CN101851681A - 基于核糖体28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是基于核糖体28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定方法，属于农业生物技术范畴。28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定方法是测定叶螨不同属物种的一段特定28S-rRNA序列，通过序列分析软件计算各物种遗传距离和构建系统发育树，从而对各物种进行快速区分。本发明根据叶螨28S-rRNA基因序列设计了一对新的特异性引物，可扩增出多态性的目的片段，长度约为547-578bp。本发明所述叶螨分属的快速鉴定方法迅速、简单、可靠，既节约成本，又省时高效。用核糖体28S-rRNA分子鉴定技术可广泛用于叶螨分属水平上的鉴定。
Description
一、技术领域
本研究开发了一种能快速有效进行叶螨分属鉴定的方法，属于生物技术领域，可用于叶螨分属水平上的鉴定和验证。
二、背景技术
叶螨是一种危害果蔬和温室植物的世界范围的重要经济害虫。物种的鉴定是生物安全中最基本的问题，而叶螨物种鉴定的困难在于有限的形态学特征，而且这些特征具有高度的相似性。另外，只有很少一部分分类学家专于叶螨的形态学鉴定，并且数量日趋减少。基于DNA序列对叶螨科物种的鉴定，相对于传统的形态学鉴定而言具有特殊的意义，它的优点是迅速、简单、可靠。
作者已研究基于核糖体28S-rRNA的D1-D2部分序列对叶螨进行分属水平上的快速鉴定，并证实了该鉴定方法具有可靠性和实用性。
三、发明内容
技术问题 本发明的目的是通过设计新的核糖体28S-rRNA的特异性引物，扩增出目的片段，通过序列分析软件计算各物种的遗传距离和构建系统发育树，从而在属水平上迅速区别和鉴定物种。
技术方案 基于核糖体28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定方法，共分为四步：
1)提取叶螨总DNA
挑单头雌成螨放入25μl STE缓冲液中进行碾磨，加入2μl 10mg/ml蛋白酶K，37℃孵育30min后，95℃初始变性5min并使蛋白酶K失活，作为DNA模板用于PCR扩增，STE缓冲液配制：100mMNaCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0；
2)PCR扩增
根据GenBank上登录的叶螨28S-rRNA的基因片段，利用Primer 5.0软件设计了一对特异性引物：即上游引物28S-F：5’-AACGAGATTCCCACTGTCCC-3’和下游引物28S-R：5’-GCCTTAGGACACCTGCGTTA-3’。以提取的叶螨总DNA作为DNA模板，反应体系及扩增条件如下：
反应体系：
ddH2O 30.6μL
10×Buffer 5uL
Mg2Cl 25mM 5μL
DNTP 2.5mM 4μL
Primer 28S-F 20μM 1.5μL
Primer 28S-R 20μM 1.5μL
Taq DNA聚合酶5U/μm 0.4μL
DNA模板 2.0μL
总体积 50μL
扩增条件：
预变性94℃，4min；
30个循环：变性92℃，1min，退火55℃，1min，延伸72℃，1min；
3)克隆和测序：利用AXYGEN回收试剂盒对PCR产物进行纯化，再将纯化产物连接到pGEM-T载体，最后导入感受态大肠杆菌中进行振荡培养，挑取培养基中长出的白斑，在LB培养液中培养，将菌液送到测序公司进行测序，每个种群取三个样品进行克隆和测序，以它们的一致序列为准。
4)序列数据分析
获得的未知物种DNA序列用BLAST工具进行检索并从Genebank下载同源性相近的物种序列，下载序列要求：同一属不同物种2条以上，至少3个不同属；对同源性DNA序列用Clustal X 1.81软件进行序列比对生成aln文件；将生成的aln文件用MEGA 4.01软件转换生成meg文件；采用距离法计算各样间的遗传距离，遗传距离小于2％的为同一属的物种，遗传距离远大于2％的为不同属的物种；基于p-distance模型，用邻接法构建系统发育树，通过1000次检验获得系统树分支的置信度；同一属的物种以99％的置信度处在同一进化枝上，未知物种获得属种分类。
有益效果
1、基于核糖体28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定方法与传统的形态学鉴定相比，克服了叶螨相似的形态学特征的干扰，从而进行快速准确的鉴定。
2、降低了鉴定的技术门槛，鉴定者无需分类学专业知识，只要掌握基本的分子克隆技术和序列分析软件即可使用此鉴定方法。
3、基于核糖体28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定技术利用碱基ACTG组成的序列使物种鉴别数值化。
四、附图说明
