CN101855343A - 控制基因表达的表观遗传调控复合物 - Google Patents

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Abstract

一种包含至少一个具有位点特异性DNA结合活性的第一域和至少一个具有精氨酸甲基转移酶活性的第二域的表观遗传调控多肽复合物，其中所述第二域能够甲基化位于组蛋白H2A末端区域的精氨酸残基。所述复合物能够调控细胞内基因表达，特别是通过控制组蛋白H2A和H4末端区域中R3的甲基化调控哺乳动物干细胞中的基因表达。所述复合物的实例包括具有Blimp1的DNA结合活性和Prmt5的精氨酸甲基转移酶活性的多肽复合物。

Description

控制基因表达的表观遗传调控复合物
技术领域
本发明涉及基因表达的表观遗传调控领域。特别地，本发明涉及以控制基因体内和体外表达为目标的、具有组蛋白甲基转移酶活性的组合物和方法。
背景技术
表观遗传学涉及由细胞或多细胞组织向其子代传递的、并非由基因的核苷酸序列编码的信息。通常通过对DNA或染色质结构的化学修饰实现表观遗传控制。例如，可以通过对与基因组DNA结合的组蛋白进行甲基化和乙酰化以调节基因表达。组蛋白的甲基化和乙酰化常发生在组蛋白的末端，此域为外露的表面并且由于具有大量如精氨酸(R)和赖氨酸(K)的氨基酸残基而带有净正电荷。组蛋白末端的化学修饰受具有组蛋白甲基转移酶活性(MTase)和组蛋白乙酰转移酶活性(HAT)的酶调节。
表观遗传修饰可发生在生物体正常发育的不同时段，并且也发生在正常细胞向癌细胞转化期间。此类修饰常造成特定基因的沉默或活化。大量文献证明，在癌症中多数肿瘤细胞都显示出异常的DNA表观遗传印记(FeinbergAP & Vogelstein B，(1983)Nature 1(5895)：89-92)。
干细胞是能够在很大程度上进行自我更新并且能够分化成祖细胞的细胞。就这一点而言，干细胞也是癌症起源的潜在因素。干细胞可具有长的寿命，在此期间干细胞发生的遗传突变和表观遗传修饰会增加其恶性化趋势。根据假设，由于干细胞所在的环境处于增殖和分化的竞争性细微平衡中，微小而意义深远的表观遗传变化能够将所述平衡推向肿瘤干细胞表型一侧。对调控表观遗传修饰的原因和方式的鉴定对于癌症的理解、检测和治疗，尤其是对于肿瘤干细胞的治疗特别重要。实际上，人们认为复发和恶性癌症病例难以治疗的因素之一为所述癌症可能包含不对常规治疗做出反应的肿瘤干细胞。
体细胞核移植(SCNT)被用于产生用于畜牧业生产(克隆或干细胞治疗)、蛋白质生物制备和建立疾病模型的动物(Wilmut I，Beaujean N，de SousaPA，Dinnyes A，King TJ，Paterson LA，Wells DN，Young LE.(2002)Nature.Oct10；419(6907)：583-6)。与SCNT功效和成功率相关的问题之一是体细胞基因组包含妨碍成功重编程(reprogramming)的大量稳定的表观遗传标记。此外，受体卵细胞可以包含发挥表观遗传作用的因子，这些因子也会导致所述方法的失败。因此，需要提供改进SCNT功效的组合物和方法，并以此通过这种方式促进生物加工的应用。
小鼠原始生殖细胞(PGC)的特化为分析体内表观遗传修饰作用提供了有吸引力的实验模型。首先在小鼠胚胎E7.5期发现约45个PGC的起始群(Ginsburg，M.，Snow，M.H.& McLaren，A.(1990)Development 110，521-8)。其后，这些PGC迁移并从E10.5期起进入生殖脊，在生殖脊中对生殖细胞继续执行进一步的大量表观遗传程序。在E13.5期，雌性体内生殖细胞进入减数分裂前期，而雄性体内生殖细胞在雄性腺中进入有丝分裂阻滞。
PGC特化后马上发生显著的表观遗传修饰，包括分别通过HMTase和HAT对组蛋白末端进行甲基化和乙酰化(Surani et al.，2004(CSHSymposium)；Seki et al.，2004；Lachner，M.，O′Sullivan，R.J.& Jenuwein，T.(2003)J Cell Sci 116，2117-24；和Vaquero，A.，Loyola，A.& Reinberg，D.(2003)Sci Aging Knowledge Environ 2003，RE4)。在假定能调控PGC的这些表观遗传变化的候选基因中有属于保守性SET/PR域蛋白质家族的HMTase。
因此，需要提供改进细胞内表观遗传调控机制控制的试剂和方法。特别地，需要可以更好地控制基因表达的组合物和方法以影响干细胞和癌细胞的细胞命运决定。
发明内容
本发明的第一个方面提供了包含至少一个具有位点特异性DNA结合活性的第一域和至少一个具有精氨酸甲基转移酶活性的第二域的分离多肽复合物，其中所述第二域能够甲基化位于组蛋白H2A末端区域的精氨酸残基。
在本发明的一个具体实施方案中，所述第二域具有精氨酸甲基转移酶活性，可提供精氨酸残基的对称性NG，N′G-二甲基化，如位于组蛋白H2A末端区域第3位点的精氨酸残基(H2AR3)的对称性NG，N′G-二甲基化。任选地，所述第二域还能够甲基化位于组蛋白H4末端区域的精氨酸残基，如位于组蛋白H4末端区域第3位点的精氨酸残基(H4R3)。在本发明的一个实施方案中，精氨酸甲基转移酶活性归属于Prmt5精氨酸甲基转移酶域或其衍生物或同源物。
根据本发明，所述第一域能够特异性地靶向结合于哺乳动物基因组DNA中参与基因表达控制的一个或多个共有序列。此类位点通常位于但不限于非编码启动子区、非翻译区或内含子中。在一个具体实施方案中，本发明的DNA结合域能够结合PRDI/Blimp1型结合位点，此类结合位点为具有四个GGGAAAG基序的共有序列，其中两个基序位于靶基因的5′-启动子区，另外两个基序位于转录起始位点的下游。适合地，DNA结合域包含Blimp1蛋白质，PRDI/Blimp1多肽的DNA结合部分，或其同源物或其衍生物。
本发明的第二个方面提供了适于诱导多肽复合物在哺乳动物细胞中表达的核酸表达载体构建物，所述载体包含可操作性地连接于启动子序列的一个或多个编码序列，其中，所述一个或多个编码序列编码至少一个具有位点特异性DNA结合活性的第一多肽域和至少一个具有精氨酸甲基转移酶活性的第二多肽域，其中所述第一域特异性地靶向结合哺乳动物基因组DNA中参与基因表达控制的一个或多个共有序列，而所述第二域具有精氨酸甲基转移酶活性，可向位于多肽底物中的精氨酸残基提供对称性NG，N′G-二甲基化。
依照本发明的一个具体实施方案，所述多肽底物是组蛋白。任选地，所述第二多肽域能够甲基化位于组蛋白H2A末端区域第3位点的精氨酸残基(H2AR3)，并且也能够甲基化位于组蛋白H4末端区域的精氨酸残基。
适合的表达载体包括质粒、粘粒、病毒载体和如YAC的人工染色体。启动子序列可任选选自组成型启动子或诱导型启动子。适合的诱导型启动子包括特征明显的Tet或三苯氧胺调控系统。其它的系统可包括热激敏感型启动子。
在本发明的一个实施方案中，所述表达载体包含表达盒，在所述表达盒中，第一编码序列编码第一多肽域，而第二编码序列表达第二多肽域。任选地，所述第一编码序列编码PRDI/Blimp1多肽，而第二编码序列编码Prmt5多肽。在一个具体实施方案中，通过一个或多个插入序列分隔所述第一和第二编码序列是有利的。所述一个或多个插入序列可适当地包含至少一个内部核糖体进入位点(IRES)，以促进细胞中第一和第二编码序列的双顺反子表达。本发明的表达载体还可以包含一个或多个核酸序列，该序列编码选自选择标记、抗生素抗性标记和报告子的多肽。
