CN101851627A - 中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂EsCystatin基因编码蛋白及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学和生物化学技术领域，中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂(EsCystatin)基因体外重组表达技术及其功能鉴定。公开了中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有序列SEQ ID NO.1核苷酸序列和SEQ ID NO.2中氨基酸序列。还公开了中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂对木瓜蛋白酶的抑制作用，利用本发明所获得的重组蛋白在开发抗菌类药物和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。

Description

中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂EsCystatin基因编码蛋白及应用

技术领域：

本发明属于分子生物学和生物化学技术领域，涉及中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂(EsCystatin)基因的体外重组表达技术及其活性鉴定。本发明利用体外重组表达技术获得了中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂EsCystatin蛋白，该重组蛋白对木瓜蛋白酶具有一定抑制作用，以及在开发抗菌类药物和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。

背景技术：

半胱氨酸蛋白酶抑制剂是广泛存在于动植物组织和体液中的蛋白酶抑制剂，它能与木瓜蛋白酶、组织蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶形成紧密的复合物，抑制他们的活性，从而保护蛋白质的二硫键不被半氨酸蛋白酶破坏，阻止蛋白的降解。半胱氨酸蛋白抑制剂是抑制半胱氨酸蛋白酶的一类超家族，根据它们的结构特征可分为三个家族。第一类半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族是一类低分子量蛋白，无二硫键；第二类半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族，也是只有一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域，至少有两个分子内二硫键，第三类半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族是含有多个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域，每个结构域中的二硫键的位置类似于第二类家族。在脊椎动物中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂是抑制半胱氨酸蛋白水解酶的一类蛋白家族，主要是组织蛋白酶家族的强抑制剂。它们可保护和调控内源蛋白水解酶活性。在人类抵抗心血管疾病，脑梗死高血压病、糖尿病、原发性肾病、恶性肿瘤时，出现难以控制蛋白质水解和组织损伤，半胱氨酸蛋白酶抑制剂起到调控和保护的功能。近年来，无脊椎动物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂也有零星报道，比如在肝吸虫(Fasciola hepatica)，线虫(Acanthocheilonema viteae)，马来丝虫(Brugia malayi)，盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)，巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)，捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)和马蹄蟹(Trachypleus tridentatus)中的半胱氨酸蛋白酶可参与机体的免疫防御。但是在甲壳动物中还没有半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究报道。

中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)属于甲壳动物，是我国重要的水产养殖品种之一。然而，随着养殖规模和养殖条件的恶化，病害发生日益频繁，尤其是病毒、细菌、真菌等微生物引起的传染性疾病，每年均造成巨大的经济损失，严重阻碍了甲壳动物养殖业的发展。因此，开展中华绒螯蟹免疫机制研究，为蟹病的防治寻找更科学有效的途径，以期通过蟹自身免疫抵抗力的提高来防止和减少蟹病的发生，具有十分重要的理论与实践意义。因此从中华绒螯蟹中克隆半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因，并对其体外原核重组表达蛋白的抑制活性进行深入研究，将有助于开发天然的水产药物用于人类疾病的治疗。

发明内容：

本发明的目的是从中华绒螯蟹中克隆到半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因，为进一步研究中华绒螯蟹防御机制提供基础，并为中华绒螯蟹的病害防治，开发医药产品和饲料添加剂奠定应用基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因EsCystatin，具有序列SEQIDNo.1中碱基序列。其是从中华绒螯蟹中克隆到半胱氨酸蛋白酶抑制剂EsCystatin的cDNA序列，该序列全长为1486bp，包括开放阅读框363bp，编码120个氨基酸，5’非编码区长为92bp，3’非编码区长为1031bp，有一个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)，和多聚腺苷酸尾巴。利用pEASY-E1表达载体在大肠杆菌中Rosetta-gami表达菌株中重组表达了该蛋白，表达产物对木瓜蛋白酶具有明显的抑制活性。木瓜蛋白酶浓度为1μg mL^-1。当重组蛋白浓度达到300μgmL^-1时，接近89％的木瓜蛋白酶活性被抑制，当重组蛋白浓度达到350μg mL^-1时，木瓜蛋白酶活性100％被抑制。

其编码蛋白具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列，分子量为13.39kDa，等电点为5.48，具有一个半胱氨酸蛋白酶样结构域，没有半胱氨酸残基，没有二硫键。

