CN101899097A

CN101899097A - 一种b血型抗原表位模拟肽及其应用

Info

Publication number: CN101899097A
Application number: CN2010102194164A
Authority: CN
Inventors: 张积仁; 岑东芝; 李许锋; 罗敏; 邹建军
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2010-07-07
Filing date: 2010-07-07
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2030-07-07
Also published as: CN101899097B

Abstract

本发明提供了一种B血型抗原表位模拟肽，其氨基酸序列为：His-Ser-Leu-Lys-His-Thr-Gln-Met-Ser-Tyr-Ser-Ser。本发明所述B血型抗原表位模拟肽可以模拟B血型的糖抗原表位，用于制备抗肿瘤DNA疫苗。本发明还提供了一种抗肿瘤DNA疫苗，该疫苗是由编码权利要求1所示肽和Fas胞内段融合蛋白的基因插入到pIRES质粒的多克隆位点构建得到的，瘤内局部注射所述DNA疫苗后，能够被肿瘤细胞摄取，并表达模拟肽和抗肿瘤因子的融合蛋白，与补体及天然存在的抗体结合发挥CDC及ADCC作用杀死肿瘤细胞。

Description

一种B血型抗原表位模拟肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及短肽，特别是抗原表位模拟肽。

背景技术

人类致力于肿瘤免疫的研究经历了100多年的历史，形成了完整的理论体系，并建立了包括非特异性免疫治疗、肿瘤疫苗、过继性细胞免疫治疗、细胞因子免疫治疗等一系列的免疫疗法。肿瘤免疫治疗的基本思路是通过相关技术方法调动宿主的免疫系统的抗肿瘤免疫应答能力，消灭已经形成的肿瘤细胞或抑制其进一步发展。多数免疫治疗方法能够增强患者全身的免疫功能，但抗肿瘤效果却与预期的相差很多。主要原因是肿瘤患者免疫功能状态并不能直接反应机体抗肿瘤免疫效应，即使患者全身的免疫功能得到改善，但肿瘤微环境内的免疫效应却是仍处于抑制状态，导致治疗效果不理想。临床器官移植后，由于受者体内预先存在有抗供者组织抗原的抗体，它们可与供者组织相结合，通过激活补体而直接破坏靶细胞，或通过补体激活所产生的活性片段引起血管通透性增高和中性粒细胞浸润，导致毛细血管和小血管内皮细胞损伤、纤维蛋白沉积和大量血小板聚集，并形成血栓，从而使移植器官发生不可逆性缺血、变性、坏死，导致超急性排斥反应的发生。已有研究利用血型A单克隆抗体筛选噬菌体随机十二肽库得到的模拟多肽与GST蛋白进行N端融合后能够特异性结合抗A抗体，具有天然血型A抗原的抗原性，将其用于ABO不相容性移植前受者体内血浆中的血型特异性抗体滤除。基于这种临床现象，假设将具有相应抗原的红细胞膜引入体内存在相应抗体的肿瘤患者的肿瘤组织内部，这样就有可能在肿瘤内部发生这样的反应，继而引起肿瘤内部非特异性及特异性抗肿瘤免疫反应，从总体上改变肿瘤内部免疫抑制状态，达到治疗肿瘤的目的。

在红细胞表面的ABO血型抗原是糖脂，是异种移植发生超急性排斥反应的最主要靶抗原，人体内存在针对该抗原的天然抗体，异种移植后预先存在体内的天然抗体与移植器官血管内皮细胞表面的抗原结合，激活补体，最终导致移植器官的坏死。基于上述理论，将人体内这种天然存在的抗体应用到肿瘤的免疫治疗中，利用这种预先存在人体内的天然抗体，制备与体内存在天然抗体相应的血型抗原，直接肿瘤内注射，体内预先存在的天然抗体可导致抗原抗体反应发生，并激活补体，从而导致肿瘤细胞的坏死。但B血型糖抗原的合成技术复杂，纯化困难且成本高；另外多糖成分性质不够稳定，不易于进行修饰等操作。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种B血型抗原表位模拟肽。