本发明的第三个方面提供了控制哺乳动物细胞中基因表达的方法，包括诱导细胞中多肽复合物的形成，其中所述多肽复合物包含至少一个具有位点特异性DNA结合活性的第一域和至少一个具有精氨酸甲基转移酶活性的第二域，其中所述第二域能够甲基化位于组蛋白H2A末端区域的精氨酸残基。在一个具体实施方案中，通过在细胞中诱导PRDI/Blimp1多肽或其同源物或其衍生物的表达来诱导细胞中多肽复合物的形成。
在一个具体实施方案中，通过使用编码Blimp1多肽或其衍生物或同源物的表达载体转染细胞来诱导细胞内PRDI/Blimp1多肽的表达。任选地，通过使用上文所述的表达载体转染细胞来诱导细胞内PRDI/Blimp1多肽的表达。典型的哺乳动物细胞为来自组织的或细胞系形式的人类细胞。在本发明的一个具体实施方案中，所述哺乳动物细胞为肿瘤细胞或细胞系或癌细胞或细胞系。合适地，本发明此方面的方法可在体外或体内实施。
在本发明的一个具体实施方案中，基因表达控制导致一个或多个选自以下组的基因的表达控制：c-Myc、Dhx38、Pcdh7、Q8C9T7、Xyltl、DnaH1、Baip2、Nek7、Dusp2、ENSMUSG00000027041、Sirt4和Blimp1的。在细胞中诱导所述多肽复合物会导致这些基因中一个或多个基因的表达降低。
本发明的第四个方面提供了促进干细胞自我更新并抑制其分化的方法，该方法包含抑制干细胞中Blimp1/Prmt5复合物的形成。所述干细胞可任选为哺乳动物干细胞，合适的干细胞是人类干细胞。在本发明的一个具体实施方案中，所述干细胞选自成体干细胞、始祖干细胞和多能干细胞。应当了解的是，本发明无意于人类的生殖性克隆或以促进人类生殖性克隆为目的而操作或使用人类胚胎。
在本发明此方面的一个具体实施方案中，通过使干细胞接触Blimp1抑制剂化合物、Prmt5抑制剂化合物和/或Blimp1/Prmt5复合物抑制剂化合物来抑制所述细胞中Blimp1/Prmt5复合物的形成。适合的抑制剂化合物可选自小分子抑制剂、与Blimp1mRNA或Prmt5mRNA结合的siRNA分子、与Blimp1mRNA或Prmt5 mRNA结合的反义寡核苷酸以及Blimp1或Prmt5多肽的负显性形式。
本发明的另一方面提供了控制细胞中Prmt5定位，特别是内源Prmt5定位的方法，该方法包括在所述细胞中诱导Blimp1多肽的表达，从而诱导细胞中Blimp1/Prmt5复合物的形成。在细胞中诱导的Blimp1可以是内源Blimp1或外源Blimp1。适合的细胞可以是哺乳动物干细胞。
本发明的另一方面提供了本发明的多肽复合物以及包含上述表达载体构建物的细胞(适合的细胞为哺乳动物/人类细胞)在治疗癌症中的用途。
附图简述
图1：(a)显示E7.5-E12.5期间小鼠生殖细胞特化和发育的关键事件的总结；(b)显示通过两个代表性起始PGC(灰色)和两个体细胞(白色)的单细胞cDNA PCR的候选SET/PR域基因表达分析。黑色区域表明检测到PGC和体细胞中的表达。
图2：显示免疫沉淀(IP)的小鼠Blimp1复合物具有精氨酸甲基转移酶活性。(a)在293T细胞中表达Myc标记的小鼠Blimp1或相应的对照，使用抗Myc抗体通过Western印迹分析Myc免疫沉淀物；(b)使用同样的免疫沉淀物用于针对纯化组蛋白H3、H2A和重组H2A(rH2A)的HMTase分析，分别显示其荧光图(F)和丽春红染色膜(P)；(c)放射性同位素标记rH2A的微测序，X轴表示rH2A中第1位至第14位的氨基酸，Y轴表示以每分钟次数(cpm)计的单个氨基酸残基的[3H]掺入；和(d)显示H4和H2A.1氨基最末端序列保守性的比对。
图3：显示生殖细胞中Blimp1和Prmt5的重叠表达形成特异的H2A/H4R3me图谱。(a、b、c)显示通过抗Blimp1(a)、抗Prmt5(b)和抗Prmt1(c)特异性抗体免疫染色而检测到的不同发育阶段PGC中Blimp1、Prmt5和Prmt1的表达图谱，使用抗Stella/PGC7、抗Oct4或抗TG1/SSEA1抗体检测到的生殖细胞，与DAPI染色的DNA图像一起形成的复合图像；(d、e)显示在293T细胞中表达Myc标记的小鼠Blimp1或相应的对照；使用抗Prmt5抗体(anti Prmt5)、抗Myc抗体(anti Myc)或抗Prmt1抗体(anti Prmt1)通过Western印迹分析Myc、Prmt5或Prmt1免疫沉淀物，信号标记(*)为非特异性信号；(f)使用抗H4R3me2s抗体通过所示不同发育阶段PGC的免疫染色来分析生殖细胞中H2A/H4 R3的甲基化；使用抗阶段特异性标记物(即Oct4或TG1/SSEA1)的抗体对生殖细胞进行共染色；与DAPI染色的DNA图像一起形成复合图像；比例尺：10μm(各图的比例相同)。
图4：显示基因座Dhx38内Blimp1/Prmt5结合元件的体内鉴定。(a)Dhx38转录起点(TS)和起始密码子(ATG)附近推定的Blimp1结合位点的位置，(A、B、C、D)显示用于ChIP分析的扩增序列；(b)ChIP分析中内源Prmt5与基因座Dhx38的基因组DNA的相互作用，使用抗Prmt5抗体或IgG抗体(anti-IgG)免疫沉淀E10.5胚胎单独生殖嵴细胞提取物的上清(s)或细胞核(n)部分，使用末端基因组DNA(+)和水(-)作为对照。
图5：显示将Blimp1和Prmt5由细胞核转移到细胞质后生殖细胞中Dhx38的表达上调，造成H2A/H4R3me2s修饰水平的下降；在所示发育阶段生殖脊的冷冻切片上进行(a)Dhx38、(b)Blimp1和Prmt5以及(c)H2A/H4R3me2s的免疫染色；使用抗Prmt5、抗Myc或抗Prmt1特异性抗体检测生殖细胞；与DAPI染色的DNA图像一起形成复合图像；比例尺：10μm(各图的比例相同)。
图6：显示多能EG和胚胎癌(EC)细胞中Blimp1、Prmt5和Dhx38的分析。(a)对EG细胞进行的Blimp1、Prmt5和Dhx38免疫染色；与DAPI染色的DNA图像一起形成复合图像，注意Dhx38和Blimp1表达之间的反向关系；(b)对ES、EG或EC(P19)提取物中Blimp1和Oct4的Western印迹分析；(c)Myc标记的小鼠Blimp1在所示P19多能EC细胞中的表达；使用抗Prmt5、抗Myc或抗Prmt1抗体通过Western印迹分析Prmt5免疫沉淀物，使用抗微管蛋白抗体检测起始物(input)上样量相等的泳道中的微管蛋白水平，发现向EC(P19)细胞中引入Blimp1时Dhx38受到抑制；(d)通过ChIP分析发现在Myc-Blimp1转染的EC(P19)细胞中Dhx38基因座上H4R3me2s水平增加；使用抗Myc或抗H4R3me2s抗体免疫沉淀来自P19细胞的细胞提取物；A、B、C、D是指如图4所示的Dhx38基因座中包含Blimp1结合位点的区域。
图7：显示(a)由图1所示E7.5期PCR表达筛选所得候选SET/PR域基因的免疫荧光分析，其中使用抗特异性组蛋白甲基转移酶的特异性抗体对从E8.5期胚胎分离的细胞进行免疫染色，使用生殖细胞特异性抗体(抗Oct4或抗Stella/PGC7抗体)检测生殖细胞；(b)使用相应抗体在E8.5期PGC中免疫共染色Blimp1和Prmt5，通过组织非特异性碱性磷酸酶(AP)的表达标记生殖细胞；与DAPI染色的DNA图像一起形成复合图像；比例尺：10μm(各图的比例相同)。
图8：显示抗H4R3me2s抗体的特征描述；可以使用单甲基基团(a)，对称排列的双甲基基团(b)或不称排列的双甲基基团(c)修饰精氨酸；先使用带有对称脱甲基化R3的H4合成肽产生抗H4R3me2s抗体(AbcamTM)，然后进行Western印迹分析测定其特异性；(d)所述抗体针对有或没有与Blimp1-Myc免疫沉淀物(即Myc-Blimp1或Myc)温育的小牛胸腺组蛋白(H4、H3、H2A、H2B)进行的Western印迹，和(e)在与包含未经修饰的、R3me2s和R3me2a的H4多肽进行竞争性试验后，所述抗体仍能高效识别对称二甲基化的肽。