本发明利用表达序列标签技术和cDNA末端快速扩增技术从中华绒螯蟹中克隆到半胱蛋白酶抑制剂的cDNA的全长序列，通过PCR技术，扩增该基因的全部编码区片段克隆到pEASY-E1表达载体中，在大肠杆菌Rosetta-gami中实现原核体外重组表达。重组产物经镍琼脂糖凝胶纯化，透析复性后，对木瓜蛋白酶具有明显的抑制活性。当重组蛋白浓度达到300μg mL^-1时，接近89％的木瓜蛋白酶活性被抑制，当重组蛋白浓度达到350μg mL^-1时，木瓜蛋白酶活性完全被抑制。本发明为中华绒螯蟹防御机制提供理论基础，并为中华绒螯蟹的病害防治，开发医药产品和饲料添加剂奠定应用基础。

附图说明

图示为本发明中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂对木瓜蛋白酶的抑制作用图。

具体实施方式：

下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

实验例1：

中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的cDNA克隆

用T3引物对中华绒螯蟹血细胞cDNA文库测序获得了7535条高质量的EST序列，这些序列被拼接成911条contigs和2032条singletons，通称为Unigenes。其中一条拼接序列推导出的氨基酸序列与高等动物人，鼠中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂蛋白具有较高的同源性，经SMART软件进行预测，该序列具有一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂样结构域，序列的3’端有一个加尾信号(AATAAA)和多聚腺苷酸尾巴(poly A)。根据这条拼接序列设计正向引物P1(5’-AATGGCGTTCAACACTTCAC-3’)和正向引物P2(5’-CATCACAATACTATCCTCGCTCAC-3’)和adaptor dT引物(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACT₁₇-3’)采用3’末端的快速扩增技术扩增半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的3’末端，所得序列进行拼接。然后采用引物P3(5’-TCGAATTCCCTCAGCACCGGACG-3’)和引物P4(5’-TTGAGATTTGCTAAGCTTTATTTAGT-3’)扩增中华绒螯蟹半胱蛋白酶抑制基因的cDNA全长，克隆到pMD-18T载体，选取阳性克隆送至生物公司进行测序。测序结果与经BLAST分析显示该扩增片段为半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因。

实验例2：

本发明的中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因编码区体外原核重组表达与抑制活性测定

1、重组载体的构建

本发明中采用的重组载体为Novagen公司的pEASY-E1原核表达载体。通过PCR技术，引物P5(5’-ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCGAATT-3’)和P6(5’-GAAATAGGAGATGGGTCGGTCCAAT-3’)扩增中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因编码区片段。反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。将PCR产物直接连接到pEASY-E1原核表达载体，连接液转化大肠杆菌TOP10，菌落PCR筛选并测序。

2、重组蛋白的表达和纯化

用构建好的重组载体转化Rosetta-gami表达菌株，并筛选阳性克隆，测序确认表达框的正确性。挑取单克隆，接种于50mL LB液体培养基中，37℃震荡摇床中培养12-16小时，然后以1∶100的比例接种200mL LB液体培养基中，37℃培养至OD600＝0.5-0.7。加入IPTG，使终浓度达到1mmol/mL，继续培养4h。4℃，5000rpm，离心10min，收集菌体，于-20℃冻存备用。同时做未诱导对照，取1ml菌液离心，弃去上清后，加入80μL水和20μL 5X蛋白上样缓冲液，100℃沸水煮沸10分钟，稍离心，收集上清液和和沉淀，SDS-PAGE检测表达产物。

重组蛋白以包涵体形式存在，以常规方法经过包涵体纯化、复性获得重组中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白抑制剂蛋白。

3、重组蛋白的抑制活性测定

在每支EP管中加入50μL酪蛋白(5.0mg mL^-1)，37℃保温10min后，加入30μL木瓜蛋白酶(1mg mL^-1)和200μL适量纯化后的重组蛋白，再加缓冲液(50mmol L^-1pH7.6Tris-HCl，2mmol L^-1半胱氨酸盐酸盐，0.1mmol L^-1EDTA)至终体积300μL，37℃保温20min后，加入3mL考马斯亮蓝G250溶液，混匀，室温放置20min，在595nm波长下测剩余木瓜蛋白酶活性。每一数据测定3次，取平均值。

实验结果：

当重组蛋白浓度达到300μg mL^-1时，接近89％的木瓜蛋白酶活性被抑制，当重组蛋白浓度达到350μg mL^-1时，木瓜蛋白酶活性100％被抑制(附图所示)。

序列表

SEQ ID No.1

<110>中国科学院海洋研究所

<120>中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂EsCystatin基因编码蛋白及应用

<141>2010-02-01

<160>2

<210>1

<211>1486

<212>cDNA

<213>中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)