本发明解决上述问题的技术方案是：

一种B血型抗原表位模拟肽，该模拟肽的氨基酸序列为：His-Ser-Leu-Lys-His-Thr-Gln-Met-Ser-Tyr-Ser-Ser。(SEQ NO.1)。

本发明所述的B血型抗原表位模拟肽可通过化学合成的方法得到，如多肽固相合成法；也可通过基因工程的方法得到，例如：将编码所述模拟肽的DNA序列克隆到原核/真核表达载体中进行表达，然后用常规方法分离纯化目的多肽按即可。上述方法均是本领域的常规技术，这里不再详述。

本发明所述B血型抗原表位模拟肽可以模拟B血型的糖抗原表位，代替B血型糖抗原用于治疗肿瘤。

但是本发明模拟肽缺乏跨膜区及胞内段，不易定位于细胞膜表面表达。因此，最好利用编码所述模拟肽的基因代替人Fas基因胞外段形成融合基因SEQ NO.2 DNA疫苗。瘤内局部注射所述DNA疫苗后，能够被肿瘤细胞摄取，并表达模拟肽/Fas融合基因，使本发明模拟肽锚定于肿瘤细胞表面的，与补体及天然存在的抗体结合发挥CDC及ADCC作用杀死肿瘤细胞。

本发明所述的抗肿瘤DNA疫苗是重组pIRES质粒，其外源基因包括SEQ NO.2所示的融合基因。

所述DNA疫苗可通过将SEQ NO.2所示的融合基因插入到pIRES质粒的多克隆位点构建得到。

为了进一步提高本发明所述DNA疫苗的抗肿瘤活性，可在所述重组pIRES质粒的另一多克隆位点插入Mip3β基因。Mip3β基因的表达产物具有强大的趋化作用，结合融合蛋白中Fas胞内段三聚化发生促肿瘤细胞凋亡作用，使肿瘤内部微环境的免疫抑制状态逆转而发挥抗肿瘤作用。

附图说明

图1是重组pIRES质粒的双酶切鉴定图，其中，1为DNAMAKER，2～6依次为M-pIRES、P/F-pIRES、P/F-M-pIRES和pIRES的双酶切产物。

图2是转染后细胞mRNA表达的RT-PCR鉴定图，其中，1为DNAMAKER，2～6依次为P/F-pIRES、M-pIRES、P/F-M-pIRES和pIRES的RT-PCR产物。

图3是Western Blot法鉴定转染后细胞模拟肽/Fas融合蛋白表达的印迹图。

图4是补体依赖细胞毒作用(CDC)统计分析的折线图，其中，-■-为M-pIRES，□为P/F-pIRES，-◇-为P/F-M-pIRES，-◆-为pIRES。

图5是抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)统计分析的折线图，其中，-■-为M-pIRES，□为P/F-pIRES，-◇-为P/F-M-pIRES，-◆-为pIRES。，

图6是流式细胞仪检测诱导转染后细胞凋亡的象限图，其中，A是P/F-M-pIRES的检测结果，B是P/F-pIRES的检测结果，C是M-pIRES的检测结果，D是pIRES的检测结果，E是阴性对照。

具体实施方式

下述实施例中，P表示编码本发明所述肽的基因，F表示人Fas基因，M表示Mip3β基因。

例1B血型抗原表位模拟肽的发现与筛选

本发明B血型抗原表位模拟肽最初是从噬菌体随机12肽库中筛选出来的，具体方法如下：

1、噬菌体随机12肽库的滴度测定，保证投入噬菌体量约为1.5×10¹¹pfu。

2、噬菌体随机肽库的亲和淘选法

(1)在ELISA板上包被100mg/L，100μl/孔抗血型B抗原单克隆抗体，在湿盒中轻轻振荡，4℃孵育过夜。取10μl肽库原液用TBS稀释至100μl，加入ELISA板孔中，100μl/孔，室温缓慢振荡1h。用0.1％TBST洗板10次。加入100μl 0.2M甘氨酸-盐酸(pH2.2)，将洗脱液用LB培养基稀释扩增，测定噬菌体滴度。