图1作者一共获得中国叶螨科6个属11个物种的28条核糖体28S序列。另外，从GenBank中下载10条螨类的28S序列：太平洋细须螨Tenuipalpus pacificus(登录号：AB287405)用作外群，T.truncatus，T.urticae，T.piercei，T.hydrangeae，Petrobia harti，Panonychus citri，Panonychus ulmi，Oligonychus coffeae和T.kanzawai(登录号分别是AY750692-750699和AB369895)被当成未鉴定种群用于系统发生分析和验证鉴定结果。分支上的数值表示的是1000次重复抽样检测的置信度。
五、具体实施方式
1、核糖体28S-rRNA特异性引物设计
根据GenBank上登录的叶螨28S-rRNA的基因片段，利用Primer 5.0软件设计了一对特异性引物，即，上游引物5’-AACGAGATTCCCACTGTCCC-3’和下游引物5’-GCCTTAGGACACCTGCGTTA-3’，用于扩增28S-rRNA的部分片段。基于核糖体28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定技术的具体步骤如下：
1)提取叶螨总DNA
挑取单头雌成螨放入25μl STE缓冲液中进行碾磨，加入2μl 10mg/ml蛋白酶K，37℃孵育30min后，95℃初始变性5min并使蛋白酶K失活，作为DNA模板用于PCR扩增，STE缓冲液配制：100mMNaCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0；每个叶螨地理种群或物种提取DNA 8头，总共28个种群，共提取224头叶螨总DNA。
2)PCR扩增
根据GenBank上登录的叶螨28S-rRNA的基因片段，利用Primer 5.0软件设计了一对通用引物：即上游引物28S-F：5’-AACGAGATTCCCACTGTCCC-3’和下游引物28S-R：5’-GCCTTAGGACACCTGCGTTA-3’。以提取的叶螨总DNA作为DNA模板，反应体系及扩增条件如下：
反应体系：
ddH2O 30.6μL
10×Buffer 5μL
Mg2Cl 25mM 5μL
DNTP 2.5mM 4μL
Primer 28S-F 20μM 1.5μL
Primer 28S-R 20μM 1.5μL
Taq DNA聚合酶5U/μm 0.4μL
DNA模板 2.0μL
总体积 50μL
扩增条件：
预变性94℃，4min；
30个循环：变性92℃，1min，退火55℃，1min，延伸72℃，1min；
3)克隆和测序：利用AXYGEN回收试剂盒对PCR产物进行纯化，再将纯化产物连接到pGEM-T载体，最后导入感受态大肠杆菌中进行振荡培养，挑取培养基中长出的白斑，在LB培养液中培养，将菌液送到测序公司进行测序，每个种群取三个样品进行克隆和测序，以它们的一致序列为准。
4)序列数据分析
获得的DNA序列用BLAST工具进行序列分析、DNA序列检索；用Genedoc软件进行序列同源性比较；用BioEdit软件进行序列编辑；用Clustal X软件进行序列比对；比对结果输入MEGA 4软件，采用距离法计算各样间的遗传距离，并基于p-distance模型，用邻接法构建系统发育树，通过1000次检验获得系统树分支的置信度。
同一属的物种遗传距离小于2％，不同的属的物种遗传距离远大于2％；同一属的物种以99％的置信度处在同一进化枝上，不同属物种被明显区分开。
2、基于核糖体28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定
使用者无需分类学专业知识，只需掌握常规的分子克隆技术：提取DNA，PCR扩增，产物纯化，连接和转化，摇菌，送菌液进行测序，以及采用常用的序列分析软件。
比如我们现在要鉴定一个未知物种：首先通过分子克隆和测序获得其28S-rRNA序列；获得的DNA序列用BLAST工具进行DNA序列检索并从Genebank下载同源性相近的物种序列(下载序列要求：同一属不同物种2条以上，至少3个不同属)；对同源性DNA序列用Clustal X 1.81软件进行序列比对生成aln文件；将生成的aln文件用MEGA 4.01软件转换生成meg文件；采用距离法计算各样间的遗传距离，并基于p-distance模型，用邻接法构建系统发育树，1000次检验获得系统树分支的置信度。我们通过未知物种和其他物种的遗传距离及其在系统发育树中的位置可从属水平上鉴定该物种。
软件具体操作方法：
1.在word里输入未知物种和Genebank下载的序列，输入物种名(Genebank数据库中每个序列对应有来源种或属)，未知物种另命名，如‘W1’，并在名字前加上“＞”。
2.将其复制生成txt文本文件，并命名，如“patent.txt”。
3.双击打开Clustalx1.81，点击下拉菜单‘File’，选择’Load sequence’，选择操作文件，如“patent.txt”，打开文件。
4.在出现的窗口中选择下拉菜单Alignment，选择‘Do Complete Alignment’，生成一个aln文件如“patent.aln”。
5.打开软件MEGA 4.01，选择下拉菜单‘File’，点击‘Open Data’，选择以上生成的aln文件，如“patent.aln”，点击‘打开’按钮。
6.在打开的窗口中，选择下拉菜单‘Utilities’，点击‘Convert to MEGA Format’选项，出现的对话框中选择‘OK’按钮，保存生成meg文件，命名文件，如“patent.meg”，关闭当前窗口。