<221>中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂

<222>(1)...(1486)

<400>1

 

tcgaattccc tcagcaccgg acgagagagc tacatttttt cctcctctga agtgatttgt     60

cttcgtcttc gtccacgacc ccaaggaaca agatgggtct cagggtcatc agtgtaggac    120

tcttcattac tacagtgttg ttaggcatga aagcaaccgc tgtcgggatg cctggaggac    180

tgtcagagga gaagccgatg actcccgagg tgcaggagct catcaacgaa gtcaggcccg    240

atgtggagga gcacctgggt cgccccgtgt ctcgcttcga ggggttgaac tacaagaccc    300

aggtggtgtc aggcctcaac tacttcgtca aggttgacat cggtgacaac gaggtggtgc    360

acatcagggt gtaccatacc ttcgacggca ccaacaccct gaatggcgtt caacacttca    420

ccgacaaatt ggaccgaccc atctcctatt tctgaggcac ccatccaccc atgatatagt    480

aactaagaaa gcagagtccc ctcggtggtt aactatacta tatgcaccca cccaccgcca    540

tcacaatact atcctcgctc actcgcatac atacctttcg tttttaaaag attgattata    600

gtctatcgac tctataactt gagcactgtg gcttggcccg gggaaccccc cattgtttac    660

acaactagcg atgacctgcg catggcgatc tgtctcactg ttagtctacg ttatctattt    720

atgcagtata tatataaatt cataatacaa ttacatggtg ttatgaatgg cttgggattt    780

gagggaaaga gaacgactcg ggaaaccctc catttcactt gtcaacgtgg ctcatgcgac    840

cttgccgcct gaaggacctt ggcaacaggc gccaagccgc actgttaatt cacccttcct    900

ccaccatggg aaactcacgt cctgcacagc caagcaaaag agatcatata taacactaat    960

aagagagaga gagagaggta gcgagcccct ctgatctcga gtagagtgat ggagccatgt   1020

ggcgcagaag ctcggtctcc ctgagcaacg cctaaaggct gaagttagag tcgatggagt   1080

ataattatat cgttcatgat tttactgtta caaaagatat atagacccac aaggaaatat   1140

tgattagttt attcatgatt ttagtgttgc aagagagata tgcccacaac tatgtaagga   1200

gaattgaagt gcttaaatgt atggttgatt cctattttaa atgttgcaag gagatattaa   1260

agcaaattat agagaaagga tcgtggtgct tgatttgtca tttcagacgt taaacataaa   1320

acaaaggttt agagtgaaaa tgtttataag cagaatttaa ctttcaagta aactcgatta   1380

ctcattcaac tatatatata gtattataca taatctctgg tggagggtat ttttacatga   1440

ttactaaata aagcttagca aatctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                  1486

SEQ ID No.2

<110>中国科学院海洋研究所

<120>中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂EsCystatin基因编码蛋白及应用

<140>

<141>2010-02-01

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>2

<211>120

<212>PRT

<213>中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)

<222>(1)...(120)

<400>2

 

Met Gly Leu Arg Val Ile Ser Val Gly Leu Phe Ile Thr Thr Val

                5                   10                  15

Leu Leu Gly Met Lys Aal Thr Ala Val Gly Met Pro Gly Gly Leu

                20                  25                  30

Ser Glu Glu Lys Pro Met Thr Pro Glu Val Gln Glu Leu Ile Asn

                35                  40                  45

Glu Val Arg Pro Asp Val Glu Glu His Leu Gly Arg Pro Val Ser

                50                  55                  60

Arg Phe Glu Gly Leu Asn Tyr Lys Thr Gln Val Val Ser Gly Leu

                65                  70                  75

Asn Tyr Phe Val Lys Val Asp Ile Gly Asp Asn Glu Val Val His

                80                  85                  90

Ile Arg Val Tyr His Thr Phe Asp Gly Thr Asn Thr Leu Asn Gly

                95                  100                 105

Val Gln His Phe Thr Asp Lys Leu Asp Arg Pro Ile Ser Tyr Phe

                110                 115                 120

Claims (4)

1.一种中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因，它具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其所示信息为：

(1)序列特征：

长度：1486个碱基对

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

(2)分子类型：cDNA

(3)假设：否

(4)反义：否

(5)来源：中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)