具体实施方案
在详细阐明本发明之前，提供有助于理解本发明的多个定义。本文引用的所有文献通过参考方式全文并入本文。除非另有定义，否则本文使用的科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。
本文所用术语“重编程”是指改变或除去细胞核中表观遗传修饰的步骤。重编程有利于降低细胞命运定型，并以此降低细胞整体并尤其是细胞核的分化状态。大体而言，重编程包括使分化的或定型的体细胞核回复到胚胎细胞、生殖细胞或干细胞具有的基因表达、表观遗传和功能状态。体细胞核的重编程是如SCNT等程序优选的第一步骤，其对于控制细胞分化状态(潜能)的其它程序也很重要。
本文所用术语“癌”是指位于肿瘤内的或具有与肿瘤相关的性质的组织或细胞。肿瘤通常具有区别于正常组织和正常细胞的特征。这些特征包括但不限于：退变程度、细胞形态改变、形状的不规则性、细胞粘附性的降低、转移能力、血管新生水平的升高、细胞侵袭性的增加、细胞凋亡水平的下降和细胞恶性化的普遍增加。与“癌(cancer)”相关且通常具有相同含义的术语包括肉瘤、恶性肿瘤(carcinoma)、瘤(tumor)、上皮瘤、白血病、淋巴瘤、息肉、转化、肿瘤和类似术语。
术语“表观遗传修饰”是指基因组的化学标记。表观遗传标记可包括DNA甲基化(印记)以及与DNA相连蛋白质(例如，组蛋白)的甲基化和乙酰化。由于表观遗传修饰，经常在哺乳动物中观察到亲源特异性基因的表达(来自母系或父系染色体)。在亲本种系中，表观遗传修饰可导致稳定的基因沉默或活化。
“生物加工”是指使用活细胞或其组分生产所需终产物的技术。在本发明中，可通过细胞的表观遗传修饰增强这些细胞用于生物加工的能力。典型的生物加工技术包括SCNT。
本文所用术语DNA结合域和/或精氨酸甲基转移酶的“衍生物或同源物”是指分别与本发明分子具有基本相似的序列同一性的mRNA和多肽。认为衍生物和同源物包含来自其它物种所述序列的直系物以及仍具有高水平等价功能的突变体。所述“基本相似的序列同一性”是指序列相似性水平为约50％、60％、70％、80％、90％、95％至约99％的同一性。可以使用常规方法(Henikoff and Henikoff Proc.Natl.Acad.Sci.USA1992；89：10915；andAltschul et al.，Nucleic Acids Res.1997；25：3389-3402)测定序列同一性百分比。或者，本发明多肽的同源物可以是能够在高、中或低严格条件下具有与本文所述序列杂交能力的那些序列。
所用术语“表达载体”是指可将合适大小的另一DNA序列片段整合到其内部的线性或环状DNA分子。此类DNA片段可包括用于所述DNA序列片段编码基因转录的其它片段。所述其它片段可包括但不限于：启动子、转录终止子、增强子、内核糖体进入位点、非翻译区、多聚腺苷酸信号、选择性标记、复制起点等类似物。表达载体通常衍生自质粒、粘粒、病毒载体和酵母人工染色体，载体通常是包含多个来源的DNA序列的重组分子。
在用于如表达载体等的DNA序列时，术语“可操作性连接”是指对序列进行排列使其合作发挥功能，从而达到其预期目的，即启动子序列可启动转录并通过所连接的编码序列直至终止信号。
“多核苷酸”是指单链或双链的共价连接的核苷酸序列，其中通过磷酸二酯键连接各个核苷酸的3′和5′末端。所述多核苷酸可由脱氧核糖核酸碱基或核糖核酸碱基组成。多核苷酸包括DNA和RNA，并且可通过体外合成或由天然来源分离制备。多核苷酸的大小通常表示为双链多核苷酸中碱基对(bp)的数目，或在单链多核苷酸的情况下，表示为核苷酸(nt)的数目。1000bp或1000nt等于1千个碱基(kb)。长度小于约40个核苷酸的多核苷酸通常被称为“寡核苷酸”。
本文所用术语“启动子”是指基因中可与转录因子和/或RNA聚合酶结合以控制相关编码序列表达的区域。启动子通常但不总位于基因的5′-非编码区和翻译起始密码子的上游。基因的启动子区域可包含一个或多个共有序列，其作为DNA结合蛋白的序列特异性DNA结合域的可识别结合位点。此外，此类结合位点也可位于启动子外的区域，例如位于内含子中的增强子区域或位于编码序列的下游。
应用于多肽或多肽复合物时，术语“分离”是指从其天然起源的生物体中移出的多肽。优选的分离多肽基本不含有其起源生物体蛋白质组中固有的其它多肽。最优选的分离多肽为至少95％纯度的形态，更优选大于99％的纯度。在本文中，术语“分离”意在包括处于不同物理形态的相同多肽，无论所述多肽是天然形态、变性形态、二聚/多聚、糖基化、结晶化或衍生的形态。而本文提及使用的“复合物”包括第一和第二多肽域包含在单个多肽链中的情况，以及第一和第二域包含在彼此非共价结合的分别的多肽链中的情况，还有形成翻译后共价键以将单独的域连接起来从而形成结合功能单位的情况。
在本发明的一个实施方案中，提供了Blimp1和Prmt5的新型复合物，所述新型复合物能够通过表观遗传控制机制调控哺乳动物细胞中的基因表达。
体细胞通常沿分化途径由较低特化度发育成较高特化度或定型状态。较低特化度的体细胞可显示出作为始祖干细胞产生多种不同细胞类型的能力。以特定干细胞作为祖细胞产生这些不同细胞类型的量通常被称为这种干细胞的“潜能”。因此，多能干细胞可作为很多不同分化细胞类型的祖细胞。如果一种细胞可分化成体内的所有细胞，则是全能细胞。如果一种细胞可分化成大多数细胞类型，则是多能细胞。因为能够产生除胚外组织(即滋养外胚层)之外哺乳动物的大多数细胞类型，所以胚胎干细胞通常被称为多能细胞。本发明提供了在基因表达控制水平控制细胞命运决定的方法。本发明的蛋白质复合物在表达或引入哺乳动物细胞时，可使细胞命运决定远离多能性。相反地，在干细胞中抑制本发明蛋白质复合物的活性或仅抑制Blimp1组分的活性可使细胞命运决定倾向于多能性和自我更新。
本发明可应用的另一个相关领域是癌症治疗。即使不是全部也是大多数癌症都发生表观遗传变化，其包括肿瘤抑制基因的显著下调和沉默以及致癌基因的上调。肿瘤抑制基因的重新活化由于能够下调致癌基因从而可改善癌症表型。因此，控制体内基因表达和细胞命运决定的方法是一种很有前景的癌症治疗途径。
B淋巴细胞诱导的成熟蛋白(Blimp1)
Blimp1是包含5个DNA结合锌指基序的100kDa蛋白质(GENBANK登录号：NM_007548)。Blimp1的人类同源物被称为PRDI-BF1或PRDM1(GENBANK登录号：NM_000198)。最初，通过细胞因子IL-2和IL-5处理后B细胞淋巴细胞系(BCL1)的消减筛选来分离Blimpl cDNA。Blimp1的异常表达足以导致BCL1细胞的终末分化。Blimp1被认为是终末B细胞发育的“总调节因子”(Yu J.et al.(2000)Mol.Cell.Biol.20(7)：2592-2603)。
在人体中，小鼠Blimp1的人直系物PRDI-BF1能够与H3赖氨酸甲基转移酶G9a形成复合物。现已证明这种复合物能够通过染色质介导的机制在基因的启动子区域沉默人干扰素β(IFN-β)基因(Gyory I.et al.(2004)Nat.Imm.5：299-308)。
现已发现Blimp1与参与表观遗传修饰的因子形成复合物。包含Blimp1和组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)的复合物被认为通过组蛋白末端赖氨酸残基的脱乙酰化来改变核小体结构并抑制基因转录。由于赖氨酸残基的乙酰化可有效中和其正电荷，因而脱乙酰化会恢复其带电性，并且由于硬脂酸和其它作用会导致核小体结构的修饰。