7.在MEGA主窗口中，选择下拉菜单‘File’，打开meg文件，在Input Data对话框中点击选择‘Nucleotide sequences’，点击‘Yes’，在接下来的对话框‘Protein-coding nucleotide sequencedata？’选择‘No’。
8.出现两个窗口：在Sequence Data Explorer窗口中，选择下拉菜单Data中选择Setup/Select Taxa&Groups，立即出现一个对话框，在对话框左下角点击按钮‘New group’，即生成并出现第一个新组名：Gp1，修改建立种的组名，如‘Amphitetranychus viennensis’，Genebank数据库中每个序列对应有来源种和地理种群或品系，据此建立种的组名并进行分类分组，每个物种建立一个组，未知物种单独建立一个组(本研究中共建立11个物种组)；同时在Sequence Data Explorer窗口右侧会出现各序列命名；如将Amphitetranychus viennensis物种点击选中，再点击中间的向左按钮，这样Amphitetranychus viennensis物种被选入了‘Amphitetranychus viennensis’组(本研究中有4个该物种的地理种群，所以该物种组就包括4个序列)，用同样的方法将其他物种分组。
9.在主窗口下拉菜单Distances中选择‘Compute Between Groups Means’，弹出Analysis Preferences对话框，在‘Model’栏中点击绿色小方块，出现按钮，继续点击右弹出菜单‘Nucleotide’，选择‘p-distance’，保持其它默认设置，点击‘Compute’，计算物种的遗传距离(本研究中一共计算了11个物种的遗传距离)。
10.按照步骤8方法，在Sequence Data Explorer窗口中，选择下拉菜单Data中选择Setup/Select Taxa&Groups，立即出现一个对话框，在对话框左下角点击按钮‘New group’，即生成并出现第一个新组名：Gp1，修改建立属的组名，如‘Amphitetranychus’，Genebank数据库中每个序列对应有来源种或属，据此建立属的组名并进行分类分组，每个属建立一个相应的组，未知物种单独建立一个组；(本研究中共建立6个组，分别代表6个不同的属)；在主窗口下拉菜单Distances中选择‘Compute Between Groups Means’和‘Compute within Groups Means’，按照步骤9的方法分别计算属内属间平均遗传距离。
11.在主窗口主菜单中点击下拉菜单Phylogeny，选择‘Bootstrap Test ofPhylogeny’，右弹出菜单选择‘Neighbor-Joining’，弹出一个对话框，在‘Phylogeny Test and Options’点击右边绿色小方块，在弹出的对话框中左边一栏‘Test of inferred phylogeny’中选择‘Bootstrap’，右边一栏‘Replications’选择值‘1000’，点击左下角‘对号’返回上一级对话框；在‘Model’栏中点击绿色小方块，出现按钮，继续点击右弹出菜单‘Nucleotide’，选择‘p-distance’，保持其它默认设置。点击‘Compute’按钮，生成系统发育树。
12.根据未知物种在系统发育树的位置，以及未知物种与其它物种的遗传距离，迅速准确地判断出该未知物种的分属分类地位。同一属的物种遗传距离小于2％，不同的属的物种遗传距离远大于2％；同一属的物种以99％的置信度处在同一进化枝上，不同属物种被明显区分开。
作者研究了来自叶螨科6个属11个种28个种群的核糖体28S-rRNA部分片段。这是一段来自28S的D1-D2区域长的片段，经过MEGA 4的计算，11个物种的两两核苷酸差异统计结果见表2，属间核苷酸差异见表3。由表2可以看出，叶螨属内各物种的核糖体28S-rRNA核苷酸遗传距离均小于2％，其平均属内核苷酸遗传距离只有0.002(见表3)。而全爪螨属内苹果全爪螨和柑橘全爪螨核苷酸差异仅为0.008。然而，由表3可以看出属间遗传距离远远大于种间遗传距离。
3、基于核糖体28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定技术的准确性
如图1所示，太平洋细须螨Tenuipalpus pacificus(登录号：AB287405)作为外群，最先被分离出来，6个属的物种都以较高的置信度各成一个进化枝，系统发育树完全支持形态学上鉴定的属的地位，进一步说明了基于核糖体28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定技术具有较高的准确性。
表1用于研究的叶螨物种
表2叶螨28S-rRNA序列的种间遗传距离＊
*注：1山楂双叶螨Amphitetranychus viennensis；2二斑叶螨T.urticae；3朱砂叶螨T.cinnabarinus；4截形叶螨T.truncatus；5土耳其斯坦叶螨T.turkestani；6神泽叶螨T.kanzawai；7酢浆草岩螨Petrobia harti；8柑橘全爪螨Panonychus citri；9苹果全爪螨Panonychus ulmi；10竹裂爪螨Schizotetranychus bambusae；11梧桐缺爪螨Aponychus firmianae
