(2)所述的植酸胶束修饰的玻碳电极制备方法为：依次用粒径0.3微米和0.05微米氧化铝粉抛光处理7mm²玻碳电极，100瓦超声波下，先后在去离子水、无水乙醇、去离子水溶液中各清洗3分钟后，滴涂0.001mol/L植酸胶束，用量为5μL。

本发明基于植酸IP₆胶束球制备的辣根过氧化物酶HRP传感器的制备方法要点如下：将0.001mol/L的植酸钠溶液在90℃下加热回流20分钟，然后在室温下冷却使其自组装成植酸胶束；用0.05-0.3微米氧化铝粉抛光处理玻碳电极GCE，再依次用去离子水，无水乙醇，去离子水，超声清洗3分钟，使得玻碳电极表面无划痕；移取5μL上述植酸胶束溶液滴加到抛光处理过的玻碳电极表面，于室温下晾干；然后取3μL 5mg/mL的辣根过氧化物酶溶液滴涂在玻碳电极上，置4℃冰箱内；待干后，滴加3μL用pH7.0磷酸缓冲液五倍稀释的全氟磺酸(原液浓度为5％)溶液，置于4℃冰箱内干燥并保存。本发明Nafion/HRP/IP₆胶束/GCE制备过程如附图1所示。

辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)分子量小，比活性高，纯酶容易制备。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成。

植酸分子含有6个非共平面的磷酸酯键，加热后能够自组装成胶束。一部分磷酸酯键在胶束球内部，另一部分暴露在胶束球外面。这些独特的性质类似于生物磷酸酯膜，使其易与酶或蛋白质结合，为酶在生物传感器的固定提供良好的微环境。基于植酸胶束球IP₆制备辣根过氧化物酶HRP传感器，用于检测过氧化氢。我们制备了性能稳定的IP₆胶束，通过透射电子显微镜TEM和场发射电子扫描显微镜FESEM观察了IP₆胶束和IP₆胶束-HRP复合材料的形貌，并考察了修饰传感器的电化学行为及其对过氧化氢的检测。实验结果表明，由于IP₆胶束独特的性质，为HRP的固定提供了良好的微环境，制得的传感器具有检测限低、灵敏度高、响应时间短、米氏常数小、生物亲和性高等优点。

通过透射电镜TEM和场发射电子扫描显微镜FESEM可以清楚地显示植酸胶束的形貌。如附图2所示：a图是植酸胶束经磷钨酸盐溶液染色后，拍得的TEM图；可以看到植酸胶束粒径大约35nm，成球状均匀分布。b图是将胶束溶液滴在抛光过玻碳片上，获得的FESEM图；从图中可以观察到植酸胶束均匀的分布在膜内，大小均一，分散性很好。c图是将IP₆胶束与HRP溶液混合后，获得的TEM图，由图可知植酸胶束球象生物膜一样不仅将HRP吸附在其周围，而且很好的把HRP包埋在球状胶束内部。这种存在形式极大的提高了HRP酶在电极表面的负载量，并且为酶提供了良好的生物亲和性的环境，保持其生物活性。

紫外可见光谱能够有效的监测亚铁血红素基团吸收带的变化，以表征其结构的变化。图3用紫外可见光谱表征了IP₆胶束，HRP和HRP-IP₆胶束复合物。从图3a得知，IP₆胶束溶液不能产生表面等离子共振吸收峰；然而纯HRP溶液，在396nm处出现了明显的吸收峰，如图3b所示，这属于HRP的特征吸收峰。当HRP与IP₆胶束混合后，产生的表面等离子共振吸收峰红移至397nm，如图3c所示。这是由于HRP与IP₆胶束混合后相互作用，使得吸收峰仅发生1nm的移动。HRP的结构并未发生变性，相反，植酸胶束可能提供了良好的微环境，保持生物活性，利于HRP的固定。