Blimp1的已知靶标包括c-Myc、IFN-β、CD23、CD22、II类MHC、BSAP(Pax5)、早期B细胞因子和CIITA。所有这些基因均被Blimp1转录抑制。B细胞分化期间c-Myc基因的转录被Blimp1抑制，c-Myc基因是BCL1淋巴细胞中Blimp1的重要靶标。Blimp1对c-Myc启动子的抑制需要Blimp1分子中的多个区域，包括N-末端酸性区和第99位与第464位氨基酸之间的区域(Yu J.et al.，见上文)。
致癌蛋白c-Myc对于生长控制、凋亡和/或分化的调节至关重要，并且其失调还是多种肿瘤的起因。B细胞中c-Myc的表达失调常常是致瘤的。c-Myc基因至Ig基因座的染色体易位出现于大多数的人类Burkitt淋巴瘤和鼠浆细胞瘤中(Lin K.I.et al.，(2000)Mol.Cell Biol.(20)23：8684-8695)。
可以通过LIF/STAT3依赖性信号维持小鼠ES细胞作为多能性、自我更新群。现已证明STAT3调控Myc转录因子的表达。还认为成体干细胞需要Myc的活化。RT-PCR分析表明ES细胞中Myc的转录提高。ES细胞通常需要包含LIF的培养基，否则ES细胞会倾向于分化而不是自我更新。现已发现从培养条件中除去LIF后，ES细胞中的Myc水平迅速下降，说明LIF可能是ES细胞分化的必要条件。实验表明与LIF相当水平的Myc独自能维持ES细胞的状态(即，多能表型)，并且在Myc失活时，干细胞群减少(CartwrightP.et al.，(2005)Development 132：885-896)。
蛋白质精氨酸甲基转移酶5(Prmt5)
已知有两类组蛋白甲基转移酶(HMTase)，其包含主要发现于具有赖氨酸特异性甲基化酶活性的蛋白质中的SET(Suvar3-9，Enhancer of Zeste，Trithorax)域，或发现于PRMT的精氨酸特异性甲基化酶催化域。PRMT可被分成I型和II型：I型PRMT催化精氨酸残基的单甲基化和不对称的脱甲基化，而II型PRMT催化形成单甲基化和对称二甲基化的精氨酸。在六种已知的PRMT中，只有PRMT5(GENBANK登录号：NM_006109(人)；NM_013768(小鼠))表现为可以靶向组蛋白的II型PRMT。特别地，现已发现PRMT5靶向H3和H4N-末端的特定精氨酸残基。
PRMT5可结合基于BRG1和hBRM的hSWI/SNF染色质重塑复合体。在此类复合体中，PRMT5具有通过甲基化组蛋白H3中第8位精氨酸残基(H3R8)刺激细胞生长和非锚定依赖性生长的能力，并以此降低如ST7和NM23等已知具有肿瘤抑制作用的基因的表达(Richard S.et al.，(2005)Biochem.J.388：379-386)。现已发现PRMT5还参与CYCLINE和CAD的转录抑制。
Blimp1/Prmt5复合物
因为尚未发现Blimp1本身具有特异的组蛋白甲基转移酶活性，因此本发明人着手鉴定Blimp1SET/PR域可能具有的活性。发明人现已证明Blimp1能够与PRMT5形成新型复合物，在体内所述复合物持续存在于小鼠生殖细胞谱系中直至PGC进入生殖脊，这表明Blimp1在哺乳动物早期生殖细胞谱系中具有持续的作用。下文更详细的描述进一步分析表明新型Blimp1/Prmt5复合物通过甲基化组蛋白H2A和H4产生独特的表观遗传特征。可以相信，这个证据首次证明组蛋白H2A末端甲基化是表观遗传调节的机制。此外，下文更详细描述的实验证明多能EG和ES细胞中存在Prmt5而不存在Blimp1。
Blimp1在多能EC细胞系P19中的表达导致对已知在多能细胞中高水平表达的基因的抑制。该实验表明Blimp1/Prmt5复合物是重要的基因表达调控因子，并且可对细胞命运选择产生显著影响，特别是多能性和分化方面。因此，发明的一个实施方案提供了在利用生物活性(如Blimp1/Prmt5复合物在体外和体内的生物活性)的基础上进行基因控制的机制。
尽管不希望受理论的束缚，发明人相信由于具有5个锌指DNA结合域，Blimp1可以在所述复合物中提供基因靶向功能。Prmt5在定位到DNA时可作为HMTase提供精氨酸甲基转移酶活性，从而导致基因表达的抑制。已知Blimp1的人类直系物可结合到人IFN-β启动子区域的PRDI位点上(Keller A.D.& Maniatis T.(1991)Genes Dev.5：868-879)。如上所述，也发现Blimp1能够抑制c-Myc的表达。依照本发明，现已鉴定出作为Blimp1/Prmt5复合物特异性靶标的新基因亚群，这些基因的表达可受到所述新型复合物的调控。此亚群包括具有不同功能的基因，而这些基因被认为在调节细胞潜能、细胞周期、分化、细胞粘附、表观遗传重编程以及可能的肿瘤抑制方面起重要作用。
根据本发明，Blimp1/Prmt5抑制复合物的存在与生殖细胞中高水平的H2A/H4R3me2s相关。然而，在B细胞向浆细胞分化的期间，Blimp1靶向G9a依赖性H3K9me2。因此，Blimp1能够通过结合不同的结合伴侣指导多种细胞命运的决定和性质，而染色质重塑可能是这些过程的核心。Blimp1除在小鼠生殖细胞特化早期中具有明显重要作用之外，本发明证明如在PGC特化后生殖细胞中所观察到的那样，Blimp1还参与染色质独特表观遗传特征的形成。然而，E10.5期后，当在生殖细胞中检测到大量的基因组范围内的编程时，Blimp1/Prmt5脱离PGC细胞核进入细胞质。因此，对Blimp1/Prmt5复合物、H2A/H4第3位精氨酸的对称性二甲基化以及随后生殖细胞中大量基因组范围内的重编程三者之间关系的认识，使得对此关键过程的潜在机制以及如何在细胞内控制核重编程有了更深入的了解。
本发明还使得对Blimp1/Prmt5在多能胚胎生殖腺(EG)细胞中的功能有了更深入的了解，其中由PGC向EG细胞的演变过程与Blimp1的缺失明显相关。本发明提供了直接证据证明，Blimp1对抑制新生和使PGC远离获得明显的多能干细胞样表型是至关重要的。因此，Blimp1/Prmt5活性的激动剂和拮抗剂可分别在调节细胞命运决定远离或倾向于多能性表型的方面起重要作用。此外，细胞内的Blimp1表达提供了一种机制以削减Prmt5的核内精氨酸甲基转移酶活性并使其远离潜在的细胞质底物。此种作用在干细胞分化期间以及所需细胞或细胞系的一般细胞周期进程中是有利的。
本发明中作为Blimp1和/或Prmt5抑制剂使用的特定核酸小分子是被称为小干扰RNA(siRNA)的小片段双链RNA。此类干扰RNA(RNAi)技术可在体内选择性地使基因功能失活。在本发明中，可使用RNAi敲除细胞内Blimp1和/或Prmt5的表达。在此方法中，双链mRNA被RNA酶dicer识别并切割，从而产生长度为21-23个核苷酸的RNAi片段。这些RNAi可与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合，并被RISC解旋。随后，反义单链引导RISC接近包含互补序列的mRNA，从而对所述mRNA进行核酸内切酶切割(Elbashir et al.，(2001)Nature 411；494-498)。因此，此技术提供了在体细胞中靶向降解Blimp1和/或Prmt5 mRNA的方法，所述体细胞将应用于生物加工或需要提高其自我更新的多能性表型中。本领域中已有关于产生靶向Prmt5的siRNA技术的描述(Richard S.，见上文)。靶向人PRMT5的合适siRNA序列的实例包括：
5′-CTCATTTGCTGACAATGAA-3′[SEQ ID NO：1]
