CN101893598A - 一种集成高效富集二维毛细管电泳装置及富集分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及毛细管电泳技术，具体的说是一种集成高效富集二维毛细管电泳装置及相关富集分离方法。装置包括：一个二维毛细管电泳接口；两根毛细管柱，第一维毛细管出口端与接口的一端相连，其进样端置于入口池中，第二维毛细管的进样端与接口的另一端相连，其出口端置于出口池中；其富集分离方法为：样品组分经第一维毛细管电泳富集分离后流经接口进入第二维毛细管分离，实现二维毛细管电泳；在第一维毛细管入口端进行进样预富集，同时在二维毛细管接口处采用在线富集技术。本发明将高效富集技术同二维毛细管电泳分离相结合，具有灵敏度高、柱效损失小及不同毛细管电泳模式间联用的特点，可同时提高复杂样品的分离度和检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及毛细管电泳技术，具体地说是一种集成高效富集二维毛细管电泳装置及富集分离方法。
背景技术
对复杂样品的分离分析，一维毛细管电泳的分离能力有限。二维毛细管电泳是近年来发展起来的新的分离技术，由于其峰容量大、分辨率高，在复杂样品的分离分析中倍受关注。然而，迄今为止，二维毛细管电泳分析复杂样品的报道还很少，主要原因是二维毛细管电泳还没有商品化仪器，二维毛细管柱间的接口难以制作。目前已报道的二维毛细管电泳接口有十字交叉型接口[文献1：Michels，D.A.；Hu，S.；Dambrowitz，K.A.；Eggertson，M.J.；Lauterbach，K.；Dovichi，N.J.Electrophoresis，2004，25，3098-3105.]、微注射器接口[文献2：Zhang，M.；El Rassi，Z.J.Proteome Res.，2006，5，2001-2008.]、聚砜中空纤维膜接口[文献3：Yang，C.；Liu，H.；Yang，Q.；Zhang，L.；Zhang，W.；Zhang，Y.Anal.Chem.，2003，75，215-218.]和蚀刻多孔膜接口[文献4：Liu，H.；Zhang，L.；Zhu，G.；Zhang，W.；Zhang，Y.Anal.Chem.，2004，76，6506-6512.]，以上报道的二维毛细管电泳装置存在着只适用于蛋白质等生物大分子的分离分析、在二维接口处损失部分待测物以及第一维分离区带在接口处扩散等缺陷，将二维毛细管电泳用于低分子量物质分离分析的装置及方法还未见报道。
毛细管柱过细的内径使得其光谱检测光程过小，对检测灵敏度产生很大影响，限制了其对痕量组分的分离分析，为提高灵敏度，只好采用激光诱导荧光[文献5：Zhu，C.R.；He，X.Y.；Kraly，J.R.；Jones，M.R.；Whitmore，C.D.；Gomez，D.G.；Eggertson，M.J.；Quigley，W.；Boardman，A.；Dovichi，N.J.Anal.Chem.，2007，79，765-768.]、质谱[文献6：Schoenherr，R.M.；Ye，M.；Vannatta，M.；Dovichi，N.J.Anal.Chem.，2007，79，2230-2238.]等高灵敏检测器同二维毛细管电泳联用，但同高灵敏检测器联用使整个二维分离检测装置非常复杂，且价格昂贵。在线富集技术可使检测灵敏度得到较大提高，场放大进样、大体积样品堆积、瞬间等速电泳以及离子选择性耗尽进样等富集法可使灵敏度提高1000倍以上，而pH修饰法、动态pH连接法、胶束扫集法以及瞬间移动化学反应界面法等富集方法只需改变缓冲溶液的组成或pH即可实现高效富集，非常适合于二维毛细管电泳柱间切换时通过调整二维分离缓冲液的成分及pH进行在线富集，压缩样品区带，避免第一维分离区带在柱间接口处扩散，提高检测灵敏度。但到目前为止，将在线富集技术集成到二维毛细管电泳中提高检测灵敏度和柱效的研究还未见报道。
发明内容
为克服上述不足，本发明的目的是提供一种柱效和灵敏度更高、适于复杂样品中痕量组分要求的集成高效富集二维毛细管电泳装置及富集分离方法，它具有分离柱效高、检测灵敏度高、分离度大、二维分离模式转换灵活的特点，不仅适用于蛋白质等生物大分子的富集分离，还可用于低分子量物质的富集分离分析。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种集成高效富集二维毛细管电泳装置，包括：一个二维毛细管电泳接口；两根毛细管柱分别作为第一维和第二维毛细管，第一维毛细管出口端与接口的一端相连，其进样端置于装有第一维分离缓冲液的入口池中，第二维毛细管的进样端与接口的另一端相连，其出口端置于装有第二维分离缓冲液的出口池中。