(2)PEG/NaCl二次沉淀法纯化制备噬菌体扩增液。

(3)依次递减包被抗体的浓度和逐步增加洗涤液的浓度，对肽库进行数次“吸附-洗涤-洗脱-扩增”，直至后一轮与上一轮回收率不变。

3、噬菌体ELISA

5×10¹⁰TU/ml噬菌体(溶于TBS)包被ELISA微孔，湿盒中4℃过夜。第二天TBST、(含0.5％Tween 20)洗涤5次，每孔加入0.5μg抗体NaM87.1F6，37℃孵育1h后，TBST洗涤10次。每孔加入1∶5000稀释的HRP标记亲和素，37℃孵育30min后，TBST洗涤10次。以TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)为底物显色，测定A450nm。每个克隆包被两孔。噬菌体原肽库作为阴性对照。

4、噬菌体DNA序列的测定以及展示多肽的推导提取单克隆噬菌体的基因组DNA，10μl送Invitrogen公司测序，测序引物为CCCFCATAGFTAGCGFAACG。用DNAStar软件分析测序获得的噬菌体外源基因，推导出的多肽序列如下：

His-Ser-Leu-Lys-His-Thr-Gln-Met-Ser-Tyr-Ser-Ser

例2P/F-pIRES、P/F-M-pIRES重组质粒及其抗肿瘤效果的研究

一、P/F-pIRES、P/F-M-pIRES重组质粒的构建

①、P/F-pIRES重组质粒的构建

以SEQ NO.2序列为模板，以dATP、dGTP、dCTP及dTTP为原料，通过脱保护基活化、连接、封闭、氧化等步骤于ABI 394 DNA/RNA合成仪形成模拟肽与FAS基因的跨膜区及胞内段融合的P/F融合基因，融合基因的上游含有Xho I酶切位点，下游含有Mlu I酶切位点。将P/Fas融合基因和pIRES质粒用Xho I和Mlu I进行双酶切处理，酶切反应体系共40μL，包括：8μL 10×Tango Buffer，2μL Xho I，2μL Mlu I，10μL DNA和18μL灭菌水。反应体系旋涡振荡混匀后置于PCR仪中，37℃反应5小时。纯化上述酶切反应产物，利用T4 DNA连接酶进行连接反应，连接反应体系共25μL，包括：2.5μL 10×Buffer，5μL PCR产物，3μL载体，1μL T4 DNA连接酶和13.5μL灭菌水。体系配好混匀后16℃过夜，连接产物4℃保存，尽量24h内进行转化。

经过上述步骤将P/Fas融合基因插入到pIRES质粒的多克隆位点A中构建出P/F-pIRES重组质粒。

②、P/F-M-pIRES重组质粒的构建

以人慢性扁桃体炎组织cDNA作为模板，用上游引物M1、下游引物M2 PCR扩增Mip3β基因，扩增的目的片断长度为297bp。总反应体积为20μL，其中含2μL cDNA和1U聚合酶其余各试剂的终浓度为：引物0.5μmol/L，dNTP 0.1mmol/L，MgCl₂ 1.5mmol/L，1×Buffer缓冲液。反应在PCR扩增仪中进行。反应条件：首先94℃预变性5min，然后94℃1min，56℃1min，72℃1.5min循环30次，最后72℃总延伸10min。扩增产物在100伏特电压下，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

M1：5’GC

ATGGCCCTGCTACTGGCC 3’

方框内为Xba I酶切位点；

M2：5’AT

TTAACTGCTGCGGCGCTTC 3’

方框内为Not I酶切位点；

E.Z.N.A.凝胶回收试剂盒纯化Mip3β基因PCR产物，将纯化后的PCR产物和P/F-pIRES重组质粒用Xbal I和Not I进行双酶切处理，酶切反应体系共40μL，包括：8μL 10×TangoBuffer，2μL Xba I，2μL Not I，10μL DNA和18μL灭菌水。反应体系旋涡振荡混匀后置于PCR仪中，37℃反应5小时。纯化上述酶切反应产物后利用T4 DNA连接酶行连接反应。连接反应体系共10μL，包括：1μL 10×Buffer，1μL PCR产物，2μL载体，1μL T4 DNA连接酶和5μL灭菌水。