5′-GGACCTGAGAGATGATATA-3′[SEQ ID NO：2]
5′-GTTTCAAGAGGGAGTTCAT-3′[SEQ ID NO：3]
本发明的Blimp1/Prmt5复合物也可用于鉴定与其在细胞环境中相互作用的其它蛋白质和多肽。可使用鉴定蛋白质间相互作用的常规方法(例如，酵母双杂交筛选)来鉴定Blimp1/Prmt5复合物相互作用活性的潜在激动剂和拮抗剂。鉴定抑制Blimp1与Prmt5结合的小分子也在本发明的范围之内，例如，通过掩蔽或破坏与Blimp1中已知直接与其它蛋白质相互作用的那些域之间的相互作用来抑制Blimp1与Prmt5结合的小分子(Yu J.et al.，见上文)。可使用如
Figure G2007800218480D00141
等技术研究blimp1、Prmt5和/或Blimp1/Prmt5复合物蛋白质与蛋白质间的相互作用或蛋白质与小分子间的相互作用，其中
Figure G2007800218480D00142
使用表面等离子共振检测分子间相互作用(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ；另参见www.biacore.com)。
可通过自动化高通量筛选方法来筛选与Blimp1/Prmt5复合物结合的分子和蛋白质。因此，本发明提供了通过检测Blimp1/Prmt5复合物和靶分子之间阳性结合相互作用来鉴定与Blimp1/Prmt5复合物相互作用的分子的方法。可使用进一步的筛选步骤测定所鉴定的阳性结合相互作用是否具有药理学重要性，即靶分子是否能够调节Blimp1、Prmt5和/或Blimp1/Prmt5复合物的生物学活性或功能。如果鉴定出具有正调控作用的分子，则将此分子列为“命中”，并随后将其作为潜在的候选药物进行评定。此时或之前可考虑其它因素，例如所述分子的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)、生物利用度和毒性特征。如果潜在的药物分子满足药理学需要，则可被认为是药学上相容的。可配制合适的组合物以依照本领域已知的标准方法测试其体外和体内活性。
实施例
方法和试剂
胚胎分离：从远系小鼠MF1不同发育阶段的胚胎中分离原始生殖细胞。将阴栓形成的当天记为E0.5。由先前公布的文献(Saitou，M.，Barton，S.C.&Surani，M.A.(2002)Nature 418，293-300)建立单细胞cDNA文库。
免疫染色：使用胰蛋白酶处理切好的包含生殖细胞的胚胎片以制备单细胞悬浮液。随后，将细胞放置在包被有聚(L-赖氨酸)的载玻片上，用2％PFA固定并用PBS清洗3次，以进行下一步处理。将E11.5期的完整胚胎生殖脊切下，用PBS清洗，用4％ PFA在4℃下固定2小时，用PBS清洗，并在4℃下于20％蔗糖中放置过夜。将所得物包埋在O.C.T(BDH)中并冷冻切片。使用IF缓冲剂(PBS；0.1％ Triton；10mg/mL BSA)对单细胞或切片进行渗透处理。在4℃下与一抗温育过夜，随后用IF缓冲剂清洗3次，并与二抗(Alexa564、Alexa 488，Molecular Probes)在室温下温育2小时，并用PBS清洗。随后在含DAPI的Vectashields(Vector laboratories)中封固(mount)载玻片。使用BioRad Radiance 2000共聚焦显微镜观察免疫荧光。使用了以下抗体和稀释液：PGC7(T.Nakano产；1:2500)、Oct4(BD Transduction Laboratories；1:200)、TG1(小鼠生殖细胞特异性抗SSEA1单克隆抗体；1:1)、Blimp1(K.Calame产；1:10)、Prmt5(Upstate；1:250)、Prmtl(Upstate；1:200)、H4R3me2s(Abcam；1:1000)、Dhx38/Prp16(Proteintech Group；1:200)、Ezh2(Upstate；1:50)、G9a(AbcamTM；1:100)、Pfml(AbcamTM；1:50)、Setl(得自W.Herr；1:200)
免疫沉淀试验和核提取物的制备：通过RT-PCR扩增小鼠Blimp1的编码区，并将产物克隆到pcDNA3-MycHisA中以获得pCMV-MycBlimp1构建物。使用PBS清洗转染有原始载体(称为pCMV-Myc)和pCMV-MycBlimp1的293T或P19细胞，并在IP缓冲液(包含150mMNaCl、1％ NP40、0.1％ Triton、50mM Tris(pH 8.0)和完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche))中裂解所述细胞。通常免疫沉淀反应使用2x107个细胞。将全细胞提取物与2μg的Myc抗体(New England Biolabs)一同温育。或者使用抗Prmt5或抗Prmt1抗体(Upstate)在4℃下温育过夜。随后，加入30μL蛋白A/G的琼脂糖微珠，在4℃反应2小时。用IP缓冲剂清洗所述微珠5次。通过在Laemli样品缓冲剂中煮沸以洗脱被结合的蛋白。根据厂商的使用说明(细胞核提取试剂盒；Active Motif)制备ES、EG或P19细胞的核提取物，每次上样使用25μg核部分。
体外甲基转移酶检测：将从转染有pCMV-Myc或pCMV-MycBlimp1的293T细胞免疫沉淀试验中获得的微珠用HMTase缓冲剂(25mM NaCl、25mMTris，pH 8.8)再次清洗两次，并用于稍作改良的如文献16所述的HMTase检测。简要而言，将1μg的H3或H2A(Roche)或重组H2A(A.Brehm惠赠)作为底物，2μCi的S-腺苷-L-[甲基-3H]蛋氨酸([3H]SAM；AmershamBiosciences)作为甲基供体，两者在20μL的HMTase缓冲液混合物中于37℃温育3小时。将蛋白溶解于18％SDS-PAGE凝胶中，转移到PDVF膜上，并通过丽春红染色和荧光显影得到可视化。通过连续Edman降解法(Protein andNucleic acid Chemistry Facility，Cambridge University，UK)在体外对甲基化rH2A进行微测序，随后通过闪烁计数法测定单个氨基酸中3H的掺入。为了检测H2A/H4特异性甲基化，在存在有免疫沉淀的Blimpl复合物和上述SAM的条件下，将H4、H3、H2A和H2B(Roche)温育，并使用抗H4R3me2s抗体(AbcamTM，Cambridge，UK)进行Western印迹分析，其中检测H4R3me2s抗体的特异性已经通过竞争试验得到检测(参见所附数据：图8)。