所述二维毛细管电泳接口为一套管，在套管管壁一侧打一小孔，在孔中插入一侧管并与开关阀相连；所述第一维和第二维毛细管柱的内径可以为25～75μm，长度为10～60cm。
应用所述装置进行集成高效富集二维分离时，样品组分在第一维毛细管入口端预富集后进入第一维毛细管柱中分离，第一维流出组分顺次流经接口并进入第二维毛细管进行电泳分离，样品组分流经接口时采用富集技术避免第一维分离组分在接口处扩散，实现集成高效富集二维毛细管电泳分离。
所述样品组分在第一维毛细管入口端预富集方法为场放大进样、离子选择性耗尽进样、大体积样品堆积或等速电泳；所述第一维流出组分流经接口时通过动态pH联接、pH修饰、移动化学反应界面或胶束扫集富集技术避免第一维分离组分在接口处扩散；所述二维分离柱的分离模式可以为毛细管区带电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管等电聚焦、毛细管凝胶电泳或毛细管电色谱。
本发明具有如下优点：
1、检测灵敏度高。本发明采用了双重高效富集技术，样品组分在第一维毛细管入口端进行预富集(场放大进样、离子选择性耗尽进样、大体积样品堆积或瞬间等速电泳)，可以引入大体积样品并进行区带锐化，提高灵敏度；第一维流出组分经接口时再次采用富集技术(动态pH联接、pH修饰、胶束扫集或移动化学反应界面)不仅避免第一维分离组分在接口处扩散，还可进一步压缩样品区带，提高检测灵敏度。因此，该系统具有较高的检测灵敏度，可用于复杂样品中痕量组分的分析。
2、柱效高。由于在二维分离接口处采用在线富集技术压缩样品区带，避免第一维分离组分在接口处扩散，从而保证了系统的高柱效性。
3、应用范围广。通过改变二维分离缓冲溶液，可用于阳离子、阴离子和中性化合物的富集分离，并且不仅能富集分离蛋白质等生物大分子，还可用于低分子量物质的富集分离分析。
附图说明
图1为本发明集成高效富集二维毛细管电泳装置示意图，(1)进样预富集及第一维分离，(2)第一维流出组分进入第二维毛细管并在接口处进行富集，(3)第二维分离；
图2为本发明一个实施例中四种低分子量药物的毛细管区带电泳谱图。
图3为本发明一个实施例中四种低分子量药物的毛细管区带电泳-胶束电动毛细管色谱二维富集分离谱图。
具体实施方式
以下为实施本发明的具体示例，其作用在于进一步阐明本发明的内容，使阅读者更容易理解，但不构成对本发明要求的保护范围的限定或限制。
实施例一集成高效富集二维毛细管电泳装置的构建
一个具体的集成高效富集二维毛细管电泳装置如图1所示。
二维毛细管的接口套管1为聚四氟乙烯管(2cm长，300μm内径)，在管壁一侧打一小孔(50μm孔径)，将聚四氟乙烯套管加热使其软化，趁热从两端相对插入毛细管3(河北永年光导纤维厂，48cm长，50μm内径，375μm外径)和毛细管4(河北永年光导纤维厂，40cm长，50μm内径，375μm外径)分别作为第一维和第二维毛细管，使两毛细管的接缝位于聚四氟乙烯套管的小孔处，冷却后，聚四氟乙烯管与两毛细管紧紧箍在一起，在小孔中插入一聚四氟乙烯侧管2并与开关阀V相连，在第一维毛细管距离出口端3cm、第二维毛细管距离出口端5cm处分别开一个检测窗口D1和D2，将其穿过紫外检测器，将第一维毛细管入口端插入入口池B1，第二维毛细管出口端插入出口池B4。
实施例二集成高效富集二维毛细管区带电泳-胶束电动毛细管色谱分离方法
如图1所示，具体操作过程为：
(1)首先用注射器将第一维和第二维毛细管内分别充满毛细管区带电泳和胶束电动毛细管色谱分离缓冲液。再用注射器从第一维毛细管入口端充入一段氢氧化钠溶液塞。入口池B1和缓冲液池B2注满毛细管区带电泳缓冲液，侧管2放入缓冲液池B2中，将相应的电极插入B1和B2池内；将CZE毛细管入口端插入样品池内，给第一维毛细管柱上施加电压电动进样一段时间，阳离子分析物进入第一维毛细管被迎面而来的氢氧根离子中和堆积在样品与氢氧化钠溶液的界面处进行离子耗尽进样预富集；进样结束后，将第一维毛细管入口端插入入口池B1，缓冲液中的氢离子进入毛细管穿过中性分析物区带向阴极迁移，被中和的分析物带上正电荷根据淌度不同进行毛细管区带电泳分离。