经过上述步骤将扩增的Mip3β基因插入到pIRES质粒的多克隆位点B中构建出P1/F-M-pIRES重组质粒。

③、提取质粒及酶切鉴定

将构建好的重组质粒①P/F-M-pIRES、②P/F-pIRES、③M-pIRES、④pIRES常规转化大肠杆菌后，16小时左右长出菌落。每个培养皿随机挑选数个单菌落，分别置于100μL LB培养液(Amp 100μg/mL)中，旋涡震荡混匀。收集扩增的大肠杆菌利用质粒提取试剂盒提取质粒；将提取的重组质粒分别用Xho I/Mlu I、Xbal I/Not I进行双酶切鉴定，酶切反应体系同前，体系配好后旋涡振荡混匀，然后置于PCR仪中37℃反应12小时，酶切产物100伏电压下用1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。电泳结果如图1和表1所示，从重组质粒中切下来的P/Fas融合基因片段大小约为600bp，Mip3β基因片段大小约为297bp，与预期结果相符。

表1

	M-pIRES	P/F-pIRES	P/F-M-pIRES	pIRES
					XbalI/NotI	+	-	+-	+
XbalI/MluI	-	+	-+	+

④、重组质粒序列分析鉴定

构建的重组质粒①P/F-M-pIRES、②P/F-pIRES、③M-pIRES、④pIRES经过双酶切鉴定正确后，还需要进行测序以验证插入多克隆位点A、B序列的正确性，A位点从插入片段的下游1236-1253位置开始延逆时针方向进行单向测序，测序引物序列为‘AAAGACGGCAATATGGTG’。B位点从插入片段的上游1543-1560位置开始延顺时针方向进行单向测序，测序引物序列为‘AAATGGCTCTCCTCAAGC’。测序结果显示P/Fas融合基因的Fas基因部分、Mip3β基因序列与Genbank中序列比对结果完全正确。

三、DNA疫苗转染真核细胞后的表达情况

1、利用Lipofectamine^TM 2000Kit转染黑色素瘤细胞株B16

利用Lipofectamine^TM 2000Kit转染B16细胞，将培养板放入5％CO₂培养箱中(37℃)培养，4～6小时后将培养基更换为含有胎牛血清和抗生素的培养基。以与pIRES大小及性质相仿的pEGFP质粒为进行转染预实验，通过荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率为76.95％，证明转染效率高，适合进行重组质粒的转染。

2、RT-PCR检测

收集转染后培养48小时的B16细胞提取总RNA，逆转录合成cDNA作为模板，用IRES区下游引物IRES-R(5′-TATAGACAAACGCACACCGG-3′)及pIRES载体上游的T7公共引物(5′-TACGACTCACTATAGGCTAG-3′)扩增A位点基因；用IRES区上游引物IRES-F(5’-TAAAAAAACGTCTAGGCCCC-3’)及pIRES载体下游的T3公共引物(5’-TAACCCTCACTAAAGGGAAG-3’)扩增B位点基因，PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶在100伏特电压下电泳。电泳结果如图2和表2，结果显示P/Fas融合基因、Mip3β基因可以被转染的B16细胞转录。

	M-pIRES	P1/F-pIRES	P1/F-M-pIRES	pIRES
					引物IRES-R/T7	-	+	+-	+
引物IRES-F/T3	+	-	-+	+

3、Western Blot观察转染前后外源基因的蛋白表达

每个长满单层B16细胞的100mm培养皿中加入1ml裂解液1％tritonX-114(美国Amresco公司)，得到细胞全蛋白。根据文献将细胞全蛋白分为去污剂相(细胞膜蛋白)和水相(除膜蛋白外其余蛋白)。将纯化的膜蛋白进行12％SDS-PAGE分离，蛋白转移至PVDF膜上.用封闭液(2％小牛血清白蛋白，0.05％Tween-20，20mM Tris-HCI，150mM NaCl pH7.5)室温封闭2h，用封闭液(1∶1000)稀释的抗血型B抗原单克隆抗体室温孵育1h，二抗工作液为封闭液(1∶7500)稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG室温孵育1h.NBT/BCIP试剂盒进行显色。结果如图3所示P1/Fas融合基因可以被转染的B16细胞翻译，并且与特异抗血型B抗原单克隆抗体结合，证明所编码的蛋白定位于细胞膜上。