染色质免疫沉淀(ChIP)克隆和ChIP：在室温下将单细胞悬液在1％甲醛中交联10分钟。随后将这些细胞破碎，并在50mM Tris(pH8.0)、10mMEDTA、1％SDS中裂解细胞核，随后进行超声破碎。如上文所述，对所述提取物进行免疫沉淀，同时加入纯化的IgG(Santa Cruz)作为阴性对照。随后，微珠在50mM NaHCO3、1％ SDS中洗脱两次，所得上清在65℃下用蛋白酶K处理5小时，然后进行苯酚/氯仿纯化和乙醇沉淀。随后，使用以下引物(正向引物1：ccaggaggggtttcatcaactg(SEQ ID No.4)和反向引物1：tgttaccgtctcacttggtgtttg(SEQ ID No.5)；正向引物2：acctcacaactgctgggattac(SEQ ID No.6)和反向引物2：ttcgttttctgcgtccgtg(SEQ ID No.7)；正向引物3：tttgtcgcagtgtcttatcgtaac(SEQ ID No.8)和反向引物3：taggaaggtgttggggaggg(SEQ ID No.9)；正向引物4：atgaggtttgagaagtgtggc(SEQ ID No.10)和反向引物4：atcagcggtggtggtgacagc(SEQ ID No.11))，通过标准的PCR反应分析PRMT5(Upstate)或H4R3m32(AbcamTM)的ChIP样品。当用于ChIP克隆试验时，使用抗Myc抗体进行连续两轮免疫沉淀。之后，DNA沉淀经T4DNA聚合酶平端化，然后连接到退火的JW102和JW10325上。随后，使用JW102通过PCR扩增所述连接产物(55℃ 2min、72℃ 5min、94℃ 2min的1个循环，94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1min的20个循环，和72℃ 5min的最后一个循环)。将PCR产物克隆到pGEM-T(Promega)中，通过PCR检测菌落的插入物，并通过标准方法对产物进行测序。随后，使用如Ensembl(http://www.ensembl.org)的在线生物信息资源进行BLAST检索。
实施例1：Blimp1活性的鉴定
小鼠PGC特化后马上发生显著的表观遗传修饰，包括分别通过甲基转移酶(HMTase)和乙酰转移酶(HAT)对组蛋白末端进行甲基化和乙酰化。在可能对PGC中这些表观遗传变化进行调控的候选基因中有属于保守性SET/PR域蛋白质家族的HMTase。在E7.5PGC和周边体细胞中对25个含有SET/PR域的候选基因进行了表达分析，并发现Blimp1、G9a、Set1、Ezh2和Pfml在包含PGC的胚胎区域中表达(图1b和图7)。然而，只有Blimp1的表达被限定于E7.5期PGC，其后在生殖细胞中持续表达。
为了研究Blimpl SET/PR域的活性，首先要确定使用抗Myc抗体可以使293T细胞中瞬时表达的带Myc标记小鼠Blimp1被有效地免疫沉淀(图2a)。随后，利用免疫沉淀物对组蛋白H3进行标准放射性组蛋白甲基转移酶试验(Rea，S.et al.，(2000)Nature406，593-9)。在H3的对应位置观察到相对较弱的信号，但令人惊讶的是，在组蛋白H2A和H4的对应位置还检测到显著条带(图2b)，通过Western印迹(数据未出示)确定后者是H3制备物中存在的低水平污染。推断体外H3位置的微弱信号可能是由先前在B细胞中报道的Blimp1相关G9a造成的(Gyory et al.，见上文)。然而，生殖细胞并不显现出显著的组蛋白H3第9位赖氨酸的二甲基化(H3K9me2；这是G9a造成的初级修饰)，也未发现G9a功能损失在可检测的程度上影响PGC的特化。因此，决定将重点落在观察到的免疫沉淀Blimp1对组蛋白H2A和H4的活性上。
基于H2A末端甲基化的新发现，决定首先检测免疫沉淀物对小牛胸腺和重组H2A制备物的甲基转移酶活性，并发现所述免疫沉淀物对这种组蛋白具有强烈的甲基化活性(图2b)。对甲基转移酶试验的放射性标记重组蛋白产物进行连续Edman降解，以测定H2A末端的氨基酸残基靶标。由释放氨基酸片段的闪烁计数法检测rH2A R3的放射性标记(图2c)。使用小牛胸腺和重组H4制备物获得了相同的结果(数据未出示)。考虑到组蛋白H2A和H4的N-末端起始几个残基间的氨基酸序列保守性(图2d)，这一发现是一致的。已知，H4 R3甲基化在转录调节中起重要作用。然而，这些结果预示着存在对组蛋白H2A上R3的其它新型甲基化。
实施例2：Blimp1/Prmt5复合物的鉴定
由于SET/PR域与仅在赖氨酸残基上的组蛋白甲基转移酶活性相关，可以推定上述检测到的精氨酸甲基转移酶活性可能不归于Blimp1，并且必然暗示免疫沉淀物中存在其它HMTase。先前已有报道称两种蛋白质精氨酸甲基转移酶Prmt1和Prmt5介导组蛋白H4 R3的甲基化。Prmt1是在不同类型底物上产生NG-单甲基精氨酸(Rme1)和不对称NG，N′G-二甲基精氨酸(Rme2a)的I型精氨酸甲基转移酶。如上所述，Prmt5属于II型精氨酸甲基转移酶，负责精氨酸的单甲基化(Rme1)和对称性NG，N′G-二甲基化(Rme2s)(图8)20。使用上述单细胞cDNA文库分析新生PGC和周边体细胞中这些蛋白的表达，以检测这些蛋白之一是否能在体内与Blimp1结合。发现E7.5期PGC中不存在Prmt1，而Prmt5则出现在PGC和体细胞内(数据未出示)。但在蛋白质水平上，Prmt5显示出核染色，并且与从E8.5期起的体细胞相比高度富集于PGC中(图3a、图3b；图S1b并参考下文)。另一方面，检测到Prmt1主要在这些阶段的生殖细胞的细胞质中。
接着，决定研究与Blimp1相互作用的是否是Prmt5或Prmt1。实际上，发现Myc标记的Blimp1能够有效地在免疫共沉淀293T细胞中的内源性Prmt5(图3d)。反之，Prmt5也可以沉淀Myc标记的Blimp1(图3d)。相反，对Myc标记的Blimp1和内源Prmt1的检测未发现两者之间的任何相互作用(图3e)。这些试验确认在293T细胞中Blimp1和Prmt5能够形成复合物。考虑到这些蛋白在PGC中的重叠表达(图3a、图3b；图S1b)，可推定Blimp1和Prmt5是PGC中同一蛋白质复合物的一部分，并且所述复合物也可在发育过程中出现在其它部位或成体的正常组织和肿瘤组织中。
实施例3：Blimp1/Prmt5复合物在体内的活性
测试针对H4R3me2s产生的抗体的特异性，结果显示所述抗体可高效识别来自小牛胸腺的组蛋白H2A和H4(图8b左侧；H2A和H4也作为污染物出现在H3和H2B制备物中)。在竞争试验中，此抗体被包含R3me2s的H4(1-9C)多肽有效地滴定(图S2c)。此外，此抗体还识别H4和H2A的Blimp1/Prmt5HMTase试验产物(图S2b右侧)，因此进一步证明这是由所述复合物造成的Prmt5的对称性二甲基化活性而不是Prmt1的不对称二甲基化活性。
使用H2/H4R3me2s修饰的特异性抗体通过免疫细胞化学方法分析从早期胚胎分离的PGC。在E8.5期的PGC和体细胞中均可见明显的H2A/H4R3me2s(图3f)，但是E10.5期，主要在生殖细胞中观察到较多的H2A/H4R3me2s积累(图3f)。然而，在使用识别单甲基化和/或不对称二甲基化的H4R3(H4R3me1和H4R3me2a)的抗体时，发现PGC中的此类修饰发生在E8.5期而不是E10.5期(数据未出示)。将两种抗体所得的数据组合可见，从E8.5期至E10.5期，PGC中趋向于H2A/H4R3me2s的发展。这些结果说明生殖细胞发育期间存在特异染色质特征，认为这是由于Prmt5和Blimp1同时存在的结果。重要的是注意到，有多种其它的组蛋白末端修饰对生殖细胞的特异染色质状态起作用。现已发现，Blimp1的功能损失导致停止增殖的起始PGC样细胞异常发育(Ohinata，Y.et al.，(2005)Nature 5，5)。
实施例4：Blimp1/Prmt5复合物体内靶标的鉴定
如上所述，Blimp1可通过将相互作用因子招募到特定位点来引导细胞分化期间的基因调控。采用染色质免疫沉淀克隆法鉴定推定的Blimp1靶标，其中首先在293T细胞中过表达Myc标记的Blimp1。随后，使用抗Myc抗体免疫沉淀来自这些293T细胞的核提取物，提取免疫沉淀的DNA并纯化，由连接接头平滑化，经PCR扩增并克隆。选择多个克隆，并通过测序进行分析，随后通过BLAST分析对克隆插入物进行定位。在32个克隆中，有11个克隆与已知基因的可能调控序列之内或其附近的区域相对应(参见表1)。
表1
 