(2)当第一维分离的第一个区带到达检测器D1时，关闭开关阀V，在出口池B4中注满胶束电动毛细管色谱缓冲液，同时将阴极端电极插入出口池B4中，在两毛细管柱上施加电压，在第一维毛细管中分离的区带被电渗流驱送到第二维毛细管中，在第一维缓冲液和第二维缓冲液的界面处，样品离子进行pH联接在线富集，同时被第二维缓冲液中的β-环糊精和十二烷基硫酸钠胶束捕获而进一步压缩区带。当最后一个区带到达检测器D1时，继续通电40s确保最后一个区带到达第二维毛细管入口。
(3)在缓冲液池B3中注满胶束电动毛细管色谱缓冲液，打开开关阀V，将侧管2放入缓冲液池B3中，同时将阳极端电极插入缓冲液池B3中，给第二维毛细管柱上施加电压，第一维流出组分在第二维毛细管中进一步进行手性分离和胶束电动毛细管色谱分离。
实施例三集成高效富集二维毛细管区带电泳-胶束电动毛细管色谱分离四种低分子量药物及其对映体
如图1所示，第一维分离采用毛细管区带电泳，分离缓冲液为20mmol/L醋酸钠/醋酸，pH 3.0，进样时采用离子耗尽进样预富集，第一维毛细管入口端充入0.8cm氢氧化钠溶液，12kV电动进样12min，在引入大量样品离子的同时锐化样品区带，实现高效预富集，富集后的区带在第一维毛细管中进行毛细管区带电泳分离；第二维分离采用胶束电动毛细管色谱，分离缓冲液为50mmol/L硼酸钠+30mmol/L十二烷基硫酸钠+10mmol/L β-环糊精，pH9.0，第一维分离流出组分流经接口进入第二维毛细管，在二维缓冲液界面处，阳离子分析物再次失去质子，经pH联接-胶束扫集双重富集，不仅抵消了第一维分离区带在接口处的扩散，还可进一步压缩样品区带，提高检测灵敏度；在接口处经双重富集后的样品组分进入第二维毛细管进一步进行胶束电动毛细管色谱分离。
样品为四种低分子量药物及其对映体的混合液，分别为普萘洛尔、美托洛尔、尼莫地平和尼卡地平(美国，Sigma公司)，β-环糊精、十二烷基硫酸钠、冰醋酸、无水醋酸钠、四硼酸钠和硼酸均为分析纯(上海化学试剂公司)，其他试剂为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。所有缓冲液及样品溶液在使用前均需用0.45μm微孔滤膜过滤，且在临用前超声脱气。
其实验结果：
如图2所示，四种低分子量药物普萘洛尔、美托洛尔、尼莫地平和尼卡地平混合物采用毛细管区带电泳一维分离时，按照淌度不同只分成了3个峰，分离效果较差。
如图3所示，经过第一维毛细管区带电泳分离为3个峰后，由电渗流驱动，各个峰依次通过接口进入第二维毛细管，按照胶束电动毛细管色谱模式和手性模式进一步分离，四种低分子量药物及其对映体分离出了8个峰，顺利实现了毛细管区带电泳-胶束电动毛细管色谱和手性分离不同模式的联用。因为第二维分离以第一维分离的每个谱峰为基础进样的，因此峰容量、分离度和分辨率都得到很大提高，且将高效富集技术集成到二维分离中，灵敏度和柱效都很高。
Claims (7)
1.一种集成高效富集二维毛细管电泳装置，其特征包括：
一个二维毛细管电泳接口；
两根毛细管柱分别作为第一维和第二维毛细管，第一维毛细管出口端与接口的一端相连，其进样端置于装有第一维分离缓冲液的入口池中，第二维毛细管的进样端与接口的另一端相连，其出口端置于装有第二维分离缓冲液的出口池中。
2.一种按照权利要求1所述集成高效富集二维毛细管电泳装置，其特征在于：所述二维毛细管电泳接口为一套管，在套管管壁一侧打一小孔，在孔中插入一侧管并与开关阀相连。
3.一种按照权利要求1所述集成高效富集二维毛细管电泳装置，其特征在于：所述第一维和第二维毛细管柱的内径可以为25～75μm，长度为10～60cm。
4.一种应用权利要求1所述装置进行集成高效富集二维分离的方法，其特征在于：样品组分在第一维毛细管入口端预富集后进入第一维毛细管柱中分离，第一维流出组分顺次流经接口并进入第二维毛细管进行电泳分离，样品组分流经接口时采用富集技术避免第一维分离组分在接口处扩散，实现集成高效富集二维毛细管电泳分离。
5.按照权利要求4所述集成高效富集二维分离的方法，其特征在于：所述样品组分在第一维毛细管入口端预富集方法为场放大进样、离子选择性耗尽进样、大体积样品堆积或等速电泳。
6.按照权利要求4所述集成高效富集二维分离的方法，特征在于：所述第一维流出组分流经接口时通过动态pH联接、pH修饰、移动化学反应界面或胶束扫集富集技术避免第一维分离组分在接口处扩散。
7.按照权利要求4所述集成高效富集二维分离的方法，其特征在于：所述二维分离柱的分离模式可以为毛细管区带电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管等电聚焦、毛细管凝胶电泳或毛细管电色谱。
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