4、转染后外源蛋白表达对肿瘤细胞的影响

4.1补体介导的细胞杀伤(CDC)实验

用无酚红RPMI-1640培养液悬浮转染后对数生长期的细胞，计数后调整细胞密度至1×10⁶/ml作为靶细胞，按100μl/孔将细胞悬液加入96孔细胞培养板，培养过夜。每孔分别加入终浓度为2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml及20μg/ml的抗血型B抗原单克隆抗体，振荡混匀5s，于37℃湿盒内孵育1h。洗2遍。每孔分别加入100μl新鲜补体，振荡混匀5s，于37℃湿盒内孵育1h。洗2遍。加入CCK-8溶液10μL/well，继续培养4h，酶标仪450m波长测A值。

实验结果使用析因设计资料的方差分析进行分析，结果如图4所示不同分组之间差异有显著性(F＝293.119，P＜0.01)；多重比较结果显示P/F-M-pIRES组、P/F-pIRES组细胞活力明显低于M-pIRESM-pIRES组与pIRES组。不同浓度之间差异有显著性(F＝4.630，P＜0.05)，多重比较结果显示2.5ug组抑制率明显低于其他各组。药物与浓度之间交互相应显著。

4.2抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)

靶细胞的制备：取对数生长期的转染后细胞为靶细胞，用RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×10⁵cells/mL。按100μl/孔将细胞悬液加入96孔细胞培养板，培养过夜。每孔分别加入终浓度为10μg/ml的抗血型B抗原单克隆抗体，振荡混匀5s，于37℃湿盒内孵育1h。效应细胞的制备：常规制备小鼠脾淋巴细胞单细胞悬液，用RPMI-1640培养液调整细胞密度至1×10⁶/ml。ADCC的检测：靶细胞50μl加入96孔培养板内，设3个效靶比，分别为10∶1、20∶1及40∶1，每份标本做2个复孔。置于37℃、5％CO₂培养箱中培养4h。实验终止前4h加入CCK-8溶液10μL/well，继续培养4h，酶标仪450m波长测A值。

实验结果使用析因设计资料的方差分析进行分析，结果如图5所示，不同分组之间差异有显著性(F＝293.119，P＜0.01)；多重比较结果显示P/F-M-pIRES组细胞活力明显低于其他各组；随着效靶比的增加，细胞活力逐步下降。

4.3促凋亡作用的检测

用无酚红RPMI-1640培养液悬浮转染后对数生长期的细胞，计数后调整细胞密度至1×10⁶/ml，按200μl/孔将细胞悬液加入6孔细胞培养板。每孔分别加入终浓度20μg/ml的抗血型B抗原单克隆抗体，振荡混匀5s，于37℃培养过夜。洗2遍，胰酶消化，转入离心管中。以AnnexinV，Pl双染，室温，避光反应15min PBS重悬后上机流式细胞仪检测分析染色情况。

实验结果使用单因素方差分析进行分析提示P/F-M-pIRES组细胞凋亡率明显高于其他各组，图6展示了具体的流失细胞图结果。

Claims

1.一种B血型抗原表位模拟肽，该模拟肽的氨基酸序列为：His-Ser-Leu-Lys-His-Thr-Gln-Met-Ser-Tyr-Ser-Ser。

2.一种抗肿瘤DNA疫苗，该疫苗是重组pIRES质粒，其外源基因包括SEQ NO.2所示的融合基因。

3.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的外源基因还包括Mip3β基因。