表3叶螨28S-rRNA序列的属内属间遗传距离＊＊
**注：1双叶螨属Amphitetranychus；2叶螨属Tetranychus；3岩螨属Petrobia；4全爪螨属Panonychus；5裂爪螨属Schizotetranychus；6缺爪螨属Aponychus
序列表
<110>南京农业大学
<120>基于核糖体28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定方法
<130>说明书
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>引物28S-F
<222>(1)..(20)
<223>
<400>1
aacgagattc ccactgtccc 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>引物28S-R
<222>(1)..(20)
<223>
<400>2
gccttaggac acctgcgtta 20
Claims (1)
1.基于核糖体28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定方法，其特征在于：
1)提取叶螨总DNA
挑单头雌成螨放入25μl STE缓冲液中进行碾磨，加入2μl 10mg/ml蛋白酶K，37℃孵育30min后，95℃初始变性5min并使蛋白酶K失活，作为DNA模板用于PCR扩增，STE缓冲液配制：100mMNaCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0，提取DNA；
2)PCR扩增
根据GenBank上登录的叶螨28S-rRNA的基因片段，利用Primer 5.0软件设计了一对特异性引物：即上游引物28S-F：5’-AACGAGATTCCCACTGTCCC-3’和下游引物28S-R：5’-GCCTTAGGACACCTGCGTTA-3’，以提取的叶螨总DNA作为DNA模板，反应体系：
ddH2O 30.6μL
10×Buffer 5μL
Mg2Cl 25mM 5μL
DNTP 2.5mM 4μL
Primer 28S-F 20μM 1.5μL
Primer 28S-R 20μM 1.5μL
Taq DNA聚合酶5U/μm 0.4μL
DNA模板 2.0μL
总体积 50μL
扩增条件：
预变性：94℃，4min；
30个循环：变性92℃，1min，退火55℃，1min，延伸72℃，1min；
3)克隆和测序：利用AXYGEN回收试剂盒对PCR产物进行纯化，再将纯化产物连接到pGEM-T载体，最后导入感受态大肠杆菌DH5a中进行振荡培养，挑取培养基中长出的白斑，在LB培养液中培养，将菌液送到测序公司进行测序，每个种群取三个样品进行克隆和测序，以它们的一致序列为准；
4)序列数据分析
获得的未知物种DNA序列用BLAST工具进行检索并从Genebank下载同源性相近的物种序列，下载序列要求：同一属不同物种2条以上，至少3个不同属；对同源性DNA序列用Clustal X 1.81软件进行序列比对生成aln文件；将生成的aln文件用MEGA 4.01软件转换生成me、文件；采用距离法计算各样间的遗传距离，遗传距离小于2％的为同一属的物种，遗传距离远大于2％的为不同属的物种；基于p-distance模型，用邻接法构建系统发育树，通过1000次检验获得系统树分支的置信度；同一属的物种以99％的置信度处在同一进化枝上，未知物种获得属种分类。
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| CN201010206926A CN101851681A (zh) | 2010-06-23 | 2010-06-23 | 基于核糖体28S-rRNA对叶螨分属的快速鉴定方法 |
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| CN (1) | CN101851681A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108846262A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-11-20 | 广西大学 | 基于dft的rna二级结构距离计算构建系统发育树的方法 |
-
2010
- 2010-06-23 CN CN201010206926A patent/CN101851681A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108846262A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-11-20 | 广西大学 | 基于dft的rna二级结构距离计算构建系统发育树的方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20101006 |