基因 命中区域 推定的功能
Dhx38 5′-上游区域 信号转导/细胞周期
Pcdh7 5′-上游区域 细胞粘附
Q8C9T7 内含子 染色质调控
Xylt1 内含子 代谢
DnaH1 内含子 细胞骨架/精子活动性活力
Baip2 内含子 信号转导/细胞骨架组构
Nek7 第一内含子 细胞周期调控
Dusp2 5′-上游区域 信号转导/细胞周期
ENSMUSG00000027041 内含子 代谢
Sirt4 第二内含子 代谢/转录调控
Blimp1 3′-UTR 转录
实施例5：Blimp1/Prmt5复合物对Dhx38基因表达控制的特征描述
在被鉴定的Blimp1推定靶标之中，选择Dhx38进行进一步的研究。Dhx38是编码含有RNA解旋酶的DEAH盒的保守基因(也称为Prp16)，在线虫(C.elegans)精子向卵母细胞转化期间其对性别决定基因的翻译后调控至关重要(Graham，P.L.& Kimble，J.(1993).Genetics 133，919-31)。
在仔细检查Dhx38基因座时发现其包含与Blimp1共有结合位点对应的4个GGGAAAG基序；其中两个位于5′-区域，另两个位于转录起始位点的下游(图4a)。虽然现有的抗Blimp1抗体在免疫染色过程中有效，但其不能有效免疫沉淀Blimp1(数据未出示)。因此，使用Prmt5确定Dhx38是否是Blimp1/Prmt5在生殖细胞内的靶标。使用抗Prmt5抗体对E10.5期胚胎生殖脊细胞悬液中包含的PGC进行ChIP试验，其中E10.5期是Blimp1和Prmt5在生殖细胞核中共表达的时期(见上文)。实际上确实发现抗Prmt5抗体能够沉淀所选的+7152至+7541位核苷酸序列，该序列包含Dhx38基因的、包含Blimp1共有结合位点的第11个外显子(图4b)。在本ChIP试验中，其它3个推定的结合位点不与所述抗Prmt5抗体结合。这些结果说明Prmt5被招募到如Dhx38的Blimp1靶标，并由此说明Blimp1/Prmt5复合物调控生殖细胞中此类靶基因的表达。
基于Dhx38是Blimp1/Prmt5复合物在生殖细胞中的靶标的证据，对PGC中Dhx38的表达/抑制进行了研究。发现在E10.5和E11.5期检查不到Dhx38(图5a)。然而，在E12.5期雌性和雄性PGC中Dhx38均被上调(图5a)，这明显地伴随着E11.5期生殖细胞中Prmt5和Blimp1从细胞核到细胞质的重新定位而发生(图5b)。在E12.5期，Prmt5和Blimp1均不存在于PGC细胞核中(数据未出示)。雌性和雄性生殖细胞中紧随Dhx38上调之后分别是减数分裂和有丝分裂阻滞。因此，Blimp1/Prmt5和Dhx38的表达之间具有反向关系。这些结果说明Blimp1和Prmt5可在生殖细胞中对如Dhx38等靶基因起到转录抑制的作用。这种抑制作用在生殖细胞进入生殖脊且Blimp1和Prmt5完成细胞核至细胞质的转移后开始减弱。应注意到组蛋白精氨酸甲基化主要与转录激活相关，虽然最近发现Prmt5相关的H3R8me活性与基因表达下降有关(Pal S.et al.，见上文)。此外，据先前报道Blimp1和Prmt5都是转录抑制因子，因此，本文所述生殖细胞中Blimp1/Prmt5复合物相关的对称性精氨酸二甲基化可能会促进基因抑制。
实施例6：多能干细胞中的Blimp1-Prmt5复合物
决定检查多能胚胎生殖细胞(EG)以进一步了解Blimp1/Prmt5的作用。EG细胞可衍生自体外的分离PGC，因此被认为是等价于PGC的最接近的细胞系。已发现EG细胞也是Prmt5阳性，但与PGC不同，其缺乏Blimp1(图6a和图6b)。与此观测结果一致的是发现EG细胞也是Dhx38阳性，这表明Dhx38基因的表达可能归因于Blimp1的缺失(图6a和图6b)。在EG细胞中过表达Myc标记的Blimp1以重建Blimp1/Prmt5抑制复合物。然而，此类尝试在细胞转染仅12小时后即导致强烈的细胞毒性，而由pCMV-Myc转染的对照EG细胞的细胞存活能力则没有受到影响(数据未出示)。在多能胚胎干细胞(ES)中也获得了类似的结果(数据未出示)。
随后，选择具有类似于EG和ES细胞的多能性特征的多能小鼠胚胎癌(EC)细胞系P19。与ES/EG类似，P19细胞的确显示出Prmt5和Dhx38的表达，但没有表达Blimp1(图6b和图6c)。然而，发现这些细胞能够耐受Blimp1的表达，因此可用于免疫沉淀，而在所述免疫沉淀中的确证实过表达的Myc-Blimp1与小鼠EC细胞中内源Prmt5之间存在相互作用(图6c)。特别地，在P19细胞中此瞬时表达的Blimp1/Prmt5复合物随后导致了Dhx38的下调(图6c)。ChIP分析证实所述Dhx38的下调伴随着Dhx38基因座上H2A/H4R3me2s水平的升高(图6d)。这些观察印证了Blimp1/Prmt5复合物是造成如Dhx38等靶基因抑制的观点，这也可能在PGC中存在。
虽然本文详细公开了本发明的具体实施方案，但这些以实施例方式的公开仅出于说明的目的。上述实施方案并非有意限制以下权利要求书的范围。发明人认为对本发明进行的多种替换、变更和改进均不脱离权利要求书规定的本发明的精神和范围。
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<120>控制基因表达的表观遗传调节复合物
 