电化学交流阻抗技术EIS可以根据电极在修饰过程中阻抗的变化表征电极组装的不同阶段，是一种研究表面修饰电极界面性质的有效手段，如图4所示，考察了不同修饰电极在[Fe(CN)₆]^4-/3-(含有0.1mol L^-1KCl)溶液中的交流阻抗曲线。电化学交流阻抗图由半圆部分和线性部分组成。高频区的半圆直径代表电子迁移阻抗，而阻抗的大小控制着氧化还原电子探针[Fe(CN)₆]^4-/3-在电极表面迁移的动力学，半径越大，电阻越大。EIS曲线(a)是裸玻碳电极的交流阻抗谱，该阻抗曲线在一定频率范围内都近似为一条直线，说明裸玻碳电极表面的电子迁移几乎不受阻碍，其表面传递的电子受扩散控制。在裸电极上修饰了IP₆胶束后，IP₆胶束/GCE(b)在谱图上可以观察到一个较大的半圆阻抗弧，表明IP₆胶束膜的形成使[Fe(CN)₆]^4-/3-在电极表面的电子转移阻力增大。当滴上HRP之后，HRP/IP₆胶束/GCE(c)阻抗弧的半径明显增大，这说明HRP通过与IP₆胶束的相互作用，吸附到了电极上。同样的，更大的Nafion/HRP/IP₆胶束/GCE(d)阻抗弧的半径表明电子在电极表面的迁移更加困难，以此证明Nafion成功地固定到了电极上。

图5考察了不同修饰电极的循环伏安(CV)曲线，图5a是裸玻碳电极的CV曲线，无氧化还原峰。直接滴涂HRP溶液的修饰电极的循环伏安曲线为b曲线，只能观察到很微弱的还原峰，说明直接滴涂酶溶液无法保持酶良好的生物活性，HRP中的血红素Fe^Ⅲ/Ⅱ无法与电极表面进行有效的电子传递。图5c是滴涂了植酸溶液的修饰电极的循环伏安曲线，能观察到HRP中的血红素Fe^Ⅲ/Ⅱ的氧化还原反应，说明IP₆起到了促进电子传递和保持酶活性的作用。图5d是滴涂了含有IP₆胶束的修饰电极的循环伏安曲线，观察到一对明显的准可逆氧化还原峰，循环伏安图上的氧化还原峰来源于HRP，即HRP中的血红素中Fe^Ⅲ/Ⅱ的氧化还原反应：HRP(Fe^Ⅲ)+e＝HRP(Fe^Ⅱ)；扫速在300mV/s的情况下，E_pa＝-0.389V；E_pc＝-0.366V；ΔE_p＝0.023V；是一个准可逆的过程，电子传递速度较快。比较图5c和图5d，我们发现图5d的氧化还原峰更可逆，电子传递更加快。表明IP₆胶束的存在能有效提高HRP中的血红素Fe^Ⅲ/Ⅱ与电极表面电子传递的速率，降低电子在电极和固定化酶间的迁移阻力，提高电子迁移率，有效地加速了酶的再生过程。修饰Nafion也起到了固定作用，酶在膜内不易流失，提高了稳定性，避免了其它物质的干扰。

从图6中观察Nafion/HRP/IP₆胶束/GCE对H₂O₂的电催化性能，图上可以观察到，当H₂O₂加入到磷酸缓冲液PBS后，HRP的还原峰电流变大、氧化峰电流变小。并且还原峰电流随着H₂O₂浓度的增加而增大，如图6a→图6g所示，同时伴随着氧化峰电流的减小直至消失。实验结果表明：固定在Nafion/HRP/IP₆胶束/GCE上的HRP对H₂O₂具有很好的电催化还原活性，能够实现对H₂O₂的检测。

计时电流法定量的考察该传感器的性能参数：图7是Nafion/HRP/IP₆胶束/GCE在-0.24V的工作电位下，向pH 7.0的PBS中连续加入H₂O₂的计时电流响应曲线。随着H₂O₂浓度的不断增加，还原电流逐级增加并在3s内快速达到95％的稳态电流，表明这是一个快速的电催化反应。内插图反映了该传感器在不同H₂O₂浓度下对催化电流的线性校正关系，Nafion/HRP/IP₆胶束/GCE对H₂O₂的检测浓度范围为0.1至0.5μmol L_-1和0.6至1.6μmol L^-1，线性相关系数R＝0.998(n＝5)和R＝0.997(n＝11)，检测限为0.3μmol L^-1，信噪比S/N＝3。

表观米氏常数apparent Michaelis Menten constant，

是一种与酶的浓度无关的酶促反应特征常数，它可以表征酶与底物之间亲合力的大小。

可以通过Lineweaver-Burk方程求得：

$1/I_{\mathrm{ss}}=K_M^{\mathrm{app}}/I_{\max }C+1/I_{\max }$

式中，I_ss是加入底物后测得的稳态电流，C是底物浓度，I_max是底物达饱和后测得的最大电流。米氏常数根据稳态电流的倒数和H₂O₂浓度的倒数作图后，所得到的斜率和截距求得。按此公式测得Nafion/HRP/IP₆胶束/GCE的