(6)序列描述：SEQ ID No.1

tcgaattccc tcagcaccgg acgagagagc tacatttttt cctcctctga agtgatttgt    60

cttcgtcttc gtccacgacc ccaaggaaca agatgggtct cagggtcatc agtgtaggac   120

tcttcattac tacagtgttg ttaggcatga aagcaaccgc tgtcgggatg cctggaggac   180

tgtcagagga gaagccgatg actcccgagg tgcaggagct catcaacgaa gtcaggcccg   240

atgtggagga gcacctgggt cgccccgtgt ctcgcttcga ggggttgaac tacaagaccc   300

aggtggtgtc aggcctcaac tacttcgtca aggttgacat cggtgacaac gaggtggtgc   360

acatcagggt gtaccatacc ttcgacggca ccaacaccct gaatggcgtt caacacttca   420

ccgacaaatt ggaccgaccc atctcctatt tctgaggcac ccatccaccc atgatatagt   480

aactaagaaa gcagagtccc ctcggtggtt aactatacta tatgcaccca cccaccgcca   540

tcacaatact atcctcgctc actcgcatac atacctttcg tttttaaaag attgattata   600

gtctatcgac tctataactt gagcactgtg gcttggcccg gggaaccccc cattgtttac   660

acaactagcg atgacctgcg catggcgatc tgtctcactg ttagtctacg ttatctattt   720

atgcagtata tatataaatt cataatacaa ttacatggtg ttatgaatgg cttgggattt   780

gagggaaaga gaacgactcg ggaaaccctc catttcactt gtcaacgtgg ctcatgcgac   840

cttgccgcct gaaggacctt ggcaacaggc gccaagccgc actgttaatt cacccttcct   900

ccaccatggg aaactcacgt cctgcacagc caagcaaaag agatcatata taacactaat   960

aagagagaga gagagaggta gcgagcccct ctgatctcga gtagagtgat ggagccatgt  1020

ggcgcagaag ctcggtctcc ctgagcaacg cctaaaggct gaagttagag tcgatggagt  1080

ataattatat cgttcatgat tttactgtta caaaagatat atagacccac aaggaaatat  1140

tgattagttt attcatgatt ttagtgttgc aagagagata tgcccacaac tatgtaagga  1200

gaattgaagt gcttaaatgt atggttgatt cctattttaa atgttgcaag gagatattaa  1260

agcaaattat agagaaagga tcgtggtgct tgatttgtca tttcagacgt taaacataaa  1320

acaaaggttt agagtgaaaa tgtttataag cagaatttaa ctttcaagta aactcgatta  1380

ctcattcaac tatatatata gtattataca taatctctgg tggagggtat ttttacatga  1440

ttactaaata aagcttagca aatctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                 1486

2.权力1要求所述中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白抑制剂基因编码的蛋白，它具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，其所示信息为：

(1)序列特征：

长度：120个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：线性

(2)分子类型：蛋白质

(3)序列描述：SEQ ID No.2

Met Gly Leu Arg Val Ile Ser Val Gly Leu Phe Ile Thr Thr Val

                5                   10                  15

Leu Leu Gly Met Lys Aal Thr Ala Val Gly Met Pro Gly Gly Leu

                20                  25                  30

Ser Glu Glu Lys Pro Met Thr Pro Glu Val Gln Glu Leu Ile Asn

                35                  40                  45

Glu Val Arg Pro Asp Val Glu Glu His Leu Gly Arg Pro Val Ser

                50                  55                  60

Arg Phe Glu Gly Leu Asn Tyr Lys Thr Gln Val Val Ser Gly Leu

                65                  70                  75

Asn Tyr Phe Val Lys Val Asp Ile Gly Asp Asn Glu Val Val His

                80                  85                  90

Ile Arg Val Tyr His Thr Phe Asp Gly Thr Asn Thr Leu Asn Gly

                95                  100                 105

Val Gln His Phe Thr Asp Lys Leu Asp Arg Pro Ile Ser Tyr Phe

                110                 115                 120

3.一种根据权利要求2所述的中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白抑制剂蛋白的制备方法，其特征在于：(1)利用引物P5和P6扩增中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白抑制剂基因编码区片段；(2)PCR扩增产物与pEASY-E1载体连接，连接后转化大肠杆菌TOP10，筛选转化子，测序鉴定；(3)重组质粒pEASY-E1-cystatin转入表达菌株Rosetta-gami进行诱导培养，超声波破碎处理菌体收获重组蛋白，经镍柱纯化，透析复性后得到具有活性的中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白抑制剂蛋白。

4.一种权利要求3所述的中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白抑制剂蛋白的应用。其特征在于：中华绒螯蟹半胱氨酸蛋白抑制剂的重组产物可作为蛋白酶的抑制剂在开发抗菌类药物和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。

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