<130>P15242WO/DJC
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<150>GB0608945.2
<151>2006-05-05
 
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<211>19
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
 
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<221>misc_feature
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<223>PRMT5的siRNA
 
<400>1
ctcatttgct gacaatgaa                                                             19
 
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<213>智人(Homo sapiens)
 
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<223>PRMT5的siRNA
 
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ggacctgaga gatgatata                                                             19
 
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
 
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<223>PRMT5的siRNA
 
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Claims (51)

1.一种分离多肽复合物，其包含至少一个具有位点特异性DNA结合活性的第一域和至少一个具有精氨酸甲基转移酶活性的第二域，其中所述第二域能够甲基化位于组蛋白H2A末端区域的精氨酸残基。
2.如权利要求1所述的多肽复合物，其中所述第二域具有精氨酸甲基转移酶活性，提供精氨酸残基的对称性NG，N′G-二甲基化。
3.如权利要求1和2任一项所述的多肽复合物，其中所述第二域能够甲基化位于组蛋白H2A末端区域中第3位点的精氨酸残基(H2AR3)。
4.如以上权利要求中任一项所述的多肽复合物，其中所述第二域还能够甲基化位于组蛋白H4末端区域的精氨酸残基。
5.如权利要求4所述的多肽复合物，其中所述第二域能够甲基化位于组蛋白H4末端区域第3位点的精氨酸残基(H4R3)。
6.如以上权利要求中任一项所述的多肽复合物，其中所述精氨酸甲基转移酶活性归属于Prmt5精氨酸甲基转移酶域或其衍生物或其同源物。
7.如以上权利要求中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一域特异性地靶向结合于哺乳动物基因组DNA中参与基因表达控制的一个或多个共有序列。
8.如权利要求7所述的多肽复合物，其中所述第一域特异性地结合于PRDI/Blimp1型共有结合位点。
9.如以上权利要求中任一项所述的多肽复合物，其中所述第一域包含PRDI/Blimp1多肽、PRDI/Blimp1多肽的DNA结合部分、或其衍生物。
10.一种分离多肽，其包含具有位点特异性DNA结合活性的第一域和至少一个具有精氨酸甲基转移酶活性的第二域，其中所述第一域特异性地靶向结合于哺乳动物基因组DNA中参与基因表达控制的一个或多个共有序列，并且所述第二域具有精氨酸甲基转移酶活性，其提供精氨酸残基的对称性NG，N′G-二甲基化。
11.如权利要求10所述的分离多肽，其中所述第一域特异性地结合于PRDI/Blimp1型共有结合位点。
12.如权利要求10或11所述的分离多肽，其中所述精氨酸甲基转移酶活性归属于Prmt5精氨酸甲基转移酶域或其衍生物或其同源物。
13.适于诱导哺乳动物细胞中多肽复合物表达的核酸表达载体构建物，所述载体包含：
可操作性地连接于启动子序列的一个或多个编码序列，其中，所述一个或多个编码序列编码至少一个具有位点特异性DNA结合活性的第一多肽域和至少一个具有精氨酸甲基转移酶活性的第二多肽域，其中所述第一域特异性地靶向结合于哺乳动物基因组DNA中参与基因表达控制的一个或多个共有序列，而所述第二域具有精氨酸甲基转移酶活性，向位于多肽底物中的精氨酸残基提供对称性NG，N′G-二甲基化。
14.如权利要求13所述的表达载体，其中所述多肽底物是组蛋白。
15.如权利要求13和14任一项所述的表达载体，其中所述第二多肽域能够甲基化位于组蛋白H2A末端区域中第3位点的精氨酸残基(H2AR3)。
16.如权利要求13-15中任一项所述的表达载体，其中所述第二多肽域还能够甲基化位于组蛋白H4末端区域的精氨酸残基。
17.如权利要求16所述的表达载体，其中所述第二域能够甲基化位于组蛋白H4末端区域第3位点的精氨酸残基(H4R3)。
18.如权利要求13-17中任一项所述的表达载体，其中所述精氨酸甲基转移酶活性归属于Prmt5精氨酸甲基转移酶域或其衍生物或其同源物。
19.如权利要求13-18中任一项所述的表达载体，其中所述第一域特异性地靶向结合于哺乳动物基因组DNA中参与基因表达控制的一个或多个共有序列。
20.如权利要求19所述的表达载体，其中所述第一域特异性地结合于PRDI/Blimp1型共有结合位点。
21.如权利要求20所述的表达载体，其中所述第一域包含PRDI/Blimp1多肽、PRDI/Blimp1多肽的DNA结合部分、或其衍生物。
22.如权利要求13-21中任一项所述的表达载体，其中所述启动子是诱导型启动子。
23.如权利要求13-21中任一项所述的表达载体，其中所述启动子是组成型活性启动子。
24.如权利要求13-23中任一项所述的表达载体，其中所述载体包含表达盒，在所述表达盒中第一编码序列编码第一多肽域，第二编码序列表达第二多肽域。
25.如权利要求24所述的表达载体，其中所述第一编码序列编码PRDI/Blimp1多肽，所述第二编码序列编码Prmt5多肽。
26.如权利要求13-24中任一项所述的表达载体，其中所述第一编码序列和第二编码序列通过一个或多个插入序列分隔。
27.如权利要求26所述的表达载体，其中所述一个或多个插入序列包含至少一个内部核糖体进入序列(IRES)。
28.如权利要求13-27中任一项所述的表达载体，其还包含一个或多个核酸序列，所述核酸序列编码选自选择标记、抗生素抗性标记和报告子的多肽。
29.控制哺乳动物细胞中基因表达的方法，其包括在所述细胞中诱导多肽复合物的形成，其中所述多肽复合物包含至少一个具有位点特异性DNA结合活性的第一域和至少一个具有精氨酸甲基转移酶活性的第二域，其中所述第二域能够甲基化位于组蛋白H2A末端区域的精氨酸残基。
30.如权利要求29所述的方法，其中通过在细胞中诱导PRDI/Blimp1多肽或其同源物或其衍生物的表达来诱导细胞中所述多肽复合物的形成。
31.如权利要求30所述的方法，其中通过使用编码Blimp1多肽或其衍生物或其同源物的表达载体转染细胞，从而在所述细胞中诱导PRDI/Blimp1多肽的表达。
32.如权利要求30所述的方法，其中通过使用如权利要求13-28中任一项所述的表达载体转染细胞，从而在所述细胞中诱导PRDI/Blimp1多肽的表达。
33.如权利要求29-32中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。
34.如权利要求29-33中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是肿瘤细胞或癌细胞。
35.如权利要求29-34中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。
36.如权利要求29-34中任一项所述的方法，其中所述方法在体内进行。
37.如权利要求29-36中任一项所述的方法，其中所述基因表达控制导致对选自于c-Myc、Dhx38、Pcdh7、Q8C9T7、Xylt1、DnaH1、Baip2、Nek7、Dusp2、ENSMUSG00000027041、Sirt4和Blimp1的一个或多个基因的表达控制。
38.如权利要求37所述的方法，其中细胞中多肽复合物的诱导导致权利要求37中列出的一个或多个基因表达的下降。
39.促进干细胞自我更新并抑制其分化的方法，其包含抑制所述干细胞中Blimp1/Prmt5复合物的形成。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述干细胞是哺乳动物干细胞。
41.如权利要求39和40中任一项所述的方法，其中所述干细胞是人干细胞。
42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述干细胞选自成体干细胞、始祖干细胞和多能干细胞组成的组。
43.如权利要求39-42中任一项所述的方法，其中通过使所述干细胞接触Blimp1抑制剂化合物、Prmt5抑制剂化合物和/或Blimp1/Prmt5复合物抑制剂化合物来抑制所述干细胞中Blimp1/Prmt5复合物的形成。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述抑制剂化合物选自以下组成的组：小分子抑制剂、与Blimp1或Prmt5mRNA结合的siRNA分子、与Blimp1或Prmt5mRNA结合的反义寡核苷酸以及Blimp1或Prmt5多肽的负显性形式。
45.控制细胞中Prmt5定位的方法，其包括诱导细胞中Blimp1多肽的表达，从而诱导细胞中Blimp1/Prmt5复合物的形成。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物干细胞。
47.权利要求1-12中任一项所述的分离多肽复合物在癌症治疗中的应用。
48.权利要求1-12中任一项所述的分离多肽复合物在制备癌症治疗药物中的应用。
49.细胞，其包含权利要求13-28中任一项所述的表达载体。
50.如权利要求49所述的细胞，其为哺乳动物细胞。
51.如权利要求50所述的细胞，其为人类细胞。
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