较低的

说明固定在Nafion/HRP/IP₆胶束/GCE上的HRP具有较高的活性，能够准确的测定H₂O₂含量。

该Nafion/HRP/IP₆胶束/GCE修饰电极在PBS中以100mV s^□1连续扫描40圈，其电流响应信号变化不明显。将其置于PBS中4℃保存20天后，其电流响应信号仍能保持初始电流的91％。

修饰电极对0.1μmol L^-1 H₂O₂溶液4次重复测定的相对标准偏差(R.S.D.)为3.6％。3支同样方法修饰的Nafion/HRP/IP₆胶束/GCE在相同条件下对0.1μmol L^-1 H₂O₂响应电流的相对偏差为6.4％。

上述实验结果表明本发明传感器具有令人满意的重现性和稳定性。

本发明用植酸胶束球制备的修饰电极，不仅将HRP吸附在胶束周围，而且很好的把HRP包埋在球状的胶束内部。这种存在形式极大的提高了HRP酶在电极表面的负载量，并且为酶提供了良好的生物亲和性的环境，保持其生物活性，实现对H₂O₂的准确测定。

本发明在世界上首次利用植酸胶束制备检测过氧化氢生物传感器，具有直接实现电子转移，测定过氧化氢准确；测限低，灵敏度高的特点；是生物传感器技术的重大突破，具有新颖性、创造性和实用性。

本发明的优点是：

1、制备方法简单，绿色环保，成本低。

2、运用植酸胶束球修饰的生物传感器能够实现直接电子转移，完成对过氧化氢准确测定。

3、检测限低，灵敏度高，生物亲和性好。

附图说明

图1为传感器的制备过程图；

图2：a和b分别为植酸胶束的透射电镜TEM图和场发射扫描电镜FESEM图，c图为辣根过氧化物酶与植酸胶束混合液的透射电镜TEM图；

图3为不同溶液的紫外可见吸收光谱图；

图4为不同修饰层数的电极的电化学交流阻抗图；

图5为不同修饰电极的循环伏安图；

图6为目标传感器对不同浓度H₂O₂的循环伏安图：

图7为目标传感器Nafion/HRP/IP₆胶束/GCE在pH 7.0的PBS中连续加入H₂O₂的计时电流响应曲线，工作电位：-0.24V。内插图：响应电流与H₂O₂浓度的校正曲线的计时电流图。

上述电化学实验在上海辰华仪器有限公司CHI 660D型电化学工作站上进行。透射电子显微镜TEM图由JEOL-JEM200CX型透射电镜得到；紫外-可见UV-vis光谱实验使上海天美科学仪器有限公司UV-8500型紫外-可见分光光度计；其他仪器为梅特勒-托利多仪器上海有限公司FE20实验室pH计；上海科导超声仪器有限公司SK2200H超声仪。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明。

基于植酸胶束球IP₆胶束制备的辣根过氧化物酶HRP传感器的制备方法：将0.001mol/L的植酸钠溶液在90℃下加热回流20分钟，然后在室温下冷却使其自组装成植酸胶束.移取5μL上述植酸胶束溶液滴加到抛光处理过的玻碳电极表面，室温下晾干。然后取3μL 5mg/mL的辣根过氧化物酶溶液滴涂在玻碳电极上，置4℃冰箱内。待干后，滴加3μL用pH 7.0磷酸缓冲液稀释五倍的全氟磺酸溶液(原液浓度为5％)置4℃冰箱内干燥并保存。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种植酸胶束修饰的过氧化氢传感器制备方法，包括以下步骤：

（1）将0.001mol/L的植酸钠溶液90℃条件下加热回流20分钟，室温冷却；

（2）在抛光处理后的7mm²玻碳电极表面，滴涂5μL植酸胶束溶液，室温下晾干；

（3）将3μL 5mg/mL的辣根过氧化物酶溶液固定到步骤（2）制备的植酸胶束-玻碳电极上；

（4）将步骤（3）产物置于4℃冰箱内，干燥；

（5）制备全氟磺酸溶液：室温条件下，取5%全氟磺酸溶液，用5倍体积的pH 7.0磷酸缓冲液稀释；

（6）将步骤（5）制备的全氟磺酸稀释液3μL，滴加至步骤（4）产物上制得植酸胶束修饰的过氧化氢传感器。

2.根据权利要求1所述植酸胶束修饰的过氧化氢传感器制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的植酸胶束修饰的玻碳电极制备方法为：用粒径0.3微米和0.05微米氧化铝粉抛光处理7mm²玻碳电极，在100瓦超声波下，依次在去离子水、无水乙醇、去离子水溶液中各清洗3分钟后，滴涂0.001mol/L植酸胶束，用量为5μL。

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